專利名稱：ErdB3抗體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及結(jié)合ErbB3受體的抗體。具體地說，本發(fā)明涉及這樣的抗ErbB3抗體，它顯著提高heregulin(HRG)與ErbB3蛋白的結(jié)合親和性，并且/或者降低同時表達ErbB2和ErbB3兩種受體的細胞內(nèi)由HRG誘導的ErbB2-ErbB3蛋白復合物的形成，并且/或者降低這類細胞內(nèi)heregulin誘導的ErbB2的活性。現(xiàn)有技術(shù)調(diào)節(jié)細胞生長和分化的信號轉(zhuǎn)導有一部分是由各種細胞蛋白的磷酸化作用來調(diào)控的。蛋白酪氨酸激酶是催化該過程的酶。受體蛋白酪氨酸激酶被認為通過對胞內(nèi)底物的配體刺激性酪氨酸激酶磷酸化作用來指導細胞的生長。Ⅰ類亞族的生長因子受體蛋白酪氨酸激酶包括由erbB1基因編碼的170KDa的上皮生長因子受體。erbB1基因被認為是人類惡性腫瘤的病因。具體地說，該基因的過量表達已被發(fā)現(xiàn)存在于侵襲性較高的乳房癌、膀胱癌、肺癌和胃癌中。
Ⅰ類亞族的另一成員p185neu最初被認定是來自化療大鼠成神經(jīng)細胞瘤的基因的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，neu基因(又稱erbB2和HER2)編碼185kDa的受體蛋白酪氨酸激酶。人HER2基因的擴增和/或過量表達與乳房癌和卵巢癌的預后差有關(guān)(Slamon等，科學(Sience),235；177-182(1987)；Slamon等，科學(Sience),244；707-712(1989))。HER2的過量表達還被發(fā)現(xiàn)與其它癌癥有關(guān)，其中包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。
另一相關(guān)基因，稱為erbB3或HER3也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。參見美國專利5,183,884和5,480,968；Plowman等，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:4905-4909(1990)；Kraus等，美國科學院院報，90:2900-2904(1993)。Kraus等(1989)發(fā)現(xiàn)，在某些人乳房腫瘤細胞系中，erbB3mRNA水平顯著升高，這表明，erbB3和erbB1和erbB2一樣在某些人惡性腫瘤中起一定的作用。以上研究證明了某些人乳房腫瘤細胞系表現(xiàn)出穩(wěn)態(tài)ErbB3酪氨酸磷酸化作用的顯著加強，這進一步表明該受體可能在人惡性腫瘤中起一定的作用。由此，Kraus等在美國專利5,183,884和5,480,968中敘述了用結(jié)合ErbB3的抗體來進行的診斷性生物分析。
人們已經(jīng)就erbB3在癌癥中的作用進行了廣泛的研究。它被發(fā)現(xiàn)在乳房癌[(Lemoine等,英國癌癥雜志(Br.J.Cancer)66:1116-1121(1992))]，胃腸道癌癥[(Poller等，病理學雜志(J.Pathol.)168:275-280(1992),Rajkumer等，病理學雜志，170:271-278(1993)和Sanidas等，世界癌癥雜志(Int.J.Cancer)54:935-940(1993))]和胰腺癌[(Lemoine等，病理學雜志，168:269-273(1992)和Friess等，臨床癌癥研究(Clinical Cancer Research)1:1413-1420(1995))]中過量表達。
ErbB3在ErbB受體族中是獨特的，其獨特之處在于它甚少或者沒有固有酪氨酸激酶活性[(Guy等，美國科學院院報，91:8132-8136(1994)]和Kim等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)269:24747-55(1994))。當ErbB3與ErbB2共表達時，形成一活性信號復合物，ErbB2的抗體能夠破壞該復合物(Sliwkowski等，生物化學雜志269(20):14661-14665(1994))。此外，當ErbB3與ErbB2共表達時，其與heregulin(HRG)的親和性也被增加到較高的親和性狀態(tài)。有關(guān)ErbB2-ErbB3蛋白復合物可參見Levi等，神經(jīng)科學雜志(Journal of Neuroscience)15:1329-1340(1995)；Morrissey等，美國科學院院報，92:1431-1435(1995)和Lewis等，癌癥研究(CancerRes.)56:1457-1465(1996)。
Rajkumar等，英國癌癥雜志70(3)459-465(1994)發(fā)明了抗ErbB3的單克隆抗體，它對于表達該受體的細胞系的非貼壁依賴性生長具有活化作用。
Ⅰ亞族生長因子受體酪氨酸激酶還進一步包括HER4/p180erbB4受體。參見歐洲專利申請599,274；Plowman等，美國科學院院報90:1746-1750(1993)；和Plowman等，自然(Nature)366:473-475(1993)。Plowman等發(fā)現(xiàn)，HER4表達的增加與包括乳腺腺癌在內(nèi)的某些上皮性起源的癌癥密切相關(guān)。由此，歐洲專利申請599,274敘述了確定人腫瘤狀態(tài)(特別是乳腺癌)的診斷方法，即評價HER4的表達。
人們因?qū)ふ野┗騂ER2的活化劑而發(fā)現(xiàn)了一族heregulin多肽。這類蛋白質(zhì)似乎來自位于人8號染色體短臂上一單基因的不同拼接方式，Lee等，基因?qū)W(Genomics)16:790-791(1993)；和Orr-Urtreger等，美國科學院院報90:1867-1871(1993)。
Holmes等分離并克隆了一族HER2受體的多肽活化劑，他們稱之為heregulin-α(HRG-α)、heregulin-β1(HRG-β1)、heregulin-β2(HRG-β2)、heregulin-β2樣(HRG-β2樣)和heregulin-β3(HRG-β3)。參見Holmes等，科學(Science)256:1205-1210(1992)；和WO92/20798。45kDa多肽HRG-α是由MDA-MG-231人乳房癌細胞系的條件培養(yǎng)基純化得到的。以上研究證明了純化heregulin多肽在MCF-7乳癌腫瘤細胞內(nèi)激活HER2受體的酪氨酸磷酸化作用的能力。而且，還證明了heregulin多肽對SK-BR-3細胞(高水平地表達HER2受體)的促有絲分裂活性。和EGF族的其它生長因子一樣，可溶性HRG多肽似乎來自膜結(jié)合性前體(稱前HRG)，后者經(jīng)蛋白水解后釋放出45kDa的可溶性形式。這類前HRG缺少N末端的信號肽。
雖然heregulin的前213個氨基酸殘基都是一致的，但是它們?nèi)愿鶕?jù)C末端有所差別的兩種不同的EGF樣功能區(qū)(domain)分成兩大類，α和β。但是，這些EGF樣功能區(qū)中含有的6個半胱氨酸殘基間的間距(spacing)是一致的。根據(jù)氨基酸序列比較，Holmes等發(fā)現(xiàn)，在EGF樣功能區(qū)內(nèi)的第一至第六半脫氨酸之間，GRG與結(jié)合肝素的EGF樣生長因子(HB-EGF)的一致性為45％，與雙調(diào)蛋白(AR)的一致性為35％，與TGF-α的一致性為32％，與EGF的一致性為27％。
Peles等，細胞(Cell)69:205-216(1992)；和Wen等，細胞69:559-572(1992)首次描述了44kDa的Neu分化因子(NDF)，它是人HRG的鼠對應(yīng)物。和HRG多肽一樣，NDF在EGF樣功能區(qū)之前有一個免疫球蛋白(Ig)同源性功能區(qū)，而且缺少N末端的信號肽。此后，Wen等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)14(3):1909-1919(1994)為了擴展NDF族進行了“徹底的克隆”。這項工作發(fā)現(xiàn)了6種不同的成纖維性前NDF。采用Holmes等的命名法，NDF根據(jù)EGF樣功能區(qū)的序列被分為α或β多肽。同種型1至4的區(qū)別在于可變的并列膜序列段(juxtamembranestretch)(在EGF樣功能區(qū)和跨膜功能區(qū)之間)的堿基。同樣，同種型a、b和c被描述成具有長度不等的胞質(zhì)功能區(qū)。以上研究者認為，不同的NDF同種型是由于不同的拼接而產(chǎn)生的，它們行使著不同的組織特異性功能。
Falls等，細胞72:801-815(1993)描述了他們稱之為乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)多肽的heregulin族中的另一成員。該雞源ARIA多肽刺激肌肉乙酰膽堿受體的合成。也見WO94/08007。ARIA是一種β型heregulin，缺少象HRGα和HRGβ1-β3那樣位于Ig樣功能區(qū)和EGF樣功能區(qū)之間的完整的“糖”間隔區(qū)(富含糖基化位點)。
Marchionni等，自然362:312-318(1993)鑒定出了幾種他們稱之為神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長因子(GGF)的牛源蛋白質(zhì)。這些GGF具有與前述heregulin蛋白質(zhì)相同的Ig樣功能區(qū)和EGF樣功能區(qū)，但是具有一個氨基末端的Kringle功能區(qū)。GGF一般沒有位于Ig樣功能區(qū)和EGF樣功能區(qū)之間的完整的“糖”間隔區(qū)。GGF中只有GGFII具有N末端的信號肽。
Bacus等，病理模型(Pathology Patterns)102(4)(增刊.1):S13-S24(1994)論述了乳房癌中ErbB2族受體和heregulin多肽的表達。
有關(guān)上述受體族，還可參見Alimandi等，癌基因(Oncogene),10:1813-1821(1995)；Beerli等，分子和細胞生物學15:6496-6505(1995)；Karunagaran等，歐洲生物學雜志(EMBO J)15:254-264(1996)；Wallash等，歐洲生物學雜志14:4267-4275(1995)；和Zhang等，生物化學雜志271:3884-3890(1996)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合ErbB3蛋白并且具有下述一項或多項特征的抗體能夠在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)減少由heregulin誘導的ErbB2-ErbB3蛋白復合物的形成；能夠提高heregulin對ErbB3蛋白的結(jié)合親和性；在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)減少heregulin誘導的ErbB2活性。
本發(fā)明還涉及結(jié)合ErbB3蛋白并減少heregulin與之結(jié)合的抗體。
較好的是結(jié)合ErbB3受體胞外功能區(qū)內(nèi)某表位的單克隆抗體。一般說來，目的抗體至少以約10nM的親和性與ErbB3受體結(jié)合，至少約1nM則更好。在有的實施方案中，為了例如受體的親和性純化或診斷試驗，抗體被固定(例如共價連接)在固相上。
上述抗體可以是組合物的形式，其中含有抗體和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明還提供了分離出的核酸分子，其編碼上述抗體并可能另含有與之可操作性連鎖的啟動子；表達載體，包含與調(diào)控序列可操作性連鎖的核酸分子，調(diào)控序列是可被用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞識別的；包含核酸的細胞系(例如雜交瘤細胞系)；和利用編碼抗體的核酸分子產(chǎn)生抗體的方法，其中包括培養(yǎng)含有所述核酸的細胞和(可選性地)由細胞培養(yǎng)物，最好是細胞培養(yǎng)基回收抗體。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物的方法，包括給哺乳動物使用治療有效量的所述抗體，而所述哺乳動物患有需要用所述抗體治療的疾病。
另一方面，本發(fā)明提供了一種體外或體內(nèi)檢測ErbB3的方法，包括令抗體與被懷疑含有ErbB3的細胞接觸，檢測是否發(fā)生結(jié)合。所以，本發(fā)明提供了一種檢測以ErbB3過量表達為特征的腫瘤的方法，包括的步驟有令細胞與所述的抗體接觸，檢測抗體與細胞結(jié)合的程度。用于此類試驗的抗體通常要加以標記。所述的試驗可以是體外(例如ELISA試驗)或體內(nèi)試驗。對于體內(nèi)腫瘤診斷來說，一般將抗體與放射性同位素結(jié)合，然后給哺乳動物服用，然后通過體外對放射性掃描來觀察哺乳動物中抗體與組織結(jié)合的程度。


圖1顯示在各種抗ErbB3單克隆抗體存在下HRG與K562 ErbB3細胞的結(jié)合情況。將純化的抗ErbB3抗體與K562 ErbB3細胞懸液以及125I-HRGβ1(177-244)一起培養(yǎng)。在冰上約18小時后計數(shù)結(jié)合的細胞。將計數(shù)結(jié)果以相對無抗體時結(jié)合情況(對照)的百分比作圖表示。利用過量的非標記HRGβ1(177-244)(HRG)測定非特異性結(jié)合?？笶rbB2蛋白(2C4)和HSV(5B6)的抗體被用作陰性對照。
圖2顯示抗體濃度對HRG結(jié)合情況的影響。對3-8D6抗體進行劑量依賴性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRG結(jié)合加強。將K562 ErbB3細胞與固定濃度的125I-HRG共培養(yǎng)，同時提高3-8D6抗體的濃度。試驗數(shù)據(jù)顯示為結(jié)合細胞數(shù)相對抗體濃度所做的圖。
圖3顯示在有或無3-8D6抗體或其Fab片段存在下HRG與K562 ErbB3細胞的結(jié)合。在沒有(對照)或有100nM的3-8D6或其Fab存在下進行了競爭性配體結(jié)合試驗。將數(shù)據(jù)按結(jié)合量/總量(B/T)對總HRGβ1(177-244)作圖。
優(yōu)選實施方案的詳細說明Ⅰ．定義除非另作說明，“ErbB3”在本文中表示哺乳動物ErbB3蛋白，“erbB3”表示哺乳動物erbB3基因。優(yōu)選的ErbB3蛋白是位于細胞膜上的人ErbB3蛋白。美國專利5,480,968和Plowman等在美國科學院院報87:4905-4909(1990)中對人erbB3基因進行了描述。
目的抗體不與其它蛋白，例如由erbB1、erbB2和/或erbB4基因編碼的蛋白發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。在此類實施方案中，經(jīng)熒光激活細胞分選分析(FACS)或放射性免疫沉淀(RIA)測定，抗體與所述非ErbB3蛋白的結(jié)合度(例如與內(nèi)源性受體的細胞表面結(jié)合)低于10％。但是，有時，抗體可能與ErbB4受體交叉反應(yīng)但是可能不與例如EGFR和/或ErbB2受體交叉反應(yīng)。
“heregulin”(HGR)在本文中表示激活ErbB2-ErbB3蛋白復合物的多肽(即在與之結(jié)合后誘導ErbB2-ErbB3復合物內(nèi)的酪氨酸殘基的磷酸化作用)。該術(shù)語所涵蓋的各種heregulin多肽都已在前文予以揭示。它還包括天然HRG多肽的生物活性片段和/或變體，例如其EGF樣功能區(qū)片段(例如HRGβ1(177-244))。
“ErbB2-ErbB3蛋白復合物”是ErbB2受體與ErbB3受體的非共價結(jié)合寡聚體。當同時表達上述兩種受體的細胞接觸HRG時就會形成所述的復合物。如后文實施例所述，該復合物可以通過免疫沉淀來分離，并利用SDS-PAGE進行分析。
“在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)降低由heregulin誘導的ErbB2-ErbB3蛋白復合物的形成”表示從數(shù)據(jù)上看，與未處理的(對照)細胞相比，就統(tǒng)計學意義上說抗體能夠明顯減少接觸了抗體和HRG的細胞內(nèi)形成的ErbB2-ErbB3蛋白復合物的數(shù)量。表達ErbB2和ErbB3的細胞可以是天然細胞或細胞系(例如Caov3細胞)，或者可以是通過在宿主細胞內(nèi)引入編碼所述蛋白中每一種的核酸而重組產(chǎn)生的細胞。較好的是，經(jīng)對復合物Western印跡雜交的反射比掃描光密度測定法(reflectance scanning densitometry)(參見后文實施例)測定，抗體將所述復合物的形成減少至少50％，更好的為至少70％。
“在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)降低由heregulin誘導的ErbB2活性”的抗體，與未處理的(對照)細胞相比，就統(tǒng)計學意義上說明顯降低ErbB2在HRG結(jié)合ErbB2-ErbB3蛋白復合物(存在于表達兩種受體的細胞的表面)內(nèi)的ErbB3時產(chǎn)生的酪氨酸磷酸化活性。這可以根據(jù)ErbB2-ErbB3復合物與HRG和目的抗體接觸后其中的磷酸酪氨酸(phospbotyrosine)水平來確定。表達ErbB2和ErbB3的細胞可以是天然細胞或細胞系(例如Caov3細胞)，或者可以是重組產(chǎn)生的。ErbB2活性可以如后文實施例所述，通過在Western印跡之后用抗磷酸酪氨酸的抗體進行檢測來測定。或者，可以利用WO95/14930和Sadick等，分析生物化學(AnaliticalBiochemistry)235:207-214(1996)所述的激酶受體激活試驗來定量測定ErbB2活性。較好的是，經(jīng)對抗磷酸酪氨酸抗體檢測復合物用Western印跡雜交的反射比掃描光密度測定法測定(見后文實施例)，抗體將heregulin誘導的ErbB2活性減低至少50％，至少70％則更好。
抗體可能“提高heregulin對ErbB3蛋白的親和性”。這表示，從數(shù)據(jù)上看，在抗體存在下(例如100nM抗體)，與對照(無抗體)相比，結(jié)合ErbB3(例如存在于天然細胞或細胞系，或者用重組技術(shù)引入細胞的內(nèi)源性ErbB3，見后文實施例)的HRG數(shù)量就統(tǒng)計學意義上說明顯增加。例如，與對照相比，存在100nM抗體時，HRG結(jié)合到如本文所述轉(zhuǎn)染以erbB3的K562細胞系的數(shù)量增加至少10％，至少50％更好，至少約100％則最好(參見圖1)。
減少與ErbB3蛋白例如在細胞上存在的ErbB3結(jié)合的HRG的抗體即干擾ErbB3蛋白上的HRG結(jié)合位點，從而從統(tǒng)計學上看明顯減少能夠與分子上該位點結(jié)合的heregulin的數(shù)量。此類抗體有例如本文實施例中所述的3-2F9、3-3E9和3-6B9抗體。
“抗體”按其最廣的涵義使用，具體包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性(multispecific)抗體(例如雙特異性抗體)，以及凡是表現(xiàn)出所需的生物活性的抗體片段。所述抗體可以是例如IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。但是，抗體不宜為IgM抗體。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。所述抗體片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；間抗體(diabodies)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“單克隆抗體”在此表示由一群基本上同源的抗體(即，除了可能少量存在的天然突變之外，組成該群的各個抗體是完全相同的)獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，只針對單一抗原位點。而且，不同于一般包括針對不同決定族(表位)的不同抗體的常規(guī)抗體制劑(多克隆抗體)，單克隆抗體只針對抗原上的一個決定族。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點還在于，它們是由雜交瘤培養(yǎng)物產(chǎn)生的，不受其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表示抗體由是得自基本同源的抗體群這一特征，而不應(yīng)理解成抗體的產(chǎn)生需要任何特定的方法。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以是利用Kohler等，自然256:495(1975)首次論述的雜交瘤法制備，也可以是利用重組DNA法(參見美國專利4,816,567)制備?！皢慰寺】贵w”還可以是利用例如Clackson等，自然352:624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志222:581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離得到的。
單克隆抗體在此特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及表現(xiàn)出所需的生物活性的此類抗體的片段，其重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體內(nèi)的對應(yīng)序列一致或同源，而鏈的其余部分與來自其它種或?qū)儆谄渌贵w類或亞類的抗體內(nèi)的對應(yīng)序列一致或同源(美國專利4,816,567；Morrison等，美國科學院院報81:6851-6855(1984))。
非人抗體(例如鼠抗體)的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(例如Fv、Fab、Fab’或抗體的其它抗原結(jié)合序列)，含有來自非人免疫球蛋白的基本序列。人源化抗體的絕大部分是人免疫球蛋白(受體的抗體)，其中來自受體互補決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需的特異性、親和性和能力的但來自例如小鼠、大鼠或兔之類非人種(供體抗體)CDR的殘基所取代。有時，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被對應(yīng)的非人殘基取代。而且，人源化抗體可以包含既非在受體抗體內(nèi)亦非外來CDR或構(gòu)架序列內(nèi)的殘基。這種修飾作用是為了進一步完善和優(yōu)化抗體的性能。一般說來，人源化抗體包含基本上完整的至少一個，通常兩個可變功能區(qū)，功能區(qū)中的CDR區(qū)的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的該區(qū)，而FR區(qū)的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的該區(qū)。人源化抗體最好還包括免疫球蛋白通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。有關(guān)進一步的具體內(nèi)容可參見Jones等，自然321:522-525(1986)；Reichmann等，自然332:323-329(1988)；和Presta,(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。人源化抗體包括PrimatizedTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)來自用目的抗原免疫短尾猿猴而產(chǎn)生的抗體。
“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含存在于單條多肽鏈內(nèi)的抗體的VH和VL功能區(qū)。一般說來，F(xiàn)v多肽進一步包含位于VH和VL功能區(qū)之間的多肽接頭，它能使sFv形成適合抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。有關(guān)sFv，可參見Pluckthum的“單克隆抗體的的藥物學”(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第113卷，Rosenburg和Moore編，Spring-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
“間抗體(diabodies)”指有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，其中包含在同一多肽鏈內(nèi)與輕鏈可變功能區(qū)(VL)連接的重鏈可變功能區(qū)(VH)(VH-VL)。通過使用短至使同一鏈內(nèi)兩功能區(qū)無法配對的接頭，功能區(qū)被迫與其它鏈的互補功能區(qū)配對，由此形成兩個抗體結(jié)合位點。例如歐洲專利404,097；WO93/11161；和Hollinger等在美國科學院院報90:6444-6448(1993)中對間抗體有更為全面的論述。
“分離的”抗體是經(jīng)鑒定的和分離和/或回收自其天然環(huán)境中某組份的抗體。其天然環(huán)境中的污染組份是指會干擾所述抗體的診斷或治療性用途的物質(zhì)，可能包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，抗體純化至(1)經(jīng)Lowry法測定，按其重量計純度高于95％，最好高于99％，(2)其純度通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀足以獲得至少15個N末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列，或者(3)達到用Coomassie藍或最好用銀染色法，經(jīng)還原或非還原條件下SDS-PAGE測定的均性。分離的抗體包括原位存在于重組細胞內(nèi)的抗體，因為至少該抗體天然環(huán)境的組份之一將不存在。但是，通常，分離抗體還需經(jīng)至少一步純化步驟來制備。
“補救受體結(jié)合表位”在此指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)內(nèi)的表位，它負責延長體內(nèi)IgG分子血清半衰期。
“處理”指治療性處理和預防或防止措施。那些需要處理的包括已經(jīng)患有疾病或者需要防止疾病的。
就處理目的而言，“哺乳動物”指任何歸類為哺乳動物的動物，包括人、家養(yǎng)和畜牧養(yǎng)的動物，以及觀賞動物、比賽用動物或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、牛等。所述哺乳動物最好是人。
“病癥”指能因用抗ErbB3抗體處理而好轉(zhuǎn)的任何病癥。其中包括慢性或急性病癥，或者包含令哺乳動物發(fā)生該病癥的病理狀況的疾病。一般說來，該疾病是一種存在heregulin對ErbB2-ErbB3蛋白復合物過度激活的疾病。本文中有待處理的疾病包括例如良性和惡性腫瘤；白血病和惡性淋巴瘤；神經(jīng)元性、神經(jīng)膠質(zhì)性、星形細胞性、下丘腦性和其它腺體性、巨噬細胞性、上皮性、基質(zhì)性和囊胚性疾?。灰约把装Y、血管源性和免疫性疾病。
“癌”和“癌性的”指或表示哺乳動物體內(nèi)通常以細胞生長失控為特征的生理情況。癌的例子包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌更特殊的例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)、腎癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)以及各種腦部和頸部癌癥。
“細胞毒劑”在此指抑制或阻止細胞功能和/或?qū)е录毎茐牡奈镔|(zhì)。該術(shù)語傾向于包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化療劑和例如來自細菌、真菌、植物或動物的酶活毒素或其片段。
“化療劑”是用于治療癌癥的化合物?；焺┌ɡ绨⒚顾?Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消胺、細胞毒素、紅豆杉醇、甲氨蝶呤、順氯銨鉑、美法侖、長春堿、博來霉素、依托泊甙、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞賓、卡鉑、替尼泊甙、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線菌素D、絲裂霉素、Esperamicins(參見美國專利4,675,187)、美法侖以及其它氮芥。
“細胞因子”是由對其它細胞起胞間介體作用的細胞群釋放的蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。所述細胞因子例如淋巴因子、單核因子和慣稱的多肽激素。包括在細胞因子中的是生長素，例如人生長素、N-甲硫氨酸人生長素和牛生長素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白類激素，例如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺素(TSH)、和促黃體素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤促乳素；腫瘤壞死因子α和β；穆勒氏抑制物(mullerian-inhibiting substance)；鼠促性腺素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，例如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子Ⅰ和Ⅱ；紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factor)；干擾素，例如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒巨噬細胞-CFS(GM-CFS)；和粒細胞-CFS(G-CFS)；白細胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子，例如TNF-α或TNF-β；以及包括LIF和試劑盒配體(kit ligand(KL))在內(nèi)的其它多肽因子。在本文中，細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)，以及天然序列細胞因子的生物學活性對等物。
“前藥(prodrug)”在此指藥學活性物質(zhì)的前體或衍生形式，其對腫瘤細胞細胞毒性低于親本藥，并且能夠被酶激活或轉(zhuǎn)化成較高活性的親本形式。參見Wilman，“癌癥化療中的前藥”(“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”)，生物化學協(xié)會學報(Biochemical Society Transaction)14,pp.375-382，第615次會議，Belfast(1986)和Stella等，“前藥定靶藥物釋放的化學方法”(“Prodrug:A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery”)，受控藥物釋放(Directed Drug Delivery)，Borchardt等編，pp.247-267,Humana Press(1985)。本發(fā)明的前藥包括，但不限于，含磷酸的前藥、含硫代磷酸的前藥、含硫酸的前藥、含肽的前藥、經(jīng)D-氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含β內(nèi)酰胺的前藥、更適宜取代的苯氧基乙酰胺的前藥或更適宜取代的苯乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前藥，它們可以轉(zhuǎn)化為細胞毒性更高的游離藥?？梢匝苌蔀楸景l(fā)明所用前藥形式的細胞毒性藥包括例如，但不限于，前文所述的化療劑。
“標記”在此指直接或間接與抗體偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。標記可以就其自身被檢測到(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或者，如果是酶標記，它們可催化可檢測化合物或組合物底物的化學轉(zhuǎn)變。
“固相”指本發(fā)明抗體可吸附于其上的非液態(tài)基質(zhì)。固相的例子在此包括部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷構(gòu)成的固相。在有的實施方案中，根據(jù)上下文，固相可能包括測試板的孔；而在其它實施方案中，可能是純化柱(例如親和性色譜柱)。該術(shù)語還包括分散的顆粒構(gòu)成的不連續(xù)固相，如美國專利4,275,149所述。
“脂質(zhì)體”是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，通常被用來向哺乳動物傳遞藥物(例如本文所述的抗ErbB3抗體和優(yōu)選的化療劑)的小囊泡。脂質(zhì)體的組份通常排列成雙層結(jié)構(gòu)，與生物膜的脂排列類似。
“分離的”核酸分子是經(jīng)鑒定的，并且與通常與之相伴存在于該抗體核酸天然來源中的污染核酸分子中至少一種分離的核酸分子。分離的核酸分子不是其天然形式或處于其天然環(huán)境中。所以，分離的核酸分子與存在于天然細胞內(nèi)的核酸分子是不同的。但是，分離的核酸分子包括含于正常表達抗體的細胞內(nèi)的核酸分子，例如，該核酸分子可以位于上不同于天然細胞內(nèi)的位置。
表達“調(diào)控序列”指在特定的宿主微生物內(nèi)表達與之可操作性連鎖的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合原核細胞的調(diào)控序列包括啟動子，優(yōu)選的操縱子序列和核糖體結(jié)合位置。已知，真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和加強子。
當與另外的核酸序列形成功能關(guān)聯(lián)的時候，核酸是“可操縱性連鎖”的。例如，如果表達成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，前導序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA可操作性連鎖；如果它作用于序列的轉(zhuǎn)錄，啟動子或加強子與編碼序列可操作性連鎖；或者，如果它的位置有助于翻譯，核糖體結(jié)合位置與編碼序列可操作性連鎖。一般說來，“可操縱性連鎖”表示連接的DNA序列是鄰接的，而且如果是分泌前導序列，是鄰接而且是讀碼相的。但是，加強子不必是鄰接的。連鎖可以通過常規(guī)限制性位點處的連接作用完成。如果所述的位點不存在，根據(jù)常規(guī)方法，可以使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
在本文中，“細胞”“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”是互換使用的，而且所有這些名稱都包括子代。所以，“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細胞”包括，不計轉(zhuǎn)化數(shù)量，原代所述細胞及由其形成的培養(yǎng)物。還可以理解成，由于特地的或意外的突變，所有子代的內(nèi)含DNA可能不完全一樣。具有相同功能或生物活性的突變子代，例如在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選到的，也包括在內(nèi)。如果有不同的命名，通過上下文可以理解清楚。Ⅱ．本發(fā)明的實施方案A．抗體的制備以下說明所例舉的是產(chǎn)生要求保護的抗體的技術(shù)。
(ⅰ)多克隆抗體多克隆抗體通常是通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動物體內(nèi)生成的。它可以用于利用例如馬來酰亞氨苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中的R和R1是不同的烷基)的雙官能劑或衍生劑將有關(guān)抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，后者例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物。
例如，將100微克或5微克(分別適合兔或小鼠)蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物與3體積Freund完全佐劑混合后在多處皮內(nèi)注射該溶液，如此用抗原、免疫偶聯(lián)物或衍生物免疫動物。一個月后，通過多處皮下注射以原量1/5至1/10的肽或有Freund完全佐劑偶聯(lián)物對動物加強免疫。7至14天后，放出動物的血，分析血清的抗體效價。對動物的加強免疫進行至達到穩(wěn)定效價(titer plateaus)。較好的是，用相同抗原但與不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)反應(yīng)劑偶聯(lián)而成的的偶聯(lián)物加強免疫。偶聯(lián)物還可以在重組細胞內(nèi)制備成融合蛋白的形式。而且，凝聚劑，例如明礬適合用來加強免疫應(yīng)答。
(ⅱ)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本上同源的抗體(即，除了可能存在的少量天然突變之外，構(gòu)成樣群的各抗體是一樣的)制得的。所以，修飾語“單克隆”表示抗體不是不同抗體的混合物這一特性。
例如，單克隆抗體可以用Kohler等，自然256:495(1975)首次公開的雜交瘤方法制得，或者利用重組DNA方法制得(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，鼠或其它合適的宿主動物，例如倉鼠，如前文所述接受免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細胞?；蛘撸梢泽w外免疫淋巴細胞。然后使用合適的融合劑，例如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體理論與實踐(MonoclonalAntibodies:Principles and Practic)pp.59-103(Academic Press)1986)。
將如此制得的雜交瘤細胞接種并培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中最好含有一種或多種抑制非融合親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基中一般含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷這些抑制HGPRT缺陷型細胞生長的物質(zhì)(HAT培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些融合效率高、支持選定的抗體生產(chǎn)細胞穩(wěn)定且高水平地生產(chǎn)抗體、而且對諸如HAT培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，例如來自MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤的(可以由SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California USA獲得)，和SP-2或X63-Ag8-653細胞(可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,Maryland USA獲得)。也有用人骨髓瘤細胞和人-鼠異源骨髓瘤細胞系來生產(chǎn)人單克隆抗體的(Kozbor,免疫雜志(J.Immunol.)133:3001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
分析生長有雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。較好的是，用免疫沉淀法或例如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的體外結(jié)合分析來測定由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
例如，單克隆抗體的結(jié)合親和性可以利用Scatchard分析(Munson等，生物化學年刊(Anal.Biochem.)107:220(1980))來測定。
在雜交瘤細胞經(jīng)鑒定具有生產(chǎn)所要求的特異性、親和性和/或活性的抗體后，可以利用限制性稀釋過程將克隆亞克隆化并利用標準方法培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體理論與實踐(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)pp.59-103(Academic Press)1986)。就此目的而言，合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以以腹水瘤的形式生長在動物體內(nèi)。
利用常規(guī)免疫球蛋白純化技術(shù)，例如A蛋白-瓊脂糖柱(protein A-Sepharose)、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和性色譜，以合適的方式從培養(yǎng)基、腹水液或血清中分離出由亞克隆分泌的單克隆抗體。
使用常規(guī)方法可以方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA并進行測序(例如，利用能與編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是所述DNA的優(yōu)選來源。分離之后，可以將DNA接入表達載體，表達載體然后被轉(zhuǎn)染到例如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或雜交瘤細胞等原本并不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞內(nèi)，以便在重組宿主細胞內(nèi)獲得生成的單克隆抗體。論述在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的文章有Skerra等，現(xiàn)代免疫觀點(Cur.Opinion in Immunol.)5:256-262(1993)和Pluckthum，免疫學綜述(Immunol.Revs.)130:151-188(1992)。
在另一實施方案中，可以從用McCafferty等在自然348:552-554(1990)中所述的技術(shù)建立的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等在自然352:624-628(1991)和Marks等在分子生物子雜志222:581-597(1991)中分別敘述了利用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。此后的出版物敘述了通過鏈改組生產(chǎn)高親和性(nM級)人抗體(Marks等，生物技術(shù)(Biol/Technology)10:779-783(1992))，和以重組感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建極大噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)21:2265-2266(1993))。所以，以上技術(shù)是在常規(guī)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)之外用于分離單克隆抗體的可供選擇的方法。
還可以對DNA進行修飾，例如以人重鏈和輕鏈恒區(qū)的編碼序列代替同源的鼠序列(美國專利4,816,567；Morrison等，美國科學院院報81:6851(1984))，或者將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或一部分與免疫球蛋白的編碼序列共價連接。
通常，非免疫球蛋白多肽被用以替代抗體的恒區(qū)，或者用以替代抗體抗原結(jié)合位置之一的變區(qū)，由此形成嵌合的二價抗體，其中抗原結(jié)合位置之一具有對一抗原的特異性，而另一抗原結(jié)合位置則具有對另一不同抗原的特異性。
(ⅲ)人源化的和人的抗體人源化非人抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的。一般說來，人源化抗體引入有一個或多個非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常被稱為“外來”殘基，它們通常取自“外來”的可變功能區(qū)。人源化可以主要按照Winter及其同事(Jones等，自然321:522-525(1986)；Riechmam等，自然332:323-327(1988)；Verhoeyen等，科學239:1534-1536(1988))的方法，用嚙齒動物CDRs或CDR序列代替人抗體的相應(yīng)序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人可變功能區(qū)非全部地被非人的相應(yīng)序列所取代。實際上，人源化的抗體通常是這樣的人抗體，即其中部分CDR殘基以及可能部分FR殘基被來自嚙齒動物抗體同樣位置的殘基所取代。
選擇用于制造人源化抗體的人可變功能區(qū)，包括重鏈和輕鏈，對于降低抗原性是十分重要的。根據(jù)所謂的“最適合”的方法，用嚙齒動物抗體可變功能區(qū)的序列對整個已知人可變功能區(qū)序列文庫進行篩選。然后以與嚙齒動物序列最近似的人序列作為人源化抗體的人構(gòu)架(FR)(Sims等，免疫學雜志151:2296(1993)；Chothia等，分子生物學雜志196:901(1987))。另一種方法使用來自一特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列作為特定的構(gòu)架。相同的構(gòu)架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國科學院院報89:4285(1992)；Presta等，免疫學雜志151:2623(1993))。
在對抗體人源化的同時保留其對抗原的高親和性和其它優(yōu)良生物特性也是十分重要的。為了達到上述目的，根據(jù)一較好的方法，人源化抗體是用如下方法制備的，即用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物。對于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說，三維免疫球蛋白模型是常用而熟悉的。有這樣的計算機程序，它說明并顯示選定的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢視這些顯示內(nèi)容可以對殘基在候選免疫球蛋白序列功能中可能的作用進行分析，即，分析可能影響候選免疫球蛋白與抗原結(jié)合能力的殘基。如此，可以從受體和外來序列中選出FR殘基并進行組合，由此獲得理想的抗體特性，例如對靶抗原的親和性提高。通常，CDR殘基對于影響與抗原結(jié)合具有直接和最重要的關(guān)系。
或者，現(xiàn)在可以產(chǎn)生在免疫后能夠生產(chǎn)全部人抗體而無內(nèi)源性免疫球蛋白生成的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已有報道，在嵌合和種系突變小鼠內(nèi)抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失造成對內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠內(nèi)將在以抗原攻擊后生產(chǎn)出人抗體。參見，例如，Jakobovits等，美國科學院院報90:2551(1993)；Jakobovits等，自然362:255-258(1993)；Bruggermann等，免疫學的一年(Year in Immuno)7:33(1993)。人抗體還可以是來自噬菌體顯示文庫的(Hoogenboon等，分子生物學227:381(1991)；Marks等，分子生物學222:581-597(1991))。
(ⅳ)抗體片段已經(jīng)有了各種方法生產(chǎn)抗體片段。通常，所述片段是通過用蛋白酶消化完整的抗體而得到的(參見Morimoto等，生物化學和生物物理學方法雜志(Journal ofBiochemical and Biophysical Methods)24:107-117(1992)和Brennan等，科學229:81(1985))。但是，現(xiàn)在，抗體片段可以直接由重組宿主細胞產(chǎn)生。例如，抗體片段可以分離自前述抗體噬菌體文庫?；蛘?，可以直接從大腸桿菌回收Fab’-SH片段，然后化學偶合成F(ab’)2片段(Carter等，生物技術(shù)10:163-167(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab’)2片段可以從重組宿主細胞培養(yǎng)物中直接分離得到。生產(chǎn)抗體片段的其它方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的。
(ⅴ)雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩個不同的表位具有結(jié)合特異性的抗體。例舉的雙特異性抗體可能與兩個不同的ErbB3蛋白表位結(jié)合。其它此類抗體可能是將一個ErbB3結(jié)合位置與EGFR、ErbB2和/或ErbB4的結(jié)合位置組合?；蛘?，抗ErbB3臂可與結(jié)合在白細胞表面的觸發(fā)分子的臂組合，后者例如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受體(FcγR)例如FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16)，以使細胞防御機制主要針對ErbB3表達細胞。雙特異性抗體還可以用于將細胞毒劑定位于表達ErbB3的細胞。所述抗體具有結(jié)合ErbB3的臂和結(jié)合細胞毒劑(例如皂草素、抗α干擾素、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。全長雙特異性抗體的常規(guī)生產(chǎn)方法是基于共表達兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中的兩鏈具有不同的特異性(Millstein等，自然305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，雜交瘤(四交瘤(quadromas))可能產(chǎn)生10種不同抗體的混合物，只有其中之一具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化，一般通過親和色譜進行，十分繁瑣，而且產(chǎn)率很低。WO93/08892和Traunecker等在歐洲生物學雜志10:3655-3659(1991)中公開了類似的方法。
根據(jù)另一種方法，具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位置)的抗體可變功能區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。最好是與免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)融合，包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。較好的是，至少融合體之一具有包含輕鏈結(jié)合所必需的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及視需要而定的免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染到合適的宿主微生物中。當在構(gòu)建中使用比例不等的三條多肽可得到最佳得率時，這為在實施中調(diào)節(jié)三條多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。但是，當表達比例相等的至少兩條多肽鏈具有高的得率，或者比例并不特別重要時，可以將兩條或全部三條多肽鏈的編碼序列插入在同一表達載體內(nèi)。
在這種方法較好的實施方案中，雙特異性抗體的一條臂上有具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，另一臂上有雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，這種不對稱結(jié)構(gòu)有助于將所需的雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合分離，因為免疫球蛋白輕鏈只存在于雙特異性分子的一半將方便分離。WO94/04690公開了所述方法。有關(guān)產(chǎn)生雙特異性抗體的其它細節(jié)可參見例如Suresh等，酶學方法(Methods in Enzymology)121:210(1986)。
根據(jù)另一種方法，一對抗體分子之間的界面可以經(jīng)改造使得從重組細胞培養(yǎng)物中回收得到的異源二聚體百分比達到最大。較好的界面包括至少一對抗體恒定區(qū)的CH3功能區(qū)。在該方法中，第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通過以小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)取代大氨基酸側(cè)鏈在第二抗體分子的界面形成大小與大側(cè)鏈近似或相同的補償“穴”。這提供了一種使得異源二聚體得率高于其它不需要的終產(chǎn)物例如同源二聚體的機制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，異源偶聯(lián)體的抗體之一可以與親和素偶合，另一個與生物素偶合。已經(jīng)有人提出用這樣的抗體令免疫系統(tǒng)細胞有目標地針對不希望其存在的細胞(美國專利4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可以利用任何常規(guī)交聯(lián)法來制備。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，在美國專利4,676,980中公開了所述的交聯(lián)劑以及一系列交聯(lián)技術(shù)。
文獻中還記述了由抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以利用化學鍵來制備雙特異性抗體。Brennan等，科學229:81(1985)敘述了一種將完整的抗體蛋白酶解切割成F(ab’)2片段的方法。所述片段在二硫酚絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在下被還原，以穩(wěn)定化連二硫酚和防止形成分子間二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(NTB)衍生物。然后將Fab’-NTB衍生物之一以巰基乙胺還原成Fab’-硫醇，并與等摩爾量的另一Fab’-NTB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所形成的抗體可以用作酶的選擇性固定化劑。
最新的技術(shù)發(fā)展方便了直接從大腸桿菌回收可以通過化學偶合形成雙特異性抗體的Fab’-SH片段。Shalaby等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med)175:217-225(1992)敘述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的生產(chǎn)。各Fab’片段由大腸桿菌分別分泌，并經(jīng)受控的體外化學偶合形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過量表達HER2受體的細胞和正常人T細胞，并能夠觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞對人乳房癌靶細胞的溶解活性。
各種直接由重組細胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性片段的技術(shù)也是已知的。例如，已有人用亮氨酸拉鏈生成了雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜志148(5):1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩個不同抗體的Fab’部分連接。該抗體同源二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后從新氧化成抗體異源二聚體。該方法還可以被用來產(chǎn)生抗體同源二聚體。Hollinger等在美國科學院院報90:6444-6448(1993)中所述的“間抗體”技術(shù)提供了另一種制造雙特異性抗體片段的機制。所述片段包含由一接頭將輕鏈可變功能區(qū)(VL)連接的重鏈可變功能區(qū)(VH)，接頭很短以致于同一鏈上的兩個功能區(qū)之間無法配對。所以，同一片段上的VH和VL功能區(qū)被迫與其它片段上的互補性VL和VH功能區(qū)配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位置。利用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體的其它方法也已有所報道。參見Gruber等，免疫學雜志152:5368(1994)。
可考慮使用二價以上的抗體。例如抗原制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學雜志147:60(1991)。
(ⅵ)篩選具有要求特性的抗體上文敘述了產(chǎn)生抗體的技術(shù)。被選出的是具有在此所述的特性的抗體。
為了選擇減少HRG誘導的ErbB2-ErbB3蛋白復合物形成的抗體，可以將表達上述兩種受體的細胞(例如Caov3細胞)與緩沖液(對照)或抗體預培養(yǎng)，然后用HRG或?qū)φ站彌_液處理。然后細胞被裂解，可以將粗裂解液離心以去除不溶性物質(zhì)。上清液與共價固定于固相的ErbB2特異性抗體一起孵育。洗滌后，通過SDS-PAGE分離出免疫沉淀物。然后用抗ErbB3抗體檢測凝膠的Western印跡。顯影后，可將印跡雜交揭下并用抗ErbB2抗體再檢測。為了定量測定所述抗體對HRG誘導的復合物的形成的影響，可以對凝膠進行反射比掃描光密度測定。由此，可以選出與對照未處理細胞相比降低了ErbB2-ErbB3復合物形成的抗體。參見后文實施例。
為了選擇在表達ErbB2和ErbB3受體的細胞內(nèi)有降低HRG誘導的ErbB2激活作用的抗體，該細胞可與緩沖液(對照)或抗體預培養(yǎng)，然后用HRG或?qū)φ站彌_液處理。然后裂解細胞，粗裂解液可經(jīng)離心去除不溶性物質(zhì)。如后文實施例所述，通過Western印跡雜交，然后用抗磷酸酪氨酸抗體來測定ErbB2激活作用。ErbB2激活作用可以通過例如對該凝膠的反射比掃描光密度測定法來定量?；蛘撸琖O95/14930和Sadick等在分析生物化學235:207-217(1996)中所述的激酶受體激活作用分析法可以用來測定ErbB2激活作用。
如后文實施例所述，抗體對結(jié)合ErbB3的HRG的作用可以通過在沒有(對照)和有抗ErbB3抗體存在下將表達這些受體的細胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)染后表達ErbB3的4E9H3細胞)與放射性標記的HRG(例如其EGF樣功能區(qū))一起培養(yǎng)來測定。那些提高HRG對ErbB3受體親和性的抗體可以被選用于進一步的開發(fā)。如果要選擇的抗體是封閉HRG與ErbB3結(jié)合的抗體，在該分析中這樣的抗體可以被鑒定出來。
為了篩選與被目的抗體結(jié)合的ErbB3上表位結(jié)合的抗體(例如封閉3-8B8抗體與ErbB3結(jié)合的抗體)，可以進行如《抗體，實驗室手冊》(Antibodies,A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane編(1988)中所述的常規(guī)交叉封閉分析。
(ⅶ)效應(yīng)物功能改造可能需要就效應(yīng)物功能對本發(fā)明抗體進行修飾，從而加強抗體在例如治療癌癥中的效果。例如，可在Fc區(qū)內(nèi)引入半胱氨酸殘基，由此允許在該區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此形成的同源二聚體抗體可以具有改善的內(nèi)在能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷性和抗體依賴性細胞毒性(ADDC)。參見Caron等，實驗醫(yī)學雜志176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,免疫學雜志148:2918-2922(1992)。加強了抗癌活性的同源二聚體抗體還可以如Wolff等在癌癥研究(CancerResearch)53:2560-2565(1993)中所述利用異源雙功能(heterobifunctional)交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可以經(jīng)改造后具有兩個Fc區(qū)，并由此加強其補體裂解性和ADDC能力。參見Stevenson等，抗癌藥的設(shè)計(Anti-Cancer Drug Design)3:219-230(1989)。
(ⅷ)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及包含與細胞毒劑偶聯(lián)的所述抗體的免疫偶聯(lián)物，細胞毒劑例如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶聯(lián)物)。
用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑已在前文論述過?？梢允褂玫拿富钚远舅鼗蚱淦伟ò缀矶舅谹鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、modeccin A鏈、α八疊球菌素(αsarcin)、油桐蛋白、dianthin蛋白、美商路(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPⅡ和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、gelonin、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢菌素(tricothecenes)。有多種放射性核素可用于生成放射性偶聯(lián)的抗ErbB3抗體。例如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗體與細胞毒劑的偶聯(lián)物是用多種雙官能蛋白偶合劑制備的，后者例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫代戊環(huán)(iminothiolane)(IT)、亞胺酯的雙官能衍生物(例如己二亞氨酸二甲酯鹽酸鹽)、活潑酯(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮基化合物(例如二(對疊氮基苯甲酰)己二胺)、二重氮衍生物(例如二-(對重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)和二活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等在科學238:1098(1987)中所述的方法來制備。碳14標記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一例用于將放射性核素與抗體偶聯(lián)的螯合劑。參見WO94/11026。
在另一實施方案中，為了用于腫瘤導向，抗體可以與“受體”(例如鏈霉親和素)偶聯(lián)，此時，給患者使用抗體-受體偶聯(lián)物，接著用清洗劑去除循環(huán)系統(tǒng)中的未被結(jié)合的偶聯(lián)物，然后使用與細胞毒劑(例如放射性核素)偶聯(lián)的“配體”(例如親和素)。
(ⅸ)免疫脂質(zhì)體本處所述的抗ErbB3抗體還可以制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體是利用本領(lǐng)域已知方法制備的，例如以下所述Epstein等，美國科學院院報82:3688(1985)；Hwang等，美國科學院院報77:4030(1980)；和美國專利4,485,045和4,544,545。美國專利5,013,556公開了延長了循環(huán)時間的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可以通過含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)生成。將脂質(zhì)體擠壓通過一定孔徑的濾器形成具有所需直徑的脂質(zhì)體。如Martin等在生物化學雜志257:286-288(1982)中所述，可通過二硫置換反應(yīng)將本發(fā)明中抗體的Fab’片段與脂質(zhì)體偶聯(lián)。脂質(zhì)體中可以包含化療劑(例如阿霉素)。參見Gabizon等，國立癌癥研究所雜志(J.NationalCancer Inst.)81(19)1481(1989)。
(ⅹ)抗體依賴性酶介導的前藥療法(ADEPT)通過將抗體與可將前藥(例如肽基化療劑，參見WO81/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥物的前藥激活酶偶聯(lián)，本發(fā)明的抗體還可以用于ADEPT。例如，可參見WO88/07378和美國專利4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組份包括任何能以此途徑激活前藥以使之轉(zhuǎn)為它的更激活、更有細胞毒性的形式的酶。用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物中的酶組份包括，但不限于，用于將含磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的堿性磷酸酶；將含硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的芳基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥5-尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基蛋白酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)化含D氨基酸取代基的前藥的D-丙胺酰基羧基肽酶；用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的糖切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥的β-內(nèi)酰胺酶；和用于分別將在其胺氮原子上帶有苯氧基乙?；虮交阴；鶊F的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶?；蛘?，可以用具有酶活性的抗體(在本領(lǐng)域中又稱“抗體酶”)將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化成游離的活性藥(參見Massey，自然328:457-458(1987))?？梢匀绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物，用于向腫瘤細胞群傳遞抗體酶。
本發(fā)明的酶可以利用本領(lǐng)域的公知技術(shù)與抗ErbB3抗體共價結(jié)合，例如利用前文所述的異源雙官能交聯(lián)劑?；蛘?，利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建這樣的融合蛋白，包含與本發(fā)明酶的至少一個功能性活性位置連接的至少本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合區(qū)(參見Neuberger等，自然312:604-608(1984))。
(ⅹⅰ)抗體-補救受體結(jié)合表位融合體在本發(fā)明部分實施方案中，可能宜采用抗體片段而不是完整的抗體來加強對腫瘤的穿透。此時，為了延長它的血清半衰期可能需要對抗體片段加以修飾。這可以通過例如在抗體片段中加入補救受體結(jié)合表位來做到(例如，通過抗體片段對應(yīng)區(qū)的突變，或通過將表位加到肽標記中，然后通過例如DNA或肽合成將肽標記融合在抗體片段的兩端或中部)。
制備此類體內(nèi)半衰期延長的抗體變體的合成方法包括數(shù)個步驟。首先是鑒定IgG分子Fc區(qū)的補救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)象。鑒定了該表位后，對目的抗體的序列進行修飾以包含被鑒定結(jié)合表位的序列和構(gòu)象。在序列突變之后，檢測抗體變體，看它的體內(nèi)半衰期是否比原抗體長。如果抗體變體在測試中的體內(nèi)半衰期并未延長，其序列進一步被改變以包含被鑒定結(jié)合表位的序列和構(gòu)象。改變后的抗體再就體內(nèi)半衰期的延長接受測試，該過程持續(xù)直至獲得表現(xiàn)出體內(nèi)半衰期延長的分子。
如此加到目的抗體中的補救受體結(jié)合表位是任何合適的前文定義的表位，其質(zhì)性取決于例如被修飾抗體的類型。轉(zhuǎn)移的進行需使目的抗體仍然具有前述活性。
所述表位通常構(gòu)成這樣一個區(qū)域，在其中，F(xiàn)c功能區(qū)一個或兩個環(huán)的一個或多個氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的相同位置。更好的是，F(xiàn)c功能區(qū)一個或兩個環(huán)的三個或更多個殘基被轉(zhuǎn)移。還要好的是，表位來自(例如IgG的)Fc區(qū)的CH2功能區(qū)，被轉(zhuǎn)移到抗體的CH1、CH3或VH區(qū)，或一個以上的此類區(qū)域。或者，表位來自Fc區(qū)的CH2功能區(qū)，被轉(zhuǎn)移到抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)?；駽1和VL兩個區(qū)。
在最好的一種實施方案中，補救受體結(jié)合表位包含序列(5’至3’)PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:1)，還可以再包含選自以下組的序列HQSLGTQ(SEQ ID NO:2)、HQNLSDGK(SEQ ID NO:3)、HQNISDGK(SEQ IDNO:4)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:5)，尤其是當抗體片段是Fab或F(ab’)2時。在另一種最好的實施方案中，補救受體結(jié)合表位是具有以下序列(5’至3’)的多肽，包含序列HQNLSDGK(SEQ ID NO:3)、HQNISDGK(SEQ ID NO:4)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:5)和PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:1)。
B．載體、宿主細胞和重組方法本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述抗體的分離的核酸，包含該核酸的載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生抗體的重組技術(shù)。
為了重組產(chǎn)生抗體，其編碼核素被分離出來并插入到用于進一步克隆(擴增DNA)或表達的復制載體中。利用常規(guī)技術(shù)可方便的分離出編碼單克隆抗體的DNA并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。有許多載體可以使用。載體的組成通常包括，但不限于，以下之一或幾個信號序列，復制起點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(ⅰ)信號序列組成本發(fā)明的抗ErbB3抗體不僅可以利用重組法直接制得，也可以是帶異源多肽的融合多肽，異源多肽最好是在成熟蛋白或多肽的N末端具有一個特異性切割位置的信號序列或其它多肽。異源信號序列最好是被宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切割)的序列。對不識別和加工天然抗ErbB3抗體的信號序列的原核宿主細胞來說，信號序列被替代成選自以下組的原核信號序列，例如堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定性腸毒素Ⅱ前導序列。為了能被酵母菌分泌，天然信號肽可以替代以例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導序列，α因子前導序列(包括酵母菌屬和克魯維酵母屬的α因子前導序列)，或酸性磷酸酶前導序列，C.albicans葡糖淀粉酶前導序列或Wo90/13646所述的信號序列。在哺乳動物的細胞表達中，可以使用哺乳動物信號序列和病毒分泌前導序列，例如單純皰疹病毒gD信號序列。
此類前導區(qū)的DNA以讀碼框的形式與編碼抗ErbB3抗體的DNA連接。
(ⅱ)復制起點表達載體和克隆載體都含有能夠使得載體在一種或多種所選宿主細胞中復制的核酸序列。一般說來，克隆載體內(nèi)的所述序列能夠使得載體不依賴于宿主的染色體DNA來復制，它包含復制起點或自主復制序列。多種細菌、酵母和病毒的這類序列是公知的。質(zhì)粒pBR322的復制起點適用于大多數(shù)革蘭氏陰性菌，2μ質(zhì)粒的復制起點適用于酵母，各種病毒(例如SV40，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)的復制起點適用于哺乳動物細胞中的克隆載體。一般說來，哺乳動物表達載體不需要復制起點(通常，使用SV40復制起點只是因為它含有早期啟動子)。
(ⅲ)選擇基因表達和克隆載體可能含有選擇基因，又稱可選擇標記。典型的選擇基因編碼如下蛋白(a)提供抗生素或毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)抗性，(b)補足營養(yǎng)缺陷，或者(c)提供無法從復合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素(例如編碼桿菌D丙氨酸消旋酶的基因)。
選擇法實例之一使用藥物來阻止宿主細胞的生長。用異源基因轉(zhuǎn)化成功的細胞產(chǎn)生提供抗藥性的蛋白，因而能夠經(jīng)選擇過程而存活。這類主要選擇法的實例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一例適合用于哺乳動物細胞的可選擇標記是能夠鑒定出攝取抗ErbB3抗體核酸的細胞組份，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白Ⅰ和Ⅱ，最好是靈長類的金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞通過將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在含氨甲蝶呤(Mtx)的培養(yǎng)基中，進行首次甄別，氨甲蝶呤是DHFR的競爭性拮抗劑。如果使用野生型DHFR，合適的宿主細胞是缺乏DHFR的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，用編碼抗ErbB3抗體、野生型DHFR蛋白和例如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)這樣的另一可選擇標記轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的生長細胞(特別是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)可以通過將細胞培養(yǎng)在含有針對可選擇標記的選擇劑(例如氨基糖甙類抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中來選擇。參見美國專利4,965,199。
一種適用于酵母菌的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7(Stinchcomb等，自然282:39(1979))中的trp1基因。trp1基因為酵母突變株(例如ATCC No.44076或EPP41。Jones，遺傳(Genetics)85:12(1977))不能在色氨酸中生長而提供了選擇標記。所以，酵母宿主細胞基因組內(nèi)的trp1缺陷為通過在無色氨酸條件下的生長來檢測轉(zhuǎn)化作用提供的有效的環(huán)境。類似的，leu2缺陷型酵母株(ATCC 20,622或38,626)由已知的含Leu2基因的質(zhì)粒來補足。
此外，來自1.6微米的環(huán)形質(zhì)粒pKD1的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母菌?；蛘?，據(jù)報道，可將用于大量生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)用于乳酸克魯維酵母菌(K.lactis),Van den Berg，生物技術(shù)8:135(1990)。用于由克魯維酵母工業(yè)株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達載體也已公開。Fleer等，生物技術(shù)9:968-975(1991)。
(ⅳ)啟動子表達和克隆載體通常含有被宿主微生物識別并與抗ErbB3抗體核酸可操作性連鎖的啟動子。適用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和例如tac啟動子這樣的雜交啟動子。但是，其它已知細菌啟動子也是適合的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還含有與編碼抗ErbB3抗體的DNA可操作性連鎖的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核基因都含有位于轉(zhuǎn)錄起始位置上游約25至30個堿基的一段AT豐富區(qū)。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始位置上游70至80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一段序列是CNCAAT區(qū)，其中的N可以是任意核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’末端是AATAAA序列，這可能是在編碼序列3’末端添加聚A尾端的信號。所有以上序列都適合插入真核表達載體中。
適用于酵母菌宿主的合適的啟動序列包括例如3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油酸-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。
其它酵母菌啟動子，即其優(yōu)點還在于轉(zhuǎn)錄受生長條件控制的誘導型啟動子是以下酶的啟動區(qū)乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解性酶、金屬硫蛋白、甘油酸-3-磷酸脫氫酶、和負責麥芽糖和半乳糖的利用的酶。有關(guān)用于酵母菌表達的合適的載體和啟動子還可參見EP73,657。較好地，還可以與酵母菌啟動子一起使用酵母菌加強子。
在哺乳動物宿主細胞內(nèi)從載體轉(zhuǎn)錄抗ErbB3抗體是受例如以下啟動子調(diào)控的，例如來自病毒基因組的啟動子，病毒例如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、B型肝炎病毒和最好的猴病毒40(SV40)，來自異源哺乳動物的啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，來自熱休克啟動子，只要以上提供的啟動子與宿主細胞系統(tǒng)具有相容性。
最好，得到的早期和晚期SV40病毒的啟動子是另含有SV40病毒復制起點的SV40限制性片段。人巨細胞病毒的立即早期啟動子最好是HindⅢ E限制性片段。美國專利4,419,446公開了一種利用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主內(nèi)表達DNA的系統(tǒng)。美國專利4,601,978對此系統(tǒng)進行了改進。另外，有關(guān)在鼠細胞內(nèi)在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子調(diào)控下表達人β干擾素cDNA，可參見Reyes等，自然297:598-601(1982)。或者，Rous肉瘤病毒的長末端重復序列可以用作啟動子。
(ⅴ)增強子元件由高級真核細胞轉(zhuǎn)錄本發(fā)明編碼抗ErbB3抗體的DNA常會因在載體中插入增強子序列而得以增強。現(xiàn)在已經(jīng)知道了許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但是，通常使用的是來自真核細胞病毒的增強子。包括例如位于復制起點晚期側(cè)的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子的增強子，位于復制起點晚期側(cè)的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。另外，有關(guān)激活原核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，自然297:17-18(1982)。增強子可以在載體中拼接在抗ErbB3抗體編碼序列的5’或3’端，但是最好位于啟動子的5’端。
(ⅵ)轉(zhuǎn)錄終止用在真核宿主細胞(酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的成核細胞)內(nèi)的表達載體還包含轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此種序列一般來自真核或病毒DNA或cDMA的5’，有時是3’的非翻譯區(qū)。此種區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄成編碼抗ErbB3抗體的mRNA非翻譯區(qū)內(nèi)聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段?？捎玫霓D(zhuǎn)錄終止(序列)之一是牛生長激素的聚腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026，以及其中公開的表達載體。
(ⅶ)宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化用于克隆和表達載體內(nèi)的DNA的合適宿主細胞是原核細胞、酵母菌、或前述高級真核細胞。適合此目的的原核細胞包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微生物，例如腸桿菌科，如以大腸埃希氏菌為例的埃希氏桿菌屬，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷伯氏桿菌屬，變形桿菌屬，以鼠傷寒沙門氏菌為例的沙門氏菌屬，以粘質(zhì)(地衣型芽胞桿菌于1989年4月12日出版的DD266710中已公開)沙雷氏菌為例的沙雷氏菌屬和志賀氏桿菌屬，以及以枯草芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌為例的芽孢桿菌屬，(地衣型芽胞桿菌于1989年4月12日出版的DD266710中已公開)以綠膿假單孢菌為例的假單孢菌屬，和鏈霉菌屬。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主之一是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但是其它菌株例如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATTC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也可使用。以上只是舉例，而并不局限于此。
除了原核細胞植物，例如絲狀真菌或酵母菌這類真核微生物也是編碼抗ErbB3抗體載體的合適的克隆或表達宿主。在低級真核宿主微生物中，釀酒酵母菌或一般面包酵母是最常用的。但是，許多其它屬、種和菌株也是常用而且可以用于本發(fā)明的，例如栗酒裂殖酵母，以乳酸克魯維酵母菌、K.fragilis(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母菌(ATCC16,045)、K.wicheramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母菌和K.marxianus為例的克魯維酵母屬；yarrowia(EP402,226)；巴斯地畢赤酵母(EP183,070)；念珠菌；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙鏈孢霉；例如許旺酵母的許旺酵母屬；絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、毒霉菌屬、球枝藻屬、和以構(gòu)槽曲霉和黑曲霉為例的曲霉屬宿主。
用于表達糖基化抗ErbB3抗體的合適宿主細胞來自多細胞生物。無脊椎動物細胞包括例如植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定出了多種桿狀病毒株及其變體以及對應(yīng)的來自以下宿主的允許宿主細胞，宿主例如5Podoptera frugiperda(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黃猩猩果蠅(果蠅)和中國桑蠶。許多用于轉(zhuǎn)染的毒株是公開可以得到的，例如Autographa californica NPV的L-1變體和中國桑蠶NPV的Bm-5株，根據(jù)本發(fā)明，所述的病毒尤其適合用作轉(zhuǎn)染Spodoptera frugiperda細胞的病毒。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
但是，最令人感興趣的是脊椎動物細胞，而且以培養(yǎng)(組織培養(yǎng))來增殖脊椎動物細胞已經(jīng)是常規(guī)方法了。可用的哺乳動物宿主細胞系例如經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(為了在懸浮培養(yǎng)物中生長而被亞克隆的293或293細胞，Graham等，基因病毒雜志(J.GenVirol)36:59(1977))；幼年倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等，美國科學院院報77:4216(1980))；鼠塞爾托利細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人子宮癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；狗腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL1442)；人肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2,HB 8065)；鼠乳腺癌腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等,紐約科學協(xié)會記要(Annals N.Y.Acad.Sci.)383:44-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞和人肝癌細胞系(Hep G2)。
宿主細胞用前述用于生產(chǎn)抗ErbB3抗體的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化，然后培養(yǎng)在為了誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因而改變過的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
(ⅷ)培養(yǎng)宿主細胞用于生產(chǎn)本發(fā)明抗ErbB3抗體的宿主細胞可以培養(yǎng)在多種培養(yǎng)基中。商品化的培養(yǎng)基例如Ham氏F10培養(yǎng)基(Sigma)，基本必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma),RPMI-1640(Sigma),和Dulbecco氏改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)Sigma)適合用于培養(yǎng)所述的宿主細胞。此外，任何一種以下所述的培養(yǎng)基都可以用作培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基Ham等，酶學方法(Meth.Enz.)58:44(1979),Barnes等，生物化學學報(Anal.Biochem)102:255(1980),美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195或美國專利Re.30,985。根據(jù)需要,任何上述培養(yǎng)基都可以補充以激素和/或其它生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白、或上皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素(GENTAMYCINTM))、微量元素(即存在時的最終濃度通常為微摩爾級的無機化合物)和葡萄糖或與之相當?shù)哪芰吭?。任何其它必需的補償成份也可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當濃度包括在內(nèi)。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等和過去用于培養(yǎng)選用于表達的宿主細胞時一樣，而且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
(ⅸ)抗ErbB3抗體的純化在使用重組技術(shù)時，抗體可以產(chǎn)生在細胞內(nèi)、壁膜間隙內(nèi)或直接分泌在培養(yǎng)基中。如果抗體生成在細胞內(nèi)，第一步是通過例如離心或超濾去除顆粒狀碎片(或者是宿主細胞或者是裂解片段)。Cater等在生物技術(shù)10:163-167(1992)中敘述了分離分泌在大腸桿菌壁膜間隙內(nèi)的抗體的方法。簡而言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下用約30分鐘融解細胞糊。細胞碎片可以通過離心去除。如果抗體分泌在培養(yǎng)基中，通常，首先用購得的蛋白質(zhì)濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)將得自此類表達系統(tǒng)的上清液濃縮?？梢栽谌魏吻笆霾襟E中加入諸如PMSF這樣的蛋白酶抑制劑以抑制蛋白酶解，并加入抗生素以阻止外來污染菌的生長。
由細胞制得的抗體組合物可以利用例如羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析和親和色譜來純化，其中親和色譜是最好的純化技術(shù)。A蛋白是否適合用作親和性配體取決于存在于抗體中的免疫球蛋白Fc功能區(qū)的種類和同種型。A蛋白可以用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學方法雜志(J.Immunol.Meth.)62:1-13(1983))。G蛋白可推薦用于所有的鼠同種型和人γ3(Guss等，歐洲生物學雜志5:1567-1575(1986))。固定親和性配體的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是也可以用其它基質(zhì)。機械性能穩(wěn)定的基質(zhì)例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以獲得比瓊脂糖快的流率和較短的處理時間。如果抗體包含CH3功能區(qū)，可以使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker,Philipshburg,NJ)來純化。根據(jù)回收的抗體，也可以使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如在離子交換柱上分離、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠柱色譜、肝素SepharoseTM上的色譜、陰離子或陽離子交換樹脂上的色譜(例如聚天冬氨酸色譜柱)、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何預備純化步驟之后，可以對包含目的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水性色譜，用pH在約2.5-4.5的洗脫緩沖液進行，最好在低鹽濃度(例如約0-0.25M的鹽)下進行。
C．藥物制劑為了便于保存，可以通過將具有要求純度的抗體與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制成凍干制劑或水溶液形式的抗體治療用制劑(《雷明頓藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.編(1980))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對接受者是無毒的，它們包括例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸的緩沖液；包括維生素C和甲硫氨酸在內(nèi)的抗氧化劑；防腐劑(例如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；氯化苯甲烴銨；氯化芐乙氧銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫TMPluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
本發(fā)明制劑還可以包含一種以上治療特殊狀況所需的活性混合物，它們最好具有互補的活性但是不相互產(chǎn)生負影響。例如，在某制劑中可能需要進一步提供與EGFR、ErbB2、ErbB4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的抗體?；蛘?，除此之外，組合物還包含化療劑或細胞因子。所述分子，以適合各自預定目的所需的有效含量相互組合。
活性成份還可以包裹在分別通過凝聚法或界面聚合法制備的例如羥甲基纖維素或明膠膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。亦可在膠態(tài)藥物釋放系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微珠、微乳液、毫微顆粒和毫微膠囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《(雷明頓藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.編(1980))中敘述了此類技術(shù)。
用于體內(nèi)使用的制劑必須是無菌的。通過滅菌濾膜過濾可以方便地做到這一點。
可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑包括例如包含所述抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)體，所述的基質(zhì)體是有形的物體，例如膜形或微膠囊。合適的緩釋基質(zhì)體包括例如聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、諸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate組成的可注射微球)之類可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類聚合物能夠使分子釋放持續(xù)100天以上，有些水凝膠可在較短的時間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。當膠囊化的抗體在體內(nèi)保留較長時間時，它們可能會因為在37℃接觸水分而變性或凝聚，結(jié)果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改變。根據(jù)有關(guān)的機制可以設(shè)計出合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚機制是通過硫-二硫鍵置換反應(yīng)而形成了分子間的S-S鍵，穩(wěn)定化可以是通過修飾巰基殘基，低溫干燥酸性溶液，控制含水量，使用合適的添加劑和設(shè)計特殊的聚合基質(zhì)組合物而達到。
D．抗體的非治療性用途本發(fā)明的抗體可以用作親和純化試劑。在這種方法中，抗體利用本領(lǐng)域公知的方法固定在例如Sephadex樹脂或濾紙的固相上。被固定的抗體與待純化的含ErbB3蛋白(或其片段)的樣品接觸，然后用合適的溶劑洗滌載體，所述的溶劑能夠基本上去除樣品中除了與固定化抗體結(jié)合的ErbB3蛋白之外所有其它物質(zhì)。最后，用另一種能將ErbB3蛋白從抗體上釋放的溶劑洗滌載體，例如pH5.0的甘氨酸緩沖液。
抗ErbB3抗體還可以用作對ErbB3蛋白的診斷性分析中，例如檢測其在特定細胞、組織或血清中的表達。這樣，該抗體可以用于診斷人惡性腫瘤(參見美國專利5,183,884)。
用于診斷時，抗體通常用一可檢測部分標記。有許多標記可以使用，它們可以大致如下分類(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I?？梢岳美纭冬F(xiàn)代免疫學方法)》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷，Coligen等編，Wiley-Interscience,New York,New York,Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素來標記抗體，放射性可以利用閃爍計數(shù)法來測定。
(b)熒光標記，例如稀土螯合劑(銪螯合劑)或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰，麗絲胺，藻紅素和德克薩斯紅(Texas red)。熒光標記可以利用例如上文《現(xiàn)代免疫學方法》中所述的方法與抗體偶聯(lián)。熒光可以利用熒光計來定量。
(c)各種酶底物標記，美國專利4,275,149公開了其中部分。所述的酶通常催化可以用各種技術(shù)測定的生色底物的化學改變。例如，酶催化底物的顏色變化，這種變化可以用分光光度計來測定?；蛘?，酶改變底物的熒光性或化學發(fā)光性。前文已經(jīng)說明了定量測定熒光變化的技術(shù)?；瘜W發(fā)光底物因化學反應(yīng)而被電激發(fā)，并由此發(fā)光，發(fā)出的光可以被測定(例如利用化學光度計)或向熒光受體供能。酶標記包括例如螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利4,737,456)，螢光素，2,3-二氫二氮雜萘二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)，蘋果酸脫氫酶，脲酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過氧化物酶，微過氧化物酶等。O’Sullivan等在“制備用于酶免疫分析的酶-抗體偶聯(lián)物的方法”，《酶學方法》(“Methods forthe Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for usein Enzyme Immunoassay”(Methods in Enzym.)(J.Langone和H.Van Vunakis編)，Academic press,New York,73:147-166(1981)中描述了酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。
酶-底物的組合物包括，例如(ⅰ)辣根過氧化物酶(HRPO)和作為底物的氫過氧化物酶，其中的氫過氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB))；(ⅱ)堿性磷酸酶(AP)和作為生色底物的對硝基苯磷酸；(ⅲ)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如對硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或熒光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說還有許多其它酶-底物組合。對這些組合的可總的參見美國專利4275149t 4318980。有時，標記物與抗體間接偶聯(lián)。技術(shù)人員也知道各種獲得所述組合的方法。例如，抗體可以與生物素偶聯(lián)，上述三大類標記中的任何一種都可以與親和素偶聯(lián)，或者正相反。生物素選擇性地結(jié)合親和素，標記可以間接方式與抗體偶聯(lián)。或者，為了將標記與抗體間接偶聯(lián)，抗體可以與小的半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，而上述不同類型的標記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。這樣就獲得的標記與抗體的間接偶聯(lián)。
在本發(fā)明另一實施方案中，抗ErbB3抗體不必被標記，其存在可以利用標記過的結(jié)合該ErbB3抗體的抗體來檢測。
本發(fā)明抗體可以用在任一種已知的分析方法中，例如競爭性結(jié)合分析，直接或間接夾心分析和免疫沉淀分析。Zola,《單克隆抗體技術(shù)手冊》(MonocloneAntibodies:A Manual of Techniques),PP.147-158(CRC Press,Inc.,1987)。
競爭性結(jié)合分析依賴于標記過的標準物與被測樣品中分析物競爭結(jié)合有限量抗體的能力。被測樣品中ErbB3蛋白的量與與抗體結(jié)合的標準物的量成反比。為了方便測定被結(jié)合標準物的量，通常令抗體在競爭前或競爭后不溶解，這樣就可以方便地將與抗體結(jié)合的標準物和分析物與未結(jié)合的標準物和分析物分離。
夾心分析法涉及使用兩種抗體，各自結(jié)合待測蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夾心分析中，被測樣品分析物與固定在固體載體上的第一抗體結(jié)合，然后第二抗體與分析物結(jié)合，由此形成不溶性三部分復合物。參見美國專利4,376,110。第二抗體本身可以是用可檢測部分標記過的(直接夾心分析法)，或者利用以可檢測部分標記的抗免疫球蛋白抗體來測定(間接夾心分析法)。例如，夾心分析法之一是ELISA，其中的可檢測部分是酶。
對于免疫組織化學來說，腫瘤樣品可以是新鮮的或者冷凍的或者包在石蠟和以福爾馬林之類防腐劑固定的。
抗體還可以用于體內(nèi)診斷分析。通常，以放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標記抗體，使得可以利用免疫閃爍照相術(shù)來定位腫瘤。
E．診斷試劑盒為了方便，本發(fā)明抗體可以試劑盒的形式提供，即一定量的反應(yīng)劑與進行診斷分析的說明書的包裝組合。如果抗體是用酶標記的，試劑盒將包含酶所需的底物和輔因子(例如提供可測定的生色團和熒光團的底物前體)。此外，還可能包括其它添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖劑或裂解緩沖劑)等。為了使所提供的試劑濃度能使得分析的靈敏度最高，各種試劑的相對量變化很大。具體地說，試劑可以是干粉，通常是凍干粉末形式的，可包括賦形劑在內(nèi)，它們一經(jīng)溶解將形成具有合適濃度的試劑溶液。
F．抗體的治療用途本發(fā)明的抗ErbB3抗體被認為可以用于治療這樣的病癥，即發(fā)生了ErbB2-ErbB3復合物的過度激活，尤其是當所述的激活作用是由heregulin多肽介導的。可以用ErbB3抗體治療的病況和疾病包括例如良性或惡性腫瘤(例如腎的、肝、腎膀胱、乳房、胃的、卵巢、結(jié)腸直腸、胰腺的、肺、外陰、甲狀腺、肝癌；肉瘤；惡性膠質(zhì)瘤和各種頭頸部腫瘤)；白血病和惡性淋巴瘤；其它疾病例如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔疾??；和炎癥、血管生成性和免疫性疾病。
本發(fā)明抗體利用已知方法給哺乳動物，最好是人使用，所述方法例如靜脈內(nèi)的(例如靜脈注射濃縮藥團(bolus)或在一段時間內(nèi)連續(xù)輸注)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦脊髓腔內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)注射、口服、局部或吸入途徑使用。優(yōu)選的是靜脈內(nèi)給抗體。
其它緊急方案可以與使用本發(fā)明抗ErbB3抗體相結(jié)合。例如，用本發(fā)明抗體治療的患者可以同時接受放射物治療?；蛘?，另外給患者使用化療劑。所述化療劑的制備和劑量方案可以根據(jù)制造商的說明，或者由有經(jīng)驗的技術(shù)人員評經(jīng)驗來確定。這類化療的制備和劑量方案在Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams和Wilkins,Baltimore,MD(1992)中也敘述了?；焺┛梢栽谑褂每贵w之前或之后使用，也可以同時使用。
較好的還可以使用抗其它腫瘤相關(guān)性抗原的抗體，例如結(jié)合EGFR,ErbB2,ErbB4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抗體?？梢越o患者同時使用兩種或兩種以上抗ErbB3抗體。或者，還可以再給患者使用一種或多種細胞因子。
對于為了預防或治療疾病來說，抗體的合適劑量將取決于上述定義的被治疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、抗體給予是用來預防還是用來治療、以前的治療、患者病史和對抗體的應(yīng)答性，以及主治醫(yī)師的處方?jīng)Q定?？贵w適合一次性或系列地給患者使用。
根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，不論是一次或多次分開給藥，還是連續(xù)輸注，1微克/公斤至15毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗體是給患者使用的最初候選劑量。典型的日劑量可能在約1微克/公斤至100毫克/公斤或以上，這取決于上述提到的因素。對于幾天或更長時間內(nèi)的重復給藥(這取決于病況)來說，治療需持續(xù)至出現(xiàn)疾病癥狀有所期望的抑制。但是，也可以使用其它給藥方案。所述治療的進展可以方便地利用常規(guī)技術(shù)和分析方法來監(jiān)測。
G．產(chǎn)品本發(fā)明另一實施方案提供了一種含有用于治療上述疾病的材料的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括容器和標簽。合適的容器包括例如普通瓶、藥瓶、注射器和試管。容器可以用各種材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治療疾病的有效組合物，并具有一個無菌的出人口(例如容器可以是具有一個塞子的靜脈輸液袋或藥瓶，該塞子可用皮下注射針頭穿透)。該組合物中的有效成份是抗ErbB3抗體。容器上或與容器相聯(lián)的標簽說明組合物是用于治療特定病癥的。產(chǎn)品還可以含有另一個容器，其中包含藥學上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根據(jù)商業(yè)上的需要或使用者的需要，它還可以包括其它材料，例如其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，注射管，包裝附屬品，以及使用說明。
H．材料的保藏以下雜交瘤細胞系已經(jīng)在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA(ATCC)保藏雜交瘤/抗體名稱ATCC No.保藏日期8B8HB-120701996年3月12日以上保藏是根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定及其有關(guān)條款進行的。由此保證培養(yǎng)物在自保藏日起的30年內(nèi)有活性。根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定以及Genentech Inc.與ATCC簽定的協(xié)定，可向ATCC獲得所述細胞系，所述協(xié)定保證(a)在本專利授權(quán)之前，由有關(guān)專員根據(jù)37CFR§1.14和35USC§122決定是否可以獲得所述培養(yǎng)物，(b)一旦被授予了專利權(quán)，有關(guān)公眾獲得被保藏的培養(yǎng)物的所有限制都將從此永遠消除。
本申請的受讓人同意，如果在適宜的培養(yǎng)條件下，保藏的培養(yǎng)物死亡、丟失或損傷，將在得到通知后立即替換以相同培養(yǎng)物的活性樣品。可以獲得被保藏的細胞系不應(yīng)理解成由此可以違反各國政府機關(guān)根據(jù)其專利法授予的權(quán)利來實施本發(fā)明。
以上書面說明應(yīng)該足以使得本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明的范圍并不局限于被保藏的培養(yǎng)物，因為所保藏的只是本發(fā)明內(nèi)容之一的一個證明，任何功能上與此相當?shù)呐囵B(yǎng)物都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。此處材料的保藏并不是承認此處的說明書不足以使得本發(fā)明的任何內(nèi)容，包括最佳實施方案得以實施，也不應(yīng)該將它理解成將權(quán)利要求的范圍局限于文中具體的說明。實際上，根據(jù)前文所述，除了文中所示和所述的之外，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說，都將通過前面的描述中變得顯而易見，這些都屬于本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
關(guān)于歐洲專利申請的指定國，在公告被授予歐洲專利權(quán)或申請被駁回或撤回或視為撤回之日前，被保藏微生物的樣品只能發(fā)放給由樣品請求人指定的專家來獲得。(EPC第28(4))以下實施例是對本發(fā)明的說明而非限定。在本說明書中引用的所有公開文獻都已清楚地表明在此引作參考。
實施例抗ErbB3抗體的產(chǎn)生本實施例說明了具有在此所述特性的抗ErbB3抗體的產(chǎn)生。
材料與方法細胞系。人骨髓性白血病細胞系K562(據(jù)Northern印跡雜交分析，缺乏Ⅰ類亞族受體蛋白酪氨酸激酶)和人卵巢癌細胞系Caov3由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)獲得。兩者都培養(yǎng)在補充以10％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、100單位/毫升青霉素100微克/毫升鏈霉素和10mM HEPES(“生長培養(yǎng)基”)的RPMI1640培養(yǎng)基中。
K562細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染K562細胞系并挑選出ErbB3表達克隆。簡而言之，將erbB3cDNA亞克隆到pcDNA-3哺乳動物細胞表達載體(Invitrogen)中，通過電穿孔(electroporation)引入K562細胞(1180mF,350V)。轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)在含0.8mg/ml G418的生長培養(yǎng)基中。通過有限稀釋獲得抗性克隆，并利用Western印跡雜交和heregulin(HRG)結(jié)合分析測定ErbB3的表達。ErbB3表達克隆4E9H3被用于本報告所述的實驗。佛波酯刺激被發(fā)現(xiàn)明顯加強K562轉(zhuǎn)染子內(nèi)ErbB3的表達。因此，在用于下文各種分析之前，4E9H3細胞被放在含10納克/毫升佛波-12-豆蔻酸乙酸酯(PMA)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
抗體。ErbB3蛋白的特異性單克隆抗體是抗以下受體的重組片段產(chǎn)生的，即受體的細胞外功能區(qū)(ECD)在其氨基末端與單克隆抗體5B6的Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV Ⅰ)糖蛋白D(gD)表位融合的重組片段。ErbB3信號序列的編碼序列被gD多肽內(nèi)1-53氨基酸的編碼序列取代。氨基酸1-25編碼gD的信號序列而氨苯酸26-53含有針對單克隆抗體5B6的表位。參見WO95/14776。得到的結(jié)構(gòu)物，gD.ErbB3.ECD利用抗gD抗體親和色譜柱來純化。如下進行免疫。雌性Balb/c小鼠(Charles River)先足底注射以100微升RIBI’sTM佐劑(RibiImmunochemResearch,Inc,.Hamilton,MT)中的5微克gD.ErbB3.ECD。每二周用5微克gD.ErbB3.ECD在足底對動物進行加強免疫，共兩次，最后，足底注射以5微克gD.ErbB3.ECD。最后一次免疫后的3天，取出淋巴結(jié)，制備用于PEC融合的單細胞懸浮液。
純化單克隆抗體，并通過固相和液相ELISA測定其與ErbB2和ErbB4的交叉反應(yīng)性。有關(guān)固相ELISA，用1微克/毫升ErbB2.ECD,gD.ErbB3.ECD或gD.ErbB4.ECD包被96孔微量滴定板，過夜。加入1微克/毫升的抗ErbB3 Mab，在室溫下(RT)孵育1小時，洗滌后加以與HRPO偶聯(lián)的山羊抗鼠(gam)IgG。進行ELISA，在490納米處讀數(shù)。有關(guān)液相ELISA，用1微克/毫升gamIgG(Fc特異性)包被96孔微量滴定板，過夜。加入1微克/毫升的抗ErbB3 Mab，在室溫下(RT)孵育1小時，洗滌后加以生物素標記的ErbB2.ECD,gD.ErbB3.ECD或gD.ErbB4.ECD。該反應(yīng)在室溫下進行1小時，洗滌后加以HRPO鏈霉親和素。進行ELISA，在490納米處讀數(shù)。在本分析中，抗ErbB3抗體不與ErbB2或ErbB4交叉反應(yīng)。
通過木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生3-8D6抗體的Fab片段。通過A蛋白親和性色譜然后凝膠過濾色譜去除未消化的IgG和Fc片段。SDS-PAGE和以Fc特異性抗體為探針的Western印跡雜交未在Fab集合中檢測到任何IgG。
HRG結(jié)合分析。所有HRG結(jié)合實驗都使用β1同種型的EGF樣功能區(qū)，即HRGβ1177-244(Sliwkowski等，生物化學雜志269:14661-5(1994))。在沒有(對照)和有100nM ErbB3抗體存在下，將5.0×1044E9H3細胞與100pM125I-HRG在0℃培養(yǎng)一夜，由此就其對HRG結(jié)合的作用篩選ErbB3抗體組。無關(guān)IgG被用作陰性對照。在一96孔過濾器(Millipore)中收獲細胞并用冰冷的分析用緩沖液(含10mM HEPES的RPMI培養(yǎng)基，pH=7.2)洗滌。然后取出濾器計數(shù)。
至于抗體劑量依賴性實驗，4E9H3細胞與100pM125I-HRG在抗體濃度不斷增加下一起培養(yǎng)。在沒有(對照)或有100nM抗體或Fab片段存在下測定HRG親和性量度。所述實驗是以競爭性抑制的方式進行的，即不斷增加未標記HRG而固定125I-HRG濃度不變(35pM)。對于對照實驗(無抗體)，對每份樣品使用1×105的4E9H3細胞。由于分析的動力學范圍限制，在抗體或Fab片段存在下用于結(jié)合的4E9H3細胞數(shù)量被減少至每份樣品2.5×104的。
抗體對HRG刺激的磷酸化作用的減弱。天然表達ErbB2和ErbB3的Caov3細胞在室溫下與250nM抗ErbB3抗體3-8D6，該抗體的Fab片段或緩沖液(對照)一起預培養(yǎng)60分鐘。已知阻斷HRG刺激的ErbB2磷酸化作用的抗ErbB2抗體，2C4(Fendly等，癌癥研究50:1550-1558(1990))被用作陽性對照。然后，細胞在室溫下接受最終濃度為10nM的HRG刺激8分鐘，或者不接受刺激。通過去除上清液并將細胞溶解在SDS樣品緩沖液中來終止反應(yīng)。然后用裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE。用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸(Transduction Labs)檢測凝膠的Western印跡雜交，用化學發(fā)光底物(Amersham)來顯影印跡。用Holmes等在科學256:1205-1210(1992)中所述的反射比掃描光密度計掃描印跡。
抗體減少ErbB2-ErbB3蛋白復合物形成。Caov3細胞與緩沖液(對照)、250nM抗ErbB3抗體3-8D6或其Fab片段，或抗ErbB2抗體(2C4)在室溫下預培養(yǎng)60分鐘，然后用10nM HRG或?qū)φ站彌_液處理10分鐘。在(“裂解緩沖液”)25nMTris,pH=7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,1.0％Triton X-100TM,1.0％CHAPS,10％v/v甘油，并含0.2mM PMSF,50m TU/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)和10mM亮抑蛋白酶肽(1eupeptin)中裂解，粗裂解產(chǎn)物經(jīng)粗略離心去除不溶性物質(zhì)。將上清液和與不溶性載體(Affi Prep-10TM,Bio-Rad)共價偶聯(lián)的3E8即ErbB2的特異性單克隆抗體(Fendly等，癌癥研究50:1550-1558(1990))一起孵育。孵育在4℃過夜。免疫沉淀物用冰冷的裂解緩沖液洗滌兩次，重懸在最小體積的SDS樣品緩沖液中，進行SDS-PAGE。然后用多克隆抗ErbB3抗體(Santa CruzBiotech)檢測凝膠的Western印跡雜交。如Holmes等在科學256:1205-1210(1992)中所述用反射比掃描光密度計掃描印跡雜交。在用ECL化學發(fā)光底物顯影后，將印跡剝下再用多克隆抗ErbB2(Santa Cruz Biotech)檢測。用抗ErbB2重復進行檢測的印跡記圖顯示，每份樣品免疫沉淀出等量的ErbB2。
結(jié)果對一組抗ErbB3胞外功能區(qū)的單克隆抗體分析了其影響HRG與ErbB3結(jié)合的能力。最初的篩選是通過在125I-HRG存在下將最終濃度為100nM的各純化抗體與4E9H3細胞一起培養(yǎng)來進行的。4E9H3細胞是人骨髓性白血病細胞系K562的ErbB3轉(zhuǎn)染子。K562細胞系不表達內(nèi)源ErbB受體或HRG。所以，heregulin與4E9H3細胞結(jié)合只可能通過ErbB3發(fā)生。樣品在冰上培養(yǎng)一夜之后，計數(shù)結(jié)合的細胞數(shù)。如圖1所示，與對照(無抗體)相比，抗RrbB3單克服抗體中的兩種(2F9和3E9)減少了與4E9H3細胞結(jié)合的125I-HRG的量。但是，其它幾種抗體明顯加強了配體的結(jié)合。以上結(jié)果顯示，這些抗ErbB3抗體能夠提高HRG結(jié)合的親和性和/或提高HRG結(jié)合位置的利用度。為了進一步表述這些抗體對HRG與ErbB3結(jié)合的影響，用加強HRG結(jié)合的3-8D6抗體進行了劑量依賴性實驗。在濃度不斷提高的3-8D6抗體存在下將4E9H3細胞與100pM125I-HRG一起培養(yǎng)。在冰上培養(yǎng)一夜后測定結(jié)合細胞數(shù)。結(jié)果以結(jié)合細胞數(shù)量對抗體濃度作圖顯示在圖2中。HRG結(jié)合的加強與抗體濃度的升高之間存在著相關(guān)性。heregulin結(jié)合在10至100nM IgG之間達到飽和。3-8D6抗體的EC50值為722pM。對于兩種抗體，都沒有觀察到劑量應(yīng)答曲線在高抗體濃度時的下降。
在所述抗體存在下測定了HRG結(jié)合的Scatchard分析，結(jié)果列于表1。
表1數(shù)據(jù)組 Kd位置/細胞對照 1.2×10-93.6×105MAb 3-8D62.1×10-102.4×105FAb 3-8D62.8×10-102.9×105無抗體時，HRG與ErbB3結(jié)合的Kd經(jīng)測定為1200pM，這與過去測得的HRG結(jié)合ErbB3的親和性量度是一致的。每個細胞上的結(jié)合位置數(shù)量經(jīng)測定為36,000。在抗體3-8D6存在下，HRG結(jié)合的測得結(jié)合常數(shù)顯著升高至210pM。但是，在3-8D6存在下，HRG結(jié)合位置數(shù)量并沒有增加。
為了確定ErbB3配體結(jié)合親和性的升高是否依賴于抗體的二價化，在100nM木瓜蛋白酶消化3-8D6抗體制得的Fab片段存在下進行HRG結(jié)合實驗。用于所述實驗的Fab片段是經(jīng)A蛋白親和色譜和凝膠過濾色譜純化的。在純化制劑中經(jīng)SDS-PAGE測定沒有完整的IgG。如圖3所示，HRG結(jié)合在完整抗體或由其產(chǎn)生的Fab片段存在下幾乎是一致的。對以上數(shù)據(jù)的Scatchard分析得出在Fab存在下HRG結(jié)合的解離常數(shù)為280pM，由該實驗測得的每個細胞上的受體個數(shù)也與對照基本相同。以上數(shù)據(jù)與圖2所示一致，在圖2中，完整抗體的劑量應(yīng)答曲線在高抗體濃度時表現(xiàn)為平臺而不是鐘形曲線，此時發(fā)生的可能是單價抗體結(jié)合。與任何理論無關(guān)，以上數(shù)據(jù)表明，在以上抗體存在下觀察到的HRG結(jié)合的改變并不需要二價抗體存在。
接著，用共表達ErbB2和ErbB3的卵巢腫瘤細胞系Caov3測定3-8D6抗體在受體酪氨酸磷酸化分析中的作用。細胞在與3-8D6抗體(250nM)或緩沖液(對照)預培養(yǎng)60分鐘后接受10nM HRG的刺激。用抗磷酸化酪氨酸檢測Western印跡雜交來分析全細胞裂解液。HRG處理沒有激發(fā)4E9H3細胞內(nèi)的磷酸化作用。用3-8D6抗體處理4E9H3細胞既不誘導ErbB3本身的磷酸化，對Caov3細胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化也沒有作用。在用HRG刺激后，在一分子量約為180kDa的蛋白質(zhì)上檢測到一標記過的酪氨酸磷酸化信號。用ErbB2的特異性抗體2C4處理Caov3細胞能夠封閉HRG介導的酪氨酸磷酸化信號。當細胞在用HRG刺激之前用抗ErbB3抗體3-8D6處理時，酪氨酸磷酸化也降低。通過對全細胞裂解產(chǎn)物抗磷酸酪氨酸印跡的掃描光密度觀察到，在180至185kDa,3-8D6抑制磷酸化信號達約80％(76％至84％不等)。該信號是由ErbB3和ErbB2兩者上的酪氨酸磷酸殘基產(chǎn)生的。與對照相比，用由3-8D6抗體制得的Fab片段處理Caov3細胞也降低180kDa條帶的HRG激發(fā)的磷酸化。但是，F(xiàn)ab的抑制活性略低于完整抗體。
只表達ErbB3的細胞上由3-8D6抗體介導的受體親和性升高與ErbB2和ErbB3共表達相關(guān)的親和性升高一樣。而且，該抗體在表達兩種受體的細胞內(nèi)抑制HRG激發(fā)的ErbB2激酶活性。為了測定抗ErbB3抗體是否與ErbB2直接競爭與ErbB3的結(jié)合，用Caov3細胞進行了一系列共免疫沉淀實驗。細胞與抗體或緩沖液(對照)一起預培養(yǎng)，然后用10nM HRG處理10分鐘。然后用抗ErbB2的單克隆抗體進行細胞裂解產(chǎn)物的免疫沉淀。然后通過Western印跡雜交分析沉淀物中是否存在ErbB3。實驗結(jié)果顯示，HRG激發(fā)的細胞裂解產(chǎn)物的ErbB2免疫沉淀物中存在ErbB3，但在未激發(fā)裂解產(chǎn)物中沒有。以上數(shù)據(jù)表明HRG在Caov3細胞中引發(fā)ErbB2-ErbB3復合物的形成。在以抗ErbB2單克隆抗體2C4處理的樣品的免疫沉淀物中沒有檢測到ErbB3。在細胞用HRG激發(fā)前用3-8D6抗體或由其制得的Fab片段預培養(yǎng)時，觀察到了ErbB3信號的明顯減弱。這表明3-8D6抗體抑制HRG處理后ErbB2-ErbB3復合物的形成。對抗ErbB2免疫沉淀物的抗ErbB3Western印跡雜交的掃描光密度測定顯示，抗ErbB3信號(表明ErbB2-ErbB3復合物的存在數(shù)量)被3-8D6削弱約80％(71％-90％)。用抗ErbB3檢測重復印跡時，在每個泳道中都存在對等量的ErbB2。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Genentech,Inc.(ⅱ)發(fā)明名稱ErbB3抗體(ⅲ)序列數(shù)量5(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Genentech,Inc.
(B)街道460 Point San Bruno Blvd(C)城市South San Francisco(D)州California(E)國家USA(F)郵政編碼94080(ⅴ)計算機可讀吸收(A)媒質(zhì)類型3.5英寸，1.44Mb軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WinPatin(Genentech)(ⅵ)當前申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Lee,Wendy M.
(B)注冊編號40,378(C)參考/卷宗編號P1003PCT(ⅸ)通訊信息(A)電話415/225-1994(B)傳真415/952-9881(C)電傳910/371-7168(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro1 510 11(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述His Gln Ser Leu Gly Thr Gln1 5 7(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys15 8(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys1 5 8(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln1 5 8
權(quán)利要求
1．一種抗體，它結(jié)合ErbB3蛋白，并在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)減少heregulin誘導的ErbB2-ErbB3蛋白復合物的形成。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它還提高heregulin對ErbB3蛋白的結(jié)合親和性。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它還在細胞內(nèi)降低heregulin誘導的ErbB2活性。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它是單克隆抗體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它是人源化的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它是人抗體。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它是抗體片段。
8．根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體片段，它是一段Fab片段。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它是標記過的。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它被固定化在固相上。
11．一種抗體，它結(jié)合ErbB3蛋白并提高heregulin對ErbB3蛋白的結(jié)合親和性。
12．一種抗體，它結(jié)合ErbB3蛋白并在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)降低heregulin誘導的ErbB2活性。
13．一種抗體，它結(jié)合ErbB3蛋白并減少heregulin與之的結(jié)合。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，它還在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)降低heregulin誘導的ErbB2活性。
15．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它結(jié)合由8B8抗體結(jié)合的表位。
16．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，它具有8B8抗體的互補性決定區(qū)。
17．一種組合物，含有權(quán)利要求1所述的抗體和藥學上可接受的載體。
18．產(chǎn)生權(quán)利要求1所述抗體的細胞系。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的細胞系，它是產(chǎn)生8B8抗體的雜交瘤細胞系。
20．測定ErbB3蛋白的存在的方法，它包括將被懷疑含有ErbB3蛋白的細胞與權(quán)利要求1所述的抗體接觸，測定所述抗體與細胞的結(jié)合。
21．一種試劑盒，其中包含權(quán)利要求1所述的抗體和使用所述抗體檢測ErbB3蛋白的說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合ErbB3蛋白并具有以下特性之一項或多項的抗體:在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)減少heregulin誘導的ErbB2－ErbB3蛋白復合物的形成的能力;提高heregulin對ErbB3蛋白結(jié)合親和性的能力;在表達ErbB2和ErbB3的細胞內(nèi)減少heregulin誘導的ErbB2活性的特征。
文檔編號C12P21/08GK1214695SQ97193358
公開日1999年4月21日 申請日期1997年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月27日
發(fā)明者R·阿基塔, M·斯利夫科夫斯基 申請人:基因技術(shù)股份有限公司