專利名稱：修飾的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及提高核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)量的方法和試劑。因此本發(fā)明可應(yīng)用于任何有關(guān)核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的發(fā)明使在體外擴(kuò)增核酸序列成為可能，有關(guān)PCR的資料可見美國(guó)專利號(hào)4,683,195；4,683,202；和4,965,188；Saiki等，1985，科學(xué)(Science)2301350-1354；Mullis等，1986，Cold SpringsHarbor，Symp.Quant.Biol.51263-273；以及Mullis和Faloona，1987，酶學(xué)方法(Methods Enzymol)，155335-350。PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用已廣泛見于本學(xué)科文獻(xiàn)，例如，PCR相關(guān)課題范圍見于PCR技術(shù)-DNA擴(kuò)增原理和應(yīng)用，1989，(HA.Erlich編)stockton press，New York；PCR方案方法和應(yīng)用指南，1990，(M.A.Znnis等編)，Academic press，San Diego；以及PCR策略，1995，(M.A.Znnis等編)，Academc press，San Diego；銷售商例如PerkinElmer(Norwalk，CT)，出售PCR反映試劑并出版PCR手冊(cè)。
自從最初核酸擴(kuò)增方法公布以來，各種以引物為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增方法包括(但并不僅限于這些)連接酶鏈反應(yīng)(LCR，Wuand Wallace，1989，基因?qū)W(Genomics)4560-569；Barany，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88189-193)；聚合酶、連接酶鏈反應(yīng)(Barany，1991，PCR方法和應(yīng)用、15-16)；間隙連接酶鏈反應(yīng)(PCT專利申請(qǐng)公布號(hào)WO90/01069)，修復(fù)鏈反應(yīng)(歐洲專利申請(qǐng)公布號(hào)439,182A2)，3SR(kwoh等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)861173-1177；Guatelli等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊USA871874-1878；PCT專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 92/0880A)。以及NASBA(美國(guó)專利號(hào)5,132,238)；Abramson和Myers，在1993當(dāng)前生物技術(shù)(Current Opinon in Biotechnology)4；41-47中概括了各種擴(kuò)增體系。
以引物為基礎(chǔ)的擴(kuò)增反應(yīng)特異性依賴于引物雜交的特異性，在高于常規(guī)擴(kuò)增的溫度下，引物只與延伸的目的序列雜交。但擴(kuò)增反應(yīng)混合物通常在室溫下制備，因此會(huì)降低引物雜交特異性所需要的溫度，在非嚴(yán)謹(jǐn)條件下，引物可能會(huì)非特異性的與只有部分互補(bǔ)的核酸序列結(jié)合，或與其他引物結(jié)合，并引發(fā)非目的延伸產(chǎn)物的合成而伴隨目的序列擴(kuò)增。非特異引物延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增可與目的序列擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)并顯著降低所需序列的擴(kuò)增效率。
常見的一種非特異擴(kuò)增產(chǎn)物類型是模板非依賴性擴(kuò)增反應(yīng)的人工產(chǎn)物，稱之為“引物二聚體”。引物二聚體是一雙鏈片段，長(zhǎng)度通常接近于兩個(gè)引物長(zhǎng)度的總和，一般發(fā)生于一個(gè)引物在另一個(gè)引物之上延伸時(shí)，產(chǎn)生的多聯(lián)體可作為非目的模板，由于該模板長(zhǎng)度比較短，因此能有效擴(kuò)增。
可以通過在反應(yīng)開始前減少引物延伸產(chǎn)物的形成來降低非特異擴(kuò)增。在一種稱為熱起動(dòng)法的方案中，從反應(yīng)混合物中去除一種或多種反應(yīng)物直到溫度升至足以產(chǎn)生特異雜交時(shí)。在該方法中，反應(yīng)混合物在反應(yīng)條件不能保證特異引物雜交期間不支持引物延伸。
在手工熱起動(dòng)方法中，由于反應(yīng)管在最初的高溫孵育后是打開的，以便加入缺失的反應(yīng)物，因此工作強(qiáng)度大而且增加反應(yīng)混合物污染的危險(xiǎn)。但可以用熱敏感物質(zhì)(例如，石蠟)隔離反應(yīng)成分。見美國(guó)專利號(hào)5,411,876及Chou等，1992，核酸研究(Nud.Acids.Res.)20(7)1717-1723。該方法中反應(yīng)前的高溫孵育可以融化熱敏感物質(zhì)，從而使反應(yīng)物得以混合。
另一種在反應(yīng)開始前降低引物延伸產(chǎn)物形成的方法是依據(jù)DNA聚合酶特異抗體對(duì)DNA聚合酶的熱可逆性阻滯作用，見美國(guó)專利號(hào)5,338,671。在制備反應(yīng)混合物之前將抗體和DNA聚合酶在緩沖液中室溫下孵育，以形成抗體-DNA聚合酶復(fù)合物?？贵w對(duì)DNA聚合酶活性的阻止作用可被反應(yīng)前孵育時(shí)的高溫失活。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是DNA聚合酶特異抗體的生產(chǎn)昂貴而費(fèi)時(shí)，特別是大劑量應(yīng)用時(shí)。而且反應(yīng)混合物中抗體的加入要求重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增反應(yīng)。
反應(yīng)開始前延伸產(chǎn)物的形成也可通過加入一種單鏈結(jié)合蛋白來抑制，該蛋白以熱可逆方式與引物非共價(jià)結(jié)合并防止雜交從而阻滯引物延伸。
非特異擴(kuò)增也可通過酶降解反應(yīng)開始前形成的延伸產(chǎn)物而降低，該法詳見美國(guó)專利號(hào)5,418,149。新合成延伸物的降解可通過脫氧尿苷三磷酸(dUTP)和軟膏(UNG)加入到反應(yīng)混合物中并在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)前45-60℃孵育反應(yīng)混合物的方法實(shí)現(xiàn)。引物延伸形成的含尿嘧啶的DNA在擴(kuò)增前用UNG降解。該方法的缺點(diǎn)是延伸產(chǎn)物的降解競(jìng)爭(zhēng)延伸產(chǎn)物的形成，而且非特異引物的消除可能會(huì)不完全。該方法的優(yōu)點(diǎn)是介入到反應(yīng)混合物中的含尿嘧啶的DNA作為前面反應(yīng)的污染劑也被降解，因此該方法也減少了由于前一反應(yīng)的擴(kuò)增核酸造成的PCR污染問題。
現(xiàn)有技術(shù)中的分子生物學(xué)和核酸生化技術(shù)可在本學(xué)科內(nèi)完全得到解釋，例如，Sambrook等，1989，分子克隆-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York；寡核苷酸合成(M.J.Gait編，1984)；核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higgins編，1984)；以及一系列酶學(xué)方法(AcademicPress，Inc.)。
本發(fā)明為體外核酸序列擴(kuò)增提供了共價(jià)修飾的寡核苷酸引物。應(yīng)用本發(fā)明的修飾引物可減少非特異擴(kuò)增，特別是引物二聚體的形成，和/或與非修飾引物的擴(kuò)增相比，同時(shí)增加目的片段的產(chǎn)量。
本發(fā)明一方面涉及一用于核酸序列擴(kuò)增的寡核苷酸引物，具有以下一般結(jié)構(gòu)
其中S1代表大約5和大約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之間的第一個(gè)核苷酸序列；其中S2代表1和3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之間的第二個(gè)序列；其中N代表一個(gè)含有嘌呤或嘧啶堿基的核苷酸，該堿基含有一環(huán)外胺；其中R代表一修飾物基團(tuán)，R通過環(huán)外胺與N共價(jià)結(jié)合，R具有以下結(jié)構(gòu)
其中R1、R2各自代表氫、C1-C10烷基、烷氧基、苯基、苯氧基、取代苯基、萘基或取代萘基。烷基可以是支鏈或非支鏈。
優(yōu)選實(shí)施方案中，N是一修飾的常規(guī)核苷酸，比如N為修飾后的腺苷、胞苷或鳥苷，修飾成分與腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶堿基的環(huán)外胺共價(jià)結(jié)合，N更優(yōu)選為修飾的腺苷。
優(yōu)選實(shí)施方案中，R為2-萘甲基，芐基、或取代芐基。優(yōu)選取代的芐基具有如下結(jié)構(gòu)
其中R3代表一C1-C6支鏈或直鏈烷基，更優(yōu)選C1-C4支鏈或直鏈烷基、甲氧基或硝基，R3優(yōu)選對(duì)位連接。
更優(yōu)選實(shí)施方案中，R為芐基、對(duì)一甲基芐基、對(duì)叔丁基芐基、對(duì)甲氧芐基、或2-萘甲基。
本發(fā)明另一方面涉及由光敏共價(jià)結(jié)合的修飾基團(tuán)修飾的擴(kuò)增引物，該修飾基團(tuán)會(huì)部分或全部阻滯引物延伸。該光敏修飾物可以結(jié)合環(huán)外胺(如在前述修飾的核苷酸中的)也可結(jié)合環(huán)氮。在一實(shí)施方案中，至少有一個(gè)硝基芐基結(jié)合到3′末端核苷酸的腺嘌呤、鳥嘌呤、或胞嘧啶堿基的環(huán)外胺。
本發(fā)明另一方面涉及一對(duì)或一系列引物，其中至少有一個(gè)引物按上面所述修飾過。優(yōu)選實(shí)施方案中，一對(duì)或全部的一系列引物都被修飾。
本發(fā)明另一方面涉及擴(kuò)增核酸的方法，包括用本發(fā)明的修飾引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及擴(kuò)增目的核酸的方法，包括用本發(fā)明的光敏修飾引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中反應(yīng)混合物用光照射，該光應(yīng)足以消除修飾基團(tuán)并形成引物延伸產(chǎn)物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，照射在擴(kuò)增反應(yīng)開始前，反應(yīng)混合物被加熱到高于50℃后，作為獨(dú)立的一步進(jìn)行。另一實(shí)施方案中，照射是伴隨擴(kuò)增過程的初始階段一起進(jìn)行的，例如，伴隨RNA擴(kuò)增反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄階段，或DNA擴(kuò)增反應(yīng)的初始變性階段。
本發(fā)明另一方面涉及核苷酸序列體外擴(kuò)增的試劑盒，其中包含一對(duì)引物，該引物中至少有一個(gè)是按本文所述修飾過的。本發(fā)明的試劑盒也包含一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)物，例如核酸聚合酶或連接酶、核苷三磷酸酶、以及適當(dāng)?shù)木彌_液。
附圖概述

圖1顯示用芐基化的引物進(jìn)行HIV-1RNA擴(kuò)增的結(jié)果，如實(shí)施例5所述。
圖2顯示用芐基化的引物進(jìn)行HCVRNA擴(kuò)增的結(jié)果，如實(shí)施例6所述。
圖3顯示用分別用三種修飾基團(tuán)之一修飾后的引物進(jìn)行HCV RNA擴(kuò)增的結(jié)果，如實(shí)施例7所述。
圖4顯示用光敏修飾后引物進(jìn)行HCV RNA擴(kuò)增的結(jié)果，如實(shí)施例8所述。
圖5顯示用芐基修飾的引物和用對(duì)叔丁基芐基修飾的引物擴(kuò)增分枝桿菌DNA的結(jié)果，如實(shí)施例10所述。
圖6顯示適用于芐基或取代芐基修飾的脫氧腺苷(dA)可控孔度玻璃(CPG)合成的常用反應(yīng)體系。
為幫助理解本發(fā)明，對(duì)有關(guān)術(shù)語定義如下“核酸”、“寡核苷酸”指的是多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)及其它類型的多核苷酸嘌呤或嘧啶堿基的N糖甙或修飾后的嘌呤或嘧啶堿基的N糖基。“核酸”和“寡核苷酸”之間沒有長(zhǎng)度上的區(qū)別，可以互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可以包括雙股、單股DNA以及雙股、單股RNA。
“常規(guī)的”在表示核酸堿基、核苷或核苷酸時(shí)是指所述的多核苷酸中自然產(chǎn)生的那些。四種常規(guī)的(即主要的)構(gòu)成DNA的脫氧核糖核苷酸包括嘌呤堿基(腺嘌呤和鳥嘌呤)和嘧啶堿基(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。四種常規(guī)的RNA核糖核苷酸包括嘌呤堿基(腺嘌呤和鳥嘌呤)及嘧啶堿基(胞嘧啶和尿嘧啶)。除了上述常規(guī)的或通用的堿基，一些其它的嘌呤和嘧啶衍生物(稱為稀有或少數(shù)堿基)也少量出現(xiàn)于某些核酸中。在本文中“非常規(guī)的”表示核酸堿基、核苷或核苷酸時(shí)是指稀有或少數(shù)核酸堿基、核苷或核苷酸以及常規(guī)堿基、核苷或核苷酸的修飾物、衍生物或類似物，也包括含有修飾堿基成份和/或修飾糖成份的合成的核苷酸(見寡核苷酸綴合物方案，分子生物學(xué)方法，26卷(SudhirAgrawal編，Humana Press，Totowa，NJ，(1994))；寡核苷酸和類似物，實(shí)施方法(Fritz Eckstrin編，IRL Press，牛津大學(xué)出版，Oxford)。
寡核苷酸可用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?，如克隆并限制適當(dāng)序列以及直接化學(xué)合成，例如應(yīng)用Narang等的磷酸三酯法，1979，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)6890-99。Brown等的磷酸二酯法1979酶學(xué)方法，(Meth.Enzymol.)68109-151；Beaucage等的二乙基磷酸酰胺法，1981，四面體通訊(TetrahedonLett.)221859-1862；美國(guó)專利號(hào)4,458,066的固相載體法。這些合成方法在goodchild，1990，生物結(jié)合化學(xué)(Bioconjugate Chemistry)1(3)165-187中有綜述。
“堿基配對(duì)”，本領(lǐng)域中稱為“Waston-crick堿基配對(duì)”，是指眾所周知的在雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中堿基對(duì)腺嘌呤-胸腺嘧啶和鳥嘌呤-胞嘧啶之間，以及RNA/DNA雜合分子中的腺嘌呤-鳥嘧啶和鳥嘌呤-胞嘧啶，之間互補(bǔ)的氫鍵成鍵，以及非常規(guī)核苷酸對(duì)之間的類似結(jié)合。
“雜交”指的是應(yīng)用兩個(gè)單鏈核酸通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交可發(fā)生于完全互補(bǔ)的核酸鏈間或存在少量錯(cuò)配區(qū)的“基本上互補(bǔ)的”核酸鏈間。只能在完全互補(bǔ)核酸鏈間發(fā)生雜交的條件稱為“嚴(yán)格雜交條件”或“序列特異雜交條件”?；净パa(bǔ)序列的穩(wěn)定雙螺旋體可在非嚴(yán)格雜交條件下獲得。耐受的錯(cuò)配程度可通過適當(dāng)調(diào)節(jié)雜交條件控制。核酸領(lǐng)域的技術(shù)人員通過考慮一些變量能憑經(jīng)驗(yàn)可以確定雙螺旋的穩(wěn)定性。這些變量包括寡核苷酸的長(zhǎng)度和堿基對(duì)的濃度、離子強(qiáng)度、堿基對(duì)錯(cuò)配率。可以按技術(shù)指南(Sambook 1989，分子克隆-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)Cold Spring Harbor，New York；Wetmur，1991，生物化學(xué)和分子生物學(xué)評(píng)論26(3/4)227-259)進(jìn)行。
“引物”指的是在誘導(dǎo)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物條件下，在4種不同的核苷三磷酸和延伸試劑(例如DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)及適宜緩沖液和適宜溫度下，能作為DNA合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸。本文中的“引物”包括用于連接介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)中的寡核苷酸，此反應(yīng)過程中一個(gè)寡核苷酸通過與在相鄰位置雜交的第二個(gè)寡核苷酸連接而“延伸”。因此本文中的“引物延伸”是指應(yīng)用作為DNA合成起始點(diǎn)的引物進(jìn)行的單個(gè)核苷三磷酸的聚合反應(yīng)，也指兩個(gè)引物形成一個(gè)延伸產(chǎn)物的連接反應(yīng)。
引物優(yōu)選單鏈的DNA。引物的適宜長(zhǎng)度取決于該引物所要求的用途，一般在6-50個(gè)核苷酸之間。短的引物分子一般要求較低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不需要反應(yīng)模板核酸的準(zhǔn)確序列，但必須與模板充分互補(bǔ)雜交。用于擴(kuò)增給定目的序列的適宜引物設(shè)計(jì)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，可參考本文文獻(xiàn)。
引物可以為檢測(cè)或固定而添加一些特征，但不能改變引物的基本特征即作為DNA合成起始點(diǎn)。例如引物可以在5末端增加一核酸序列，它不與目的核酸雜交，但有助于克隆擴(kuò)增產(chǎn)物。引物與模板充分互補(bǔ)雜交的區(qū)域在本文中稱為雜交區(qū)域。
“目的序列”、“目的區(qū)域”、及“目的核酸”指的是用于擴(kuò)增的核酸區(qū)域或序列。
按本文所指，如果引物序列與目的序列之間的錯(cuò)配數(shù)少于引物序列與樣品中存在的非目的序列間的錯(cuò)配數(shù)，則該引物對(duì)于目的序列來說就是“特異的”。只有當(dāng)錯(cuò)配數(shù)不超過引物與目的序列間的錯(cuò)配數(shù)時(shí)才能選擇形成穩(wěn)定雙鏈的雜交條件。在該條件下目的特異引物只與目的序列形成穩(wěn)定雙鏈。因此在穩(wěn)定嚴(yán)格擴(kuò)增條件下應(yīng)用目的特異性引物能特異擴(kuò)增含有目的引物結(jié)合位點(diǎn)的序列。應(yīng)用序列特異擴(kuò)增條件能特異擴(kuò)增那些含有精確互補(bǔ)引物結(jié)合位點(diǎn)的目的序列。
“非特異擴(kuò)增”是指由于引物與非目的序列雜交并作為引物延伸底物而產(chǎn)生的該非目的序列的核酸擴(kuò)增。引物與非目的序列的雜交稱為“非特異雜交”，可發(fā)生于溫度較低、低嚴(yán)格性和預(yù)擴(kuò)增條件下。
“引物二聚體”指模板非依賴性的來自引物在另一引物作為模板時(shí)延伸產(chǎn)生的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。盡管引物二聚體經(jīng)常是兩個(gè)引物的串聯(lián)體，即一種二聚體，但也可能出現(xiàn)超過兩個(gè)引物的串聯(lián)體?！耙锒垠w”在本文中一般包括模板非依賴性的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
“反應(yīng)混合物”指的是含有進(jìn)行一種給定反應(yīng)所必須試劑的溶液?！皵U(kuò)增反應(yīng)混合物”是指進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所必須試劑的溶液，一般含有寡核苷酸引物和DNA聚合酶或適宜緩沖液中的連接酶。“PCR反應(yīng)混合物”一般含有寡核苷酸引物、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、脫氧三磷酸核苷(dNTPS)、和適宜緩沖液中的二價(jià)金屬陽離子。若反應(yīng)混合物含有進(jìn)行反應(yīng)所必須的全部試劑則為完全的，若只含有一部分試劑則為不完全混合物。熟悉本科學(xué)領(lǐng)域的人都明白，反應(yīng)成份常規(guī)單獨(dú)保存，各含有一種成份，以利于方便、穩(wěn)定儲(chǔ)存或便于調(diào)節(jié)所用化合物濃度；也知道在反應(yīng)之前合并各反應(yīng)物以形成完全反應(yīng)混合物。而且反應(yīng)物單獨(dú)包裝出售，適用的商品試劑盒含有包括本發(fā)明修飾引物在內(nèi)的任何一種反應(yīng)組分。修飾的引物本發(fā)明的擴(kuò)增引物是通過在引物3’末端的四種核苷酸中的一種上共價(jià)結(jié)合一基團(tuán)進(jìn)行修飾的。實(shí)施方案中本發(fā)明的修飾引物包括具有以下一般結(jié)構(gòu)的核酸序列
其中S1代表大約5和大約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之間的第一個(gè)核苷酸序列；S2代表1和3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之間的第二個(gè)序列；
N代表一個(gè)含有嘌呤或嘧啶堿基的核苷酸，該堿基含有一環(huán)外胺。
R代表一修飾劑基團(tuán)，R通過環(huán)外胺與N共價(jià)結(jié)合，R如下述結(jié)構(gòu)。
按實(shí)施例所示，當(dāng)修飾發(fā)生在3’末端核苷酸上時(shí)修飾效率最大，因此引物優(yōu)選包含修飾的3’末端核苷酸。
修飾的核苷酸選自那些堿基中含有環(huán)外胺的，環(huán)外胺通過其互補(bǔ)核苷酸而進(jìn)入核苷酸堿基配對(duì)中。引物一般是只含常規(guī)核苷酸的DNA。DNA中常規(guī)核苷酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶含有一環(huán)外伯胺，其通過互補(bǔ)堿基進(jìn)入堿基配對(duì)。本發(fā)明的優(yōu)選的一方面在于引物的修飾是通過將單個(gè)的修飾基團(tuán)結(jié)合到環(huán)外胺上代替胺基中的兩個(gè)氫之一(其在未修飾的堿基中能進(jìn)入堿基配對(duì))而實(shí)現(xiàn)的。修飾核苷酸的結(jié)構(gòu)中分別含有一修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶堿基，如下所示
其中S代表糖成份，R代表修飾基團(tuán)。
本發(fā)明不局限于常規(guī)核苷酸構(gòu)成的引物，任何堿基成份中與互補(bǔ)堿基配對(duì)的含有環(huán)外伯胺的核苷酸類似物都可按本文所示修飾。非常規(guī)核苷酸的例子包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、3-甲基鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶以及5-羥甲基胞嘧啶。
由于修飾物取代了一個(gè)氫原子使修飾基團(tuán)限制了修飾堿基形成氫鍵的能力。剩余的氫原子仍能參與氫鍵形成。修飾物因此影響了雜交的動(dòng)力學(xué)和熱動(dòng)力學(xué)。各種預(yù)計(jì)的修飾基團(tuán)具有如下特性1、干擾但不阻滯修飾的堿基與互補(bǔ)的堿基的Waston-Crick堿基配對(duì)；2、干擾但不阻滯修飾引物的延伸；3、允許與修飾引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的單股DNA的合成。
修飾基團(tuán)在空間上干擾堿基配對(duì)從而干擾引物延伸，因此修飾物的體積影響干擾雜交的程度。當(dāng)修飾的腺嘌呤或胞嘧啶核苷酸構(gòu)成雙股核酸時(shí)，修飾基團(tuán)會(huì)插入到大溝的中間區(qū)，因此即使相當(dāng)大的修飾基團(tuán)也幾乎不會(huì)造成雙螺旋結(jié)構(gòu)的空間紊亂，但適宜的修飾物不能太大以致阻滯氫鍵形成或阻滯引物3’-羥基的酶促延伸。當(dāng)修飾的鳥嘌呤核苷酸進(jìn)入雙股核酸時(shí)，修飾基團(tuán)會(huì)插入到小溝中，該小溝只能為應(yīng)順修飾基團(tuán)提供較小的空間，因此優(yōu)選較小的修飾基團(tuán)結(jié)合鳥嘌呤堿基。
作為下一擴(kuò)增循環(huán)模板的引物延伸產(chǎn)物含有來自引物的修飾堿基，選擇該修飾堿基要使模板中修飾堿基的存在不會(huì)終止引物延伸或抑制引物延伸。修飾堿基的性質(zhì)不能提高突變的發(fā)生，否則修飾堿基本身會(huì)在引物產(chǎn)生的模板復(fù)制中丟失。模板中修飾堿基對(duì)引物延伸的影響可用現(xiàn)有技術(shù)指南檢測(cè)到(例如Gniazdowski和Cera，1996，化學(xué)雜志(Chem.Rev.)96619-634)。
滿足上述特性的修飾基團(tuán)R適用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選具有以下結(jié)構(gòu)的修飾基團(tuán)
其中R1、R2各自代表氫、C1-C10烷基、苯基、取代苯基、萘基或取代萘基，烷基可以是支鏈或直鏈，也可使用大于C20的烷基。
優(yōu)選實(shí)施方案中R為2-萘甲基、芐基或取代芐基，優(yōu)選的取代芐基具有如下結(jié)構(gòu)
其中R3代表一C1-C6支鏈或直鏈烷基團(tuán)，更優(yōu)選C1-C4支鏈或直鏈烷基，甲氧基、硝基。C1-C4支鏈或直鏈烷基為甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丙烷、異丁烷等。甲烷和對(duì)丁烷為優(yōu)選烷基，R3優(yōu)選對(duì)位。特別優(yōu)選的修飾基團(tuán)R如下所示
一些特殊的修飾基團(tuán)可見實(shí)施例。一般來說，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以按本文提供指南從一類化合物中憑經(jīng)驗(yàn)選擇適宜的修飾基團(tuán)。特殊基團(tuán)的適宜性最好通過在擴(kuò)增反應(yīng)中應(yīng)用修飾引物來確定。成功的擴(kuò)增表明修飾堿基不會(huì)完全阻止引物延伸，而且引物衍生模板中的修飾堿基也不會(huì)終止引物延伸。引物二聚體的減少可按實(shí)施例中所述確定。光敏修飾的引物本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，引物用一個(gè)或多個(gè)光敏基因修飾，該光敏基因可以在反應(yīng)達(dá)到確保特異性的高溫反應(yīng)條件后通過光照去除。因?yàn)樵撔揎椢镌谝镅由熘叭コ?，修飾的引物在修飾基團(tuán)去除前不需要有延伸性?？捎糜诒景l(fā)明方法中的光敏修飾物的例子，見Pillai，1980，＂有機(jī)合成中的光消除性保護(hù)基團(tuán)＂，合成1-26。
本發(fā)明的光敏引物修飾優(yōu)選在3′末端核苷酸上加上一個(gè)或兩個(gè)鄰硝基芐基團(tuán)
通過在堿基成分的環(huán)外的伯胺上加上單個(gè)硝基芐基而修飾的引物，如果胺基能旋轉(zhuǎn)以使保留的氫朝向互補(bǔ)堿基，則形成的仲胺仍能參與堿基配對(duì)。如實(shí)施例中所述，這些引物可用于伴或不伴紫外光照清除的擴(kuò)增。
用兩個(gè)硝基芐基結(jié)合堿基的環(huán)外胺而修飾的引物不能延伸。這種抑制作用可能是由于修飾的堿基在進(jìn)行堿基配對(duì)時(shí)因環(huán)外胺的兩個(gè)氫被大體積的硝基芐基取代而失活。用兩個(gè)硝基芐基修飾的引物在擴(kuò)增中的應(yīng)用見實(shí)施例，在該擴(kuò)增中反應(yīng)混合物需暴露于紫外線下一段時(shí)間以充分去除硝基芐基，從而產(chǎn)生引物延伸。
在另一實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)結(jié)合到環(huán)氮上。將一個(gè)硝基芐基結(jié)合到堿基的環(huán)氮上修飾的引物，由于修飾堿基進(jìn)行堿基配對(duì)時(shí)失活而不能延伸。通過紫外線照射去除硝基芐基可以使引物延伸。
應(yīng)用去除修飾基因才能延伸的光敏引物可以進(jìn)行熱起動(dòng)擴(kuò)增。引物延伸在反應(yīng)前非特異條件下被抑制，只有當(dāng)反應(yīng)溫度升至能確保反應(yīng)特異性后，照射反應(yīng)物使引物解除抑制。修飾引物的合成修飾引物的合成是用現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法進(jìn)行的。修飾物引入的方法分4種1.通過應(yīng)用修飾的核苷作為DNA合成的支持體而引入該修飾物。
2.通過應(yīng)用修飾的核苷作為亞磷酰胺引入修飾物。
3.通過應(yīng)用DNA合成過程中的試劑引入修飾物。(例如加到DNA序列中的用芐基胺處理可轉(zhuǎn)化的亞酰胺鹽)4.合成后修飾。修飾物可以在與合成的DNA接觸時(shí)作為反應(yīng)試劑引入。
特殊修飾引物的合成見實(shí)施例。其它的修飾引物可按類似方式用標(biāo)準(zhǔn)方法合成。
修飾引物優(yōu)選用衍生的可控孔度玻璃(CPG)載體來合成。合成衍生的dACPG的常規(guī)反應(yīng)方案見圖6。特殊的修飾基團(tuán)可通過應(yīng)用適當(dāng)?shù)耐榛u化物、芐基鹵化物、取代的芐基鹵化物、萘甲基鹵化物或取代的萘甲基鹵化物等烷基化劑加入。芐基和對(duì)叔丁基芐基dACPG的合成見實(shí)施例1和2，按圖6的方案進(jìn)行。
環(huán)外氨基的烷化可用類似甲基化的方式進(jìn)行。見Grittin和Reese，1963，生物化學(xué)雜志(Biochim.Acta)68185-192。其它的合成方法見Aritoma等，1995，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.11837-1849.用修飾的引物擴(kuò)增本發(fā)明的方法包括應(yīng)用本發(fā)明的修飾引物進(jìn)行以引物為基礎(chǔ)的擴(kuò)增。修飾引物一般可以取代含有相同核苷酸序列的未修飾引物，而不需改變擴(kuò)增反應(yīng)條件。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到反應(yīng)條件略作調(diào)整對(duì)某些反應(yīng)有利。
優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾引物用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。但本發(fā)明不限于任何具體的擴(kuò)增體系。本發(fā)明的修飾引物可用于任何以引物為基礎(chǔ)的形成引物二聚體或非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增體系。實(shí)施例中包括了上述文獻(xiàn)中的擴(kuò)增方法。如同其它體系的發(fā)展，這些體系也會(huì)通過實(shí)施本發(fā)明受益。
本發(fā)明的方法適用于DNA和RNA的擴(kuò)增。例如現(xiàn)有技術(shù)中，用反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行RNA擴(kuò)增，見美國(guó)專利號(hào)5,322,770和5,310,652,Myers和Gelfand，1991，生物化學(xué)(Biochemistry)30(31)7661-7666；Young等，1993，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300。
以引物為基礎(chǔ)的擴(kuò)增中，引物延伸通常是在高溫度下用耐熱酶(例如用耐熱DNA聚合酶)進(jìn)行的。酶首先在引物的3′末端啟動(dòng)合成并向模板的5′末端方向前進(jìn)直到合成終止。用于擴(kuò)增反應(yīng)的純的熱穩(wěn)定DNA聚合酶在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的；包括(但不限于)美國(guó)專利號(hào)4,889,818；5,079,352；5,325,600；5,491,086；W091/09950；WO92/03556；W092/06200；W092/06202；W092/09689；以及美國(guó)專利號(hào)5,210,036中提及的那些酶。對(duì)熱穩(wěn)定DNA聚合酶的評(píng)述見Abramson，1995，PCR策略(M.A.Znnis等編)，39-57頁，AcademicPress，SanDiego。
優(yōu)選實(shí)施方案中(特別針對(duì)DNA擴(kuò)增)，應(yīng)用一可逆失活酶進(jìn)行擴(kuò)增，該可逆失活酶在高溫反應(yīng)條件下能復(fù)活，它的應(yīng)用通過抑制反應(yīng)開始前的引物延伸而進(jìn)一步降低了非特異擴(kuò)增?？赡媸Щ畹臒岱€(wěn)定DNA聚合酶由Hoffmann-La Roche(Nutley，NJ)開發(fā)制造，PerkinElmer(Norwalk，CT)銷售，見Birch等，1996，自然(Nature)381(6581)445-446。
修飾基團(tuán)對(duì)酶延伸引物能力的影響，部分地取決于所用的具體的酶，而部分取決于選擇的反應(yīng)條件。例如用TthDNA聚合酶在某些RNA擴(kuò)增中，用Mn2+作二階陽離子比Mg2+好。現(xiàn)有技術(shù)表明常規(guī)選擇適宜修飾基團(tuán)時(shí)要考慮酶和反應(yīng)條件。
用于擴(kuò)增反應(yīng)的樣品制備方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，在本文所引文獻(xiàn)中有詳細(xì)說明，特殊方法的應(yīng)用不是本發(fā)明的關(guān)鍵，本專業(yè)人員能按已知的樣品制備方法優(yōu)化反應(yīng)條件。
分析擴(kuò)增核酸的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，在本文文獻(xiàn)中有詳細(xì)敘述。特殊方法的應(yīng)用不是本發(fā)明的關(guān)鍵，可按應(yīng)用來選擇適宜的分析方法。
分析擴(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)選方法是通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物中雙鏈DNA總量的增加來分析，見Higuchi等，1992，生物/技術(shù)(Bio/Technology)10413-417；Higuchi等，1993，Bio/Technologyl11026-1030；歐洲專利公布號(hào)512,334和640,828。該方法本文中稱為＂動(dòng)力PCR＂.雙鏈DNA的檢測(cè)依賴于當(dāng)溴化乙錠(EtBr)和其它DNA結(jié)合標(biāo)記與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)增加的熒光度。擴(kuò)增在標(biāo)記物存在下進(jìn)行。由目的序列合成而增加的雙鏈DNA會(huì)使擴(kuò)增過程中檢測(cè)的熒光度增加。因此，該方法能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。
在動(dòng)力PCR中，測(cè)得的熒光度依賴于雙鏈DNA存在的總量，不管雙鏈DNA是來自非特異擴(kuò)增還是來自目的片段的擴(kuò)增。監(jiān)測(cè)熒光度能測(cè)量雙鏈DNA總量的增加，但測(cè)量目的序列擴(kuò)增的增加不能與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的增加分開。本發(fā)明的修飾引物特別適用于動(dòng)力PCR，因?yàn)檫@些引物不僅降低了形成引物二聚體的數(shù)量，也延緩了可檢測(cè)量的引物二聚體的形成。使引物二聚體的形成延緩到目的序列顯著增加后才發(fā)生，從而能獨(dú)立監(jiān)測(cè)目的序列擴(kuò)增的情況，并減少引物二聚體的干擾。試劑盒本發(fā)明也涉及試劑盒，即實(shí)施本方法所需化合物的多包裝單位。試劑盒包括用于核酸擴(kuò)增的引物(至少一個(gè)引物是如本文所述修飾過的)。其它可選成分包括催化引物延伸產(chǎn)物合成的試劑、底物三磷酸核苷、適宜的反應(yīng)緩沖液、以及實(shí)施本方法的有關(guān)說明。
本發(fā)明的以下這些實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明，而不是要限制本發(fā)明的范圍。本專業(yè)的普通技術(shù)人員從上面的說明書內(nèi)容和以下的實(shí)施例將會(huì)清楚地了解本申請(qǐng)權(quán)利要求范圍之內(nèi)的本發(fā)明許多實(shí)施方案。
實(shí)施例1芐基修飾引物的合成用下述兩種方法之一合成了由芐基修飾的引物。在3′末端堿基上修飾的引物是采用N6-芐基脫氧腺苷的可控孔度玻璃(CPG)載體來引發(fā)DNA而合成的。合成在內(nèi)堿基上修飾的引物是用一種N6-芐基脫氧腺苷亞磷酰胺。
在該實(shí)施例中使用以下標(biāo)準(zhǔn)的縮略語DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲酰胺TEA 三乙胺EDC 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，鹽酸化物THF 四氫呋喃DMT 4，4′-甲氧三苯甲基LCAA-CPG 長(zhǎng)鏈烷基氨基可控孔度玻璃I.N6-芐基脫氧腺苷CPG的合成步驟1合成N6-芐氧基，N6-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷在N6-芐氧基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)2′-脫氧腺苷(657mg，1.0mmol；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)中加吡啶(10ml)，并將該混合物真空蒸發(fā)干燥。重復(fù)此過程。將所得泡沫溶于無水DMF(15ml；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，冷卻至5℃。在氬氣氛下加氫化鈉(44mg，1.1mmol，1.1當(dāng)量60％的油分散液)，并在室溫下攪拌45分鐘。加芐基溴化物2分鐘(143μl，206mg，1.2mmol.1.2當(dāng)量；Aldrich ChemicalCO.，Milwaukee，WI)并在室溫下將該混合物攪拌過夜。真空蒸發(fā)干燥后的殘留物在乙酸乙酯和水(每次10ml)中分配和萃取。水相再用乙酸乙酯(10ml)萃取，將此合并的萃取物經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾和蒸發(fā)。粗產(chǎn)物通過柱色譜用甲醇∶三乙胺∶二氯甲烷(3∶0.5∶96.5)在硅膠上提純。將含產(chǎn)物的餾份合并并蒸于，得到所需的N6-芐氧基，N6-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷(410mg，54％)。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)用NMR鑒定。
步驟2琥珀?；蛟揘6-芐氧基，N6-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷(295mg，0.39mmol)加10ml吡啶并將該混合物在高真空下蒸干。重復(fù)這個(gè)步驟。將新的無水吡啶(10ml)與琥珀酸酐(200mg，2mmol，5.0當(dāng)量)和DMAP(24mg)加在一起，并在室溫下將該溶液在氬氣氛下攪拌過夜。真空下除去大部分溶劑之后的殘留物在二氯甲烷(20ml)和檸檬酸鈉溶液(20ml，0.1M，pH 5.0)中分配并萃取。水相再用二氯甲烷(20ml)萃取，合并的萃取物用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸干。產(chǎn)物通過柱色譜用乙酸乙酯、三乙胺、二氯甲烷(32∶1∶67)在硅膠上提純，得到所需的3′-琥珀酸酯，N6-芐氧基-N6-芐基-3′-O-琥珀酸-5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷(247mg，74％)。
步驟3CPG的衍生酸洗的CPG制備如下。將LCAA-CPG(1.0g，LCA 00500C，500A，88.6(mol/g)；CPG Inc.，F(xiàn)arifield，NJ)用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液(2％，20ml)在室溫下通過20分鐘的周期性回蕩進(jìn)行洗滌。將該酸洗過的CPG在玻璃料上過濾之后用二氯甲烷洗至無酸為止。所得粉末經(jīng)空氣干燥之后在室溫下真空干燥過夜。
修飾的核苷中間體與酸洗過的CPG之間進(jìn)行偶聯(lián)的方法如下。向上面制備的N6-芐氧基-N6-芐基-3′-O-琥珀酸-5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷(170mg，0.2mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入TEA(100μl)，將該溶液濃縮(在氬氣下)至大約5ml。依次加入DMAP(12mg，0.1mmol，0.5當(dāng)量)，TEA(100μl)，EDL(384mg，2.0mmol，10當(dāng)量)， 以及以上得到的酸洗過的CPG。加入無水吡啶并將該混合物密封以及在室溫下?lián)u3天之后，真空下濾出CPG，用異丙醇充分洗滌，然后再用二氯甲烷洗，空氣干燥后再真空干燥1小時(shí)。
衍生的CPG按以下方法封端。向干燥的衍生CPG中加入端A和端B溶液(每種5ml，乙酸酐/2，6-二甲基吡啶/THF以及10％N-甲基咪唑的THF溶液；Glen Research DNA合成試劑，Sterling，VA)并在室溫下?lián)u該混合物4小時(shí)。真空下濾出CPG，用異丙醇充分洗滌，然后用二氯甲烷洗，空氣干燥，再在真空下干燥過夜。II.N6-芐基脫氧腺苷亞磷酰胺的合成N6-芐氧基，N6-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷按以下方法合成。
在N6-芐氧基，N6-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧腺苷(196mg，0.26mmol)的無水THF(8ml)中加二異丙基乙胺(350μl，270mg，2.04mmol，7.8equiv.)和2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰氯(16lmg，0.68mmol，2.6當(dāng)量；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，將該混合物在室溫和氬氣氛下攪拌30分鐘。真空除去溶劑，殘留物在碳酸氫鈉溶液(5％，20ml)和乙酸乙酯(20ml)之間分配。有機(jī)相依次用碳酸氫鹽、水、和飽和鹽水(每種20ml)洗滌，用硫酸鎂干燥、過濾、以及蒸發(fā)。殘留物通過硅膠柱色譜法用丙酮/乙烷/TEA(34∶65∶0.7)提純，得到所需的亞磷酰胺(248mg，100％)。III.DNA合成、純化、以及分析將該芐基衍生的腺苷CPG(25mg，1.0mol)移至空的合成柱(Glen Research，Sterling，VA)，用這些衍生物在一個(gè)ABI 274 DNA合成器中按常用的合成方法和去保護(hù)條件來制成寡核苷酸。該合成器的生產(chǎn)商為Perkin Elmer，AppliedBiosystems Division，F(xiàn)oster City，CA。純化此粗的DMT-DNA并轉(zhuǎn)化成5′-羥基-DNA。該轉(zhuǎn)化是通過標(biāo)準(zhǔn)的DMT斷斷續(xù)續(xù)的HPLC法在-個(gè)RaininHPLC系統(tǒng)(Rainin Instrument Co，Wobum，MA)的Rainin Pure-DNA柱中進(jìn)行。用ABI毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Perkin Elmer，Applied Biosystems Division，F(xiàn)osterCity，CA)或用變性陰離子交換HPLC色譜法在Dionex Nudeopak柱(DionexCorp，Sunnyvale，CA)上對(duì)寡核苷酸作分析。
同樣，內(nèi)修飾的引物也用一種未修飾的CPG和如上合成的修飾過的亞磷酰胺來合成。
實(shí)施例2叔丁基芐基修飾引物的合成本實(shí)施例描述的是用對(duì)-叔丁基芐基在3′端腺苷上修飾的引物的合成方法。該修飾的引物基本上按實(shí)施例1的方法合成，但用的是N6-(對(duì)-叔-丁基芐基)脫氧腺苷CPG。該衍生的CPG合成方法如下。
步驟1合成N6-芐氧基-N6-(對(duì)-叔-丁基芐基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷將DMF(無水，10ml)加到N6-芐氧基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷(685mg，1.0mmol)中，蒸干。重復(fù)此過程。在氬氣下加新的DMF(10ml)。加氫化鈉(44mg，60％油溶液，1.1mmole)，混合物在室溫下攪拌0.5小時(shí)。滴加4-(叔-丁基)芐基溴(272mg，1.2mmole)并在室溫下攪拌過夜。真空除去溶劑，殘留物在乙酸乙酯和水(各20ml)之間分配。有機(jī)相用水洗(3次，20ml)，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干。粗產(chǎn)物通過硅膠酸(100g)柱色譜法用＝氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(96.5∶3∶0.5)提純，得到N6-芐氧基-N6-(p-叔-丁基芐基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷，(229mg，28.5％)。
步驟2琥珀?；苗晁狒?135mg，5當(dāng)量)和DMAP(17mg，0.5當(dāng)量)在吡啶(10ml)中的溶液來處理N6-芐氧基-N6-(對(duì)-叔-丁基芐基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷(127mg，0.27mmol)。按上述實(shí)施例1方法操作和色譜純化，得到N6-芐氧基-N6-(對(duì)-叔丁基芐基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷，3′-O-琥珀酸(199mg，82％)。
步驟3CPG的衍生上述第2步得到的琥珀酸(180mg，0.2mmol)用實(shí)施例1所述酸洗的LCAA-CPG處理。封端該CPG，真空干燥得到N6-芐氧基-N6-(對(duì)-叔-丁基芐基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷，3′-O-琥珀酸衍生的CPG，(1.065g)。
實(shí)施例3甲基修飾引物的合成用甲基在3′端腺苷上修飾的引物是用N6-甲基脫氧腺苷(dA)CPG(22mg，1μmole，Glen Research，Sterling VA)合成的。將N6-甲基脫氧腺苷CPG放在一個(gè)空的合成柱中，按標(biāo)準(zhǔn)的合成和去保護(hù)條件制得引物。該引物用實(shí)施例1所述的DMT斷斷續(xù)續(xù)的HPLC方法提純。
實(shí)施例4合成光敏的修飾引物本實(shí)施例描述用一個(gè)或兩個(gè)硝基芐基在3′端腺苷上修飾引物的合成方法。該修飾的引物基本上按實(shí)施例1所述的方法來合成，但用的是一種單硝基芐基dACPG或一種雙硝基芐基dACPG。I單硝基芐基化的引物合成N6-芐氧基-N6-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷衍生的CPG，一般應(yīng)用合成N6-芐氧基-N6-芐基-2′-脫氧腺苷衍生的CPG(實(shí)施例1)所用的方法，其中用鄰位硝基芐基溴作為烷基化試劑。用于該CPG的后面一些步驟與實(shí)施例1所述的相同，另外需要將中間體放在用鋁箔包起來的反應(yīng)燒并中來蔽光。
衍生的CPG合成之后，引物的合成如實(shí)施例1所述，但分離的方法是采用Nensorb Prep的一次性應(yīng)用柱(NEN Research Products BiotechnologgSystems，Du Pont Co，Boston MA)，該廠商有使用方法的說明。II.雙硝基芐基化的引物按以下所述的方法合成雙硝基芐基脫氧腺苷CPG。衍生的CPG合成之后接著合成和純化該引物的方法如同單硝基芐基引物所用的方法。
步驟1合成5′-O-DMT-N6-雙-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷將2′-脫氧腺苷單水合物(538mg，2.0mmol，Aldrich Chemical，Milwaukee，WI)用無水吡啶(2次，10ml)在真空下蒸干。殘留物溶于氬氣保護(hù)下的無水DMF(10ml，Aldrich，Milwaukee，Wl)，加氫化鈉(88mg，2.2mmol，1.1.當(dāng)量，60％的油分散液)，并在室溫下攪拌40分鐘。加2-硝基芐溴(710mg，3.3mmol，1.5當(dāng)量)并將此溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。真空蒸去DMF，殘留物在乙酸乙酯與水(各20ml)之間分配。水相用乙酸乙酯(20ml)萃取。合并幾次的萃取物，用水(20ml)洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾和蒸發(fā)。粗產(chǎn)物通過硅膠酸(50g)色譜柱提純(用3％MeOH的CH2Cl2溶液)，得到2′-脫氧-N6-雙-鄰-硝基芐基脫氧腺苷(320mg，30％)。
向2′-脫氧-N6-鄰硝基芐基脫氧腺苷(200mg，0.518mmol)中加入無水吡啶(10ml)并蒸干。加吡啶(10ml)接著加4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(900mg，2.3mmol，4.5當(dāng)量)和三乙胺(280mg，2.76mmol，4.0當(dāng)量)，在室溫和氬氣下攪拌5小時(shí)。加水(0.5ml)再攪拌20分鐘?；旌衔镌谝颐雅c水(各20ml)之間分配后，水相再用乙醚(20ml)萃取。合并萃取物，用水(20ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸發(fā)。混合物通過硅膠(4g，用0.7-2.5％甲醇二氯甲烷溶液)色譜柱純化，得到5′-O-DMT-N6-雙-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷，(121mg，33％)。
步驟2琥珀?；瘜?′-O-DMT-N6-雙-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷(121mg，0.145mmol)用無水吡啶(2次，3ml)蒸干。加入吡啶(3ml)、琥珀酸酐(58mg，0.58mmol，4當(dāng)量)和DMAP(11mg，催化劑)，在室溫下將該溶液攪拌3天。真空蒸發(fā)之后殘留物在二氯甲烷(10ml)與檸檬酸緩沖液(0.1M，pH5.0，10ml)。有機(jī)相用無水碳酸鈉干燥，過濾，蒸干。粗產(chǎn)物通過硅膠(2g，用EtOAc∶CH2Cl2∶TEA，32∶67∶1，10ml，然后用MeOH∶CH2Cl2，2∶97，25ml)色譜純化，得到淺黃色泡沫5′-O-DMT-N6-雙-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷-3′-O-琥珀酸，(138mg，99.5％)。
步驟3CPG的衍生按實(shí)施例1所述方法制備酸洗的LCAA-CPG。
修飾的核苷中間體與酸洗的CPG之間的偶聯(lián)按如下所述的進(jìn)行操作。將5′-O-DMT-N6-雙-鄰-硝基芐基-2′-脫氧腺苷-3′-O-琥珀酸(37mg，0.04mmol)用在一個(gè)琥珀色玻璃管形瓶中的TEA(16μl)處理并蒸發(fā)。在該殘留物中加入無水吡啶(1.5ml)、TEA(2μl)、DMAP(2.4mg)、EDC(76mg，0.04mmol)和酸洗的LCAA-CPG(200mg)，并將該混合物在一個(gè)軌道式搖動(dòng)混合器中在室溫下混合三天。減壓濾出CPG，用異丙醇充分洗滌，再用二氯甲烷洗，空氣干燥后再在真空下干燥1小時(shí)。
衍生的CPG按實(shí)施例1的方法進(jìn)行封端。
實(shí)施例5用修飾的引物擴(kuò)增-修飾核苷酸位置的影響為了證明修飾引物對(duì)形成引物二聚體的影響，同時(shí)用修飾的引物和未修飾的引物進(jìn)行HIV-1RNA擴(kuò)增。另外，為了評(píng)價(jià)修飾核苷酸的位置對(duì)降低引物二聚體的影響，用三種不同的上游修飾引物進(jìn)行擴(kuò)增，這些引物只在修飾堿基的位置上有所不同。目的核酸HIV-1RNA模板是用HIV-1RNA轉(zhuǎn)錄載體合成的，見Mulder等，1994，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol)，32(2)292-300。引物用未修飾的和修飾的引物進(jìn)行擴(kuò)增，未修飾引物的核苷酸序列如下所示，方向?yàn)?′到 3′。用上游引物RAR1032MB(SEQ ID NO1)和下游引物RAR1033 MB(SEQ ID NO2)擴(kuò)增175堿基對(duì)長(zhǎng)的產(chǎn)物，相對(duì)應(yīng)于HIV-1參照株HXB2(基因庫號(hào)K03455)的核苷酸位置2956到3130序列。
HIV-1擴(kuò)增產(chǎn)物引物 SeqIDNo. 序列RAR1032MB1 CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAARAR1033MB2 CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA上述引物為未修飾引物，未修飾引物在5′端生物素化。修飾引物按實(shí)施例1合成，其與未修飾引物含有相同核苷酸序列，但在3′末端或離3′末端上游1-3個(gè)核苷酸的位置加上一芐基化的腺苷。引物的修飾形式如下所示修飾的HIV-1擴(kuò)增引物引物 Seq ID No. 修飾核苷酸位置RAR1032MBA11 3’末端RAR1032MBA21 3’末端起1個(gè)RAR1032MBA41 3’末端起3個(gè)RAR1033MBA12 3’末端擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)在100μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，含有如下反應(yīng)物100拷貝的HIV模板RNA50mM N-[三(羥甲基)甲基]苷氨酸(Tricine)PH 8.33；110mM K OAc；300μM dATP、dCTP、dGTP(每一)；50μM dTTP；500μM dUTP；
50μM引物(每一)；3.5mM Mn(OAc)2；13％甘油；20單位Z05 DNA聚合酶*；和2.0/單位 UNG***見美國(guó)專利號(hào)5,455,170**由Hoffmann-La Roch生產(chǎn)制造，Perkin Elmer出售，Norwalk，CT.
擴(kuò)增溫度周期性變化，在TC480DNA熱循環(huán)儀，(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下溫度設(shè)計(jì)進(jìn)行反應(yīng)前孵育 45℃ 4分鐘反轉(zhuǎn)錄 60℃ 20分鐘46個(gè)循環(huán)變性 94℃ 45秒鐘退火/延伸 60℃ 45秒種最后延伸60℃ 7分鐘反應(yīng)后保存 10℃直到分析時(shí)(較短時(shí)間)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)用如下凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(100ml的3％Nusieve和0.5％Seachem)和1×TBE(0.089Mtris，0.089M硼酸，0.0025M的EDTA二鈉)電泳緩沖液分級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物。加入溴化乙錠(0.5g/ml)使DNA染色。100伏電泳約1小時(shí)。用紫外放射儀觀測(cè)溴化乙錠染色的DNA條帶。結(jié)果凝膠電泳分析結(jié)果見圖1，泳道號(hào)相對(duì)應(yīng)于用未修飾和修飾合并的引物擴(kuò)增的結(jié)果見下表。對(duì)應(yīng)于HIV產(chǎn)物的條帶在圖中用箭頭標(biāo)出了。凝膠上其他的條帶對(duì)應(yīng)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，特別是引物二聚體。引物泳道號(hào)Upstrcam DownstreamRAR1032MB RAR1033MB 1RAR1032MBA1 RAR1033MB 2RAR1032MBA2 RAR1033MB 3RAR1032MBA4 RAR1033MB 4RAR1032MB RAR1033MBA1 5RAR1032MBA1RAR1033MBA16RAR1032MBA2RAR1033MBA17RAR1032MBA4RAR1033MBA18由于引物二聚體的形成與目的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成相競(jìng)爭(zhēng)，減少引物二聚體會(huì)相應(yīng)增加目的產(chǎn)物產(chǎn)生的數(shù)量。因此，通過比較用修飾和未修飾引物擴(kuò)增形成的二聚體以及目的產(chǎn)物的量可以看出修飾引物的作用。
將用兩個(gè)非修飾引物(泳道1)擴(kuò)增結(jié)果與用單個(gè)3′-修飾的引物(泳道2和5)和用兩個(gè)3′-修飾引物(泳道6)擴(kuò)增結(jié)果比較，可以看出用一個(gè)或兩個(gè)修飾引物擴(kuò)增減少了引物二聚體的形成。在用單個(gè)3′-修飾的引物擴(kuò)增中，修飾哪條引物對(duì)降低引物二聚體的效果差別不大。用兩條修飾引物擴(kuò)增(泳道6)可使引物二聚體最大程度的降低以及目的片段量顯著的增加。
比較6-8泳道可見修飾核苷酸位置的影響。用鄰近3′末端核苷酸修飾的引物產(chǎn)生的引物二聚體的降低(泳道7)與用3′末端核苷酸修飾的引物產(chǎn)生的效果(泳道6)相同，而用3′末端上游3個(gè)堿基處核苷酸修飾的引物(泳道8)取得的成效較小。
實(shí)施例6用修飾引物進(jìn)一步擴(kuò)增-修飾核苷酸的位置影響為了進(jìn)一步說明修飾引物對(duì)引物二聚體形成的影響，對(duì)用修飾和未修飾引物擴(kuò)增HCV RNA的效果進(jìn)行了比較，如上所示。用三種只在修飾堿基部位有所不同的修飾下游引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。目的核酸HCV RNA模板是用HCV RNA轉(zhuǎn)錄載體按Yong等，1993，J.Clin.Microbiol.31(4)882-886的方法合成的。引物用修飾的和未修飾的引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，未修飾引物的核苷酸序列如下所示，方向?yàn)?′到3′。上游引物ST280A(SEQ ID NO3)和下游引物ST778AA(SEQ lD NO4)擴(kuò)增了一條HCV基因組中5′非翻譯區(qū)的含240個(gè)堿基的產(chǎn)物。
HCV擴(kuò)增引物引物Seq ID.No核苷酸序列ST280A 3GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAST778AA 4GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA以上引物設(shè)計(jì)是針對(duì)非修飾引物的，修飾引物按實(shí)施例l合成，與未修飾引物具有相同的核苷酸序列，但在3′末端或在3′末端上游1個(gè)或3個(gè)核苷酸位置上含有一芐基化的腺苷，引物的修飾形式如下所示修飾的HCV擴(kuò)增引物引物 Sep ID No.修飾核苷酸位置ST280ABAl 3 3′末端ST778AABAl4 3′末端ST778AABA24 3′末端起1個(gè)ST778AABA44 3′末端起3個(gè)擴(kuò)增和分析擴(kuò)增按實(shí)施例3進(jìn)行，但用100個(gè)拷貝的HCV RNA模板。擴(kuò)增產(chǎn)物按實(shí)施例3進(jìn)行凝膠分析。結(jié)果凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。泳道號(hào)對(duì)應(yīng)于用未修飾和修飾引物進(jìn)行的擴(kuò)增見下表。對(duì)應(yīng)于目的HCV產(chǎn)物的條帶在圖中已用箭頭標(biāo)出。凝膠中其他的條帶對(duì)應(yīng)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，特別是引物二聚體。
引物 泳道號(hào)上游 下游ST280A ST778AA1ST280A ST778AABAl 2ST280A ST778AABA2 3ST280ABA ST778AABA4 4ST280ABAlST778AA5ST280ABAlST778AABAl 6ST280ABAlST778AABA2 7ST280ABAlST778AABA4 8由于引物二聚體的形成競(jìng)爭(zhēng)目的擴(kuò)增產(chǎn)物，引物二聚體的減少通常會(huì)伴隨目的產(chǎn)物量的增加。因此可以通過比較用修飾引物擴(kuò)增相對(duì)于用非修飾引物擴(kuò)增產(chǎn)生的引物二聚體的量觀察到，以及通過比較用兩者擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段的量觀察到用修飾引物的效果。
得到的結(jié)果與前例中HCV擴(kuò)增結(jié)果相同。但在HCV擴(kuò)增中，目的產(chǎn)物的增加比HIV擴(kuò)增更明顯。比較用兩個(gè)未修飾引物擴(kuò)增的結(jié)果(泳道1)與用單個(gè)3′-修飾引物擴(kuò)增的結(jié)果(泳道2和5)以及用兩個(gè)3′修飾的引物擴(kuò)增結(jié)果(泳道6)顯示，用一個(gè)或兩個(gè)修飾引物擴(kuò)增可以降低引物二聚體。應(yīng)用兩個(gè)修飾引物(泳道6)會(huì)使引物二聚體最大程度地減少并且能使擴(kuò)增目的序列的量顯著增加。如上例所示，用單個(gè)3′修飾引物擴(kuò)增時(shí)，將哪條引物修飾對(duì)引物二聚體的降低差別不大。
通過比較泳道6-8可見修飾核苷酸位置的影響。用3′-末端核苷酸(泳道6)、鄰近3′-末端核苷酸(泳道7)以及3′-末端上游3個(gè)堿基的核苷酸(泳道8)修飾的引物擴(kuò)增結(jié)果基本一致。這表明修飾基團(tuán)可以與引物3′末端的四個(gè)核苷酸中任一個(gè)相連。
實(shí)施例7用修飾的引物擴(kuò)增-修飾基團(tuán)的作用為了進(jìn)一步說明修飾引物對(duì)引物二聚體形成的影響以及為了說明引物的變更修飾作用，比較了用修飾引物和未修飾引物擴(kuò)增HCV RNA的情況，其中引物是通過加入三個(gè)不同修飾基芐基、甲基、硝基芐基中之一來修飾的。
用兩種不同的方法分析擴(kuò)增結(jié)果。第一種方法是用凝膠電泳法分析反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)引物二聚體。第二種方法是通過用上文中動(dòng)力PCR的方法檢測(cè)引物二聚體的形成。目的核酸HCV RNA是用HCVRNA轉(zhuǎn)錄載體按Young等，1993，(J.Clill.Microbiol)臨床微生物雜志3l(4)882-886的方法合成的。擴(kuò)增引物用未修飾的和修飾的二種引物進(jìn)行擴(kuò)增，修飾引物與未修飾引物含有相同的核苷酸序列，但在3′末端腺苷處加一甲基、芐基或硝基芐基團(tuán)進(jìn)行修飾。引物合成按前面一些實(shí)施例所述，引物設(shè)計(jì)如下引物 Seq ID.No. 3′堿基的修飾ST280A3未修飾ST280AMEAl3甲基ST280ABAl 3 芐基ST280ANBAl 3 硝基芐基ST778AA4 未修飾ST778AAMEA 4 甲基ST778AABA1 4 芐基ST778AANBA14 硝基芐基擴(kuò)增反應(yīng)用含下列試劑的100μl反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增0，20，或200拷貝的HCVRNA模板50mM Tricine，PH 8.3；110mM K OAc；3.5mM Mn(OAc)2；300μM dATP、dCTP、dGTP(每一)；50μM dTTP；500μM dUTP；250nM每一引物；20單位rTth*2單位 UNG*13％ 甘油*由Hoffnann-La Roche生產(chǎn)，Perkin Elmer Norwalk，CT.出售。
每一反應(yīng)混合物的熱循環(huán)是在GeneAmp PCR體系9600熱循環(huán)儀(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下程序進(jìn)行的反應(yīng)前孵育45℃4分鐘反轉(zhuǎn)錄60℃24分鐘46個(gè)循環(huán) 變性 94℃30秒鐘退火/延伸 60℃ 30秒種最后延伸 60℃7分鐘反應(yīng)后保存4℃擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)A.凝膠電泳法擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳法按如下步驟檢測(cè)用瓊脂糖凝膠(100ml的3％Nusieve，0.5％Seachem，0.5ug/ml，溴化乙錠)和1×TBE(0.089 MTris，0.089M硼酸，0.0025M乙二胺四乙酸二鈉)電泳緩沖液分級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物。100伏電泳大約1小時(shí)，用紫外放射儀觀察溴化乙錠染色的DNA條帶。B.用動(dòng)力PCR檢測(cè)按上文所述的動(dòng)力PCR法，將嵌入染料(如溴化乙錠，當(dāng)其嵌入雙鏈DNA中時(shí)會(huì)增加熒光度)加入PCR中，通過測(cè)量反應(yīng)過程中染料的熒光度來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中雙鏈DNA的增加。因動(dòng)力PCR法測(cè)量的只是雙鏈DNA總量的增加，所以無法測(cè)知非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成情況。為了檢測(cè)來自非模板依賴的引物二聚體的非特異擴(kuò)增，不加模板核酸進(jìn)行擴(kuò)增。在無模板的反應(yīng)中，所有雙鏈DNA的增加都來自非模板依賴的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。
動(dòng)力PCR反應(yīng)條件如上文所述，但溴化乙錠是按1g/mg的濃度加入到反應(yīng)混合物中的。通過EP640,828的方法測(cè)量反應(yīng)混合物熒光度來檢測(cè)反應(yīng)的情況。
通過除以反應(yīng)早期的循環(huán)過程中測(cè)得的初始熒光度使熒光度測(cè)量法標(biāo)準(zhǔn)化，并在循環(huán)間連續(xù)測(cè)量熒光度。初始熒光度測(cè)量的循環(huán)數(shù)在各反應(yīng)中相同，以使所有測(cè)量的增加都對(duì)應(yīng)于相同的反應(yīng)循環(huán)。不含目的片段的擴(kuò)增的反應(yīng)熒光度直到引物二聚體形成時(shí)才有變化。多數(shù)反應(yīng)中，若擴(kuò)增循環(huán)足夠，最終可測(cè)得引物二聚體。修飾引物的作用可通過比較引物二聚體開始出現(xiàn)的循環(huán)次數(shù)觀察到。結(jié)果凝膠電泳分析結(jié)果見圖三。泳道數(shù)對(duì)應(yīng)于用未修飾的和三種修飾的引物以及200拷貝、20拷貝、或0拷貝的HCVRNA擴(kuò)增的情況見下表。(泳道數(shù)從左向右數(shù)，1-30是凝膠的上半，31-60泳道是凝膠的下半)。此外，分子量標(biāo)記見泳道1和31(HaeIII消化的phjX 174 RF DNA，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)以及30和60泳道(從高到低，20bp梯，GenSura，DelMar，CA)。對(duì)應(yīng)于目的特異產(chǎn)物的條帶在圖中已用箭頭標(biāo)出(～230bp)。凝膠中其他條帶對(duì)應(yīng)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物特別是引物二聚體。
圖3所示的擴(kuò)增結(jié)果泳道號(hào)模板 引物 泳道號(hào)200 未修飾 2-5200甲基修飾 6-9200芐基修飾 10-13200硝基甲苯修飾 14-1720 未修飾18-2120 甲基修飾 22-2520 芐基修飾 26-2920 硝基甲苯修飾 32-350 未修飾36-410 甲基修飾 42-470 芐基修飾 48-530 硝基甲苯修飾 54-59結(jié)果顯示用修飾引物擴(kuò)增比用未修飾引物擴(kuò)增產(chǎn)生的HCV核酸量大。而且相對(duì)于未修飾的引物，用修飾引物擴(kuò)增可降低引物二聚體。
動(dòng)力PCR檢測(cè)法中，在整個(gè)反應(yīng)過程中都監(jiān)測(cè)熒光度。通過觀測(cè)熒光度對(duì)應(yīng)于循環(huán)次數(shù)(本文未示)的曲線形狀，可檢測(cè)到的熒光度增加后其增加率在所有反應(yīng)中幾乎相同。這表明修飾引物不明顯阻滯擴(kuò)增開始后每個(gè)擴(kuò)增步驟的效率。在可測(cè)知的熒光度增加之前所進(jìn)行的循環(huán)數(shù)，各反應(yīng)有顯著不同。
為定量反應(yīng)中的差異，用熒光度超過專有熒光水平(AFL)時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)來表示結(jié)果。AFL選自接近基底熒光水平，但高于測(cè)量的熒光度的隨機(jī)波動(dòng)以使能在擴(kuò)增的幾何增長(zhǎng)期測(cè)量反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。后面循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物的積累會(huì)阻礙反應(yīng)進(jìn)行并最終達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)期。
下表概括了動(dòng)力PCR的結(jié)果，除了用芐基化的引物和20拷貝的目的片段進(jìn)行的擴(kuò)增代表4次平均值外，其他每個(gè)擴(kuò)增20或200拷貝的目的模板的值代表5次重復(fù)擴(kuò)增的平均值。無模板的擴(kuò)增值代表了8次重復(fù)的平均值。
用芐基化的引物進(jìn)行的8次無目的片段存在的擴(kuò)增中有兩次在46個(gè)循環(huán)末沒有產(chǎn)生引物二聚體。剩余的6次擴(kuò)增的平均值代表引物二聚體形成的平均條件。由于是刪除數(shù)據(jù)，所以此條件平均值不能與其他值比較。
達(dá)到AFL的循環(huán)數(shù)目的片段拷貝數(shù)引物 0 20200未修飾353634甲基 393836硝基芐基 434037芐基 (43*) 4137*2/8表示無引物二聚體形成該數(shù)據(jù)表明修飾引物明顯延緩了目的核酸的擴(kuò)增以致拖后幾個(gè)循環(huán)才達(dá)到AFL。該延緩不會(huì)造成特異擴(kuò)增產(chǎn)物的終產(chǎn)量減少。所有的目的核酸的擴(kuò)增都在本實(shí)驗(yàn)中46個(gè)循環(huán)內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期，而且由相應(yīng)的凝膠電泳分析數(shù)據(jù)表明用修飾引物會(huì)提高終產(chǎn)量。
該數(shù)據(jù)表明引物二聚體形成的延緩顯著大于目的擴(kuò)增的延緩。比較無目的片段的擴(kuò)增和200拷貝模板的擴(kuò)增可明顯看到該引物的優(yōu)點(diǎn)。用未修飾的引物，在無目的的片段的擴(kuò)增中只需1個(gè)循環(huán)后就使熒光度增加到AFL水平，這表明目的片段的擴(kuò)增很難與引物二聚體的形成區(qū)分開。相反，用修飾引物，由于引物二聚體造成的熒光度增加至少在3個(gè)循環(huán)之后，應(yīng)用芐基化的引物，該增加若發(fā)生的話，也在6個(gè)循環(huán)以后。因此，可以測(cè)到目的片段擴(kuò)增，并能與引物二聚體的形成分開。
比較無目的片段的擴(kuò)增和20拷貝模板的擴(kuò)增，修飾引物的作用顯示對(duì)引物二聚體產(chǎn)生的延緩大于目的擴(kuò)增的延緩。用未修飾的引物，20拷貝的模板不能被檢測(cè)到。用硝基芐基化和甲基化引物，引物二聚體形成明顯延緩以致能在該體系中檢測(cè)到20拷貝的模板。
每一擴(kuò)增循環(huán)的熒光度檢測(cè)數(shù)據(jù)(本文未示)表明引物二聚體形成的延緩一般足以阻止46個(gè)循環(huán)內(nèi)引物二聚體達(dá)到平臺(tái)期。因此，修飾引物明顯延緩引物二聚體的延伸以致目的片段的擴(kuò)增能完全，并使反應(yīng)在引物二聚體顯著形成以前停止。
實(shí)施例8光敏引物為說明光敏修飾引物的應(yīng)用，用修飾引物和未修飾引物擴(kuò)增HCVRNA。修飾引物用一個(gè)或兩個(gè)硝基芐基結(jié)合到3’-末端腺嘌呤的環(huán)外胺上進(jìn)行修飾。擴(kuò)增引物引物按實(shí)施例4合成，該引物的設(shè)計(jì)如下引物Seq ID.No. 3′堿基修飾ST280A 3 未修飾15239 3 雙硝基芐基15241 3 單硝基芐基ST778AA 4 未修飾15240 4 雙硝基芐基15242 4 單硝基芐基擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)每一對(duì)引物對(duì)，都用系列稀釋的加入目的片段濃度進(jìn)行反應(yīng)。共進(jìn)行兩組反應(yīng)，各包括所有的引物對(duì)和加入的目的片段濃度，每組反應(yīng)中重復(fù)進(jìn)行給定的引物對(duì)和目的片段濃度的反應(yīng)。用含有下列試劑的100μl反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增。
0，10，102，103，104'或105拷貝的HCV RNA模板55mM Tricine，90mM KOAc，3mM Mn(OAc)2。
200μM dATP、dCTP、dGTP(每一)，200μM dUTP，250nM 每一引物，10單位rTth*，2單位 UNG*，和8％ 甘油*由Hoffmann-La Roche生產(chǎn)，Perkin Elmer Norwalk，CT出售。
每一反應(yīng)混合物的熱循環(huán)在GeneAmp PCR體系9600熱循環(huán)儀(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下溫度程序進(jìn)行反應(yīng)前孵育50℃5分鐘反轉(zhuǎn)錄60℃30分鐘起始變性 95℃1分鐘2個(gè)循環(huán)變性 95℃15秒鐘退火/延伸 60℃20秒種46個(gè)循環(huán) 變性 90℃15秒鐘退火/延伸 60℃20秒種最后延伸 72℃10分鐘整個(gè)反應(yīng)中使用磨口蓋的反應(yīng)管(Perkin Elmer，Norwalk，CT)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄這一步的反應(yīng)溫度升至60度反轉(zhuǎn)錄后，從熱反應(yīng)塊中的PCR盤中除去熱蓋。反應(yīng)管的一半(重復(fù)反應(yīng)的完整部分)用鋁箔覆蓋，另一半用320nm波長(zhǎng)的手提式紫外燈(UVP型號(hào)UVM-57，UVP產(chǎn)品，San Gabriel，CA)照射十分鐘，重新放上熱蓋繼續(xù)擴(kuò)增。結(jié)果用凝膠電泳法按上文所述分析擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果見圖4。在每一反應(yīng)中所用的引物和模板拷貝數(shù)在凝膠上顯示(顯示拷貝數(shù)的對(duì)數(shù))。對(duì)應(yīng)于目的產(chǎn)物的條帶在圖中已標(biāo)出。凝膠中的其它條帶對(duì)應(yīng)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，特別是引物二聚體。
比較紫外線照射一組反應(yīng)顯示，用修飾的引物能使引物二聚體顯著減少，特別是拷貝數(shù)低。
比較無照射的一組反應(yīng)顯示，應(yīng)用二硝基芐基化引物會(huì)完全阻滯擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期的一致。用單硝基芐基化的引物進(jìn)行的擴(kuò)增不僅可以形成產(chǎn)物也能使引物二聚體顯著減少，這與前例中的結(jié)果一致。
實(shí)施例9用對(duì)叔-丁基芐基團(tuán)修飾的引物擴(kuò)增本實(shí)施例描述了用對(duì)-叔丁基芐基團(tuán)修飾的引物進(jìn)行的擴(kuò)增。目的核酸HCV RNA模板用HCV RNA轉(zhuǎn)錄載體，按Young等，1993，臨床微生物學(xué)雜志(J.Cli.Microbiol.31(4)882-886法合成。引物用實(shí)施例2中方法合成的修飾引物進(jìn)行擴(kuò)增。未修飾引物的核酸序列如下所示，方向?yàn)?’-3’。所用引物是修飾的上游引物ST280A(SEQ ID NO3)和下游引物ST778AA(SEQ ID NO4)，修飾形式見下修飾的HCV擴(kuò)增引物引物Seq ID.No. 修飾核苷酸的位置ST280ATBU 33′末端ST778AATBU43′末端擴(kuò)增并分析用含下列成份的100μl反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增20，5，2.5，2，或0拷貝的HIV RNA模板50mM Tricine，PH 8.33110mM K(OAc)300μM dATP、dCTP、及dGTP，每種，50μM dTTP500μM dUTP50nM 每一引物3.5mM Mn(OAc)213％ 甘油20單位rTth DNA聚合酶8.0單位 UNG**由Hoffmann-La Roche生產(chǎn)，Perkin Elmer Norwalk，CT出售。
擴(kuò)增溫度循環(huán)是在TC 480 DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下溫度程序進(jìn)行的反應(yīng)前孵育45℃ 12分鐘UNG滅活 90℃ 30秒鐘反轉(zhuǎn)錄60℃ 20分鐘47個(gè)循環(huán)變性 94℃ 45秒鐘退火/延伸 60℃ 70秒種最后延伸 60℃ 7分鐘反應(yīng)后保存10℃至到分析(短期內(nèi))擴(kuò)增產(chǎn)物按上文所述的凝膠電泳法分析。結(jié)果每一目的模板的擴(kuò)增按如下所述重復(fù)進(jìn)行用20個(gè)拷貝的目的模板擴(kuò)增3次，用5個(gè)拷貝的模板擴(kuò)增3次，用2.5拷貝的目的模板擴(kuò)增2次，用2拷貝的目的模板擴(kuò)增1次，在不含目的片段時(shí)擴(kuò)增23次。所有的模板擴(kuò)增都在凝膠上產(chǎn)生一預(yù)期大小的單條帶。擴(kuò)增均未產(chǎn)生引物二聚體或其它的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
本結(jié)果可與實(shí)施例6比較，兩例均用相同的引物序列擴(kuò)增相同的HCV。通過與實(shí)施例6比較發(fā)現(xiàn)用對(duì)-叔-丁基芐基修飾的引物進(jìn)行的擴(kuò)增相對(duì)于用未修飾的引物進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果有明顯改善。
另一實(shí)驗(yàn)是用上面實(shí)施例5中對(duì)-叔-丁基芐基修飾的引物擴(kuò)增HIV-1RNA，擴(kuò)增基本按上述方法進(jìn)行，與本文中的HCV體系相同，所有的HIV-1模板正擴(kuò)增都在凝膠上見到一預(yù)期大小的單條帶，擴(kuò)增均未產(chǎn)生引物二聚體或其它的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
本結(jié)果可與實(shí)施例5比較，兩例均用相同的引物擴(kuò)增相同的HCV目的片段。通過比較發(fā)現(xiàn)用對(duì)-叔-丁基芐基修飾的引物進(jìn)行的擴(kuò)增相對(duì)于用未修飾的引物進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果有明顯改善。
實(shí)施例10分枝桿菌DNA的擴(kuò)增本實(shí)施例講述了用未修飾的和修飾的引物擴(kuò)增分枝桿菌DNA的效果比較。應(yīng)用在3’末端核苷酸上加上一芐基修飾的引物和用在3’末端核苷酸上加上一對(duì)-叔-丁基芐基修飾的引物。用未修飾的引物進(jìn)行的反應(yīng)基本按Tevere等，1996，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)34(4)918-923的方法進(jìn)行。用將已知濃度的分枝桿菌DNA加入到唾液樣品中而模擬的臨床感染模型進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)用純化的分枝桿菌DNA和不含DNA的陰性對(duì)照樣本進(jìn)行擴(kuò)增。樣品準(zhǔn)備將通過顯微鏡檢測(cè)和培養(yǎng)顯示是分枝桿菌陰性的唾液樣品液化并用CDC(Kent和Kubica，1985，分枝桿菌公共衛(wèi)生學(xué)-三級(jí)實(shí)驗(yàn)室指南，美國(guó)健康和人群服務(wù)系，疾病控制中心，Atlanta，包含在本文參考文獻(xiàn)中)推薦的N-乙酰半胱氨酸氫氧化鈉法液化和消毒。將液化的唾液(100μl)加到500μl呼吸Specimen洗液(10mMTris鹽酸，1mM乙二胺四乙酸，1％(體積比)Triton X-100，0.05％NaN3，PH8.0)中，12,500×g離心10分鐘。將沉淀重懸在100μl裂解液(0.05NNaOH，1％(體積比)Triton X-100，1mM乙二胺四乙酸，0.05％NaN3)中，60℃孵育45分鐘。用100μl中和劑(0.2MTris-HCl，8mM氯化鎂，0.05％NaN3，PH7.5)中和裂解液。
將各80ul的兩種唾液裂解液混合制成混合裂解液。在每8份混合裂解液(各160ul)中加入由培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)純化的DNA原樣(每微升含2拷貝，存在于1∶1的裂解液和中和液組成的混合液中)。
將10ul的DNA原樣加到100μl1∶1的裂解液和中和劑的混合液中制備已知濃度的純化分枝桿菌DNA的樣品(不含唾液)。
陰性對(duì)照樣品(不含DNA)是100ul裂解液和100ul中和劑的混合物。擴(kuò)增引物用含下列核酸序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增引物序列KY18(SEQ ID NO5) 5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3’KY436(SEQ ID NO6) 5’-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3’KY75(SEQ ID NO7) 5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3’用以下包含連接在3’末端堿基的修飾基團(tuán)的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。所有的修飾引物按前面的實(shí)施例所示合成，所有的引物都在5’末端生物素化。引物對(duì) 引物序列 修飾A KY18(SEQ ID NO5) 未修飾KY75(SEQ ID NO7) 未修飾B KY436(SEQ ID NO6) 芐基KY75(SEQ ID NO7) 芐基C KY436(SEQ ID NO6) 對(duì)-叔-丁基芐基KY75(SEQ ID NO7) 對(duì)-叔-丁基芐基擴(kuò)增每一樣品都用未修飾的引物對(duì)KY18(5)和KY75(7)以及引物對(duì)KY436(6)和KY75(7)的修飾形式進(jìn)行擴(kuò)增。
擴(kuò)增反應(yīng)在各含50μl的上述三種樣品之一和50ul的2x反應(yīng)混合物的100μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)混合物包括以下試劑100mM Tris-HCl，pH8.9；500nM引物；各200μM dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dUTP)20％(體積比)甘油10單位Amp Taq*6單位 AmpErase**由Hoffmann-La Roche生產(chǎn)，Perkin Elmer Norwalk，CT，出售。
每一反應(yīng)混合物的熱循環(huán)在GeneAmp PCR體系9600熱循環(huán)儀(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下溫度程序進(jìn)行反應(yīng)前孵育 50℃5分鐘2個(gè)循環(huán) 變性 98℃20秒鐘退火 62℃20秒種延伸 72℃45秒種41個(gè)循環(huán) 變性 94℃20秒鐘退火 62℃20秒種延伸 72℃45秒種最后延伸 72℃ 約12小時(shí)(過夜)擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳法通過2％Nusiev，0.5％的瓊脂糖凝膠顯現(xiàn)，然后用溴化乙錠染色。結(jié)果電泳分析結(jié)果見圖5。對(duì)每一樣品的用未修飾的引物(“A”)和用修飾引物(“B”、“C”)的擴(kuò)增產(chǎn)物在相鄰的泳道進(jìn)行電泳。對(duì)應(yīng)于分枝桿菌目的序列的條帶已用箭頭標(biāo)出。其它條帶對(duì)應(yīng)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠最下面的條帶是引物二聚體，標(biāo)有“M”的泳道含有分子量標(biāo)記(HaeIII消化的PHiX174DNA)。
用未修飾的引物擴(kuò)增純化的分枝桿菌DNA都產(chǎn)生引物二聚體，修飾引物對(duì)的應(yīng)用增加了目的片段的量并基本消除了可測(cè)量的引物二聚體的形成。
與純化的DNA擴(kuò)增相反，用未修飾的引物，擴(kuò)增的反應(yīng)中唾液裂解液的存在降低了擴(kuò)增效率，而且增加了非特異產(chǎn)物的形成，表示形成外來產(chǎn)物條帶?？紤]到唾液裂解液中含有顯著數(shù)量的人類DNA，所以非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的增加并不奇怪，但該非特異產(chǎn)物不存在于純化的分枝桿菌DNA擴(kuò)增中。在唾液存在時(shí)進(jìn)行的擴(kuò)增中應(yīng)用兩種修飾引物對(duì)均可以顯著增加目的產(chǎn)物的量，并均能顯著降低非特異擴(kuò)增。
實(shí)施例11其他芐基修飾引物的合成通過芐基加到末端胞嘧啶上而修飾的引物，其合成方法基本上如實(shí)施例1所述，但用的是如下制備的連接N4-乙酰基，N4-芐基-5′-O-DMT-2′脫氧胞苷的LCAA-CPG。
步驟1N4-芐基-2′-脫氧胞苷的合成將芐基胺(20ml)加到2′-脫氧胞苷鹽酸(5.28g，20mmol，U.S.BiochemicalCorp.，Cleveland，OH)中，并將該混合物在氬氣下150℃加熱3小時(shí)。真空濃縮溶液，得到粘性黃色油，將其在水(100ml)與乙酸乙酯(100ml)之間分配。水相用乙酸乙酯洗滌并分離。真空濃縮該水相后得到黃色的漿(13g)，通過硅膠柱色譜提純(用15∶1的二氯甲烷∶甲醇作為洗脫液)，得到所需的產(chǎn)物(58g，91.5％)，一種無色的漿。
步驟2N4-乙?；琋4-芐基-2′脫氧胞苷的合成將N4-芐基-2′脫氧胞苷(2.5mg，7.9mmol)溶于15ml干燥的二甲基甲酰胺中，加入乙酸酐(8g，79mmol，10當(dāng)量)，混合物在室溫下攪拌過夜。真空除去溶劑和過量的乙酸酐。產(chǎn)物通過硅酸膠柱色譜提純(用20∶1的二氯甲烷∶甲醇作為洗脫液)，得到標(biāo)題化合物(1.3g，48％)。該化合物是高收濕的，將其在-20℃下干燥貯存。
步驟3N4-乙?；?，N4-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧胞苷的合成將N4-乙酰基，N4-芐基-2′-脫氧胞苷(76mg，0.2mmol)溶于1ml干燥的吡啶中，加入DMT-Cl(122mg，0.2mmol，1.0當(dāng)量)。將該反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)。經(jīng)TLC分析表明有些原料已反應(yīng)除去，所以再加上述一半量的DMT-Cl(61mg，0.5當(dāng)量)并再將所得的混合物攪拌一直到用TLC分析顯示出反應(yīng)完成為止。用15ml鹽水使該反應(yīng)停止，水相用二氯甲烷(3×15ml)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(2×15ml)洗滌后用無水硫酸鎂干燥。蒸去溶劑并將該混合物通過硅酸膠色譜提純(用50∶1的二氯甲烷∶甲醇)，得到N4-乙?；?，N4-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧胞苷(96mg，65％產(chǎn)率)。
步驟4琥珀?；瘜4-乙酰基，N4-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧胞苷(96mg，0.13mmol)溶解在2ml的干吡啶中。加琥珀酸酐(100mg，1.0mmol)和二甲基氨基吡啶(20mg)，所得混合物在室溫下攪拌三天。蒸去溶劑后殘留物用甲苯(3×10ml)共沸。加氯仿(50ml)使該殘留物溶解(用超聲法幫助溶解)。用鹽水(3×15ml)洗氯仿層，再用水(3×15ml)洗。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。蒸去溶劑得到108mg純的N4-乙?；?，N4-芐基，5′-O-DMT-2′-脫氧胞苷-3′-O-琥珀酸(97％產(chǎn)率)。
步驟5連接5′- O-DMT-N4-乙?；?，N4-芐基2′-脫氧胞苷-3′-O-琥珀酸的LCAA-CPG的制備活化的CPG制備如下將LCAA-CPG(1.0g，LCA00500C，CPG Inc.，F(xiàn)airField，NJ)用三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液(3％，10ml)處理并在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上(旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器，Buchi，F(xiàn)lawil，Switgerland)(無真空)旋轉(zhuǎn)混合4小時(shí)。濾出溶劑，CPG依次用9∶1的三乙胺∶乙基二異丙基胺(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，及乙醚(3×10ml)洗滌，然后真空干燥。
修飾過的核苷中間體與酸洗過的CPG之間的偶聯(lián)按如下方法進(jìn)行。在1g活化的LCAA-CPG中加入上面制備的N4-乙?；?，N4-芐基，5′-O-DMT-2′脫氧胞苷-3′-O-琥珀酸(108mg，0.13mmol)，二甲基氨基吡啶(20mg)，和5ml干吡啶。反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(無真空)旋轉(zhuǎn)三天。濾出上清液，偶聯(lián)后的LCAA-CPG相繼用吡啶(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，和乙醚(3×10ml)洗滌，然后真空干燥。
連接有N4-乙?；?，N4-芐基，5′- O-DMT-2′-脫氧胞苷-3’琥珀酸按以下方法進(jìn)行封端。在衍生的CPG中加入封端用的混合試劑A(THF/二甲基吡啶/Ac2O8∶1∶1，Glen Research DNA合成試劑，Sterling，VA)和B(10％N-甲基咪唑在THF中的溶液，Glen Research)，將該反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上(無真空)旋轉(zhuǎn)過夜。濾出溶液，偶聯(lián)的LCAA-CPG相繼用吡啶(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，THF(3×10ml)，及乙醚(3×10ml)洗滌，然后真空干燥。
衍生的LCAA-CPG通過用3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液對(duì)5mg該產(chǎn)品進(jìn)行處理來測(cè)定其偶聯(lián)能力，并通過UV光譜測(cè)定析出的二甲基三苯甲基碳離子的量。測(cè)得連接LCAA-CPG的核苷衍生物的量為19.5μmol/g。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名F.HOFFMANN-LAROCHEAG(B)街道Grenzacherstrasse124(C)城市Basle(D)洲 BS
(E)國(guó)家SwitzerlandF)郵編(ZIP)CH-4070(G)電話061-688 2511(H)傳真061-688 13 95(I)電報(bào)962292/665542 hlr ch(ii)發(fā)明名稱修飾的引物(iii)序列數(shù)7(iv)機(jī)讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)System 7.1(Mactintosh)(D)軟件Word 5.1(v)在先申請(qǐng)資料申請(qǐng)?zhí)?0-041127申請(qǐng)日20.03.97(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATGAGACA CCAGGAATTAGATATCAGTA CAA(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸，具有以下一般結(jié)構(gòu)
其中S1代表長(zhǎng)度為大約5至大約50個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列；其中S2代表長(zhǎng)度為1至3個(gè)核苷酸的第二序列；其中N代表一個(gè)含有嘌呤或嘧啶堿基的核苷酸，該堿基含有一環(huán)外胺；其中R代表一修飾物基團(tuán)，其中R通過環(huán)外胺與N共價(jià)結(jié)合，并且該R具有以下結(jié)構(gòu)
其中R1和R2各自代表氫、C1-C10烷基、烷氧基、苯基、苯氧基、取代的苯基、萘基、或取代的萘基。
2.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中R是2-萘基甲基；芐基；或取代的芐基。
3.權(quán)利要求1或2的寡核苷酸，其中R是取代的芐基，具有以下結(jié)構(gòu)
其中R3代表C1-C6支鏈或直鏈烷基、甲氧基、或硝基。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中R3代表C1-C4支鏈或直鏈烷基、甲氧基、或硝基。
5.權(quán)利要求3或4的寡核苷酸，其中R3連接在對(duì)位。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中N是腺苷。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中R選自芐基、對(duì)甲基芐基、對(duì)叔丁基芐基、對(duì)甲氧基芐基、鄰硝基芐基、及2-萘基甲基。
8.一種擴(kuò)增核酸目的序列的方法，所述方法包括用至少一種按權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
9.權(quán)利要求8的方法，該方法是聚合酶鏈反應(yīng)。
10.一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡核苷酸。
11.實(shí)質(zhì)上如前面所述的新的寡核苷酸、方法和試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提出了用于核酸序列擴(kuò)增的修飾寡核苷酸。用這種修飾過的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果非特異擴(kuò)增產(chǎn)物少,具體說,引物二聚體少,并且與未修飾的寡核苷酸用作引物進(jìn)行比較,能得到更高產(chǎn)率的擴(kuò)增產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1194270SQ9810562
公開日1998年9月30日 申請(qǐng)日期1998年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月20日
發(fā)明者斯蒂芬·G·威爾, 楊國(guó)英 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司