專利名稱：：ErbB3抗體及其用途的制作方法ErbB3抗體及其用途
背景技術(shù)：
：多肽生長因子受體的ErbB/HER亞族包括表皮生長因子(EGF)受體(EGFR、ErbBl/HERl)、"ew致癌基因產(chǎn)物(ErbB2/HER2)及最近確認的ErbB3/HER3和ErbB4/HER4受體蛋白質(zhì)(參見，例如Hynes等人(1994)歷oc&m.歷opty&^"a.iev.Omcw1198,165-184)。據(jù)推測，這些受體中的各種都由細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶(PTK)結(jié)構(gòu)域和C末端磷酸化結(jié)構(gòu)域組成(參見，例如Kim等人，(7卯《」所oc/^w./334,189-195)。體外實驗表明，與其它ErbB/HER家族成員相比，ErbB3蛋白質(zhì)的蛋白酪氨酸激酶活性顯著降低，且這種降低部分地由于在ErbB3的預(yù)計催化結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的非保守氨基酸置換(參見，例如Guy等人(1994)尸rac.Ato/.Jc"d5W.91,8132-8136;Sierke等人(1997)歷oc/^附./.322,757-763)。但是，ErbB3蛋白質(zhì)表現(xiàn)出在多種細胞環(huán)境中被磷酸化。例如，在過量表達該蛋白質(zhì)的人乳腺癌細胞系的亞群中，ErbB3在酪氨酸殘基上被組成型磷酸化(參見，例如Kraus等人(1993)尸rac.Ato/.C/SA90，2900-2904;和Kim等人，同上；還參見Schaefer等人(2006)Neoplasia8(7):613-22和Schaefer等人CancerRes(2004)64(10):3395-405)。盡管人們一直在研究ErbB3在癌癥中的作用(參見，例如Horst等人(2005)115,519-527;Xue等人(2006)CW臟廠M66,1418-1426),但是在很大程度上ErbB3作為臨床干預(yù)的靶點仍未受到重視。目前的免疫治療主要集中于抑制ErbB2的作用，且特別是ErbB2/ErbB3復(fù)合物的異二聚化(參見,例如Sliwkowski等人(1994)/腸/.C/^m.269(20):14661-14665(1994))。因此，本發(fā)明的目的在于提供有效抑制ErbB3信號傳導(dǎo)的改進的免疫治療并可用于治療和診斷多種癌癥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一類與ErbB3受體相結(jié)合并抑制各種ErbB3功能的新型單克隆抗體。例如，此處所描述的抗體能夠與ErbB3結(jié)合并抑制EGF樣配體介導(dǎo)的受體磷酸化。如此處所描述的，EGF樣配體包括EGF、TGF-a、(3細胞素(betacellulin)、肝素結(jié)合性表皮生長因子、biregulin和雙調(diào)蛋白，其與EGFR結(jié)合并誘導(dǎo)EGFR和ErbB3的二聚化。這種二聚化隨之引起ErbB3的磷酸化，并通過該受體激活信號傳導(dǎo)。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可用于治療和診斷與ErbB3介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)相關(guān)的多種癌癥。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了與ErbB3相結(jié)合并抑制EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的單克隆抗體(及其抗原結(jié)合部分)。在另一個實施方式中，抗體進一步具有下述一種或多種特性(i)抑制ErbB3配體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，包括通過ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和BIR)與ErbB3的結(jié)合介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)；(ii)抑制表達ErbB3的細胞的增殖；(iii)降低細胞表面上的ErbB3水平(例如通過誘導(dǎo)ErbB3的內(nèi)在化)的能力；(iv)抑制表達ErbB3的細胞的VEGF分泌；(v)抑制表達ErbB3的細胞的遷移；(vi)抑制表達ErbB3的細胞的球狀體生長；和/或(vii)與位于ErbB3結(jié)構(gòu)域I(殘基20-209)上的表位相結(jié)合，例如與包含或跨過ErbB3氨基酸序列的殘基20-202的表位相結(jié)合。通過表面等離子共振分析或細胞結(jié)合分析進行測量，本發(fā)明的特定的單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分的KD為50nM或更低。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的特定的單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列。本發(fā)明其它特定的單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分包含輕鏈可變區(qū)，該輕《連可變區(qū)包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列?？贵w還可以包含上述重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者?？贵w或其抗原結(jié)合部分的重鏈和輕鏈可變區(qū)通常包含一個或多個互補性決定區(qū)(CDR)。它們包含一個或多個CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域。因此，本發(fā)明其它特定的抗體及其抗原結(jié)合部分包含一個或多個選自包含SEQIDNO:7的重鏈可變區(qū)CDRl、包含SEQIDNO:8的重鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:9的重鏈可變區(qū)CDR3、包含SEQIDNO:10的輕鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:12的輕鏈可變區(qū)CDR3及其組合的CDR序列。本發(fā)明再其它的特定抗體及其抗原結(jié)合部分包含一個或多個選自包含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:15的重鏈可變區(qū)CDR3、包含SEQIDNO:16的輕鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:17的輕鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:18的輕鏈可變區(qū)CDR3及其組合的CDR序列。本發(fā)明再其它的特定抗體及其抗原結(jié)合部分包含一個或多個選自包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR3、包含SEQIDNO:22的輕鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:23的輕鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:24的輕鏈可變區(qū)CDR3及其組合的CDR序列。本發(fā)明再其它的特定抗體及其抗原結(jié)合部分包含一個或多個選自包含SEQIDNO:39的重鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:40的重鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:41的重鏈可變區(qū)CDR3、包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:43的輕鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區(qū)CDR3及其組合的CDR序列。本發(fā)明再其它的特定抗體及其抗原結(jié)合部分包含一個或多個選自包含SEQIDNO:45的重鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:46的重鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:47的重鏈可變區(qū)CDR3、包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR1、包含SEQIDNO:49的輕鏈可變區(qū)CDR2、包含SEQIDNO:50的輕鏈可變區(qū)CDR3及其組合的CDR序列。抗體及其抗原結(jié)合部分還可以包含一個或多個與上述任何CDR或CDR的組合至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的CDR。在一個實施方式中，抗體及其抗體部分完全來自人體(即包括人CDR和框架序列)。本發(fā)明的特定的人抗體包括具有源自人VH3種系基因的重鏈可變區(qū)和/或源自人VL2種系基因的輕鏈可變區(qū)的抗體。本發(fā)明還包括與此處所描述的任何抗體或其部分所結(jié)合的表位相同或重疊的表位(例如位于ErbB3結(jié)構(gòu)域I的表位，如包含或跨過ErbB3氨基酸序列的殘基20-202的表位)結(jié)合的單克隆抗體及其部分。本發(fā)明還包括與此處所描述的抗體具有相同活性的抗體(例如具有與Ab并6相同的序列的抗體)。(scaffold)的所有已知形式。例如，抗體可以是人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體或具有抗體樣性質(zhì)的蛋白質(zhì)支架，例如，纖連蛋白或錨蛋白重復(fù)序列?？贵w還可以是Fab、Fab'2、ScFv、SMIP、親和抗體(affibody)、纟內(nèi)米抗體(nanobody)或域抗體(domainantibody)?？贵w還可以具有下述任何的同種型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。在又另一個實施方式中，本發(fā)明還提供了包含此處所描述的抗體或抗原結(jié)合部分的組合、并與可4妄受的載體和/或輔沖+—起配制的組合物。在特定的實施方式中，組合物包含兩種或更多種與ErbB3上不同的表位結(jié)合的抗體或與不結(jié)合ErbB3的抗癌抗體組合的此處所描述的抗體。在再另一個實施方式中，本發(fā)明提供了編碼此處所描述的抗體及其抗原結(jié)合部分的分離的核酸。在特定的實施方式中，該核酸編碼重鏈可變區(qū)，其包含與SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)相同或在高嚴格條件下與SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37雜交的核香酸序列；或編碼輕鏈可變區(qū)，其包含與SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38至少80%(例如85%、90%、95%、％%、97%、98%或99%)相同或在高嚴格條件下與SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38雜交的核苷酸序列；或這些重鏈和輕鏈可變區(qū)的組合。本發(fā)明進一步提供了表達和/或產(chǎn)生此處所描述的抗體及抗原結(jié)合部分的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物、雜交瘤和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了包含一種或多種此處所描述的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分及任選的用于治療或診斷與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的說明的試劑盒。本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合部分可被用于廣泛的治療和診斷應(yīng)用中，特別是用于癌癥應(yīng)用中。因此，本發(fā)明的另一方面提供了通過給予足以抑制EGF樣介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的量的一種或多種此處所描述的抗體或其抗原結(jié)合部分來抑制受試者中EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3;粦酸化的方法。本發(fā)明進一步提供了通過給予足以治療癌癥的量的一種或多種此處所描述的抗體或其抗原結(jié)合部分來治療受試者中多種癌癥的方法，癌癥包括但不局限于黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃腸癌/結(jié)腸癌、肺癌、透明細胞肉瘤和前列腺癌。抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨給藥，也可以與其它治療劑(例如抗癌劑，比如其它抗體、化學(xué)治療劑和/或輻射)聯(lián)合給藥。在又其它實施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷和預(yù)測ErbB3相關(guān)疾病(例如癌癥)的方法。在一個實施方式中，這是通過將本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分與來自受試者的細胞相接觸(例如體外或體內(nèi))、并測量與細胞上ErbB3結(jié)合的水平實現(xiàn)的，其中異常高的ErbB3結(jié)合水平顯示受試者患有與ErbB3相關(guān)的癌癥。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將會在下述的具體說明和權(quán)利要求書中體現(xiàn)出來。附圖簡述圖1A和1B為柱狀圖，描述了使用山羊抗人Alexa647第二抗體的各種抗ErbB3候選抗體(Fab,此處稱為Ab)與MALME-3M黑素瘤細胞上表達的ErbB3的結(jié)合。圖2A-2D為曲線圖，描述了各種抗ErbB3候選抗體的Kd植。圖2A和2B為曲線圖，分別描述了使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)測量得到的抗體#6(稱為Ab#6)和抗體#3(稱為Ab#3)的Ko值。圖2C和2D為曲線圖，分別描述了通過細胞結(jié)合分析使用MALME-3M黑素瘤細胞測量得到的Ab#6和Ab#3的Ko值。圖3為曲線圖，描述了使用ELISA得到的抗ErbB3抗體(Ab#6)與ErbB3的結(jié)合特異性。EGFR、BSA和TGF-a用作對照。圖4為曲線圖，描述了使用ELISA測量得到的抗ErbB3抗體(Ab#6)在體外降j氐MALME-3M黑素瘤細月包中的總ErbB3水平的能力。圖5A和5B為曲線圖，描述了使用FACS分析測量得到的抗ErbB3抗體(Ab#6)下調(diào)MALME-3M細胞上的ErbB3受體的能力。圖5A顯示了使用抗體的IgGl同種型的結(jié)果。圖5B顯示了使用抗體的IgG2同種型的結(jié)果。圖6A-6D為曲線圖，描述了使用FACS分析測量得到的抗體介導(dǎo)的ErbB3下調(diào)(Ab#6)的時間過程。圖7為柱狀圖，描述了各種抗ErbB3抗體在體內(nèi)下調(diào)黑素瘤細胞中的ErbB3的能力。圖8為柱狀圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6)在體內(nèi)下調(diào)ADRr異種移植物中的ErbB3的能力。圖9為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6)在細胞效價發(fā)光分析(CellTiterGlowAssay)中抑制MALME-3M細胞增殖的能力。圖10為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6)抑制卵巢細胞系A(chǔ)DRr細胞增殖的能力。圖ll為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab弁6)抑制ACHN細胞增殖的能力。圖12為柱狀圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6)在體內(nèi)抑制ADRr異種移植物中ErbB3磷酸化的能力。圖13A-13C為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6)抑制ADRr細胞中p細胞素和神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力。圖14A-14B為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab#6IgG2同種型)抑制卵巢腫瘤細胞系OVCAR5和OVCAR8中ErbB3磷酸化的能力。圖15A-15C為曲線圖，描述了卩細胞素(BTC)結(jié)合ErbBl的能力。如圖所示，(3細胞素與ErbBl陰性MALME-3M細胞不結(jié)合(圖17A),而分別在10nM(圖17B)和200nM(圖17B)的濃度下與ErbBl陽性ADRr細胞結(jié)合。曲線圖還描述了愛必妥(Erbitux)對該結(jié)合的抑制。圖16A-16B為曲線圖，描述了抗ErbB3抗體(Ab弁6IgG2同種型)抑制MALME-3M細胞中神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。圖16A描述了Ab#6抑制MALME-3M細胞中神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力，圖16B描述了Ab#6抑制MALME-3M細胞中AKT磷酸化的能力。圖17A-D為曲線圖，描述了通過異種移植物的研究得到的抗ErbB3抗體(Ab#6)抑制(A).卵巢(ADRr細胞)、(B)前列腺(Dul45細胞)、(C)卵巢(OvCAR8細胞)和(D)胰腺(Colo357細胞)腫瘤生長的能力。圖18A和18B為曲線圖，描述了使用FACS分析測量得到的Ab#6(圖18A)和Ab#3的Fab(圖18B)抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素與MALME-3M細胞上的ErbB3結(jié)合的能力。圖19A和19B為曲線圖，描述了Ab#6抑制表皮調(diào)節(jié)素與ADRr細胞上的ErbB3結(jié)合的能力。圖19A描述了表皮調(diào)節(jié)素與ADRr細胞的結(jié)合，圖19B描述了愛必妥和Ab湘兩者抑制表皮調(diào)節(jié)素與ADRr細胞結(jié)合的能力。圖20A和20B為曲線圖，描述了肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)與ADRr細胞上的ErbB結(jié)合的能力(圖20A)以及抗ErbB3抗體(Ab弁6)缺乏抑制該結(jié)合的能力(圖20B)。圖21A-21C顯示了抗體(Ab#6、Ab#3、Ab#14、Ab#17和Ab#19)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。圖22A-22B顯示了抗體(Ab#6、Ab#3和Ab#14)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苦酸序列。圖23顯示了抗體(Ab#6、Ab#17和Ab#19)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其回復(fù)為相應(yīng)的種系氨基S臾序列。氨基酸殘基的改變處添加了下劃線。圖24A-24C為曲線圖，顯示了Ab弁6抑制胂瘤細胞VEFG分泌的能力。圖25為曲線圖，顯示了Ab弁6對細胞遷移的作用。圖26A-C為曲線圖，顯示了(A)AdrR細胞中球狀體生長的抑制、(B)AdrR中HRG誘導(dǎo)的球狀體生長的抑制，和(C)Dul45細胞中HRG誘導(dǎo)的球狀體生長的抑制。圖27A和B為曲線圖，顯示了Ab弁6對(A)HRG和(B)BTC與AdrR細胞的結(jié)合的作用。圖28為曲線圖，顯示了Ab#6對HGF誘導(dǎo)的ErbB3磷酸化的作用。圖29A和B顯示了Ab#6對(A)pErbBl和pErbB3的磷酸化以及(B)HRG誘導(dǎo)的ErbB2/3復(fù)合體形成的作用。圖30為曲線圖，顯示了Ab#6與ErbB3的氨基酸殘基20-202結(jié)合。具體實施例方式為了使本發(fā)明更容易理解，首先對一些術(shù)語進行了定義。其他定義在通篇詳細描述中給出。I.定義術(shù)語"ErbB3"、"HER3"、"ErbB3受體"和"HER3受體"在此處可互換使用，是指人ErbB3蛋白質(zhì)，如美國專利No.5480968和Plowman等人，尸rac.A^/.Jcad5W.t/W,87:4905-4909(1990)中所述；還參見Kani等人，Aoc/z^m^^y44:15842-857(2005),Cho和Leahy,Science297:1330-1333(2002)。此處所使用的術(shù)語"EGF樣配體"是指表皮生長因子受體(EGFR)的配體，包括表皮生長因子(EGF)和密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)、|3細胞素(BTC)、肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)、biregulin(BIR)和雙調(diào)蛋白(AR),它們與細胞表面的EGRF結(jié)合并刺激受體的內(nèi)在蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶活性。具體而言，EGF樣配體誘導(dǎo)形成EGFR(也稱為ErbBl)與ErbB3的蛋白質(zhì)復(fù)合體(例如參見Kim等人，(1998)別ocAem丄，334:189-195),因此導(dǎo)致復(fù)合體中酪氨酸殘基的磷酸化。本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合部分抑制EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化，并在某些實施方式中，顯示出一種或多種下述附加性質(zhì)(i)抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和biregulin(BIR)中的一種或多種介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)；(ii)抑制表達ErbB3的細胞的增殖；(iii)降低細胞表面ErbB3水平的能力；(iv)抑制表達ErbB3的細胞的VEGF分泌；(v)抑制表達ErbB3的細胞的遷移；(vi)抑制表達ErbB3的細胞的^求狀體生長；和/或(vii)與位于ErbB3結(jié)構(gòu)域I上的表位結(jié)合，例如與包含或跨過ErbB3氨基酸序列的殘基20-202的表位結(jié)合。此處所使用的術(shù)語"抑制"是指生物活性的任何統(tǒng)計學(xué)顯著的降低，包括活性的完全阻斷。例如，"抑制"可以指生物活性降^[氐大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。因此，此處所使用的短語"EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的抑制"是指相對于未處理(對照)細胞中的磷酸化而言，抗體或抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低EGF樣配體誘導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力。表達ErbB3的細胞可以為天然發(fā)生的細胞或細胞系，或者可以通過向宿主細胞引入編碼ErbB3的核香酸進行重組制造。在一個實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分抑制EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3》岸酸化至少為10%、或至少為20%、或至少為30%、或至少為40%、或至少為50%、或至少為60%、或至少為70%、或至少為80%、或至少為90%或100%,這是通過例如Kim等人，(1998)所oc/^m334:189-195以及下文的實施例中描述的蛋白質(zhì)印跡法及隨后使用抗磷酸酪氨酸抗體進行探測而確定的。此處所使用的短語"神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和biregulin介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)的抑制"是指相對于不存在抗體(對照)的信號傳導(dǎo)而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低由ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和biregulin)介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)的能力。此處的ErbB3-配體也稱作"神經(jīng)調(diào)節(jié)素樣配體"。這意味著在抗體或其抗原結(jié)合部分存在的情況下，相對于對照(沒有抗體)而言，在表達ErbB3的細胞中由神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和biregulin中的一種或多種介導(dǎo)的信號統(tǒng)計學(xué)顯著地降低?？梢酝ㄟ^分析ErbB3底物和/或存在于涉及ErbB3的細胞級聯(lián)(cascade)中的蛋白質(zhì)的水平或活性來測量ErbB3-配體介導(dǎo)的信號。在一個實施方式中，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)的水平或活性而言，抗體或其抗原結(jié)合部分降低ErbB3底物和/或在涉及ErbB3的細胞級聯(lián)中的蛋白質(zhì)的水平或活性至少為10%、或至少為20%、或至少為30%、或至少為40%、或至少為50%、或至少為60%、或至少為70%、或至少為80%、或至少為90%或100%。這樣的ErbB3-配體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)進行測量，這些技術(shù)使用用于這些蛋白質(zhì)的激酶分析(參見，例如Horst等人，同上；Sudo等人(2000)M"/zo山五"27mo/，322:388-92;和Morgan等人(1990)/歷oc/^w"191:761-767)測量ErbB3的底物(例如SHC或PI3K)或在涉及ErbB3的細胞級聯(lián)中的蛋白質(zhì)(例如AKT)的水平或活性。在特定的實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分通過抑制ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種)與ErbB3的結(jié)合抑制ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)。一些配體(例如biregulin或BIR)既作為EGF樣配體(即與EGFR/ErbBl結(jié)合)也作為ErbB3樣配體(即與ErbB3結(jié)合)起作用。此處所使用的短語"神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen和biregulin與ErbB3結(jié)合的抑制"是指相對于不存在抗體(對照)的結(jié)合而言，抗體或抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種)與ErbB3結(jié)合的能力。這意味著在不存在抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下，相對于對照(沒有抗體)而言，與ErbB3結(jié)合的ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)的量統(tǒng)計學(xué)顯著地降低。在存在本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分(對照)時的量而言，與ErbB3相結(jié)合的ErbB3配體的量可以降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。ErbB3-配體結(jié)合的降低可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)進行測量，這些技術(shù)測量存在或不存在(對照)抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下標記的ErbB3-配體(例如放射性標記的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)與表達ErbB3的細胞結(jié)合的水平。此處所使用的短語"抑制表達ErbB3的細胞的增殖"是指相對于不存在抗體時的增殖而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低表達ErbB3的細胞的增殖的能力。在一個實施方式中，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)所測量到的增殖而言，當細胞與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸時，表達ErbB3的細胞(例如癌細胞)的增殖可以降^[氐至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50D/Q、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。細胞增殖可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)進行分析，這些技術(shù)測量細胞分裂的速率、細胞群體中發(fā)生細胞分裂的比例和/或在細胞群體中由于終末分化或細胞死亡而造成的細胞損失率(例如使用細胞效價發(fā)光分析或胸苷摻入法)。此處所使用的短語"降低細胞表面ErbB3水平的能力"是指相對于未處理(對照)細胞而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低在與抗體^t妄觸的細胞的表面上發(fā)現(xiàn)的ErbB3量的能力。例如，細胞表面ErbB3水平的降低有可能是由于ErbB3內(nèi)在化的增加(或ErbB3內(nèi)吞作20用的提高)。在一個實施方式中，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)的細胞表面表達或內(nèi)在化而言，抗體或其抗原結(jié)合部分降低細胞表面ErbB3的表達至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%,和/或增加ErbB3受體的內(nèi)在化至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。在存在或不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時細胞表面的ErbB3水平和/或ErbB3受體的內(nèi)在化可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)(例如Horst等人(同上)和此處的實施例中描述的技術(shù))很容易地進行測量。此處所使用的短語"表達ErbB3的細胞的VEGF分泌的抑制"是指相對于不存在抗體時的VEGF分泌而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低表達ErbB3的細胞的VEGF分泌的能力。在一個實施方式中，相對于在不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)測量得到的VEGF分泌而言，當表達ErbB3的細胞(例如癌細胞)與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸時細胞的VEGF分泌可以降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。VEGF分泌可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)(例如此處所描述的那些技術(shù))進行分析。此處所使用的短語"表達ErbB3的細胞的遷移的抑制"是指相對于不存在抗體時的細胞遷移而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低表達ErbB3的細胞的遷移的能力。在一個實施方式中，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)所測量得到的細胞遷移而言，當表達ErbB3的細胞(例如癌細胞)與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸時細胞的遷移可以降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40o/o、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。細胞遷移可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)(例如此處所描述的技術(shù))進行分析。此處所使用的短語"表達ErbB3的細胞的球狀體(spheroid)生長的抑制"是指相對于不存在抗體時的細胞遷移而言，抗體或其抗原結(jié)合部分統(tǒng)計學(xué)顯著地降低表達ErbB3的細胞的遷移的能力。在一個實施方式中，相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時(對照)所測量得到的細胞遷移，當表達ErbB3的細胞(例如癌細胞)與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸時細胞的遷移可以降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或100%。細胞遷移可以使用本領(lǐng)域公認的4支術(shù)(例如此處所描述的技術(shù))進行分析。此處可互換使用的術(shù)語"抗體"或"免疫球蛋白"包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即"抗原結(jié)合部分")或單鏈。"抗體"包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。各重鏈由重鏈可變區(qū)(此處簡稱為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重4連恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(此處簡稱為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。Vh和VL區(qū)可以進一步細分為高變區(qū)(稱為互補性決定區(qū)(CDR)),夾雜著更加保守區(qū)域的區(qū)域(稱為框架區(qū)(FR))。各Vh和Vl由三個CDR和四個FR構(gòu)成，其從氨基端至羧基端的排列順序為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重《連和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括各種免疫系統(tǒng)細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq))的結(jié)合。本發(fā)明的示例性的抗體包括抗體#1、3和14及其抗原結(jié)合部分。此處所使用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱為"抗體部分")是指保持與抗原(例如ErbB3)特異性結(jié)合的能力的一個或多個抗體片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段完成。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，一種由Vl、Vh、CL和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，一種包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的V^和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(v)包含VH和VL結(jié)構(gòu)域的dAb;(vi)由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward等人(1989)胸匿341,544-546);(vii)由Vh或Vt結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb;和(viii)分離的互補性決定區(qū)(CDR)或(ix)兩個或更多個分離的CDR的組合，其任選地由合成的連接體接合。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域(Vl和Vh)由獨立的基因編碼，它們可使用重組方法通過合成的連接體接合，該合成連接體使它們能夠成為單個蛋白鏈，其中Vl和Vh區(qū)配對以形成單價分子(也被稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等人(1988)6We腳242,423-426;和Huston等人(1988)M^/.JcW.t/W85,5879-5883。這樣的單鏈抗體還意圖包含在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"之內(nèi)。4吏用本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來獲得這些抗體片段，并且以篩選完整抗體的相同方式來對片段的效用進行篩選?？梢酝ㄟ^重組DNA技術(shù)或完整免疫J求蛋白的酶或化學(xué)切割來產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。此處所使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指從基本同源的抗體群獲得的抗體，即組成該抗體群的各個抗體除了少量存在的可能的天然發(fā)生的突變以外都是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域公認的技術(shù)和那些在此描述的技術(shù)(例如，如Kohler等人(1975)A/^w，256:495中描述的雜交瘤方法、如Lonberg等人(1994)A^mm368(6474):856-859中描述的轉(zhuǎn)基因動物、重組DNA方法(參見，例如U.S.PatNo.4,816，567)制備單克隆抗體或者使用例如Clackson等人,iV^w^,352:624-628(1991)和Marks等人/Mo/.歷o/，222:581-597(1991)中描述的技術(shù)利用噬菌體抗體庫制備單克隆抗體。單克隆抗體包括嵌合抗體、人抗體和人源化抗體，且可以是天然發(fā)生的或重組產(chǎn)生的。術(shù)語"重組抗體，，是指通過重組方式制備、表達、創(chuàng)建或分離的抗體，例如(a)從免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如小鼠)中或從由該動物制備的雜交瘤中分離的抗體、(b)從進行轉(zhuǎn)化以表達所述抗體的宿主細胞(例如從轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體、(c)使用噬菌體展示從重組、組合抗體庫(例如包含人抗體序列)分離的抗體，和(d)使用涉及將免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)與其它DNA序列進行剪接的任何其它方式制備、表達、創(chuàng)建或分離的抗體。這樣的重組抗體可以具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在特定實施方式中，可以對這樣的重組人抗體進行體外誘變，并因此重組抗體的Vh和VL區(qū)的氨基酸序列是可能并非天然存在于體內(nèi)的人抗體種系集合(repertoire)中的序列，盡管它們源自人種系Vh和Vi序列并與其相關(guān)。術(shù)語"嵌合免疫球蛋白"或抗體是指其可變區(qū)源自第一物種而其恒定區(qū)源自第二物種的免疫球蛋白或抗體。可以例如通過基因工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建嵌合免疫球蛋白或抗體。此處所使用的術(shù)語"人抗體"意圖包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架和CDR區(qū)均源自人種系的免疫球蛋白序列，例如如Kabat等人(參見Kabat等人(1991)Segwewceso/o//mmtmo/ogz'ca//wter&s^，F(xiàn)ifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)所描述的。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。人抗體可以包含非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。但是，此處所使用的術(shù)語"人抗體"并不意圖包括其中源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗體。人抗體可以包含至少一個或多個由氨基酸殘基(例如非由人種系免疫球蛋白序列編碼的活性增強氨基酸殘基)置換的氨基酸。通常，人抗體可以包含最多達20個由不屬于人種系免疫球蛋白序列的部分的氨基酸殘基置換的位置。在特定的實施方式中，這些置換在CDR區(qū)域中，如下面所詳細描述的。術(shù)語"人源化免疫球蛋白，，或"人源化抗體，，是指包含至少一個人源化免疫球蛋白或抗體鏈(即至少一條人源化輕鏈或重鏈)的免疫球蛋白或抗體。術(shù)語"人源化免疫球蛋白鏈，，或"人源化抗體鏈，，(即"人源化免疫球蛋白輕鏈"或"人源化免疫球蛋白重鏈")是指具有包含基24本上來自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本上源自非人免疫球蛋白或抗體的互補性決定區(qū)(CDR)(例如，至少一個CDR、優(yōu)選兩個CDR,更優(yōu)選三個CDR))和進一步包含恒定區(qū)(例如在輕鏈的情況下，包含至少一個恒定區(qū)或其部分，和在重鏈的情況下，優(yōu)選包含三個恒定區(qū))的可變區(qū)的免疫球蛋白或抗體鏈(即，分別為輕或重鏈)。術(shù)語"人源化可變區(qū)"(例如，"人源化輕鏈可變區(qū)"或"人源化重鏈可變區(qū)")是指包括基本源自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本源自非人免疫球蛋白或抗體的互補性決定區(qū)(CDR)的可變區(qū)。"雙特異性"或"雙功能性抗體"是具有兩種不同的重/輕鏈對和兩種不同的結(jié)合位點的人工雜交抗體?？梢酝ㄟ^多種方法(包括雜交瘤的融合或Fab，片段的連接)來制備雙特異性抗體。參見，例如Songsivilai&Lachmann,(1990)C7/打.五;cp./mmw"o/.79，315-321;Kostelny等人(1992)/imww"o/.148,1547-1553。在特定的實施方式中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含ErbB3和IGF1-R(即胰島素樣生長因子l-受體)的結(jié)合位點。在另一個實施方式中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含ErbB3和C-MET的結(jié)合位點。在其它實施方式中，雙特異性抗體包含ErbB3的結(jié)合位點及ErbB2、ERbB3、ErbB4、EGFR、LewisY、MUC國1、EpCAM、CA125、前列腺特異性膜抗原、PDGFR-a、PDGFR-j3、C-KIT或任何FGF受體的結(jié)合位點。此處所使用的"異種抗體"相對于產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物體或纟直物進行定義。此處所使用的"分離的抗體"是指基本上不含具有不同的抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性地與ErbB3相結(jié)合的分離的抗體基本上不含與ErbB3以外的其它抗原特異性地結(jié)合的抗體)。此外，分離的抗體通?；旧喜缓渌募毎镔|(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方式中，具有不同的ErbB3結(jié)合特異性的"分離的"單克隆抗體的組合是在良好定義的組合物中進行組合。此處所使用的"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類(例如IgM或IgGl)。在一個實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分是選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD或IgE抗體同種型的同種型。在某些實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體為IgGl同種型。在其它實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體為IgG2同種型。此處所使用的"同種型轉(zhuǎn)換"是指抗體的類型或同種型從一個Ig類變?yōu)槠渌麵g類中的一個的現(xiàn)象。此處所使用的"非轉(zhuǎn)換同種型"是指當未發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因通常為緊挨著功能性重排的VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉(zhuǎn)換被分為典型的或非典型的同種型轉(zhuǎn)換。典型的同種型轉(zhuǎn)換通過編碼抗體的基因中涉及至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生。非典型的同種型轉(zhuǎn)換可以通過例如人和人^同源重組(5-相關(guān)缺失)發(fā)生。替代的非典型轉(zhuǎn)換機制(例如，特別是轉(zhuǎn)基因間的和/或染色體間的重組)可以發(fā)生并完成同種型轉(zhuǎn)換。此處所使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)換序列"是指負責(zé)轉(zhuǎn)換重組的那些DNA序列。"轉(zhuǎn)換供體"序列(典型地為n轉(zhuǎn)換區(qū))為在轉(zhuǎn)換重組過程中被刪除的構(gòu)建體(construct)區(qū)的5'端(即上游)。"轉(zhuǎn)換受體"區(qū)是在將刪除的構(gòu)建區(qū)和置換恒定區(qū)(例如，y、s等)之間。由于沒有總是發(fā)生重組的特定位點，因此最終的基因序列通常不能從構(gòu)建體進^f亍預(yù)測。"抗原"為抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合的實體(例如，蛋白質(zhì)的實體或肽)。在本發(fā)明的各種不同的實施方式中，抗原為ErbB3或ErbB3樣分子。在本發(fā)明的特定的實施方式中，抗原為人ErbB3。術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"是指抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的位點。表位可以由相鄰氨基酸形成或通過蛋白質(zhì)的三級折疊而并置的不相鄰氨基酸形成。由相鄰的氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通常仍會保留，而由三級折疊形成的表位通常在經(jīng)變性溶劑處理時會喪失。表位通常包括處于獨特的空間構(gòu)型的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸。確定表位空間構(gòu)型的方法包括本領(lǐng)域的纟支術(shù)和此處所描述的纟支術(shù)，例如，X射線晶體學(xué)和二維核磁共#展。參見,<列^口五/7/top&sA/app/"giVotoco/s,"A/^Ao^s1,"Afo/ecw/or歷o/ogy，Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。本發(fā)明還包括結(jié)合與本發(fā)明的抗體相同或重疊的表位的抗體(即竟爭結(jié)合ErbB3的抗體)或結(jié)合與此處所描述的抗體所結(jié)合的表位重疊的表位(即位于ErbB3結(jié)構(gòu)域I上的表位)的抗體。可以使用常規(guī)技術(shù)(例如免疫分析，比如表明一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結(jié)合的能力，即竟爭結(jié)合分析)來確認識別相同的表位的抗體。竟爭結(jié)合在其中所測試的免疫球蛋白抑制基準抗體對共同抗原(例如ErbB3)的特異性結(jié)合的分析中確定。已知存在許多種竟爭結(jié)合分析，例如固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心竟爭分析(參見StaMi等人，(1983)M"/w^〖"五"2:7mo/ogy9:242)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人(l兆6)/■/mmimo/.137:3614)、固相直4妾標記分析、固相直^^妄標記夾心分析(參見Harlow禾口Lane，(1988)Jw&6odz:esvJZ^Zor"to^yAfawwa/，ColdSpringHarborPress)、使用1-125標記物的固相直接標記RIA(參見Morel等人(1988)Mol.Immunol.25(1):7)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人(1990)Virology176:546)和直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)ScaM.//wmmo/.32:77)。通常，這樣的分析涉及使用與攜帶未標記的測試免疫球蛋白和標記的基準免疫球蛋白中的任一種的固相表面或細胞相結(jié)合的純化抗原(例如ErbB3)。通過確定在存在測試免疫球蛋白的情況下與固相表面或細胞相結(jié)合的標記物的量來測量竟爭抑制。通常測試免疫球蛋白過量存在。通常，當竟爭抗體過量存在時，其會抑制基準抗體與共同抗原的特異性結(jié)合至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多。此處所使用的術(shù)語"特異性的結(jié)合"、"特異性結(jié)合"、"選擇性的結(jié)合"和"選擇性結(jié)合"是指抗體或其抗原結(jié)合部分對特定的抗原或表位表現(xiàn)出可感知的親和力，且通常不表現(xiàn)出與其它抗原或表位的顯著的交叉反應(yīng)性。"可感知的"或優(yōu)選的結(jié)合包括親和力為至少106、107、108、1(fM"或10^M"的結(jié)合。大于107M"、優(yōu)選為1()8M"的親和力為更優(yōu)選的。本發(fā)明的范圍還包括此處所列的這些值之間的值，優(yōu)選的結(jié)27合親和力可以表示為親和力的范圍，例如106至10"M"、優(yōu)選為107至101QM"、更優(yōu)選為108至101GM"。"不表現(xiàn)出顯著的交叉反應(yīng)性"的抗體為不會與不希望的實體(例如不希望的蛋白質(zhì)實體)可感知地結(jié)合的抗體。例如，在一個實施方式中，與ErbB3特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分可感知地與該ErbB3分子相結(jié)合，而不會顯著地與其它ErbB分子及非ErbB蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)。可根據(jù)任何本領(lǐng)域公認的確定特異性或選擇性結(jié)合的方式來確定這樣的結(jié)合，包括，例如根據(jù)斯卡查德分析和/或竟爭結(jié)合分析確定特異性或選擇性結(jié)合。此處所使用的術(shù)語"Kd，，是指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)或抗體對于抗原的親和力。在一個實施方式中，使用表面等離子共振分析或細胞結(jié)合分析所測量到的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與抗原(例如ErbB3)相結(jié)合的親和力(KD)為50nM或更好(即，更小)(例如40nM或30nM或20nM或10nM或更小)。在特定的實施方式中，使用表面等離子共振分析或細胞結(jié)合分析所測量到的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與ErbB3相結(jié)合的親和力(Kd)為8nM或更好(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、lnM或更小)。在其它實施方式中，當使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)在BIACORE3000儀中使用重組ErbB3作為分析物以及使用抗體作為配體進行測定時，抗體或其抗原結(jié)合部分與抗原(例如ErbB3)相結(jié)合的親和力(Kd)大約小于10—7M—、例如大約小于1(T8M,IO一M或10-1GM或甚至更??；并且，抗體或其抗原結(jié)合部分以至少為與非特異性的抗原(例如BSA、酪蛋白)(預(yù)先確定的抗原或其密切相關(guān)的抗原以外的抗原)結(jié)合的親和力的兩倍的親和力與預(yù)先確定的抗原相結(jié)合。此處所使用的術(shù)語"Koff"是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。此處所使用的術(shù)語"EC50"是指在體外或體內(nèi)分析中，誘導(dǎo)出最大響應(yīng)的50%響應(yīng)(即最大響應(yīng)與基線的中間值)的抗體或其抗原結(jié)合部分的濃度。如此處所使用的，"糖基化模式"定義為與蛋白質(zhì)(更具體地，與免疫球蛋白蛋白質(zhì))共價結(jié)合的糖單元模式。此處所使用的用于某一物體的術(shù)語"天然發(fā)生的"是指某一物體可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，存在于可以從自然界的來源中分離出來且沒有在實驗室中經(jīng)過人類進行有意改變的生物體(包括病毒)中的多肽或多核苷,列為天然發(fā)生的。此處所使用的術(shù)語"重排的"是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中，在實質(zhì)上編碼完整的Vh或Vx^結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型中，V片段分別緊挨著D-J或J片段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA相比較進行識別；重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源元件。此處所使用的涉及V片段的術(shù)語"未重排的"或"種系構(gòu)型"是指其中V片段未經(jīng)重組以至于緊挨著D或J片段的構(gòu)型。此處所使用的術(shù)語"核酸分子"意圖包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選為雙鏈DNA。此處所-使用的涉及編碼與ErbB3相結(jié)合的抗體或抗體部分(例如Vh、Vl、CDR3)的核酸的術(shù)語"分離的核酸分子"是指其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼與ErbB3之外的抗原相結(jié)合的抗體的其它核苷酸序列的核酸分子，該其它序列在人基因組DNA中可能天然側(cè)鄰該核酸。此處所使用的術(shù)語"修飾的"或"修飾"是指在抗體或其抗原結(jié)合部分中改變一個或更多個氨基酸。改變可以通過在一個或多個位點添加、置換或刪除氨基酸實現(xiàn)?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)來實現(xiàn)改變，例如PCR誘變。例如，在一些實施方式中，使用本發(fā)明的方法識別的抗體或其抗原結(jié)合部分可以進行修飾，從而改變抗體或其抗原結(jié)合部分對ErbB3的結(jié)合親和力。本發(fā)明在本發(fā)明的抗體序列中還包含"保守氨基酸置換"，即不會損害該核苷酸序列編碼的抗體或包含該氨基酸序列的抗體對抗原(即ErbB3)的結(jié)合的核苷酸和氨基酸序列修飾。保守氨基酸置換包括一個類型的氨基酸被相同類型的氨基酸置換，其中所述類型由共同的氨基酸側(cè)鏈物理化學(xué)性質(zhì)以及自然界中發(fā)現(xiàn)的同源蛋白質(zhì)中的高置換頻率確定，侈寸^口通過才示〉隹Dayhoff步貞率交才灸頭巨P車(frequencyexchangematrix)或BLOSUM矩陣確定的。氨基酸側(cè)鏈被分為六大類，并包括I類(Cys);II類(Ser,Thr,Pro,Ala,Gly);III類(Asn,Asp,Gln，Glu);IV類(His,Arg,Lys);V類(Ile,Leu，Val，Met)和VI類(Phe,Tyr,Trp)。例如，Asp置換另一III類的殘基(例如Asn、Gln或Glu)為保守置換。因此，在抗ErbB3抗體中預(yù)計的非關(guān)鍵氨基酸殘基優(yōu)選使用同一類中的另一氨基酸殘基進行取代。識別不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守置換的方法是本領(lǐng)域公知的(參見,例如Brummell等人所oc/^m.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Prato7z五"g.12(10):879-884(1999);和Burks等人尸rac.胸/.vied固94:412-417(1997))。術(shù)語"非保守氨基酸置換"是指一類的氨基酸被另一類的氨基酸置換；例如，使用III類的殘基(例如Asp、Asn、Glu或Gin)來置換II類的殘基Ala。或者，在另一個實施方式中，可以沿著整個或部分抗-ErbB3抗體編碼序列隨機引入突變(保守或非保守)，例如通過飽和誘變，且得到的修飾的抗-ErbB3抗體可以針對其結(jié)合活性進行篩選。"共有序列"為相關(guān)序列的族中最常見的氨基酸(或核香酸)形成的序歹ij(參見，例^口Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987)。在蛋白質(zhì)家族中，共有序列中的各位置都由家族中在該位置中最常見的氨基酸占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)的頻率相同，在該共有序列中可以包含其中的任一個。免疫球蛋白的"共有框架"是指共有免疫球蛋白序列中的框架區(qū)。同樣地，CDR的共有序列可以通過本發(fā)明的ErbB3抗體的CDR氨基酸序列的最優(yōu)比對得到。對于核酸而言，術(shù)語"基本同源性"是指當進行優(yōu)化比對或?qū)Ρ葧r，兩個核酸或其指定序列有至少大約80%的核苷酸是相同的，通常至少大約90%至95%、更優(yōu)選為至少大約98%至99.5%的核苷酸是相同的，其具有適當?shù)暮讼闼岵迦牖蛉笔??；蛘撸瑪嘣谶x擇性雜交條件下與互30補鏈雜交時存在基本同源性。兩個核苷酸序列之間的百分同一性是該序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同源性=相同的位置#/總位置#乂100),同時考慮在對兩個序列進行最優(yōu)比對時需要引入的空位(gap)的數(shù)目和各空位的長度。序列的對比和兩個序列間百分同一性的確定可以^使用下述非限定性的實施例所描述的數(shù)學(xué)算法來完成。可以采用GCG軟件的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重，確定兩個核苦酸序列間的百分同一性。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分同一性也可以^吏用已經(jīng)引入ALIGN程序U反本2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))、使用PAM120殘基權(quán)重表(weightresiduetable)、12的空位長度罰分和4的空位罰分來確定。此外，兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以使用已經(jīng)引入到GCG軟件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法(乂Mo/.說o/.(48):444-453(1970))、使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來確定。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以進一步用作"探詢序列"對公眾數(shù)據(jù)庫進行檢索，例如來識別相關(guān)序列。這樣的檢索可以使用Altschul等人(1990)/Mo/.說'o/.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)進行。BLAST核苷酸檢索可以使用NBALST程序進行(分數(shù)-100，字長二12)以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷^歹iJ。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以使用XBLAST程序進行(分數(shù)=50，字長=3)以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以使用如Altschul等人(1997)iVwc/e/c爿c/^25(17):3389-3402中描述的空位BLAST。當使用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數(shù)。核酸可以存在于完整細胞中、細胞溶解產(chǎn)物中或以部分純化或完全純化的形式存在。當使用標準技術(shù)(包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱色譜法、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù))從其它細胞組分或其它污染物(例如其它細胞核酸或蛋白質(zhì))中純化出來時，核酸為"分離的，，或"基本上純的，，。參見，F(xiàn).Ausubel等人，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。盡管本發(fā)明的核酸組合物通常為天然序列(除了修飾的限制性位點等)，但來自cDNA、基因組或其混合物的本發(fā)明的核酸組合物可以按照標準技術(shù)進行突變來提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可以按照需要來影響氨基酸序列。特別地，可以設(shè)想與天然的V、D、J、恒定序列、轉(zhuǎn)換序列和其它此處所描述的這類序列同源的或源自它們的DNA序列(其中"源自"表示一個序列與另一序列相同或由另一序列修飾得到)。術(shù)語"可操作地連接的"是指核S臾序列與另一核酸序列具有功能性的關(guān)系。例如，如果前序列或分泌性前導(dǎo)體的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌性前導(dǎo)體的DNA可l喿作地與該多肽的DNA相連接；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強子可操作地與該編碼序列相連接；或者如果核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則該核糖體結(jié)合位點可操作地與編碼序列相連接。通常，"可操作地連接，，是指相連的DNA序列為相鄰的，且在分泌性前導(dǎo)體的情況中，相連的DNA序列是相鄰的并處于閱讀相(readingphase)中。但是，增強子并非一定是相鄰的。通過在方便的限制性位點的接合完成連接。如果不存在這樣的位點的話，可才艮據(jù)常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接頭或連接體。當核酸和另一核*列具有功能性的關(guān)系時，該核酸是"可操作地連接的"。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，該啟動子或增強子可操作地與該編碼序列連接。當涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列時，可操作地連接是指連接的DNA序列是相鄰的，且在需要合并兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，連接的DNA序列是相鄰的并處于閱讀框中。對于轉(zhuǎn)換序列而言，可操作地連接是指該序列能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)換重組。此處所使用的術(shù)語"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸的核酸分子。載體的一種類型為"質(zhì)粒"，其是指附加的DNA片斷可接合到其中的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一種載體類型是病毒載體，其中附加的DNA片斷可以接合到病毒基因組中。特定的載體能夠在其進入的宿主細胞內(nèi)進行自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和游離型(episomal)哺乳動物載體)。其它的載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因組中，從而可以與宿主基因組一起進行復(fù)制。此外，特定的載體能夠引導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達。這樣的載體被此處稱為"重組表達載體"(或簡稱為"表達載體")。一般而言，在重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達載體通常是質(zhì)粒的形式。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用。但是，本發(fā)明意圖包括這類其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們都具有等同的功能。此處所使用的術(shù)語"重組宿主細胞"(或簡稱"宿主細胞")是指引入重組表達載體的細胞。需要明白的是，這些術(shù)語并不僅指特定的所述細胞，還指這些細胞的后代。由于突變或環(huán)境影響導(dǎo)致在后代中可能會出現(xiàn)某些改變，因而事實上，這些后代可能與母細胞不相同，但是它們?nèi)匀话ㄔ诖颂幩褂玫男g(shù)語"宿主細胞"的范圍內(nèi)。此處所使用的術(shù)語"治療(treat)，，、"治療(treating)，，和"治療(treatment)"是指此處所描述的治療性或預(yù)防性4晉施。"治療"方法包括對受試者(例如，患有與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病或障礙或傾向患有這樣的疾病或防礙的受試者)給予本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，從而預(yù)防、治療、延遲該疾病或障礙或該疾病或障礙的復(fù)發(fā)、或降低其嚴重性，或減輕該疾病或障礙或該疾病或障礙的一種或多種癥狀，或者從而延長受試者的存活時間超過不接受這種治療時預(yù)期的時間。此處所使用的術(shù)語"與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病"或"與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的障礙"包括如下疾病狀態(tài)和/或與疾病狀態(tài)相關(guān)的癥狀，其中發(fā)現(xiàn)ErbB3水平升高和/或涉及ErbB3的細胞級聯(lián)的激活。已經(jīng)知道當發(fā)現(xiàn)ErbB3水平升高時，ErbB3與其它ErbB蛋白質(zhì)(例如EGFR和ErbB2)形成異二聚體。因此，術(shù)語"與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病"還包括其中發(fā)現(xiàn)EGFR/ErbB3和/或ErbB2/ErbB3異二聚體的水平升高的疾病狀態(tài)和/或與疾病狀態(tài)相關(guān)的癥狀。一^f殳而言，"與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病"是指任何需要ErbB3參與的障礙、發(fā)作、發(fā)展或癥狀的持續(xù)。示例性的ErbB3介導(dǎo)的障礙包括，^旦不局限于例如癌癥。術(shù)語"癌癥"和"癌性"指的是或描述的是通常以失控的細胞生長為特征的哺乳動物的生理狀況。癌癥的例子包括，但不局限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這樣的癌癥的更特定的例子包括扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、膠質(zhì)細胞腫瘤(例如成膠質(zhì)細胞瘤和神經(jīng)纖維瘤)、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎臟癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌和各種類型的頭部和頸部癌癥。在特定的實施方式中，使用本發(fā)明的方法治療或診斷的癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃腸/結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。此處所使用的術(shù)語"有效的量"是指當給予受試者時，如此處所描述的結(jié)合ErbB3的抗體或其抗原結(jié)合部分足以發(fā)揮治療、預(yù)后或診斷與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病的作用的量。治療有效量根據(jù)接受治療的受試者和疾病、受試者的體重和年齡、疾病狀態(tài)的嚴重性、給藥方式等的不同而變化，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以4艮容易確定治療有效量。根據(jù)本發(fā)明，給藥劑量的范圍可以為大約1ng至大約10000mg、大約5ng至大約9500mg、大約10ng至大約9000mg、大約20ng至大約8500mg、大約30ng至大約7500mg、大約40ng至大約7000mg、大約50ng至大約6500mg、大約100ng至大約6000mg、大約200ng至大約5500mg、大約300ng至大約5000mg、大約400ng至大約4500mg、大約500ng至大約4000mg、大約1pg至大約3500mg、大約5pg至大約3000mg、大約10jug至大約2600mg、大約20嗎至大約2575mg、大約30pg至大約2550mg、大約40至大約2500mg、大約50|ig至大約2475mg、大約100嗎至大約2,450mg、大約200pg至大約2425mg、大約300jug至大約2000mg、大約400jig至大約1175mg、大約500jig至大約l,150mg、大約0.5mg至大約1125mg、大約lmg至大約1100mg、大約1.25mg至大約1075mg、大約1.5mg至大約1050mg、大約2.0mg至大約1025mg、大約2.5mg至大約1000mg、大約3.0mg至大約975mg、大約3.5mg至大約950mg、大約4.0mg至大約925mg、大約4.5mg至大約900mg、大約5mg至大約875mg、大約10mg至大約850mg、大約20mg至大約825mg、大約30mg至大約800mg、大約40mg至大約775mg、大約50mg至大約750mg、大約100mg至大約725mg、大約200mg至大約700mg、大約300mg至大約675mg、大約400mg至大約650mg、大約500mg或大約525mg至大約625mg的抗體或其抗原結(jié)合部分?？梢哉{(diào)整給藥方案以才是供最佳治療反應(yīng)。有效量也是抗體或其抗原結(jié)合部分的任何毒性或有害效應(yīng)(即副作用)最小和/或#皮有益效果遠遠超過的量。術(shù)語"患者"包括接受預(yù)防或治療處理的人和其它哺乳動物受試者。此處所使用的術(shù)語"受試者"包括任何人或非人類動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患有癌癥的受試者。在特定的實施方式中，受試者是人。術(shù)語"非人類動物，，包括所有脊推動物，例如哺乳動物或非哺乳動物，例如非人類靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。術(shù)語"樣品"是指來自患者或受試者的組織、體液或細胞。通常組織或細胞會從患者身上取出，但是也可能進行體內(nèi)診斷。在實體腫瘤的情況下，組織樣品可以從通過手術(shù)取出的腫瘤取得并通過常規(guī)技術(shù)制備以進行測試。在淋巴瘤和白血病的情況下，可以獲得淋巴細胞、白血病細胞或淋巴組織并適當?shù)刂苽?。其它的患者樣?包括尿、眼淚、血清、腦脊髓液、糞便、痰、細胞提取液等)也可用于特定的肺瘤。術(shù)語"抗癌劑"和"抗肺瘤劑"是指用于治療惡性肺瘤(例如癌生長)的藥物。藥物治療可以單獨^f吏用，也可以與其它治療(例如手術(shù)或放射治療)聯(lián)合使用。取決于所涉及的器官的性質(zhì)，可以在癌癥治療中使用幾類藥物。例如，乳腺癌通常受到雌激素的刺激，因此可以使用滅活性激素的藥物來治療。同樣地，前列腺癌可以使用滅活雄激素(雄性的性激素)的藥物治療。本發(fā)明的抗癌劑特別包括下述物質(zhì)抗體(a)抗ErbB3抗體以外的其它抗體；和(b)與不同表位結(jié)合的抗ErbB3抗體靶向IGF1R的小分子注釋與IGF-1R(胰島素樣生長因子I型受體)結(jié)合的抗體，其在大多數(shù)人癌細胞表面上表達結(jié)合EGFR(表皮生長因子受體)的受體；影響EGFR表達或活性的突變可能導(dǎo)致癌癥結(jié)合cMET(間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子)的抗體；受體酪氨酸激酶MET家族的成員與不同表位結(jié)合的抗ErbB3抗體IGF-1R(胰島素樣生長因子1型受體)，其在大多數(shù)人癌細胞表皮上表達例子A12(完全人源化mAb)19D12(完全人源化mAb)CP751-871(完全人源化mAb)H7C10(人源化mAb)alR3(小鼠)scFV/FC(小鼠/人嵌合體)EM/164(小鼠)馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD72000)愛必妥/西妥昔單抗(Cetuximab)(Imclone)Vectibix⑧/巾白尼單才元(Panitumumab)(Amgen)mAb806尼妥珠單抗(NimotuzumatO(TheraCIM)AVEO(AV299)(AVEO)AMG102(Amgen)5D5(OA-5D5)(Genentech)此處描述的Ab#14(MM121-14)Herceptin(曲妥珠單抗(Trastuzumab);Genentech)1B4C3;2D1D12(U3PharmaAG)NVP-AEW541-ABMS-536,924(1H-苯并咪唑-2-基)-lH-吡啶-2-酮)輩巴向EGFR的EGFR(表皮生長因子受體)；影響小分子EGFR表達或活性的突變可能導(dǎo)致癌癥耙向cMET的cMET(間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子)；受小分子體酪氨酸激酶MET家族成員抗代謝物抗代謝物為與正常生化反應(yīng)所需的物質(zhì)(代謝物)具有相似的結(jié)構(gòu)、但其不同足以干擾細胞的正常功能(包括細胞分裂)的化合物BMS-554,417環(huán)木脂體(Cycloligan)TAE226PQ401Iressa/*非替尼(AstraZeneca)CI-1033(PD183805)(Pfizer)拉帕替尼(GW-572016)(GlaxoSmithKline)Tykerb/二曱苯磺酸拉帕替尼(SmithKlineBeecham)Tarceva⑧/埃羅替尼(Erlotinib)HC1(OSI-774)(OSIPharma)PKI-166(Novartis)PD-158780EKB-569酪氨酸石舞酸化抑制劑(Tyrphostin)AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6,7-二曱氧基喹唑淋)PHA665752ARQ197氟尿嘧啶(5-FU)卡培他濱/XELODA(HLRRoche)5-三氟曱基-2'-脫氧尿苷甲氨蝶呤鈉(Trexall)(Barr)雷替曲塞/Tomudex(AstraZaneca)培美曲塞(Pemetrexed)/Alimta(Lilly)替加氟烷化劑烷化抗肺瘤劑為將烷基連接到DNA上的烷化劑。由于通常癌細胞與正常細胞相比更加沒有限制地增殖，癌細胞對DNA損傷更加敏感，因而烷化劑在臨床上用于治療多種腫瘤。阿糖胞普(阿糖胞苷，Ara-C)/Thioguanine(GlaxoSmithKline)5-氮雜胞苷6-巰噪呤(巰噤呤，6-MP)n米唑^克嘌p令/Azasan(AAIPHA腹ALLC)6-石危鳥噪呤(6-TG)/Purinethol(TEVA)噴司4也丁(Pentostatin)/Nipent(HospiraInc.)確酸氟達拉濱/Fludara(BayerHealthCare)克拉曲濱(2-CdA,2-氯脫氧腺苦)/Leustatin⑧(OrthoBiotech)核^f唐核苦酸還原酶抑制劑(RNR)環(huán)石舞酰胺/Cytoxan(BMS)Neosar(TEVA)異環(huán)磷酰胺/Mitoxana(ASTAMsdica)塞替派(Bedford,Abraxis,Teva)BCNU—1，3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲CCNU—1,-(2-氯乙基)-3-環(huán)己基-1-亞硝基脲(甲基CCNU)六甲三聚氰胺(六曱蜜胺，HMM)/Hexalen(MGIPharmaInc.)白消安/馬利蘭(GlaxoSmithKline)鹽酸曱基芐肼/Matulane(Sigma拓樸異構(gòu)酶抑拓樸異構(gòu)酶抑制劑為設(shè)計用于干擾制劑拓樸異構(gòu)酶(異構(gòu)酶I和II)活性的化學(xué)治療劑，拓樸異構(gòu)酶是在正常的細胞周期中通過催化DNA鏈的磷酸二酯骨架的斷裂和重新連接控制DNA結(jié)構(gòu)的變化的酶。微管扭向劑微管是細胞骨架組分中的一種。在神經(jīng)細胞軸突中它們的直徑為~24nm,長度為幾孩i米至可能幾毫米。39TauPharmaceuticals,Inc.)達卡巴嗪(DTIC)苯丁酸氮芥/Leukaran(SmithKlineBeecham)馬法蘭/Alkeran(GlaxoSmithKline)順鉑(Cisplatinum,CDDP)/順氯氨柏(BristolMyers)卡鉑/伯爾定(Paraplatin)(BMS)奧沙利柏/Eloxitan(Sanofi-AventisUS)鹽酸多柔比星/Doxil(Alza)檸檬酸柔紅霉素/Daunoxome(Gilead)鹽酸米托蒽醌/Novantrone(EMDSerono)放線菌素D依托泊戒/Vepesid(BMS)/Etopophos(Hospira,Bedford,TevaParenteral等)鹽酸拓樸替康/Hycamtin(GlaxoSmithKline)替尼泊甙(VM-26)/Vumon⑧(BMS)鹽酸伊立替康(CPT-11)/Camptosar(Pharmacia&Upjohn)長春*Oncovin(Lilly)長春堿硫酸鹽/Velban(停止)(Lilly)微管作為細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)性組分，并參與許多細胞過程，包括有絲分裂、胞質(zhì)分裂和嚢泡運輸。激酶抑制劑酪氨酸激酶為在細胞內(nèi)將磷酸基團連接到氨基酸酪氨酸上的酶。通過阻斷蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的功能，這些化合物提供了一種控制癌細胞生長的工具。蛋白合成抑制誘導(dǎo)細胞凋亡劑免疫治療劑誘導(dǎo)癌癥患者發(fā)揮免疫響應(yīng)力激素與絕經(jīng)和老化相關(guān)的激素治療試圖提高身體中特定激素的量來補償年齡或疾病相關(guān)的激素降低。作為癌40酒石酸長春瑞濱/Navelbine(PierreFabre)硫酸長春地辛/Eldisine(Lilly)紫杉醇/Taxo胞(BMS)多西他賽/Taxotere(SanofiAventisUS)納米顆粒'紫杉醇(ABI-007)/A_bmxane(AbraxisBioscience,Inc.)伊沙匹隆(Ixabepilone)/IXEMPRATM(BMS)曱石黃酸伊馬替尼/Gleevec(Novartis)蘋果酸舒尼替尼/Suten惚(Pfizer)甲苯磺酸索拉非尼/Nexavar(Bayer)鹽酸尼洛替尼一水合物/Tasigna(Novartis)L-天冬酰胺酶/Elspar⑧(Merck&Co.)a干擾素血管發(fā)生抑制劑/Avastin(Genentech)IL-2—白細胞介素2(Aldesleukin)/Proleukin(Chiron)IL-12->白細胞介素12檸檬酸托瑞米芬/Fareston(GTX,Inc.)氟維斯群/Faslodex(AstraZeneca)癥治療的激素療法或者降低了特定激素的水平，或者改變了癌細胞利用這些激素來生長和擴散的能力。鹽酸雷洛昔芬/Evista(Lilly)阿那曲唾(Anastrazole)/Arimidex(AstraZeneca)來曲峻/Femara(Novartis)法倔唑(Fadrozole)(CGS16949A)依西美坦/Aromasin(Pharmacia&Upjohn)醋酸亮丙瑞林/Eligard(QTLUSA)Lupron(TAPPharm.)醋酸戈舍瑞林/Zoladex(AstraZeneca)雙羥奈酸曲普瑞才木/Trelstar(WatsonLabs)布舍瑞林(Buserelin)/Suprefact(SanofiAventis)那法瑞林西曲瑞克(Cetrorelix)/Cetrotide(EMDSerono)比卡魯胺/Casodex(AstraZeneca)尼魯米特/Nilandron(AventisPharm.)醋酸曱地孕酮/Megace(BMS)生長抑素類似物(醋酸奧曲肽/Sandostatin(Novartis))糖皮質(zhì)激素用于降低引起癌癥疼痛的腫脹的抗?jié)娔崴升堁姿幬锏厝姿?Decadron(Wyeth)芳香化酶包括咪喳酮康喳(aromatose)才中制劑化學(xué)治療劑mTOR信號傳導(dǎo)途徑在免疫抑制劑雷帕霉素的研究中最早發(fā)現(xiàn)。該高度保守的途徑調(diào)節(jié)細胞增殖以及響應(yīng)于環(huán)境因素的代謝，從而通過磷酸肌醇-3-激酶(PI-3K)將細胞生長因子受體信號傳導(dǎo)與細胞生長、增殖和血管發(fā)生聯(lián)系起來。西羅莫司(雷帕霉素)/Rapamune(Wyeth)西羅莫司月旨化物(Temsirolimus)(CCI-779)/Torisel(Wyeth)Deforolimus(AP23573)(AriadPharm.)依維莫司(Everolimus)(RAD001)/Certican(Novartis)阿霉素、5-氟尿嘧t定、細胞毒素、博來霉素、絲裂菌素C、道諾霉素、洋紅霉素、氨喋呤、放線菌素D、絲裂菌素、埃斯培拉霉素一種或多種抗癌劑可以同時施用，或者在施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分之前或之后施用。收.II.制備本發(fā)明抗體的方法(i)單克隆抗體本發(fā)明的單克隆抗體可以通過多種已知技術(shù)進行制備，例如Kohler和Milstein(1975)M^wre256:495中描述的標準體細胞雜交技術(shù)、B淋巴細胞的病毒或致瘤性轉(zhuǎn)化或使用人抗體基因庫的噬菌體展示技術(shù)。在特定的實施方式中，抗體為完全的人單克隆抗體。因此，在一個實施方式中，雜交瘤方法用于制備與ErbB3相結(jié)合的抗體。在這個方法中，小鼠或其它適當?shù)乃拗鲃游锟梢允褂煤线m的抗原進行免疫，以誘導(dǎo)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與用于免疫的抗原特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞?；蛘?，淋巴細胞可以在體外進行免疫。然后使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)，淋巴細胞可以與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤纟田月包(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。分析雜交瘤細胞在其中生長的培養(yǎng)基以4全測針對抗原的單克隆抗體的生成。在確認雜交瘤細胞產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體之后，克隆可以通過有限稀釋過程進行亞克隆4匕，并使用標準方法進行生長(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。用于止匕目的的合適的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以在動物體內(nèi)作為腹水胂瘤生長。亞克隆分泌的單克隆抗體可以從培養(yǎng)基、腹水液或血清中通過常規(guī)免疫球蛋白純化過程(例如，舉例來說，蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法)分離出來。在另一個實施方式中，與ErbB3相結(jié)合的抗體和抗體部分可以/人抗體噬菌體庫中分離出來，該噬菌體庫是使用例如McCafferty等人，Atow",348:552-554(1990)，Clackson等人,AtowM,352:624-628(1991)，Marks等人，J!Mo/.祝o/"222:581-597(1991)和Hoet等人(2005)iVa加re腸&c/mo/ogy23,344-348;Ladner等人的美國專利No.5,223,409;5,403,484;和5,571,698;Dower等人的美國專利No.5,427,908和5,580,717;U.S.McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和6,172,197;及Griffiths等人的美國專利No.5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081中描述的技術(shù)產(chǎn)生的。此外，還可以使用通過鏈改組(Marks等人，Ao/rec/wo/ogy，10:779-783(1992))以及作為用于構(gòu)建非常大的噬菌體庫的策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等人，Wwc.爿d血21:2265-2266(1993))產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體。在特定的實施方式中，使用Hoet等人(同上)描述的噬菌體展示技術(shù)制備與ErbB3相結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分。這項技術(shù)涉及產(chǎn)生具有從人類供體分離出來的免疫球蛋白序列的獨特組合并在重鏈CDR中具有合成多樣性的人Fab庫。這個庫然后用于篩選與ErbB3相結(jié)合的Fab。在再另一個實施方式中，可以使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對ErbB3的人單克隆抗體(參43見，例如Lonberg等人(1994)A^w^368(6474):856-859;Lonberg，N.等人(1994),同上；reviewedinLonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93,及Harding,F.和Lonberg，N.(1995)Ann.NY.AcadSci.764:536-546。進一步參見Lonberg和Kay的美國專利No.5,545,806;5，569，825;5,625,126;5,633，425;5，789，650;5，877，397;5,661,016;5,814,318;5,874,299和5,770,429;Surani等人的美國專利No.5,545,807;Lonberg和Kay的PCT公布No.WO92/03918，WO93/12227,WO94/25585,WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962;及Korman等人的PCT公布No.WO01/14424)。在另一個實施方式中，可以使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠(例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠)產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體(參見，例如Ishida等人的PCIV^布WO02/43478)。再進一步，表達人免疫球蛋白基因的可選的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗ErbB3抗體。例如，可以使用稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的可選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；這樣的小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利No.5，939，598;6,075,181;6,114,598;6，150,584和6,162,963中有所描述。此外，表達人免疫球蛋白基因的可選的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗ErbB3抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；如Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中所述。此外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛在本領(lǐng)域中也有所描述(Kuroiwa等人(2002)A^we20:889-894)，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗ErbB3抗體。在再另一個實施方式中，可以使用產(chǎn)生這樣的抗體的轉(zhuǎn)基因植物和/或培養(yǎng)的植物細胞(例如，舉例來說，煙草、玉米和浮萍)來制備本發(fā)明的抗體。例如，表達抗體或其抗原結(jié)合部分的轉(zhuǎn)基因煙草葉可通過例如使用誘導(dǎo)型啟動子(參見，例如Cramer等人，Cw〃.Top.Mz'craZo/./mm匪o/.240:95118(1999))被用于制備這樣的抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因玉米也可被用于表達這樣的抗體及其抗原結(jié)合部分(參見，例如Hood等人，A/v.五x/.MW.祝o/.464:127-147(1999))。還可以從包括抗體部分(例如單鏈抗體(scFv's)的轉(zhuǎn)基因植物種子，例如使用煙草種子或馬鈴薯莖，大量制備抗體(參見,例如Conrad等人，Mo/.編.38:101-109(1998))。在植物中制備抗體或抗原結(jié)合部分的方法可以參見例如Fischer等人，所otec/mo/.j;p/.歷oc/e肌30:99108(1999),Ma等人，7>em^脂ec/mo/.13:522-7(1995);Ma等人，尸/福109:341-6(1995);Whitelam等人，歷oc/^肌5bcrra肌22:940-944(1994)和美國專利No.6,040,498和6,815,184?？梢酝ㄟ^免疫沉淀或體外結(jié)合分析(例如輻射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))確定使用任何技術(shù)(包括此處所述的技術(shù))制備的與ErbB3相結(jié)合的單克隆抗體或其部分的結(jié)合特異性。還可以通過Munson等人,J朋/.歷oc/^w.，107:220(1980)的斯卡查德分析來確定單克隆抗體或其部分的結(jié)合親和力。在特定實施方式中，使用上述任何方法制備的ErbB3抗體或其部分可以通過本領(lǐng)域公i人的技術(shù)(例如那些此處所描述的技術(shù))進一步進行改造或優(yōu)化，以獲得所需的結(jié)合特異性和/或親和力。在一個實施方式中，源自ErbB3抗體的部分抗體序列可用于制備結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的抗體。例如，抗體主要通過位于六個重鏈和輕鏈互補性決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，在抗體個體之間CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更多樣化。由于CDR序列負責(zé)大部分的抗體-抗原相互作用，通過構(gòu)建包括嫁接到來自具有不同性質(zhì)的不同載體的框架序列上的來自特定的天然發(fā)生抗體的CDR序列的表達載體(參見，例如，Riechmann,L.等人，1998,A^we332:323-327;Jones,P.等人,1986,胸匿321:522-525;和Queen,C.等人,1989，尸rac.A^/.^cad&e.t/JJ.86:10029-10033)，表達模擬特定的天然發(fā)生抗體的性質(zhì)的重組抗體是可能的。這樣的框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公開的DNA數(shù)據(jù)庫中獲得。因此，本發(fā)明的抗ErbB3抗體的一種或多種結(jié)構(gòu)特征(例如CDR)可用于創(chuàng)建維持本發(fā)明抗體的至少一種功能性質(zhì)(例如抑制EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化；抑制一種或多種神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)；抑制表達ErbB3的細胞的增殖；和/或降低細胞表面的ErbB3水平)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗ErbB3抗體。在特定的實施方式中，一種或多種選自SEQIDNO:7-12、SEQIDNO:13-18、SEQIDNO:19-24、SEQIDNO:39-44和SEQIDNO:45-50的CDR區(qū)與已知的人框架區(qū)和CDR重組結(jié)合，以產(chǎn)生本發(fā)明的附加的、重組工程化的抗ErbB3抗體。重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可以源自相同或不同的抗體序列。本領(lǐng)域已知，抗體重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域?qū)贵w與抗原的結(jié)合特異性/親和力具有特別重要的作用(參見Hall等人，/mMwo/，149:1605-1612(1992);Polymenis等人，/畫,/,152:5318-5329(1994);Jahn等人，/wmimo^o/,193:400-419(1995);Klimka等人，Omce。83:252-260(2000);Beiboer等人，《/Mo/說W,296:833-849(2000);Rader等人，iVoc.iV^/.爿c"dL/5Li95:8910-8915(1998);Barbas等人，爿m.CTzem.5bc，116:2161-2162(1994);Ditzel等人，J!/mmimo/,157:739-749(1996))。因此，在某些實施方式中，產(chǎn)生的抗體包含此處所述的特定抗體的重《連和/或輕鏈CDR3(例如SEQIDNO:9,15,21，41,47和/或SEQIDNO:12,18,24,44,50)。抗體還可能進一步包含本發(fā)明抗體的重鏈和/或輕鏈CDR1和/或CDR2(例如SEQIDNO:7-8和/或SEQIDNO:10-11;SEQIDNO:13-14和/或SEQIDNO:16-17;SEQIDNO:20-21和/或SEQIDNO:22-23;SEQIDNO:39-40和/或SEQIDNO:42-43;或SEQIDNO:45-46和/或SEQIDNO:48-49)。上述工程化抗體的CDR1、2和/或3區(qū)可以包含此處所公開的確切的氨基酸序列(例如Ab#6、Ab#3、Ab#14、Ab#17或Ab#19的CDR，分別在SEQIDNO:7-12,13-18,19-24,39-44和45-50中給出)。但是，普通技術(shù)人員知道，與確切的CDR序列有一些偏差而同時保持抗體與ErbB3有效結(jié)合的能力是可能的(例如保守氨基酸置換)。因此，在另一個實施方式中，工程化抗體可以由例如，與Ab弁6、Ab弁3或Ab弁1446的一個或多個CDR90%、95%、98%、99%或99.5%相同的一個或多個CDR構(gòu)成。在另一個實施方式中，可以改變CDR的一個或多個殘基來改變結(jié)合，從而實現(xiàn)更有利的結(jié)合速率。使用這一策略，可以獲得具有超高結(jié)合親和力(例如101GM"或更高)的抗體。本領(lǐng)域公知的和那些在此描述的親和力成熟技術(shù)可用于改變CDR區(qū)域，然后再篩選所得到的結(jié)合分子以發(fā)現(xiàn)所需的結(jié)合改變。因此，隨著CDR改變，可以監(jiān)測結(jié)合親和力及免疫原性的變化并評分，從而獲得優(yōu)化出具有最優(yōu)結(jié)合力和低免疫原性組合的抗體。除了CDR的修飾之外或者代替CDR的修飾，還可以在抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的一個或多個框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4內(nèi)進行修飾，只要這些修飾不消除抗體的結(jié)合親和力即可。在另一個實施方式中，抗體針對效應(yīng)功能進行進一步修飾，從而例如4是高抗體在癌癥治療中的效力。例如，可以將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)域，從而使得該區(qū)內(nèi)形成鏈間二硫4建。因此，如此產(chǎn)生的同型二聚抗體可以具有改進的內(nèi)在化能力和/或增強的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人,j;五x/M^/.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.乂/附mwwo/.148:2918-2922(1992)。還可以4吏用Wolff等人Omceri^w"n:/z53:2560-2565(1993)中描述的異型雙功能交聯(lián)劑制備具有增強的抗肺瘤活性的同型二聚抗體?；蛘撸梢詫哂须pFc區(qū)的抗體進行工程化，并可能由此具有提高的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等人Jw"-Omcw3:219-230(1989)。本發(fā)明還包括下述的雙特異性抗體和免疫偶聯(lián)物。(ii)雙特異性抗體本發(fā)明的雙特異性抗體包括至少一種ErbB3的結(jié)合特異性和至少一種另一抗原(例如致癌基因的產(chǎn)物)的結(jié)合特異性。雙特異性抗體可被制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如WO05117973和WO06091209)。例如，制備全長雙特異性抗體可以基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中，兩條鏈具有不同的特異性(參見,例如Millstein等人，Ato"re,305:537-539(1983))。產(chǎn)生雙特異性抗體的進一步細節(jié)可以參見例如Suresh等人，Me&o^五"zymo/ogy,121:210(1986)和Bre皿an等人，5We"ce,229:81(1985)，其描述了用于制備雙特異性抗體的化學(xué)4建合過程。用于制備和從重組細胞培養(yǎng)物中直接分離雙特異性抗體片段的各種不同方法也已經(jīng)有所描述。例如，已經(jīng)使用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體(參見，例如Kostelny等人，乂/mmiwo/，148(5):1547-1553(1992))。還報導(dǎo)了使用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體片段的另一種策略(參見，例如Gruber等人,/mmw"o/,152:5368(1994))。在特定的實施方式中，雙特異性抗體包含與ErbB3相結(jié)合的第一抗體或其結(jié)合部分以及與ErbB2、ERbB3、ErbB4、EGFR、IGF1-R、C-MET、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、前列腺特異性膜抗原、PDGFR-a、PDGFR-p、C-KIT或任何FGF受體相結(jié)合的第二抗體或其結(jié)合部分。(iii)免疫偶聯(lián)物可以通過將此處所描述的抗體或其抗原結(jié)合部分與另一種治療劑結(jié)合而形成本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物。合適的藥劑包括，例如細胞毒性劑(例如化學(xué)治療劑)、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)和/或放射性同位素(例如放射性偶聯(lián)物)。用于產(chǎn)生這樣的免疫偶聯(lián)物的化學(xué)劑已經(jīng)在上面有所描述?？梢允褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀鞟鏈、白喉毒素的非結(jié)合性活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠々支單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a-帚曲霉毒、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商路蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒素、巴豆毒素、石石咸花(sapaonariaofficinalis)抑制劑、多花白初t毒素、mitogellin、局卩艮曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多種放射性核素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗ErbB3抗體。例子包括^Bi、1311、131In、90Y和186Re。本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以使用多種雙功能性蛋白偶聯(lián)劑進行制備，例如，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、酰亞胺酯的雙功能性衍生物(例如二亞胺代己二酸二曱酯鹽酸鹽)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯曱?；?己二胺)、雙-重氮書f生物(例如雙_(對_重氮苯曱?；?_乙二胺)、二異氰酸酯(例如曱代亞苯基2,6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以按照Vitetta等人,6Wewce238:1098(1987)中的描述進行制備。碳-14標記的l-異硫氰酸節(jié)基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸為用于結(jié)合放射性核苷酸和抗體的示例性螯合劑(參見，例如WO94/11026)。III.篩選本發(fā)明抗體的方法在制備與ErbB3相結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合部分之后，這類抗體或其部分可以使用本領(lǐng)域公知的多種分析方法來對其各種不同性質(zhì)(例如此處所描述的性質(zhì))進4亍篩選。在一個實施方式中，對抗體或其抗原結(jié)合部分抑制EGF才羊配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力進行篩選。這可以通過在存在或不存在抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下，用EGF樣配體處理表達ErbB3的細胞來完成。然后可以溶解細J包，離心粗溶解產(chǎn)物以去除不溶物質(zhì)?？梢酝ㄟ^例如蛋白質(zhì)印跡法、然后再使用抗磷酸酪氨酸抗體進行探測來測量ErbB3磷酸化，如Kim等人(同上)和下述實施例中所描述的。在其它實施方式中，進一步篩選抗體或其抗原結(jié)合部分的一種或多種下述性質(zhì)(1)抑制ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)；(2)抑制表達ErbB3的細胞的增殖；(3)降低細胞表面上的ErbB3水平的能力(例如通過誘導(dǎo)ErbB3的內(nèi)在化)；(4)抑制表達ErbB3的細胞的VEGF分泌；49(5)才中制表達ErbB3的纟田月包的遷移；(6)沖中制表達ErbB3的纟田月包的球狀體生長；和/或(7)與位于ErbB3的結(jié)構(gòu)域I上的表位結(jié)合，上述性質(zhì)的每一種都可以〗吏用本領(lǐng)域/zH人的才支術(shù)或此處所討論的^支術(shù)方4更地進行測量?？梢允褂贸Ｒ?guī)分析方法(例如Horst等人，同上所描述的)容易地測量神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)的抑制。例如，抗體或其抗原結(jié)合部分抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin介導(dǎo)的通過ErbB3信號傳導(dǎo)的能力可以在神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種刺激之后，如Horst等人，同上，Sudo等人，(2000)M^/zoAE"z;;mo/，322:388-92;和Morgan等人(1990)Eur.J.Biochem.,191:761-767中所描述的通過ErbB3的已知底物(例如SHC和PI3K)的激酶分析來測量。因此，可以使用神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin的一種或多種刺激表達ErbB3的細胞，并與候選抗體或其抗原結(jié)合部分一起孵育。隨后由這些細胞得到的細胞溶解產(chǎn)物可與ErbB3底物(或涉及ErbB3的細胞途徑中的蛋白質(zhì))的抗體(例如，舉例來說，抗JNK-1抗體)一起免疫沉淀，并通過本領(lǐng)域/>認的技術(shù)分析其激酶活性(例如JNK〗敫酶活性或PI3-激酶活性)。相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時的^^平或活性而言，存在抗體或其抗原結(jié)合部分時ErbB3底物或涉及ErbB3的途徑中的蛋白質(zhì)的水平或活性(例如激酶活性)的降低或完全消失是抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的抗體或其抗原結(jié)合部分的指征。在特定實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分通過降低神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種與ErbB3的結(jié)合來抑制ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。為了選擇抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種與ErbB3結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分，表達ErbB3的細胞(例如MALME-3M細胞，如下文實施例中描述的)可以在不存在(對照)(例如》文射性標記的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)接觸。如果抗體或其抗原結(jié)合部分抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin與ErbB3的結(jié)合，則相對于不存在抗體或其抗原結(jié)合部分時的量，將觀察到回收的標記物(例如放射性標記的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)的量統(tǒng)計學(xué)顯著地降低?？贵w或其抗原結(jié)合部分可以通過任何機理來抑制ErbB3-配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin)的結(jié)合。例如，抗體或重疊的位點來抑制ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、epigen或biregulin中的一種或多種)與ErbB3的結(jié)合。或者，抗體或其抗原結(jié)合部分可以通過改變或扭曲ErbB3的構(gòu)型，以-使其不能與ErbB3配體相結(jié)合，從而抑制ErbB3配體的結(jié)合。降低細胞表面ErbB3水平的抗體及其抗原結(jié)合部分可以通過其下調(diào)肺瘤細胞上的ErbB3的能力來進行識別。在特定實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合部分通過誘導(dǎo)Erbb3的內(nèi)在化(或提高內(nèi)吞作用)來降低ErbB3的細胞表面表達。為了對此進行測試，ErbB3可以被生物素化，且很容易確定細胞表面上ErbB3分子的數(shù)量，例如在存在或不存在抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下測量培養(yǎng)物中細胞單層上的生物素量(例如，如Waterman等人,歷o/.C7^m.(1998),273:13819-27中所描述的)，然后再免疫沉淀ErbB3和使用抗生蛋白鏈菌素來進行探測。在存在抗體或其抗原結(jié)合部分的情況下纟企測到生物素化ErbB3隨著時間逐漸降低意p木著抗體降低了細胞表面上ErbB3的水平。還可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)(例如下述實施例中描述的細胞效價發(fā)光分析)測試本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分抑制表達ErbB3的細胞的增殖的能力(還參見，例如Macallan等人，iVoc.A^/.^ca乂(1998)20;95(2):708-13;Perez等人(1995)Owcwi^化a廠cA55,392-398)。在另一個實施方式中，篩選抗體或其抗原結(jié)合部分抑制表達ErbB3的細胞的VEGF分泌的能力。這可以通過使用/>知的分析方法(例如可以乂人R&DSystems(Minneapolis,應(yīng)，Cat.弁DY293B)獲得的VEGFELISA試劑盒)進行。類似地，可以使用此處所描述的trans-well分析(MilliporeCorp.，Billerica,MA，Cat#ECM552)篩選抗體或部分抑制表達ErbB3的細胞(例如MCF-7細月包)的遷移的能力。在另一個實施方式中，篩選抗體或其抗原結(jié)合部分抑制表達ErbB3的細胞的球狀體生長的能力。這可以使用此處所描述的接近促進肺瘤生長的條件的分析來完成(參見，例如Herman等人(2007)JournalofBiomolecularScreeningElectronicpublication)。還可以使用本領(lǐng)域已知的和此處所描述的標準技術(shù)來識別結(jié)合到與本發(fā)明的一種或多種抗體相同的或重疊的表位上的抗體或其抗原結(jié)合部分。例如，為了篩選與感興趣的抗體所結(jié)合的ErbB3上的相同或重疊表位相結(jié)合的抗體，可以進行交叉阻斷分析，例如如^2rtZo^as,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的。IV.藥物組合物在另一個方面，本發(fā)明提供了包含與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分中的一種或其組合的組合物(例如藥物組合物)。在一個實施方式中，該組合物包含本發(fā)明的多種(例如兩種或更多種)與ErbB3上不同的表位結(jié)合的分離的抗體的組合。此處所使用的"藥學(xué)上可接受的載體，，包括任何和所有生理相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈、肌肉、皮下、非消化道、脊髓或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。取決于不同的給藥途徑，可以將活性化合物(即抗體、雙特異性和多特異性分子)包被在某種材料中，以保護該活性化合物免受酸作用和其它可能滅活該化合物的自然條件的影響。"藥學(xué)上可接受的鹽"是指保留母體化合物所需的生理活性、且不會引起任何不希望的毒性效應(yīng)的鹽(參見，例如Berge,S.M.等人1977)/尸/^rm.6W.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸力口成鹽包括衍生自非毒性的無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等)和衍生自非毒性有機酸(如，脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等)的鹽。堿加成鹽包括衍生自堿土金屬(例如鈉、鉀、錳、釣等)的鹽以及衍生自非毒性的有機胺(如，N,N'-二千基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的鹽。本發(fā)明的藥物組合物可以單獨給藥或聯(lián)合給藥(即與其它藥劑結(jié)合)。例如，聯(lián)合治療包括本發(fā)明的組合物以及至少一種或多種附加的治療劑(例如下文描述的抗癌劑)。本發(fā)明的組合物還可以與放射治療和/或手術(shù)聯(lián)合施用。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法給藥。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道給藥的途徑和/或模式根據(jù)所希望的結(jié)果而改變?；钚曰衔锟膳c保護化合物以防止其快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑(包括植入物、透皮貼片和微嚢遞送系統(tǒng))?？梢允褂每缮锝到獾?、生物相容的聚合體，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸4支術(shù)人員普遍知道的。參見，例如5kytoZ"ed朋dCo/^ra〃edie/eos^Dn/gDe/^e/^^;^teww,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。為通過特定給藥途徑來施用本發(fā)明的化合物，可能需要用某種材料包裹該化合物或與某種材料共同施用以防止其失活。例如，可以將該化合物在適當?shù)妮d體(例如脂質(zhì)體)或稀釋劑中給予受試者。藥學(xué)上可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖液。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳液以及普通的脂質(zhì)體(Strejan等人(1984)/iVeww7wmmo/.7:27)。藥學(xué)上可接受的載體包括滅菌水溶液或分散液以及用于即時制備滅菌注射溶液或分散液的滅菌粉末。這樣的介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑外，其它常規(guī)介質(zhì)或試劑都可用于本發(fā)明的藥物組合物中。輔助活性物質(zhì)也可以引入組合物中。治療組合物通常必須是滅菌的，并且在生產(chǎn)和儲存條件下穩(wěn)定。組合物可被配制成為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適用于高藥物濃度的其它有序的結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其合適的混合物。可以例如通過使用涂層(例如卵磷脂)，在分散劑的情況中維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑維持適當?shù)牧鲃有?。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇)、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^向組合物中引入延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來延長可注射的組合物的吸收。滅菌的注射溶液的制備過程是將所需量的活性化合物和根據(jù)需要的上述所列成分的一種或組合加入到適當?shù)娜軇┲?，然后再進行滅菌孩i過濾。一般而言，分散液是通過將活性化合物添加到包含基本分散介質(zhì)和選自上述列舉的成分的其它所需成分的滅菌載體中制備的。對于用于制備滅菌注射溶液的滅菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產(chǎn)生活性成分加上來自之前滅菌過濾溶液的任何需要的附加成分的粉末。調(diào)節(jié)給藥方案以提供所需的最佳反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可以單次給予大丸劑，可以分幾次劑量在不同的時間進行給藥，或者給藥劑量可以根據(jù)治療狀況的緊急程度成比例地降低或增加。例如，本發(fā)明的人抗體可以經(jīng)皮下注射每周給藥一次或兩次，或者經(jīng)皮下注射每月給藥一次或兩次。將非腸道給藥組合物配制成單位劑量形式以便于給藥和劑量的均勻性是非常有利的。此處所使用的單位劑量形式是指適于作為單一劑量給予治療的受試者的物理上分散的單元；每個單元包含經(jīng)計算與所需藥物載體結(jié)合能夠產(chǎn)生所需的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的單位劑量形式的規(guī)格由(a)活性化合物的獨特性質(zhì)和需要達到的特定治療效果，和(b)配制這種活性化合物用于個體中的靈敏治療的
技術(shù)領(lǐng)域：
中固有的局限規(guī)定，或直接取決于這些因素。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)54油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基曱苯(BHT)、卵磷脂、丙基沒食子酸酯、a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。對于治療性組合物而言，本發(fā)明的制劑包括那些適于口H經(jīng)鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或非消化道給藥的制劑。制劑可以方便以單位劑量形式存在，且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法進行制備?？梢耘c載體材料組合以制成單一劑量形式的活性成分的量將會才艮據(jù)治療的受試者和特定的給藥模式而變化?？梢耘c載體材料組合以制備單一劑量形式的活性成分的量通常為產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一4殳而言，該量為大約0.001百分比至大約90百分比的活性成分，優(yōu)選為大約0.005百分比至大約70百分比，最優(yōu)選為大約0.01百分比至大約30百分比。適于陰道給藥的本發(fā)明的制劑還包括包含本領(lǐng)域已知為合適的載體的陰道栓劑、止血塞、乳劑、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧制劑。用于局部或經(jīng)皮給藥的本發(fā)明的組合物的劑型包括粉末、噴霧、藥膏、糊劑、乳劑、乳液、凝膠、溶液、貼片和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跍缇鷹l件下與藥學(xué)上可接受的載體、與可能需要的任何防腐劑、緩沖液或推進劑混合。此處所使用的術(shù)語"非腸道給藥"和"腸道外給藥"是指腸內(nèi)和局部給藥方式之外的其它給藥方式，通常是經(jīng)注射給藥，包括但不局限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、目艮窩內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明的藥物組合物中可以使用的合適的水性和非水性載體的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和可注射有機酯(例如乙基油酸酯)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散劑的情況中通過維持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有?。這些組合物還可以包含輔劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。本領(lǐng)域公知的輔劑的特定例子包括例如無機輔劑(例如鋁鹽，例如磷酸鋁和氫氧化鋁)、有機輔劑(例如角鯊烯)、油基輔劑、病毒顆粒(例如包含源自流感病毒的膜結(jié)合性血凝素(heagglutinin)和神經(jīng)氨酸酶的病毒顆粒)。可以通過上面的滅菌過程和加入不同的抗菌劑和抗病毒劑(例4口對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)來防止微生物的出現(xiàn)。還可能希望在組合物中包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來延長可注射的藥物形式的吸收。當本發(fā)明的化合物作為藥品給予人和動物時，它們可以單獨給予，或者作為包含例如與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的0.001至90%(更優(yōu)選0.005至70%，例如0.01至30%)的活性成分的藥物組合物聯(lián)合給予。與選擇的給藥途徑無關(guān)，本發(fā)明的化合物(其可以合適的水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常^L方法配制成為藥學(xué)上可"^妻受的劑型。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以改變以獲得對于特定的患者、組合物和給藥模式有效地實現(xiàn)希望的治療反應(yīng)而不會對患者產(chǎn)生毒性效應(yīng)的活性成分的量。所選的劑量水平取決于多種藥代動力學(xué)因素，包括本發(fā)明采用的特定的組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所使用的特定化合物的排泄率、治療持續(xù)時間、與使用的特定組合物聯(lián)合使用的其它的藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀態(tài)、總體健康水平和之前的病史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已知的類似因素。具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)能夠很容易地確定和指定所需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于達到希望的治療效果所需的水平開始藥物組合物中使用的本發(fā)明的化合物的劑量，然后再逐漸增加劑量直到實現(xiàn)希望的效果為止。一般而言，本發(fā)明的組合物的合適日劑量為有效地產(chǎn)生治療效果的最低劑量的化合物量。這樣的有效劑量一般取決于上述因素。優(yōu)選的給藥方式為靜56脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥，優(yōu)選為接近目標位置給藥。如果需要的話，治療性組合物的有效的日劑量可以在整日時間內(nèi)以適當?shù)拈g隔以兩個、三個、四個、五個、六個或更多個亞劑量獨立地給藥，任選地以單位劑量形式給藥。盡管本發(fā)明的化合物單獨給藥是可能的，但是優(yōu)選作為藥物制劑(組合物)來給予該化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置來給予治療性組合物。例如，在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的治療性組合物可以4吏用無針的皮下注射裝置進行給藥，例如美國專利No.5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的7>知植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603,其公開了用于以可控的速率的分配藥物的可植入性微輸注泵；美國專利No.4.,486，194,其公開了用于經(jīng)皮給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233,其公開了以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利No.4,447,224,其公開了用于連續(xù)藥物輸送的可變流量的可植入輸注裝置；美國專利No.4,439,196,其公開了具有多腔隔室的滲透的藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利No.4,475，196，其公開了滲透的藥物遞送系統(tǒng)。許多其它的這樣的才直入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在某些實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體可被配制用于確保適當?shù)捏w內(nèi)分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物能夠通過BBB(如果需要的話)，它們必須被配制例如到脂質(zhì)體中。制備脂質(zhì)體的方法可以參見，例如美國專利4,522,811;5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體可以包含一個或多個被選擇性地轉(zhuǎn)運至特定的細胞或器官中的部分，因此能夠提高靶向藥物的轉(zhuǎn)運(參見，例如V.V.Ranade(1989)尸/^rmaco/.29:685)。示例性的耙向部分包括葉酸或生物素(參見，例如Low等人的美國專利5,416,016);甘露糖苦(Umezawa等人，(1988)AocAem.i"Commww.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)F五^S&".357:140;M.Owais等人(1995)X"^m'cra6.^ge"teC/^moAer.39:180);表面活性蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134),其不同種類可以包含于本發(fā)明的制劑中，以及本發(fā)明分子的成分；p120(Schreier等人(1994)/歷o/.C&m.269:9090);還參見K.Keinanen;M丄.Laukkanen(1994)L故.346:123;J丄Killion;I丄Fidler(1994)/m附im纖^/zocfe4:273。V.使用本發(fā)明的抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了在多種體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用中使用與ErbB3相結(jié)合的抗體及其抗原結(jié)合部分的方法。例如，本發(fā)明的抗體可用于治療與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病，包括多種癌癥。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了通過給予受試者有效治療疾病的量的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分來治療與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病。適當?shù)募膊“ɡ缍喾N癌癥，包拮f旦不局限于黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃腸癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌?？贵w可以單獨給藥或與另一種與該抗體結(jié)合或協(xié)同發(fā)揮作用的治療劑一起治療ErbB3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病。這樣的治療劑包括例如下文描述的抗癌劑(例如細胞毒素、化學(xué)治療劑、小分子和》文射治療)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與來自受試者的細胞相接觸(例如體外或體內(nèi))并測量結(jié)合細胞上的ErbB3的水平，來診斷受試者中與ErbB3上調(diào)相關(guān)的疾病(例如癌癥)的方法。異常高的ErbB3結(jié)合水平意味著受試者患有與ErbB3上調(diào)相關(guān)的疾病。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括包含本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合部分的試劑盒，其任選地包含用于治療或診斷與ErbB3上調(diào)和/或ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病的說明書。該試劑盒可以包含顯示試劑盒的內(nèi)容物的預(yù)期用途的標簽。術(shù)語標簽包括任何試劑盒上或隨試劑盒提供的文字、銷售材料或記錄材料，或其它隨試劑盒的材料。本發(fā)明其它實施方式在下述實施例中描述。下述實施例將會進一步闡明本發(fā)明，但是不應(yīng)該理解為限定本發(fā)明。序列表、附圖和所有本申請所引用的參考文獻、專利和專利申請公開的內(nèi)容在此清楚地《1入作為參考。實施例材料和方法在整個實施例部分中，除非特別說明，使用下述材料和方法。一般而言，除非特別說明，本發(fā)明的實施使用化學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)(特別是例如抗體技術(shù))的常規(guī)技術(shù)和多肽制備的才示準^支術(shù)。參見,例^口Sambrook,Fritsch和Maniatis，Mo/ecw/arC7om'"gvCoW6^"'"g//arZorZ^6orato^y尸ms^(1989);j"幼o辦五"gz'weer/wg尸ro,oco/s1(!MeAo(^z>zAfo/ecw/ar5Zo/o<§7」，510,Paul,S.，HumanaPr(1996);Jw幼o辦^fiVzg7.wee/7'w^jPra"Zca"/praac/z(PracticalApproachSeries,169),McCafferty,Ed.，IrlPr(1996);顛y^;」丄a60rato/3;Mzm似/,Harlow等人，C.S.H丄.Press,Pub.(1999);和CWreW/Votoco/sMo/ecw/ar說o/ogy，eds.Ausubel等人,JohnWiley&Sons(1992)。用于分析HCV生物學(xué)特征的體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)描述于例如丄cz6.yl打fm.(NY).;34(2):39-47(2005),口77iec/'mpanzeemode/0/CWmy/"/ec".o朋，ILARJ.;42(2):117-26(2001)中。細胞系下述實驗中所使用的所有細胞系均自國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute)獲得，或者如所說明的由研究者提供。細月包系MCF7畫ATCCcat.No.HTB-22T47D畫ATCCcat.No.HTB-133Colo357-這些細胞得自學(xué)術(shù)研究者，并描述于Kolb等人(2006)Int.J.Cancer,120:514-523中。Dul45-ATCCcat.No.HTB-81OVCAR8-來源已經(jīng)在臨時申請中描述HI975ATCCcat.No.CRL-5908腫瘤細胞的粉碎冷凍粉碎機(CovarisInc)被用于粉碎腫瘤。腫瘤被儲存在特殊的袋子中(在添加胂瘤之前預(yù)先稱重)，在對它們進行操作時置于液氮中。對于小的肺瘤，向容納肺瘤的袋子中先加入200uL裂解緩沖液，在液氮中冷凍，然后再粉碎以提高袋中腫瘤的回收率。粉碎的腫瘤被轉(zhuǎn)移至2mL的微量離心管中，并置于液氮中，直至準備進行進一步的加工。腫瘤細胞裂解腫瘤細胞在補充有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中進行裂解。裂解緩沖液被添加至腫瘤的等分試樣中，最終濃度為大約62.5mg/mL。肺瘤樣品通過渦旋勻漿30秒，并在冰上孵育大約30分鐘。裂解產(chǎn)物在QiagenQiashredder柱上旋轉(zhuǎn)大約10分鐘，以進一步對樣品進行均質(zhì)處理。澄清的裂解產(chǎn)物在干凈管中被分為等分試樣以用于下一步處理。BCA分析按照廠商的方案對所有的腫瘤樣品進行BCA分析(Pierce)。各肺瘤樣品的總蛋白濃度(以mg/mL計)隨后用于ELISA結(jié)果的標準化。ELISA分析所有的用于總的和磷酸-ErbB3的ELISA的ELISA試劑均作為Duoset試劑盒購自于R&DSystems。4吏用50|iiL抗體包,皮96孑LNuncMaxisorb板，在室溫下孵育過夜。第二日早上，在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05Q/oTween-20)洗滌(1000pl/孔)板三次。然后在室溫下使用PBS中的2。/。BSA封閉板大約一個小時。在BioTek板洗滌器中使用PBST(O.O50/0Tween-20)洗滌(1000pl/孔)板三次。然后使用50細胞裂解產(chǎn)物和稀釋于50%的裂解緩沖液和1%BSA中的標準品(一式三份)用于進一步處理。樣品在4。C下在板振動器上孵育2個小時，在BioTek板洗滌器中4吏用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孔)三次。加入大約50pl在2。/oBSA中稀釋的檢測抗體，加入PBST,在室溫下孵育大約1小時。對于磷酸-ErbB3，檢測抗體與辣根過氧化物酶(HRP)直接偶聯(lián)，并在室溫下孵育2小時。在BioTek^反洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000iul/孔)三次。加入大約50pl抗生蛋白鏈菌素-HRP,并在室溫下孵育30分鐘(除了pErbB3以外)。在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000^1/孔)三次。力口入大約50|uLSupersignalPicoELISA底物，4吏用Fusion外反閱讀器讀板。使用EXCEL分析數(shù)據(jù)。重復(fù)樣品取平均值，且誤差條用于代表兩次重復(fù)試-驗的標準偏差。實施例l:使用噬菌體展示制備抗體為了獲得本文中稱作Ab#6、Ab#3、Ab#14、Ab弁17和Ab弁19的人抗ErbB3抗體，對包含來自人供體的免疫球蛋白序列的獨特組合的人Fab噬菌體庫(Hoet等人，同上，其全部內(nèi)容通過引用方式結(jié)合于本文中)進行ErbB3結(jié)合物的初步篩選。使用純化的ErbB3和表達細胞表面ErbB3的中國倉鼠卵巢細胞系，從庫中識別到73種獨特的Fab序列。然后將這73種克隆重排(reformat)為僅無噬菌體的Fab。使用高通量方法，這些Fab被小規(guī)模地表達，并使用ELISA和Flexchip方法(是一種高通量表面等離子共振(SPR)技術(shù))測試其結(jié)合。將無噬菌體的73種Fab點才羊在芯片表面上，并測量結(jié)合動力學(xué)以及對ErbB3-his融合靶蛋白質(zhì)或ErbB3-Fc蛋白質(zhì)(R&DSystems)的表位封閉。從所得數(shù)據(jù)計算平衡結(jié)合常數(shù)以及Fab的結(jié)合/解離速率。使用大約500nMFab和1:750稀釋的山羊抗人Alexa647第二抗體稀釋液來研究各種不同F(xiàn)ab對MALME-3M細胞的結(jié)合。如圖1A和1B所示，幾種候選Fab顯示出明顯的MALME-3M細胞染色。61實施例2:抗ErbB3Fab的優(yōu)化在識別出阻斷ErbB3配體(神經(jīng)^下面對Fab的VH和VL序列進行密碼子優(yōu)化。具體而言，使用表達為IgGl或IgG2同種型的表達構(gòu)建體來重排VH和VL區(qū)域。該構(gòu)建體包括具有用于替換適當?shù)闹劓満洼p鏈序列的表達盒的Selexis骨架。Selexis載體包含CMV啟動子和匹配的poly-A信號。密碼子優(yōu)化的Ab#6的VH和VL核酸序列分別顯示于SEQIDNO:25和26,Ab井3的這些序列分別顯示于SEQIDNO:27和28,如圖22所示。實施例3:ErbB3的結(jié)合親和力使用兩項獨立沖支術(shù)(即表面等離子共振分析和利用MALME-3M細胞的細胞結(jié)合分析)測量抗ErbB3抗體的解離常數(shù)。表面等離子共振分析按照Wassaf等人(2006)^w/j^/ca/及.oc/^m.,351:241-253中的描述進行表面等離子共振分析(也被稱為Flexchip分析)。基于公式KD=KVKa來計算KD值。使用表面等離子共振分析測得的Ab#6和Ab#3的Ko值分別示于圖2A和2B中。Ab#6的Ko值大約為4nM,Ab#3的Ko值大約為8nM,分別如圖2A和2B中所示。細胞結(jié)合分析進行細胞結(jié)合分析確定Ab#6和Ab#3的Ko值，如下所示。使用2ml胰蛋白酶-EDTA+2mlRMPI+5mMEDTA在室溫下使MALME-3M細胞脫壁5分鐘。立即向胰蛋白酶化的細胞中加入完全RPMI(10ml)，溫和地重懸，并使用Beckman臺式離心機在1100rpm下旋轉(zhuǎn)5分鐘。細胞重懸于BD染色緩沖液(PBS+2%胎牛血清+0.1%疊氮化鈉，BectonDickinson)中，濃度為每毫升2x106細胞，將50|il(1x105細胞)等分試樣接種到96孔滴定一反中。在微量離心管中制備溶于BD染色緩沖液的150200nM抗ErbB3抗體(Ab#6或Ab#3)的溶液，并連續(xù)2倍稀釋至75)iilBD染色緩沖液中。稀釋的抗體的濃度范圍為200nM至0.4nM。向50pl細胞懸浮液中直接加入50pl等分的不同蛋白質(zhì)稀釋液，達到最終濃度100nM、50nM、25nM、12nM、6nM、3nM、1.5nM、0.8nM、0.4nM和0.2nM的抗體。在室溫下，96孔板中的等分細胞在平板振動器上與蛋白質(zhì)稀釋液一起孵育30分鐘，并使用300plBD染色緩沖液洗滌3次。在冷室中，細胞在平板振動器上與BD染色緩沖液中的100julAlexa647-標記的山羊抗人IgG的1:750稀釋液一起將育45分鐘。最后，洗滌細胞兩次，沉淀并重懸于250|ilBD染色緩沖液+0.5pg/ml碘化丙錠中。10000個細胞的分析是在FACScalibur流式細胞儀中使用FL4通道完成的。MFI值以及對應(yīng)的抗ErbB3抗體的濃度分別《會在y軸和x軸上。通過GraphPadPrism使用非線性回歸曲線的單位點結(jié)合模型來確定分子的KD值?；诠結(jié)=Bmax*X/KD+X(Bmax二飽和時的熒光值，X-抗體濃度，Y4吉合度)來計算KD值。如圖2C和2D所示，在使用MALME-3M細胞的細胞結(jié)合分析中，得到的Ab#6和Ab#3的Ko值分別為大約4nM禾口1.3nM。實施例4:對于ErbB3的結(jié)合特異性/表位結(jié)合如下所述，使用ELISA對Ab#6的IgG2同種型與ErbB3的結(jié)合特異性進行分析。并分析Ab#6所結(jié)合的表位的識別。具體而言，使用50|il的5jug/ml蛋白質(zhì)(重組人ErbB3、重組人EGFR或不相關(guān)的蛋白質(zhì)(BSA))包被96孔NuncMaxisorb板，并在室溫下孵育過夜。第二日早上，在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孔)三次。然后在室溫下使用PBS中的2。/。BSA封閉孔大約一個小時。在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000nl/孔)三次。在2。/qBSA,PBST中以不同的稀釋比例(1iaM,2倍系列稀釋)加入大約50plAb#6。所有的樣品重復(fù)試驗兩次，在4°C下平板振動器上孵育2小時。在BioTek板洗滌器中，使用1000inl/孔的PBST(0.05。/。Tween-20)洗滌板3次。加入50jul人IgG檢測抗體(HRP偶聯(lián)的(BethylInc;1:75000稀釋于2%BSA，PBST中))，且板在室溫下孵育1小時。在BioTek板洗滌器中，使用1000^1/孔的PBST(0.050/oTween-20)洗滌板3次。加入50|ulSupersignalPicoELISA底物，并在Fusion板閱讀器上讀板。數(shù)據(jù)使用EXCEL程序進行分析。重復(fù)樣品:取平均值，誤差條用于代表兩次重復(fù)試驗的標準偏差。如圖3所示，在ELISA中Ab#6結(jié)合重組ErbB3，但沒有顯示出與EGFR、BSA或TGF-a的明顯結(jié)合。將對應(yīng)于ErbB3的氨基酸殘基20-202的片段(截斷突變體)克隆到酵母展示載體pYD2(pYDl(Invitrogen)的改良版本，具有經(jīng)工程化置于His標記之前的終止密碼子)中Nhe和BsiWI限制性位點之間。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌抹EBY100(Invitrogen)中，包含質(zhì)粒的克隆在Trp-選擇性培養(yǎng)基中進行選擇?？寺≡诤咸烟堑呐囵B(yǎng)基中于30°C生長過夜，并通過將其轉(zhuǎn)移至含半乳糖的培養(yǎng)基中18°C生長2天以誘導(dǎo)ErbB3截斷突變體的表達。使用50nMAb弁6對顯示ErbB3截斷突變體的酵母進行染色，然后再使用Alexa染料-647標記的山羊抗人抗體進行染色。使用山羊抗人抗體對單獨的樣品進行染色僅僅用于顯示不存在第二抗體對酵母的非特異性結(jié)合。在FACSCalibur細胞分選儀(BDBiosciences)上使用流式細胞儀進行分析。如圖30所示，Ab弁6結(jié)合截斷突變體，即結(jié)合ErbB3的氨基酸殘基20-202。實施例5:腫瘤細胞上總ErbB3的下調(diào)測試Ab#6在體外和體內(nèi)下調(diào)肺瘤細胞中ErbB3表達的能力，如下所述。將MALME-3M細胞接種于96孔組織培養(yǎng)+反上，并在37°C的補充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基和5%二氧化碳中生長24小時。然后培養(yǎng)基更換為含抗生素、2mML-谷氨酰胺和有或沒有1|uM、250nM、63nM、16nM、4.0nM、1.0nM、240pM、61pM和15pM濃度的抗體的RPMI-1640培養(yǎng)基。細胞于37°C、5%二氧化碳中生長24小時，用冷的PBS洗滌，然后使用包含150mMNaCl、5mM焦石粦酸鈉、10bpV(phen)、50苯胂(phenalarsine)、1mM原釩酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)(Sigma，P714)的哺乳動物蛋白提取物(MPER)裂解(Pierce,78505)緩沖液收獲細胞。使用含0.1%tween-20的磷酸緩沖鹽水中的4%牛血清白蛋白將細胞裂解產(chǎn)物稀釋兩倍，然后通過ELISA使用小鼠抗人ErbB3捕獲抗體和生物素化小鼠抗人ErbB3第二檢測抗體進行分析?？股鞍祖溇嘏c可與化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，37070)反應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)，從而產(chǎn)生了信號。使用光度計來可一見化ELISAS。如圖4所示，通過體外ELISA測量顯示，Ab#6在體外降4氐了MALME-3M細胞的總ErbB3水平大約46.9%。不含血清和抗體的培養(yǎng)基作為對照。在進一步的實驗中，通過FACS分析來研究使用Ab弁6的IgGl和IgG2同種型對MALME-3M細月包上ErbB3受體的下調(diào)。MALME-3M細胞在15cm皿中進行胰蛋白酶化，并使用RPMI+10%胎牛血清洗滌一次。重懸細胞沉淀，4吏其密度為每毫升1x106個細胞。兩等分的2x105細胞:帔加入到12孔組織培養(yǎng)才反中，并重懸于最終體積為800|il的RPMI+10%胎牛血清中。向一個孔中加入Ab弁6IgGl或Ab弁6IgG2同種型，最終濃度為100nM(處理的樣品)，向其它孔中加入等體積的PBS(未處理的樣品)。第二日，處理的和未處理的細胞被胰蛋白酶化、洗滌，并在冰上與BD染色緩沖液中的100mMAb#6孵育30分鐘。使用1mlBD染色緩沖液洗滌兩次，并在水上與100|iil1:500稀釋的Alexa647標記的山羊抗人Alexa647稀釋液一起孵育45分鐘。然后再洗滌細胞，重懸浮于300jtilBD染色緩沖液+0.5ng/ml碘化丙錠中。10000個細胞的分析是在FACScalibur流式細胞儀中使用FL4通道完成的。如圖5A和5B所示，Ab#6的IgGl和IgG2同種型分別下調(diào)MALME-3M細胞上的ErbB3大約62%和大約66%。為了確定這種降低是否是由于MALME-3M細胞表面上的ErbB3受體的內(nèi)在化，測量在存在抗體的情況下ErbB3隨時間的表達。具體而言，MALME-3M細胞在15cm皿上進行胰蛋白酶化，并使用RPMI+l()o/o胎牛血清洗滌一次。重懸細胞沉淀，使其密度為每毫升1x106個細胞。兩等分的2x105細胞被加入到12孔組織培養(yǎng)板中，重懸于最終體積為800pi的RPMI+10。/q胎牛血清。向一個孔中加入抗ErbB3抗體，最終濃度為100nM(處理的樣品)，向其它孔中加入等體積的PBS(未處理的樣品)。第二日，處理的和未處理的細胞被胰蛋白酶化、洗滌，并在冰上與BD染色緩沖液中的100mM抗ErbB3抗體一起孵育30分鐘。使用1mlBD染色緩沖液洗滌細胞兩次，并在水上與100|il1:500稀釋的Alexa647標記的山羊抗人Alexa647稀釋液一起孵育45分鐘。然后再洗滌細胞，并重懸于300piBD染色緩沖液+0.5|ug/ml碘化丙錠中。10000個細胞的分析是在FACScalibur流式細胞儀中使用FL4通道完成的。如圖6所示，分別在0小時(圖6A)、0.5小時(圖6B)、2小時(圖6C)和24小時(圖6D)測量了在Ab弁6存在下ErbB3的下調(diào)。如圖6A-6D所示，在大約30分鐘之后，大約50%的細胞表面ErbB3受體被下調(diào)，且在大約24小時時，大約93%的細胞表面受體被下調(diào)。如下所述，還對Ab弁6在體內(nèi)引起黑素瘤細胞中ErbB3下調(diào)的能力進行了研究。簡而言之，T細胞缺陷型nu/nu小鼠(源自NIH的3-4周大的雌性小鼠；遠系雜交；白化背景)購自CharlesRiver實驗室(Wilmington,MA)。用于植入的MALME-3M細胞在收獲之前在培養(yǎng)基(RPMI培養(yǎng)基，10%FBS,L-谷氨酰胺和抗生素，37。C,5%C02)中生長達到大約80%匯合(confluency)。細胞在植入之前一直維持在水上。在小鼠右側(cè)腹皮下注射植入100)ulMALME-3M細胞，并使其恢復(fù)，同時監(jiān)控初始腫瘤生長。使用數(shù)字測徑器測量肺瘤(長度x寬度)，小鼠靜脈注射IgG2a(Sigma,M7769-5MG)。每隔一天對小鼠腹膜內(nèi)給予15嗎或100嗎6號抗體，每周對腫瘤進行三次測量，記錄在微軟EXCEL電子表格中。66記錄最終的腫瘤測量數(shù)據(jù)(LXW),使用C02窒息法對小鼠進行安樂死，切除腫瘤，在液氮中速凍，并儲存于-80°C(用于生化分析)。分析最終肺瘤測量數(shù)據(jù)，并根據(jù)例如Burtrum等人，(2003)Omcwi仏,63:8912-8921中所描述的繪制胂瘤面積和肺瘤體積的曲線圖。還可以通過"標準化"和"非標準化"的方式來分析肺瘤體積和腫瘤面積的數(shù)據(jù)。對于各測量時間點的數(shù)據(jù)的"標準化"，各組中的各個腫瘤除以由測徑器確定的初始肺瘤大小。如圖7所示，在該分析中測試的各種不同的抗體之中，在用Ab弁6的IgGl或IgG2同種型24小時處理的肺瘤中，Ab#6在注射后24小時導(dǎo)致了總ErbB3的下調(diào)。使用PBS作為對照。在進一步的試驗中，研究了Ab抓在ADRr異種移植物中體內(nèi)下調(diào)ErbB3的能力。簡而言之，樣品在冷凍粉石f機(CovarisInc)中粉碎。腫瘤^^f諸存在特殊的袋子中(在加入腫瘤之前預(yù)稱重)，并在操作過程中置于液氮中。對于小的腫瘤，首先向容納肺瘤的袋子中加入200iLiL裂解緩沖液，在液氮中冷凍，然后再粉碎以提高袋中腫瘤的回收率。粉碎的肺瘤^^皮轉(zhuǎn)移至2mL的樣i量離心管中，并置于液氮中，直到進行裂解。胂瘤在補充有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中進行溶解。裂解緩沖液被添加至腫瘤的等分試樣中，最終濃度為大約62.5mg/mL。腫瘤樣品被渦旋30秒使其均質(zhì)化，然后在水上靜置大約30分鐘。細胞裂解產(chǎn)物在QiagenQiashredder柱上旋轉(zhuǎn)大約30分鐘，以進一步使樣品均質(zhì)化。澄清的細胞裂解產(chǎn)物在干凈管中被分為等分試樣。根據(jù)上述材料和方法部分的內(nèi)容進行BCA分析。ErbB3的總水平通過ELISA確定。ELISA試劑作為Duoset試劑盒購自R&DSystems。使用50jxL各捕獲抗體包被96孔NuncMaxisorb氺反，并在室溫下孵育過夜。第二日早上，在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孔)三次，然后在室溫下4吏用PBS中的2%BSA封閉板一個小時。隨后在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孔)三次。然后將細胞裂解產(chǎn)物(50JUL)和標準樣稀釋于50%的裂解緩沖液和1%BSA中；所有的樣品重復(fù)進行兩次。板在4°C下在板振動器上孵育2個小時，然后在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000|^1/孔)三次。加入50pl用2%BSA,PBST稀釋的檢測抗體，且板在室溫下孵育1小時。在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孔)三次。加入50iul抗生蛋白鏈菌素-HRP,且板在室溫下孵育30分鐘。再在BioTek板洗滌器中使用PBST(0.05%Tween-20)洗滌板(1000pl/孑L)三次。加入50|iLSupersignalPicoELISA底物，使用Fusion才反閱讀器進行讀數(shù)。使用EXCEL分析數(shù)據(jù)。重復(fù)試驗樣品取平均值，誤差條用于代表兩次重復(fù)試驗的標準偏差。試驗的結(jié)果示于圖8中。如圖8所示，在ADRr異種移植物中Ab#6在體內(nèi)下調(diào)ErbB3。實施例6:腫瘤細胞增殖的抑制如下所示，研究了Ab弁6抑制表達ErbB3的細胞(例如癌癥細胞)的細胞增殖的能力。將MALME3M、ACHN和NCI/ADRr細胞接種于96孔組織培養(yǎng)板中，并在37°C、5%二氧化碳中于補充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長24小時。然后培養(yǎng)基更換為包含抗生素、2mML-谷氨酰胺和有或沒有1^M、250nM、63nM、16nM,4.0nM、1.0nM、240pM、61pM和15pM抗體的RPMI-1640培養(yǎng)基。細胞于37。C、5%二氧化碳中生長96小時，然后使用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega,G7573)收獲細胞，并在光度計上進行分析。不含血清和抗體的培養(yǎng)基作為對照。如圖9、10和11所示，Ab#6抑制了表達ErbB3的MALME-3M細胞(圖9)、ADRr卵巢癌細胞(圖10)和ACHN細胞(圖11)的增殖。具體而言，使用細胞效價發(fā)光分析測量得到，Ab#6抑制MALME-3M細胞大約19.6%的增殖，抑制ADRr卵巢癌細胞大約30.5%的增殖。同時，如圖11所示，Ab#6抑制了ACHN細胞大約25.4%的增殖。實施例7:腫瘤細胞中ErbB3^舞酸化的抑制如下所述，研究了Ab弁6在體內(nèi)抑制ErbB3磷酸化的能力。參照圖8，使用上述實施例5中描述的技術(shù)粉碎樣品。如上述材料和方法部分所述進行BCA分析，并參照圖8才艮據(jù)上述實施例5中的描述進4于ELISA分析。這個試驗的結(jié)果示于圖12中。如圖12所示，如按照以ng/mg總蛋白質(zhì)計的磷酸化ErbB3(pErbB3)的量測量的，Ab#6在體內(nèi)顯著地抑制卵巢異種移植物中的ErbB3磷酸化。如下所述，還研究了Ab弁6抑制(3細胞素(BTC)或神經(jīng)調(diào)節(jié)素(HRG)誘導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力。在用50mMBTC、10mMHRG或333nMTGF-a刺激之前，卵巢ADRr細胞與Ab弁6—起預(yù)孵育30分鐘。預(yù)孵育之后，去除培養(yǎng)基，且細胞在37°C、5%C02下使用50nMBTC或333nMTGF-a(對于PE498)刺激5分鐘。還使用HRG對照(5分鐘，5nM)、10%血清和0%血清對照。使用1X冷PBS洗滌細胞，并通過在冰上孵育30分鐘在30jlU冷裂解緩沖液(M-PER緩沖液加釩酸鈉(NaV04,Sigma)、2-甘油磷酸、氧化苯胂、BpV和蛋白酶抑制劑)中進行裂解。細胞裂解產(chǎn)物置于-80。C下儲存過夜。如圖13A-13C所示，Ab#6能夠顯著抑制P細胞素和神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的ErbB3的磷酸化。如下所述，在進一步的試驗中，研究了Ab弁6抑制卵巢肺瘤細胞系OVCAR5和OVCAR8中的ErbB3磷酸化的能力。OVCAR5和OVCAR8細胞系得自國家癌癥研究所的癌癥治療和診斷部門("DCTD")。按照上述材料和方法部分所述的內(nèi)容進行ELISA。該試驗的結(jié)果描述于圖14A和14B中。如圖14A和14B所示，Ab#6抑制OVCAR5和OVCAR8卵巢癌細胞系中的ErbB3磷酸化。如上所述，Ab#6抑制P細胞素介導(dǎo)的ErbB3磷酸化。為了研究P細胞素介導(dǎo)的ErbB3磷酸化是通過ErbBl還是通過ErbB3發(fā)生，進行了下述試馬全。ADRr細胞或MALME-3M細胞(1x105)在冰上與25j^M抗ErbB3Ab弁6或25pM愛必妥(作為對照)在50piBD染色緩沖液中預(yù)孵育30分鐘。30分鐘以后，向細胞中加入50pl400mM生物素化的BTC，并在冰上再孵育30分鐘。最終的濃度為12.5jLiM抗體和200nMBTC。然后使用500BD染色緩沖液洗滌細胞兩次，并與100pl抗生蛋白鏈菌素-PE(PE二藻紅蛋白)(Invitrogen)在BD染色緩沖液中的1:200稀釋液一起孵育45分鐘。最后，洗滌細胞兩次，重懸于300plBD染色緩沖液中，并在FACScalibur流式細胞儀中進行分析。作為陽性對照，1x105ADRr或MALME-3M細胞在冰上與200nMBTC—起將育30分鐘，洗滌兩次并與1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE—起孵育45分鐘。為了評估來自抗生蛋白鏈菌素-PE偶聯(lián)物的背景染色，細胞與單獨的100pi的1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE孵育45分鐘。試驗的結(jié)果示于圖15A-15C中。如圖15A所示，P細胞素(BTC)不顯示任何明顯的與ErbBl陰性MALME-3M細胞的結(jié)合。但是，如圖15B和15C所示，BTC確實顯示出與ErbBl陽性ADRr細胞的結(jié)合。同樣，如圖15B和15C所示，該結(jié)合受到愛必妥的阻斷，愛必妥是特異性地與EGFR結(jié)合的抗EGFR抗體，并作為對照以證明EGF樣配體與EGFR結(jié)合，且其在例如Adams等人(2005),A/a&re5Zo&c/mo/ogy23,1147-1157中有所描述。實施例8:腫瘤細胞中神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的抑制如下所述，研究了Ab弁6抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的肺瘤細胞信號傳導(dǎo)的能力。MALME-3M細胞接種于96孔組織培養(yǎng)板中，并在37°C、5%二氧化^友中于補充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長24小時。細胞在37。C、5%二氧化碳中于含抗生素、2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中血清饑餓24小時。細胞用或不用濃度為1pM、250nM、63nM、16nM,4.0nM、1.0nM、240pM和61pM的抗ErbB3抗體(Ab#6的IgG2同種型)預(yù)處理30分鐘，然后在37°C和5%二氧化碳下使用HRG1-(31-ECD刺激10分鐘。使用冷PBS洗滌細胞，然后使用包含150mMNaCl、5mM焦磷酸鈉、10bpV(phen)、50苯胂(phenalarsine)、1mM原釩酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，P714)的哺乳動物蛋白提取物(MPER)裂解(Pierce,78505)緩沖液收獲細胞。使用含0.1%tween-20的磷酸緩沖鹽溶液中的4%牛血清白蛋白將細胞裂解產(chǎn)物稀釋兩倍，然后使用ELISA分析AKT(ErbB3的下游效應(yīng)子)和ErbB3磷酸化。為了測試AKT磷酸化，細胞裂解產(chǎn)物使用AKT特異性捕獲抗體和對AKT的絲氨酸473上的磷酸化位點特異性的生物素化檢測抗體在ELISA板上進行試驗。用與化學(xué)發(fā)光底物(Pierce,37070)反應(yīng)的#束根過氧化物酶偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素產(chǎn)生信號。為了分析ErbB3的磷酸化，細胞裂解產(chǎn)物用ErbB3特異性的捕獲抗體和與-束根過氧化物酶偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸檢測抗體在ELISA板上進行試驗。其然后再與化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，37070)反應(yīng)。ELISA使用分光計可4見化。如圖16A和16B所示，根據(jù)降低的ErbB3(圖16A)和AKT(圖16B)磷酸化確定，Ab#6是MALME-3M中神經(jīng)調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的強力抑制劑。值得注意的是，Ab弁6抑制幾乎100%的AKT磷酸化。實施例9:卵巢、前列腺和胰腺腫瘤生長的抑制為了評估Ab#6的體內(nèi)效力，在棵鼠中建立了幾種人癌癥的異種移植物模型，且在多劑量下評估其對腫瘤生長的抑制。例如，T細胞缺陷型nu/nu小鼠(源自NIH的3-4周齡雌性小鼠；遠系雜交；白化背景)購自CharlesRiver實驗室(Wilmington,MA)以用于異種移植物研究。在收獲之前，用于植入的ADRr細胞在培養(yǎng)(RPMI培養(yǎng)基，10%FBS,L-谷氨酰胺和抗生素，37°C，5%C02)中生長至大約85%匯合。細胞在植入之前在冰上維持。在小鼠右側(cè)腹皮下注射植入100piADRr細胞，并使其恢復(fù)，同時監(jiān)控初始腫瘤生長。使用數(shù)字測徑器測量腫瘤(長度x寬度)，且小鼠靜脈注射給予71IgG2a(Sigma,M7769-5MG)。每三天對小鼠腹膜內(nèi)給藥30pg或300jig抗體#6,每周對肺瘤進行三次測量并記錄在微軟EXCEL電子表格中。記錄最終的肺瘤測量值(LxW),使用C02窒息法對小鼠進行安樂死，切除胂瘤，在液氮中速凍，并儲存于-80。C(用于生化分析)。分析的最終胂瘤測量值，如上述Burtrum等人描述的繪制腫瘤的面積和腫瘤的體積曲線圖。還通過"標準化"和"非標準化"的方式來分析胂瘤體積和胂瘤面積的lt據(jù)。對于在測量的各時間點的數(shù)據(jù)的"標準化"，各組中的各腫瘤除以由測徑器測定的初始腫瘤大小。源自人肺瘤細胞系，ADRr(卵巢)、Dul45(前列腺)和OvCAR8(卵巢)的三種不同模型的數(shù)據(jù)顯示于圖17A-C中，且Colo357異種移植物研究顯示于圖17D中。來自這些研究的數(shù)據(jù)顯示，每三天(Q3d)300jiig劑量的Ab#6顯著地抑制腫瘤的生長(在研究過程中多時間點p<0.05)。此外，當在Dul45前列腺癌模型以及腎臟和胰腺癌異種移植物模型(AC麗和COL0357)中劑量增加為600貼(Q3d)時，Ab#6的這一抑制效應(yīng)進一步提高。但是，將劑量進一步增加至1500貼Q3d并不能4是高效率(OvCAR8-圖17;COL0357),說明600嗎相對于肺瘤生長抑制為飽和劑量。從這些研究中動物血清的藥代動力學(xué)(PK)分析顯示Ab弁6的血清保留有劑量依賴性的提高。同樣，來自這些不同研究中的Ab#6的胂瘤內(nèi)水平的生化分析顯示0至~6pgMM121/|Lig總腫瘤裂解產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)的劑量依賴性范圍。實施例10:ErbB3配體與腫瘤細胞上的ErbB3相結(jié)合的抑制在進一步的試^r中，如下所述研究了本發(fā)明的抗體抑制ErbB3配體與ErbB3的結(jié)合、而不是EGF樣配體與EGFR的結(jié)合的特異性。在一個試驗中，研究了Ab#6和Ab#3的Fab形式(Ab/Fab#3)抑制ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素和表皮調(diào)節(jié)素)與ErbB3結(jié)合的特異性。為了研究Ab#6和Ab/Fab#3抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素與ErbB3結(jié)合的能力，進行了下述試驗。ADRi細胞(1x105)在水上與10抗ErbB3抗體(例如Ab#6或Ab/Fab#3)在50piBD染色緩沖液中孵育30分鐘。30分鐘之后，向細胞中加入50pi40nM的生物素化神經(jīng)調(diào)節(jié)素EGF,再在冰上孵育IO分鐘。最終濃度為5^M抗體和20nM神經(jīng)調(diào)節(jié)素EGF。然后4吏用500plBD染色緩沖液洗滌細胞兩次，并與100pl1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE(PE二藻紅蛋白)(Invitrogen)在BD染色緩沖液中孵育45分鐘。最后，洗滌細胞兩次，重懸于300plBD染色緩沖液中，并使用FACScalibur流式細胞儀進行分析。作為陽性對照，1x105ADRr細月包在冰上與20nM神經(jīng)調(diào)節(jié)素EGF—起孵育10分鐘，洗滌兩次并與1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE—起孵育45分鐘。為了評估來自抗生蛋白鏈菌素-PE偶聯(lián)物的背景染色，細胞與單獨的100iil的1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE—起孵育45分鐘。這一試^r的結(jié)果顯示于圖18A和18B中。如圖18A和18B所示，Ab#6和Ab/Fab#3都能夠抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素與ErbB3的結(jié)合。同樣，如下所示還研究了Ab弁6抑制另一ErbB3配體(表皮調(diào)節(jié)素)與ErbB3結(jié)合的能力。ADRr細胞(lx105)在冰上與25Ab#6或25|uM愛必妥(作為對照)在50plBD染色緩沖液中預(yù)孵育30分鐘。30分鐘后，向細胞中加入50pi2生物素化的Epi,并在冰上再孵育30分鐘。最終的濃度為12.5]liM抗體和1Epi。然后使用500plBD染色緩沖液洗滌細月包兩次，并與100pi1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE(PE-藻紅蛋白)(Invitrogen)在BD染色緩沖液中孵育45分鐘。最后，洗滌細胞兩次，重懸于300plBD染色緩沖液中，并使用FACScalibur流式細胞儀進行分析。作為陽性對照，1x105ADRr細胞在冰上與1juMEpi—起孵育30分鐘，洗滌兩次并與1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE—起孵育45分鐘。為了評估來自抗生蛋白鏈菌素-PE偶聯(lián)物的背景染色，細胞與單獨的100ILil的1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE—起孵育45分鐘。該試驗的結(jié)果示于圖19A和19B中。如圖19A所示，表皮調(diào)節(jié)素與ErbB3陽性ADRr細胞結(jié)合。此外，如圖19B所示，這一結(jié)合受到愛必妥和Ab將兩者的抑制，說明表皮調(diào)節(jié)素可能與EGFR和ErbB3兩者都結(jié)合。還進行了進一步的試驗來研究Ab#6是否能夠抑制EGF樣配體(例如HB-EGF)與腫瘤細胞的結(jié)合。ADRr細胞(lx105)在水上與25Ab#6或25|iiM愛必妥(作為對照)在50plBD染色緩沖液中預(yù)孵育30分鐘。30分鐘之后，向細胞中加入50iul400nM生物素化的HB-EGF,并在冰上再孵育30分鐘。最終的濃度為12.5|uM抗體和200nMHB-EGF。然后使用500piBD染色緩沖液洗滌細胞兩次，并與1001:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE(PE-藻紅蛋白)(Invitrogen)在BD染色緩沖液中孵育45分鐘。最后，洗滌細胞兩次，重懸于300nlBD染色緩沖液中，并使用FACScalibur流式細胞儀進行分析。作為陽性對照，1x105ADRr細胞與200nMHB-EGF在水上孵育30分鐘，洗滌兩次并與1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE孵育45分鐘。為了評估來自抗生蛋白鏈菌素-PE偶聯(lián)物的背景染色，細胞與單獨的100|Lil的1:200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-PE孵育45分鐘。如圖20A和20B所示，HB-EGF與ADRr細胞上的ErbB結(jié)合，Ab湘并不抑制這種結(jié)合，證明了Ab#6對抑制ErbB3配體(例如神經(jīng)調(diào)節(jié)素和表皮調(diào)節(jié)素)與ErbB3的結(jié)合是特異性的。實施例ll:腫瘤細胞中VEGF分泌的抑制使用VEGF分泌分析試驗(VEGFELISA試劑盒由R&DSystems,Minneapolis,畫，Cat.#DY293B提供)研究了Ab#6抑制表達ErbB3的細胞(例如癌細胞)的VEGF分泌的能力。首先，分析了Ab弁6抑制未處理的和HRG-131處理的MCF-7、T47D和COLO-357細胞中VEGF分泌的能力。這些研究顯示COLO-357向培養(yǎng)基中分泌最高量的VEGF。由于這些細胞還具有非常高的HRG水平(數(shù)據(jù)未顯示)，向培養(yǎng)基中添加HRG不能夠進一步誘導(dǎo)VEGF分泌(圖24A)。相反，HRG能夠誘導(dǎo)MCF-7和T47D細胞中的VEGF分泌。在所有三種細胞系中，Ab#6均顯示出在高水平下的強力抑制效果，最強的抑制是在COLO-357(圖24A)中。在三種不同的異種移植物中，Ab弁6也顯示類似的體內(nèi)抑制VEGF分泌的效果，最強的抑制是在COLO-357異種移植物(圖24B)中。VEGF的抑制與ErbB3磷酸化的抑制相關(guān)(圖24C)。VEGF分泌的抑制還與腫瘤細胞血管發(fā)生的抑制相關(guān)。特別地，已確認骨髓瘤細胞分泌因子(例如VEGF和bFGF)引發(fā)血管發(fā)生(參見，例如Leung等人(1989)5We"ce246(4935):1306-9;Yen等人(2000)Oncogene19(31):3460-9)。實施例12:細胞遷移的抑制使用trans-well分析(MilliporeCorp.,Billerica,MA,Cat#ECM552)研究了Ab弁6抑制表達ErbB3的細胞(例如MCF-7細胞)的遷移的能力。首先，使MCF-7細胞血清饑餓過夜，然后在存在或不存在Ab弁6(最終濃度為8pM)的情況下在室溫下孵育15分鐘。然后將細胞轉(zhuǎn)移至通過I型膠原涂覆的膜與下室分隔的上室中，細胞可通過所述I型膠原涂覆的膜遷移。在Ab弁6的存在或不存在的情況下，向下室中的培養(yǎng)基中加入作為化學(xué)引誘物的10%FBS。所述室在37。C孵育16小時，然后使用脫壁緩沖液去除通過所述膜遷移的細胞，并與細胞結(jié)合焚光染料一起孵育。使用熒光讀板器來定量熒光。平均焚光士SEM(11=2)顯示于圖25中。如圖25中所示，與未處理的對照(1道)相比，10%FBS刺激細胞遷移(3道)，且8^MAb弁6抑制FBS誘導(dǎo)的細胞遷移(4道)。實施例13:球狀體生長的抑制使用接近于進行腫瘤生長的條件的分析(Herman等人(2007)JournalofBiomolecularScreeningElectronicpublication)研究了Ab#6承卩制表達ErbB3的細胞的球狀體生長的能力。使用懸滴法(Herrman等人,2008),以96孔板每孔一個球狀體的頻率啟動AdrR和DU145球狀體。然后如所述的那樣使用Ab#6(最終濃度8pM)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素-(31EGF域(R&DSystems,Minneapolis,畫，Cat#396-HB，最終濃度3.4nM)或兩者的組合處理單個的球狀體。使用光學(xué)顯微鏡檢查(10X物鏡)在第751天和第13天測量球狀體的直徑。Ab#6抑制AdrR細胞中的球狀體生長(圖26A)。此外，3.4nMHRG刺激球狀體的生長，且Ab弁6抑制了HRG效應(yīng)(圖26B)。在13天試驗過程中，源自DU145的球狀體大小沒有增加；但是，HRGl-pi顯著地刺激了其生長。在這些細胞中，8Ab#6抑制了HRG誘導(dǎo)的J求狀體生長(圖26C)。實施例14:信號傳導(dǎo)的抑制研究了Ab弁6抑制由不同配體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。例如，測試了Ab#6對HRG和BTC與表達ErbB3受體的AdrR細胞結(jié)合的效果。如圖27A和B所示，使用FACS分析，Ab#6與HRG而不是BTC竟爭結(jié)合AdrR細胞。因此，Ab#6阻斷HRG與ErbB3的結(jié)合將會阻止HRG誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。此外，測試了各種不同的配體對ErbB3磷酸化的誘導(dǎo)。三種配體HRG、BTC和HGF能夠刺激AdrR細胞中ErbB3誘導(dǎo)的磷酸化，而EGF不能。如圖28所示，Ab#6抑制了AdrR細胞中HGF誘導(dǎo)的pErbB3磷酸化(圖28)。此外，如本領(lǐng)域已知的(參見，例如Wallenius等人(2000)爿mJ尸flAo/.156(3):821-910702398),在各種不同的上皮腫瘤或非上皮腫瘤中發(fā)現(xiàn)了增強的HGF信號傳導(dǎo)。ErbB3/cMET相互作用以及Ab#6在調(diào)控這種相互作用中的作用已經(jīng)證明攜帶表皮生長因子受體(EGFR)的活化突變的非小細胞肺癌通過募集MET和HER3并因此激活PI3K-AKT細胞存活途徑而產(chǎn)生對酪氨酸激酶抑制劑的抗性(Engelmann等人(2007)5Wewce316:1039-1043;Gou(2007)PNAS:105(2):692-697)。通過共免疫沉淀已經(jīng)很好地確認了攜帶活化EGFR突變的細胞系中EGFR和c-MET之間的關(guān)聯(lián)(Engelmann等人2007;Gou2007)。Guo等人最近使用共免疫沉淀證明，c-MET和ErbB3也存在于已知依賴于擴增的c-MET的胃細胞系MKN45中的復(fù)合物中。這種c-MET-erbB3相互作用還發(fā)生在攜帶野生型EGFR的AdrR細胞中，且不依賴于擴增的c-MET。HGF(肝細胞生長因子)在AdrR細胞中以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)ErbB3的磷酸化，如圖28所示。此外，Ab#6抑制HGF誘導(dǎo)的erbB3磷酸化。還研究了HRG和BTC對于ErbBl和ErbB3磷酸化的作用，發(fā)現(xiàn)HRG和BTC誘導(dǎo)ErbBl和ErbB3兩者的磷酸化。發(fā)現(xiàn)HRG是ErbB3磷酸化的更加強力的誘導(dǎo)劑，而BTC是ErbBl磷酸化的強力誘導(dǎo)劑(圖29)。這一磷酸化很可能是由ErbBl和ErbB3的復(fù)合體驅(qū)動的。簡而言之，HRG結(jié)合ErbB3誘導(dǎo)了ErbBl和ErbB3之間復(fù)合體的形成，導(dǎo)致了兩種受體的激活。相同的現(xiàn)象也很可能出現(xiàn)于BTC上，其中，BTC結(jié)合ErbBl刺激了ErbBl和ErbB3之間復(fù)合體的形成，導(dǎo)致了ErbBl和ErbB3兩者的磷酸化。配體(HRG、BTC、EGF和HGF)刺激的ErbB3磷酸化的抗體抑魁基于下述方法研究了Ab#6抑制配體(HRG、BTC、EGF和HGF)誘導(dǎo)的ErbB3磷酸化的能力1.將AdrR細胞接種在96孔板上，密度為30000細胞/孔/100uL,培養(yǎng)基為含10%FBS的RPMI培養(yǎng)基，使細胞生長過夜；2.第二日，通過改變培養(yǎng)基為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基對細胞進行血清饑餓，并使其生長過夜；3.使用不同濃度(0.01nM至100mM)的Ab#6或緩沖液(對照)預(yù)處理細胞兩小時；4.然后使用lOnMHRG和HGF刺激細胞lO分鐘，或用10mMBTC和EGF刺激細胞5分鐘；5.通過去除培養(yǎng)基并使用水冷PBS洗滌細胞一次來終止反應(yīng)；6.然后使用含1X蛋白酶抑制劑和1X磷酸酶抑制劑的25mMTris,pH+7.5、150mMNaCl、lmMEDTA、1.0%TritonX-100、1.0%CHAPS、100/c)v/v甘油來裂解細胞；以及7.根據(jù)廠商的說明，使用HumanPhospho-ErbB3ELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN，Cat.No.DYC1769)來測量細胞裂解產(chǎn)77物中的ErbB3磷酸化。ErbB2-ErbB3蛋白復(fù)合物形成的抗體抑制AdrR細胞與緩沖液(對照)或250nMAb#6在室溫下預(yù)孵育60分鐘，然后再用10nMHRG或10nMBTC或?qū)φ站彌_液處理IO分鐘。細胞在含0.2mMPMSF、50mTU/mL抑肽酶和100亮肽酶素(leupeptin)的25mMTris，pH+7.5、150mMNaCl、1mMEDTA、1.0%TritonX-IOO、1.0%CHAPS、10。/。v/v甘油中裂解，且裂解粗產(chǎn)物短暫離心以去除不溶物質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中，以l:500稀釋度加入抗ErbB3抗體(SantaCruzsc-285)。上清液在4°C下溫和搖動孵育過夜。首先使用IXPBS洗滌60|ulImmobilizedProteinA/G瓊脂糖5朱子(Pierce,Rockford,IL，Cat#20421)。將細胞裂解產(chǎn)物-抗體混合物加入到PBS洗滌的珠子中，在4。C下溫和搖動孵育2小時。然后使用冰冷裂解緩沖液洗滌免疫沉淀物三次，重懸于30jliI2XSDS樣品緩沖液中，在95。C熱變性7分鐘，在4-12%Bis-TrisGelsSDS-PAGE上電泳，并在含10%MeOH的Tri-甘氨酸緩沖液中電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在10ml封閉緩沖液中(Li-CorBiosciences,Lincoln,NE,Cat#927-40000)封閉1小時，然后與1:1000的抗ErbB2抗體(CellSignalingTechnology,Danvers,MA,Cat弁29D8)在10ml封閉緩沖液(Li畫CorBiosciences,Ca講927-40000)中孵育。使用1:5000的山羊抗-兔IRDye800(2|ul)在10ml封閉緩沖液(Li-CorBiosciences,Cat弁927-40000)中4企測信號。Ab#6也顯示完全抑制HRG刺激的ErbB2/3復(fù)合物形成(圖29B)。等同方式本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到或僅使用常規(guī)試驗就能夠確定此處所描迷的本發(fā)明特定實施方式的多種等同方式。這樣的等同方式也意圖包含在下迷的權(quán)利要求中。從屬權(quán)利要求中公開的實施方式的任意組合都包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。參考文獻的引入此處所涉及的所有出版物、專利以及待決的專利申請都通過S1用方式全文引入本文中。權(quán)利要求1.一種結(jié)合ErbB3并抑制EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。2.—種結(jié)合ErbB的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分具有一種或多種下述性能(i)抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、P細胞素、epigen或biregulin介導(dǎo)的通過ErbB3的信號傳導(dǎo)；(ii)抑制表達ErbB3的細胞的增殖；(iii)降低細胞表面的ErbB3水平的能力；(iv)抑制表達ErbB3的細胞的VEGF分泌；(v)抑制表達ErbB3的細胞的遷移；(vi)抑制表達ErbB3的細胞的球狀體生長；和/或(vii)結(jié)合位于ErbB3結(jié)構(gòu)域I上的表位。3.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，使用表面等離子共振分析法或細胞結(jié)合分析法測量的所述抗體或抗原結(jié)合部分結(jié)合ErbB3的Ko為至少大約8nM或更好。4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，EGF樣配體選自EGF、TGF-a、3細胞素、肝素結(jié)合性表皮生長因子、只又調(diào)蛋白和biregulin。5.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含的氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQEDNO:5、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%相同。6.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQEDNO:6、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%相同。7.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含的氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQEDNO:5、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列至少95%相同。8.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQEDNO:6、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少95%相同。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分進一步包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQEDNO:6、SEQIDNO:36或SEQIDNO:38所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少95%相同。10.—種結(jié)合與前述4壬一項權(quán)利要求所述的抗體所結(jié)合的表位相同或重疊的表位的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其與ErbB3氨基酸序列的殘基20-202相結(jié)合。12.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中，重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:9、15、21、41、47及其保守氨基酸置換的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:12、18、24、44、50及其保守序列修飾的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:8、14、20、40、46及其保守序列修飾的氨基酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求12-14所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:ll、17、23、43、49及其保守序列修飾的氨基酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:7、13、19、39、45及其保守序列修飾的氨基酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求12-16所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:IO、16、22、42、48及其保守序列修飾的氨基酸序列。18.—種結(jié)合ErbB3并包含重鏈和輕鏈可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3序列的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3序列選自(a)含SEQIDNO:7的重鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:8的重4連可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:9的重《連可變區(qū)CDR3;含SEQIDNO:10的輕鏈可變區(qū)CDRl;含SEQIDNO:11的輕《連可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:12的輕鏈可變區(qū)CDR3;(b)含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDRl;含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:15的重鏈可變區(qū)CDR3;含SEQIDNO:16的輕鏈可變區(qū)CDRl含SEQIDNO:17的輕鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:18的輕鏈可變區(qū)CDR3;(c)含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDRl;含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR3;及其組合;及其組合;含SEQIDNO:22的輕鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:23的輕鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:24的輕鏈可變區(qū)CDR3;和(d)含SEQIDNO:39的重鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:40的重《連可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:41的重4連可變區(qū)CDR3;含SEQIDNO:42的輕鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:43的輕4連可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:44的輕鏈可變區(qū)CDR3;和(e)含SEQIDNO:45的重4連可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:46的重鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:47的重鏈可變區(qū)CDR3;含SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:49的輕鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:50的輕鏈可變區(qū)CDR3。19.一種結(jié)合ErbB3并包含以下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)CDRl、CDR2和CDR3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分含SEQIDNO:7的重鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:8的重鏈可變區(qū)CDR2;含SEQIDNO:9的重鏈可變區(qū)CDR3;含SEQIDNO:10的輕鏈可變區(qū)CDR1;含SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)CDR2;和含SEQIDNO:12的輕《連可變區(qū)CDR3。20.—種結(jié)合ErbB3并包含以下重鏈可變區(qū)和輕《連可變區(qū)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列包含與選自SEQIDNO:9、15和21的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其中，所述輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含與選自SEQIDNO:12、18和24的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的抗體，其中，所述重鏈可變區(qū)CDR2序列包含與選自SEQIDNO:8、14和20的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。23.根據(jù)權(quán)利要求20-22所述的抗體，其中，所述輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含與選自SEQIDNO:11、17和23的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。24.根據(jù)權(quán)利要求20-23所述的抗體，其中，所述重鏈可變區(qū)CDR1序列包含與選自SEQIDNO:7、13和19的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求20-24所述的抗體，其中，所述輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含與選自SEQIDNO:10、16和22的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。26.—種結(jié)合ErbB3的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含源自人VH3種系基因的重鏈可變區(qū)。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分進一步包含源自人VL2種系基因的輕鏈可變區(qū)。28.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體選自人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。29.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分選自Fab、Fab'2、ScFv、SMIP、親和抗體、avimer、纟內(nèi)米抗體和域抗體。30.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，抗體同種型選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD和IgE抗體。31.在藥學(xué)上可接受的載體中包含前述任一權(quán)利要求所述的抗體或抗原結(jié)合部分的組合物。32.—種包含兩種或更多種前述任一權(quán)利要求所述的抗體的組合物，其中，所述抗體與ErbB3上不同的表位結(jié)合。33.—種編碼與ErbB3結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的分離的核酸，其包含與重鏈可變區(qū)SEQIDNO:25、輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:26、重鏈可變區(qū)SEQIDNO:27、輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:28、重鏈可變區(qū)SEQIDNO:29、輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:30或它們的組合至少90%相同的序列。34.—種編碼與ErbB3結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的分離的核酸，其包含在高嚴格條件下與重鏈可變區(qū)SEQIDNO:25、輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:26、重鏈可變區(qū)SEQIDNO:27、輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:28、重鏈可變區(qū)SEQIDNO:29或輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:30的核苷酸序列雜交的序列。35.—種包含^L利要求33或34所述的核酸的表達載體。36.—種包含權(quán)利要求35所述的核酸的宿主細胞。37.—種表達與前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合相同表位的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物。38.—種表達與前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合相同表位的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的轉(zhuǎn)基因植物。39.—種產(chǎn)生前述任一權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。40.—種產(chǎn)生結(jié)合ErbB3的人抗體的雜交瘤，其中，所述抗體由下述核苷酸序列編碼(a)SEQIDNO:25所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列和SEQIDNO:26所示的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其保守序列修飾；(b)SEQIDNO:27所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列和SEQIDNO:28所示的輕鏈可變區(qū)核苦酸序列及其保守序列修飾；或(c)SEQIDNO:29所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列和SEQIDNO:30所示的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列及其保守序列修飾。41.一種包含一種或多種前述任一權(quán)利要求所述的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分并任選包含用于治療或診斷與ErbB3依賴性信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病的說明的試劑盒。42.才艮據(jù)一又利要求41所述的試劑盒，其中，所述疾病為癌癥。43.—種抑制受試者中EGF樣配體介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的方法，包括以足以抑制EGF樣介導(dǎo)的ErbB3磷酸化的量給予受試者前述任一權(quán)利要求所述的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。44.一種治療受試者的癌癥的方法，包括給予受試者治療有效量的前述任一權(quán)利要求所述的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。45.根據(jù)4又利要求44所述的方法，其中，所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃腸/結(jié)腸癌、肺癌、透明細胞肉瘤和前列腺癌。46.根據(jù)權(quán)利要求43-45中任一項所述的方法，其中，所述受試者是人。47.根據(jù)權(quán)利要求43-45中任一項所述的方法，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用給予受試者。48.根據(jù)權(quán)利要求44-47中任一項所述的方法，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分與第二治療劑聯(lián)合給藥。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述第二治療劑是第二抗體或其抗原結(jié)合部分。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述第二治療劑是抗癌劑。51.根據(jù)^L利要求50所述的方法，其中，所述抗癌劑選自抗體、小分子、抗代謝物、烷化劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、微管靶向劑、激酶抑制劑、蛋白質(zhì)合成抑制劑、免疫治療劑、激素或其類似物、生長抑素類似物、糖皮質(zhì)激素、芳香化酶抑制劑和mTOR抑制劑。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述抗體為抗IGF1R抗體、抗EGFR抗體或抗cmet抗體。53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述小分子結(jié)合IGF1R、EGFR或cmet。54.—種診斷受試者中ErbB3相關(guān)的癌癥的方法，包括(a)使來自受試者的細胞在體外或體內(nèi)與權(quán)利要求1_30中任一項所述的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸，和(b)測量與細胞上的ErbB3結(jié)合的水平，其中，異常高的ErbB3結(jié)合水平表明該受試者患有與ErbB3相關(guān)的癌癥。全文摘要本發(fā)明提供了一類新型的結(jié)合ErbB3受體并抑制各種不同ErbB3功能的單克隆抗體。例如，此處所描述的抗體能夠結(jié)合ErbB3并抑制EGF樣配體介導(dǎo)的受體磷酸化。文檔編號A61K39/395GK101674846SQ200880009633公開日2010年3月17日申請日期2008年2月15日優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日發(fā)明者B·舍貝爾,M·費爾德豪斯,U·尼爾森申請人:梅里麥克制藥股份有限公司