專利名稱：用于在細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生突變體文庫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于體內(nèi)產(chǎn)生多肽變體文庫，篩選這些變體以及選擇那些顯示所需性質(zhì)的變體的方法。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生要求的多肽變體的方法。
背景技術(shù)：
日益增加的多肽(包括酶和非酶的蛋白質(zhì))正在工業(yè)上生產(chǎn)，這些多肽用于各種工業(yè)、家庭、食品/飼料、化妝品、醫(yī)藥等的用途。這些蛋白質(zhì)的主要來源之一是而且一直是天然發(fā)現(xiàn)的微生物。
用于發(fā)現(xiàn)這些具有新和特殊性質(zhì)的多肽的經(jīng)典方法一直是篩選天然存在的野生型有機(jī)體。這曾經(jīng)是獲得多肽的一種十分成功的方法，其中所說的多肽用于如上述的應(yīng)用的各種領(lǐng)域。
然而，如果因?yàn)樵谔烊凰拗飨到y(tǒng)中產(chǎn)生的數(shù)量太少而不能使得生產(chǎn)，往往不可能產(chǎn)生足夠量的這類多肽，即使成本沒有問題，要提供適合要求的足夠量的多肽(例如人生長激素)，也可能遇到困難。
這類問題已通過用于產(chǎn)生多肽的重組技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上得以克服。在本領(lǐng)域，多肽通過利用生物系統(tǒng)產(chǎn)生。把編碼某些多肽的基因克隆并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，其中該細(xì)胞將產(chǎn)生的多肽在量上比那些在原始有機(jī)體中產(chǎn)生的大得多。在最近的二十年中，按照這類技術(shù)，已發(fā)展了大量用于產(chǎn)生多肽的方法。
經(jīng)常，來自天然源的蛋白質(zhì)不滿足某些應(yīng)用的需要，修飾現(xiàn)有蛋白質(zhì)使之具有一定活性或生物物理學(xué)性質(zhì)將是必要的。
利用輻射(X射線和UV)或化學(xué)誘變劑，通過微生物的經(jīng)典誘變，產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)變體是可能的。然而，由于這種方法是一種十分麻煩且耗時(shí)的過程，在相同的最近二十年中，研究者一直在通過利用更具特異性和選擇性的重組技術(shù)(如用于創(chuàng)造人工多樣性的蛋白質(zhì)和基因工程)發(fā)展對現(xiàn)有多肽的改進(jìn)。
利用結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系與普通蛋白質(zhì)化學(xué)的知識，基于需要考慮的事，研究者已在設(shè)計(jì)多肽變體方面進(jìn)行了很久，其中所說的多肽變體顯示了各種性質(zhì)的改進(jìn)。
然而，也已認(rèn)識到多肽參與的各種相互作用是那么復(fù)雜，因此按照這些知識的合理設(shè)計(jì)有嚴(yán)重的局限性，近年來，利用隨機(jī)誘變，接著從由誘變產(chǎn)生的大量變體中篩選或選擇的方法已引起人們的興趣。
為了這一目的，產(chǎn)生了突變體的微生物文庫用于隨后的表達(dá)與篩選，以測定具有要求的性質(zhì)的變體。
多年來，許多用于創(chuàng)造多肽的大量不同變體的體外和體內(nèi)DNA誘變技術(shù)都已發(fā)展。
考慮到事實(shí)一種典型的天然存在的多肽由100-1000個(gè)氨基酸組成，每個(gè)氨基酸可以20種方式變化(僅在天然存在的氨基酸內(nèi)發(fā)生)，特定多肽的可能變體的數(shù)量是巨大的。由于主要參數(shù)(規(guī)定或測量微生物收集品或文庫的有效性以鑒定多肽的改進(jìn)變體)是不同變體的數(shù)目N，其中所說的不同變體N包含于收集品，所以已出現(xiàn)對大文庫的需要。
尤其在當(dāng)一種強(qiáng)大的選擇系統(tǒng)可供使用時(shí)，鑒定要求的多肽的限制因子是文庫的大小。
在體外系統(tǒng)情況下，本領(lǐng)域狀態(tài)下，對N的實(shí)際限制是大約108。這主要由于操縱的DNA進(jìn)入宿主有機(jī)體的轉(zhuǎn)化(把DNA引入細(xì)胞)的低效能。這個(gè)數(shù)目從有機(jī)體到有機(jī)體變化很大，在現(xiàn)存的最好情況大腸桿菌下，通常操縱的DNA的體外轉(zhuǎn)化(例如DNA片段的連接或DNA的化學(xué)處理)的效率，最多達(dá)到108細(xì)菌的文庫大小(Greg Winter，現(xiàn)代免疫學(xué)方法5:253-255,1993)。極少數(shù)這一大小的文庫的例子已報(bào)導(dǎo)了。
在其它原核生物(如Bacillus sp.、Streptococcus sp.或Staphylococcussp.)中的體外文庫構(gòu)建，由于實(shí)際原因?qū)⑹堑陀谶@個(gè)數(shù)目的數(shù)量級。
考慮到真核生物宿主(如釀酒酵母或各種Aspergillus sp.)，甚至更少數(shù)量的轉(zhuǎn)化體可期待來自體外操縱的DNA。
已報(bào)導(dǎo)了大文庫的一種特殊的情況是基于抗體輕鏈和重鏈文庫的體內(nèi)重組基于用于那種特殊情況的一個(gè)專門設(shè)計(jì)的系統(tǒng)(Griffiths,A.D.等，1994,EMBO J.14:3245-3260)。
許多方法可用以在微生物中體內(nèi)產(chǎn)生多肽的變體，從十分簡單的方法(如利用化學(xué)或物理誘變劑處理細(xì)胞)到相當(dāng)復(fù)雜的方法，該方法依賴于包含易錯(cuò)的DNA聚合酶但缺乏糾正錯(cuò)誤的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的細(xì)胞(Stratagene,XL1-red(mutS、mutD、mutT)目錄#200129)。但這些技術(shù)有一主要的弊端，由于誘變的目標(biāo)不是基因組的特定部分(編碼興趣多肽)，且高頻突變也在對細(xì)胞必須的基因以及靶基因中產(chǎn)生，導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，而且在高數(shù)量的細(xì)胞中所說的突變不影響興趣多肽。這類“噪音”將限制突變在靶區(qū)域的積累。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種特定區(qū)域的體內(nèi)靶誘變方法以產(chǎn)生很大數(shù)量N的多肽變體。
本發(fā)明的第二目的涉及利用現(xiàn)有的和未來的技術(shù)，篩選或選擇具有所需性質(zhì)的變體。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及用于在包含大量突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生文庫的方法，其中易錯(cuò)聚合酶用于各祖代細(xì)胞復(fù)制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包含ⅰ)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從該點(diǎn)開始，ⅱ)可有可無的遺傳標(biāo)記，例如，編碼具有抗抗生素抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復(fù)制機(jī)制。
本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生編碼興趣多肽的所需變體的DNA序列的方法，其中ⅰ)突變體文庫利用上述方法產(chǎn)生，ⅱ)在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所說的文庫以產(chǎn)生多肽變體，ⅲ)篩選或選擇所說的具有所需性質(zhì)的變體多肽，鑒定并分離產(chǎn)生這類所需變體的宿主，ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列；和用于測定編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中
(ⅰ)突變體文庫用上述方法產(chǎn)生，(ⅱ)把所說的文庫在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)，以產(chǎn)生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所說的所需性質(zhì)的變體多肽，鑒定并分離產(chǎn)生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
文庫的篩選或變體的選擇取決于特定多肽，及它的所需改進(jìn)和/或保持的性質(zhì)。因此，對每種情況建立篩選方案是必要的。這類方案包括文獻(xiàn)中描述的許多檢驗(yàn)(Clackson等，自然352:624-628,1991,Bryan,P等，蛋白質(zhì)1:326-334,1986)。
產(chǎn)生多樣性的結(jié)合并選擇具有所需性質(zhì)的變體的優(yōu)雅的途徑將是本發(fā)明的以噬菌體顯示系統(tǒng)體內(nèi)產(chǎn)生多樣性的方法的結(jié)合(Greg Winter，同上)。
興趣多肽的特定例子是堿性蛋白酶，該酶用于從織物除去蛋白質(zhì)污點(diǎn)的去污劑工業(yè)。在那種情況下，篩選可在實(shí)際去污劑組合物中完成以調(diào)查性質(zhì)(如熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、存儲(chǔ)穩(wěn)定性、底物特異性以及親和性、對不含水的溶劑的穩(wěn)定性、pH輪廓、離子強(qiáng)度依賴性、催化效率和洗滌性能)。
本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生所需的多肽變體的方法，其中(ⅰ)把編碼已經(jīng)按照上述方法測定的興趣多肽的DNA序列以一定的方式引入合適的宿主中，以便此序列可在所說的宿主中表達(dá)，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所說的宿主，并且(ⅲ)回收所說的多肽變體。
用于引導(dǎo)選擇的DNA序列進(jìn)入合適的宿主系統(tǒng)的方法在(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY.)中描述。
選擇合適的生長培養(yǎng)基和選擇的宿主系統(tǒng)的其它條件也在技術(shù)人員的能力之內(nèi)，這些條件利于興趣多肽變體的表達(dá)。有關(guān)這些內(nèi)容的指導(dǎo)可在(Sambrook等，同上)中找到。
用于多肽回收的大量方法也可供蛋白質(zhì)的分離與純化使用，例如，在(Scopes,R.K.,蛋白質(zhì)純化(1987)，Springer-Verlag)。
最后，本發(fā)明涉及用上述方法產(chǎn)生的多肽。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括體內(nèi)構(gòu)建興趣基因變體文庫的方法。此方法包括利用遺傳元件(如能夠不依賴于宿主染色體復(fù)制系統(tǒng)復(fù)制的噬菌體或質(zhì)粒)。通過利用分離宿主染色體的復(fù)制和遺傳元件復(fù)制(噬菌體/質(zhì)粒)的可能性，通過修飾一種復(fù)制系統(tǒng)以選擇性地在保持宿主完整染色體的遺傳元件(噬菌體/質(zhì)粒)中引入突變是可能的。這意味著在興趣基因中產(chǎn)生變異不危及宿主的生存力。
DNA復(fù)制是一種高度精確的過程，在大腸桿菌中染色體復(fù)制的誤導(dǎo)入率已估計(jì)為每輪復(fù)制每個(gè)堿基10-10次。DNA復(fù)制期間進(jìn)行的堿基配對導(dǎo)致對聚合酶的優(yōu)先選擇以在一定位置摻入正確的堿基，占全面復(fù)制保真性約為105。如果一個(gè)不正確的堿基已摻入，聚合酶將停止，3’-5’外切核酸酶常除去3’不正確摻入的堿基。這部分表明的正確讀框占全面復(fù)制保真性大約為102。細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)占最后103的保真率。
大腸桿菌中染色體的復(fù)制大多數(shù)通過DNA聚合酶Ⅲ全酶進(jìn)行，此酶是包含10種不同多肽(包括聚合酶(α-亞單位，polC基因)和3’-5’外切核酸酶(dnaQ基因))的多種蛋白質(zhì)復(fù)合物。
另一種聚合酶(DNA聚合酶Ⅰ(DNA polⅠ,polA基因)包含三種不同的活性，即，DNA聚合酶活性、3’-5’外切核酸酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，盡管事實(shí)上它是一種單一的多肽。這種聚合酶在細(xì)胞中有多種功能。除DNA修復(fù)外，由于它在遲滯DNA鏈合成期間參與DNA片段的組裝，染色體DNA復(fù)制也需要DNA polⅠ。然而，它復(fù)制的僅是基因組的十分次要的部分。
這種聚合酶還用于某些種類質(zhì)粒DNA復(fù)制的起始，例如，基于ColEⅠ復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒(如大腸桿菌和革蘭氏陰性細(xì)菌中的pBR322或革蘭氏陽性細(xì)菌中的pAMβ1樣質(zhì)粒)。這類質(zhì)?？稍跊]有以活性形式存在的DNA聚合酶Ⅲ時(shí)(例如，如果這種酶由于基因原因機(jī)能不良，如在非允許溫度下的溫敏變體)，或細(xì)胞中僅存在有限量的DNA聚合酶Ⅲ的條件下，通過DNA聚合酶Ⅰ的活性完全復(fù)制。
眾所周知某些突變導(dǎo)致DNA復(fù)制保真性的降低(或增加)。已把這些突變作圖以主要駐留于聚合酶、外切核酸酶或修復(fù)系統(tǒng)的元件中。遺憾地，這些突變大多數(shù)改變/修復(fù)現(xiàn)存的完全基因組的保真率，且這類非靶突變也不理想。
這類突變的一個(gè)例子可以是DNA polⅠ的3’-5’外切核酸酶活性的滅活。
然而，按照本發(fā)明，利用的事實(shí)是復(fù)制系統(tǒng)的某些元件可以暫時(shí)“關(guān)閉”(全部或部分)，因此，停止或大大地降低基因組的復(fù)制，而如本文限定的某些遺傳元件的復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行。
包含溫敏DNA polⅢ(即聚合酶α-亞基或使全酶有條件地?zé)o功能的另一個(gè)溫敏亞基)或染色體復(fù)制的起始所需的功能(如基于DnaA、易錯(cuò)的DNApolⅠ和colEⅠ的包含興趣基因的質(zhì)粒)的大腸桿菌菌株是按照本發(fā)明設(shè)計(jì)的遺傳系統(tǒng)的例子，以在質(zhì)粒(和興趣基因)中特異性地引入突變。
在這類系統(tǒng)中，提高溫度至非允許的值將具有的影響是使DNA polⅢ完全停止作用，而易錯(cuò)的DNA polⅠ將保持它的功能，并以減少的保真性復(fù)制質(zhì)粒，產(chǎn)生質(zhì)粒的突變拷貝。
由于突變的產(chǎn)生是隨機(jī)的，每一種細(xì)胞將產(chǎn)生獨(dú)特的突變，經(jīng)降低溫度，溫敏功能將再一次變得活躍，細(xì)胞的正常復(fù)制繼續(xù)。
變體將是具有polⅢ和polⅠ溫敏等位基因的大腸桿菌菌株，且該菌株可(通過ts阻抑物(溫敏)或通過化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)表達(dá)易錯(cuò)聚合酶。在一限制性溫度下，且在誘導(dǎo)物存在時(shí)，突變將在遺傳元件中積累。在允許溫度下，且缺乏誘導(dǎo)物時(shí)，完全系統(tǒng)作為野生型細(xì)胞起作用。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及用于在包含大量突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生突變體文庫的方法，其中易錯(cuò)聚合酶用于各祖代細(xì)胞復(fù)制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包含ⅰ)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制由此開始，ⅱ)可有可無的遺傳標(biāo)記，例如賦予對抗生素的抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復(fù)制機(jī)制。
因而，本發(fā)明包含用于在包含大量突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生突變體文庫的方法，此方法包括A)提供細(xì)胞，該細(xì)胞具有
ⅰ)易錯(cuò)聚合酶將復(fù)制全部或部分遺傳元件，其中所說的酶不依賴于所說的細(xì)胞的染色體復(fù)制機(jī)制，所說的遺傳元件包含a)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制由此開始，b)可有可無的遺傳標(biāo)記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，c)編碼興趣多肽的基因，和ⅱ)染色體的復(fù)制機(jī)制，這可以可逆地誘導(dǎo)為實(shí)質(zhì)上無功能的，B)在利于這種細(xì)胞復(fù)制的條件下，培養(yǎng)這種細(xì)胞以獲得大量祖代細(xì)胞，C)在所說的祖代細(xì)胞中可逆地誘導(dǎo)所說的染色體的復(fù)制機(jī)制以成為實(shí)質(zhì)上無功能的，達(dá)足夠的時(shí)間以使得所說的遺傳元件通過所說的異錯(cuò)聚合酶復(fù)制以在所說的遺傳元件中產(chǎn)生突變，D)在這類突變細(xì)胞中，可逆地誘導(dǎo)所說的染色體的復(fù)制機(jī)制以成為實(shí)質(zhì)上無功能的，E)在利于這類突變細(xì)胞復(fù)制的條件下，培養(yǎng)這類突變細(xì)胞。
在本文中，表達(dá)“突變體文庫”意味著一套細(xì)胞(細(xì)菌或噬菌體)(典型地為105-1013個(gè)細(xì)胞或噬菌體)，它們由于編碼興趣多肽的一種特殊基因而不同。典型地，人們將可能在文庫的每個(gè)成員中，引入一種或多種不同的氨基酸以改變這種特殊的多肽。
在本文中，表達(dá)“易錯(cuò)聚合酶”意指在DNA復(fù)制過程中，聚合酶將以比通常用于這一目的的聚合酶(例如大腸桿菌DNA polⅠ、枯草芽孢桿菌DNA polⅠ、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶)更高的頻率摻入錯(cuò)誤(在一個(gè)給定位置的一個(gè)錯(cuò)誤的核苷酸或引起一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失或插入)。
在本文中表達(dá)“祖代細(xì)胞”意指其中沒有突變引入的這類細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，突變循環(huán)可以重復(fù)，在那種情況下，這類最初突變的細(xì)胞將成為第二個(gè)突變循環(huán)的祖代細(xì)胞，等等。
在本文中表達(dá)“宿主染色體復(fù)制機(jī)制”意指DNA聚合酶或DNA聚合酶全酶，這些酶主要負(fù)責(zé)宿主染色體的復(fù)制，例如，大腸桿菌中的DNA聚合酶Ⅲ。
在本文中，表達(dá)“遺傳元件”意指由RNA或DNA組成的一種小(從1或2千個(gè)堿基到100千個(gè)堿基)實(shí)體，此實(shí)體可獨(dú)立地復(fù)制，即它包含復(fù)制起點(diǎn)。典型地，遺傳元件將是噬菌體、噬菌粒或質(zhì)粒。按照本發(fā)明，遺傳元件也必須包含編碼興趣多肽的基因，它還可包含遺傳標(biāo)記，例如賦予對抗生素的抗性的基因。
能夠不依賴于宿主復(fù)制機(jī)制復(fù)制的病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或轉(zhuǎn)座子(例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)也可用作“遺傳元件”。
Kim和Loeb(1995,PNAS 92:684-688)已表明HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-RT)能夠補(bǔ)充大腸桿菌DNApolⅠ關(guān)于染色體DNA的復(fù)制和質(zhì)粒DNA復(fù)制的起始。HIV-RT(和相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶)的誤摻入率比DNA polⅠ的比率高幾個(gè)數(shù)量級的大小，即每輪復(fù)制中每個(gè)堿基10-3-10-4個(gè)誤摻入。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，這類聚合酶替代突變的易錯(cuò)大腸桿菌DNA polⅠ的利用將明顯地增加上述系統(tǒng)中復(fù)制錯(cuò)誤的頻率。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，上述的突變循環(huán)可重復(fù)，即開關(guān)誘變聚合酶數(shù)次，因此產(chǎn)生更多突變體。此外，如果多拷貝質(zhì)粒用作遺傳元件，這個(gè)步驟還可幫助質(zhì)粒的分離。
在某些遺傳元件中，人們可預(yù)見僅部分定位在復(fù)制起點(diǎn)附近的遺傳元件由易錯(cuò)聚合酶復(fù)制。在這種情況下，興趣基因應(yīng)該位于這一區(qū)域內(nèi)。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，遺傳元件是噬菌體，其中編碼興趣多肽的基因定位于基因座，在此表達(dá)的多肽從噬菌體表面顯示，因此篩選可直接完成(參見，Greg Winther，同上)。為確保噬菌體的DNA序列和顯示的蛋白質(zhì)之間的對應(yīng)，選擇或篩選前，初級噬菌體庫應(yīng)以低感染復(fù)數(shù)通過野生型大腸桿菌。
為進(jìn)一步增加突變的頻率，本發(fā)明的方法包括實(shí)施方案，在這些實(shí)施方案中，所說的方法與修復(fù)缺損的宿主(例如mutL、mutS、mutH)或增變基因基因組類型的組合結(jié)合使用。
在本文中，表達(dá)“修復(fù)缺損的宿主”意指包含一種或多種基因變化的細(xì)胞，其中所說的基因編碼已知直接或間接參與DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)。這類突變的結(jié)果是引入的更高頻率的突變(通過聚合酶、化學(xué)藥品、X-射線、UV線等)將被修復(fù)并將“永久地”摻入基因組中，成為所謂的增變基因表型。這類基因的例子是mutL、mutS、mutH、mutT。
作為遺傳元件，如上述表明的，人們可能利用噬菌粒替代質(zhì)粒，以將變體產(chǎn)生連接到顯示系統(tǒng)上，例如M13、fI、fd。
在本文中，表達(dá)“噬菌?！币庵敢环N質(zhì)粒，除它的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)外，該質(zhì)粒還含有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。噬菌粒依賴于能夠作為一種質(zhì)粒或作為一種噬菌體(經(jīng)用輔助噬菌體感染)復(fù)制的條件。
基于噬菌粒的系統(tǒng)將包括噬菌粒的構(gòu)建，該噬菌粒包含1)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，例如ColEⅠ2)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)3)由興趣基因組成的嵌合基因，其中該興趣基因融合于編碼GⅢ蛋白質(zhì)的基因(φrum,P等，核酸研究21:4491-4498,1993)。
第一個(gè)步驟是通過生長/保持大腸桿菌菌株產(chǎn)生多樣性，其中所說的大腸桿菌菌株以如上述的這種噬菌粒轉(zhuǎn)化。第二個(gè)步驟是以輔助噬菌體感染以構(gòu)造將包裝到噬菌體微粒中的單鏈?zhǔn)删?。然后，可對顯示變體蛋白質(zhì)的噬菌體進(jìn)行選擇。
某些噬菌體(如大腸桿菌中的T4或T7或芽孢桿菌中的SPOⅡ及Phi29)也包含它們自己的DNA聚合酶，且按照本發(fā)明，人們能預(yù)見實(shí)施方案，其中如上述的遺傳元件是包含易錯(cuò)DNA聚合酶的噬菌體。
按照本發(fā)明，易錯(cuò)聚合酶典型地選自DNA聚合酶Ⅰ或逆轉(zhuǎn)錄酶。一種優(yōu)選的易錯(cuò)聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的變體。
作為一種興趣多肽，大數(shù)量是可能的，尤其是，這類顯示生物活性的多肽可論及。其中，這些多肽是對預(yù)防和治療人類和動(dòng)物中各種紊亂和疾病重要的酶、激素、受體、凝血因子、抗微生物劑及其它這類多肽。
用于工業(yè)目的的酶也可論及。在這類工業(yè)酶中，這些酶屬于羰基水解酶、羧基水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、植酸酶、抗微生物的多肽、氧化還原酶、異構(gòu)酶、裂合酶及連接酶。
在本文中，表達(dá)“羰基水解酶”意指水解包含-C(=O)-X基團(tuán)的化合物，其中所說的X是氧或氮的酶。
屬于羰基水解酶的特定種類是如水解酶(脂酶)和肽水解酶(蛋白酶)。
本文蛋白酶意指作為按照國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)與分子生物學(xué)(IUBMB)的提議(1992)在酶分類號E.C.3.4下劃分的酶。
實(shí)施例包括選自那些在酶分類(E.C.)號下劃分的蛋白酶
3.4.11(即所謂的氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.10(細(xì)菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜熱桿菌氨肽酶)、3.4.11.15(賴氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(蛋氨酰氨肽酶))；3.4.21(即所謂的絲氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(Cucumisin)、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(塞里維辛)和3.4.21.62(枯草菌素)；3.4.22(即所謂的半胱氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.22.2(番木瓜酶)、3.4.22.3(無花果蛋白酶)、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(蘿摩蛋白酶)、3.4.22.14(Actinidain)、3.4.22.30(番木瓜蛋白酶)以及3.4.22.31(Ananain)；3.4.23(即所謂的天冬氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(曲霉胃蛋白酶Ⅰ)、3.4.23.20(青霉蛋白酶)以及3.4.23.25(酵母蛋白酶)；和3.4.24(即所謂的有機(jī)金屬內(nèi)肽酶)，包括3.4.24.28(桿菌溶素)。
相關(guān)的枯草桿菌蛋白酶的例子包含枯草桿菌蛋白酶BPN＇、枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸膜菌素肽酶、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、thermitase、水溶素、芽孢桿菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7以及蛋白酶TW3。
這類易于得到的市售蛋白酶的特定例子包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Dyrazym、Savinase、Pyrase、胰蛋白酶NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro、Clear-Lens Pro(由Novo Nordisk A/S提供所有酶)。
其它市售蛋白酶的例子包括由Gist-Brocades N.V.銷售的Maxatase、Maxacal、Maxapem、由Solvay et Cie銷售的Opticlean和由Genencor International銷售的Purafect。
人們將理解蛋白酶變體也期待作為興趣多肽。這類蛋白酶變體的例子在EP 130.756(Genentech)、EP214.435(Henkel)、WO87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP251.446(Genencor)、EP260.105(Genencor)、Thomas等，(1985)，自然318,p.375-376,Thomas等，(1987)，分子生物學(xué)雜志，193,pp.803-813,Russel等，(1987)，自然328,p.496-500,WO 88/08028(Genex)、WO88/08033(Amgen)、WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP525 610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)中公開。
蛋白酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第5卷描述的測定。
本文的脂酶意指作為依據(jù)國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)與分子生物學(xué)(IUBMB)的提議(1992)，在酶分類號E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)下劃分的酶。
實(shí)施例包括選自屬于酶分類(E.C.):3.1.1(即所謂的羧酸酯水解酶)(包括(3.1.1.3)三酰甘油脂酶、(3.1.1.4.)磷脂酶A2)的那些酶中的脂酶。
脂酶的例子包括來源于下列微生物的脂酶。指明的專利出版物本文一并參考腐質(zhì)霉屬(例如H.brevispora、H.lanuginosa、H.brevis var.thermoidea和H.insolens(US 4,810,414))、假單胞菌屬(例如莓實(shí)假單胞菌、施氏假單胞菌、蔥頭假單胞菌和熒光假單胞菌(WO 89/04361)或Pseudomonas plantarii或Pseudomonas gladioli(US專利號4,950,417(Solvay酶))或產(chǎn)堿假單胞菌和假產(chǎn)堿假單胞菌(EP 218 272)或門多薩假單胞菌(WO 88/09367；US 5,389,536))、鐮孢屬(例如尖鐮孢(EP130,064)或腐皮鐮孢pisi(WO 90/09446))、毛霉屬(也稱根毛霉屬)(例如米黑毛霉(EP 238 023))、色素桿菌屬(尤其是粘稠色素桿菌)、曲霉屬(尤其是黑曲霉)、假絲酵母屬(例如C.cylindracea(也稱皺落假絲酵母)或C.antarctica(WO 88/02775)或C.antarctica脂酶A或B(WO 94/01541和WO89/02916))、地霉屬(例如白地霉(Schimada等，(1989)，生物化學(xué)雜志，106,383-388))、青霉屬(例如沙門柏干酪青霉(Yamaguchi等)，(1991)，基因，103,61-67))、根霉菌屬(例如R.delemar(Hass等，(1991)，基因，109,107-113)或雪白根霉(Kugimiya等，(1992)，生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)，56,716-719)或米曲霉))、芽孢桿菌屬(例如枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993),Biochemica等，生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，1131,253-260)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/7744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422))。
易于得到的市售脂酶的特定例子包括Lipolase、LipolaseTMUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(全部由Novo Nordisk A/S提供)其它脂酶的例子是LumafastTM，來自Genencor Int.公司的門多薩假單胞菌脂酶、LipomaxTM，來自Gist Brocades/Genencor Int.公司的假產(chǎn)堿假單胞菌脂酶、來自Unilever的腐皮鐮孢脂酶(角質(zhì)酶)、來自Solvayenzymes的Bacillus sp.脂酶。其它脂酶可由其它公司得到。
脂酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinhein，第4卷描述的，或如在AF 95/5 GB(可向Novo NordiskA/S請求獲得)中描述的測定。
在本文中，表達(dá)“糖酶”意指所有能夠打斷五碳和六碳的特定環(huán)狀結(jié)構(gòu)的糖鏈(例如淀粉)的酶(即按照國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.3.2(糖苷酶)的酶。能夠使碳水化合物，例如六碳環(huán)狀結(jié)構(gòu)的碳水化合物(如D-葡萄糖)異構(gòu)化為例如五碳環(huán)狀結(jié)構(gòu)(如D-果糖)的酶也包括在本發(fā)明的糖酶組中。
糖酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號的糖酶α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內(nèi)-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、內(nèi)-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、殼多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內(nèi)1,3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精內(nèi)1,6-葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內(nèi)1,3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內(nèi)1,6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內(nèi)1,5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖異構(gòu)酶(5.3.1.5)。
有關(guān)糖酶的例子包括來源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、來源于阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、殼多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖異構(gòu)酶(5.3.1.5)的α-1,6-葡聚糖酶。
有關(guān)糖酶的例子包括來源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、來源于擬青霉屬菌株的α-1,6-葡聚糖酶、來源于枯草芽孢桿菌的β-葡聚糖酶、來源于Humicola insolens的β-葡聚糖酶、來源于黑曲霉的β-葡聚糖酶、來源于木霉屬菌株的β-葡聚糖酶、來源于溶黃嘌呤厄氏菌菌株的β-葡聚糖酶、來源于黑曲霉的外-1,4-α-D-葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)、來源于枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、來源于米曲霉的α-淀粉酶、來源于非病原微生物的α-淀粉酶、來源于黑曲霉的α-半乳糖苷酶、來源于Humicola insolens的戊聚糖酶(Pentosanases)、木聚糖酶、纖維二糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、來源于Trichoderma reesei的纖維素酶、來源于非病原霉菌的纖維素酶、來源于黑曲霉的果膠酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶(arabinases)、半纖維素酶、來源于薄青霉的葡聚糖酶、來源于非病原霉菌的內(nèi)葡聚糖酶、來源于Bacillus acidopullyticus的pullulanases、來源于脆壁克魯維酵母的β-半乳糖苷酶、來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶。
易于得到的市售糖酶的特定例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTMAlpha、Bio-FeedTMBeta、Bio-FeedTMPlus、Bio-FeedTMPlus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、Finizym、FuneamylTM、GamanaseTM、Glucanex、Lactozym、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、Promozyme、PulpzymeTM、NovamylTM、Termamyl、AMG(淀粉葡糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym(由Novo Nordisk A/S提供所有的酶)。其它糖酶可由其它公司得到。
人們將理解這類糖酶變體也期待作為興趣多肽。
糖酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,Vellag Chemie,Weinheim，第4卷中描述的測定。
本文氧化還原酶意指依據(jù)國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.1(氧化還原酶)下的酶。
氧化還原酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號的氧化還原酶甘油-3-磷酸脫氫酶(NAD+)(1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脫氫酶NAD(p)+(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸1-脫氫酶(NADP)(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、兒茶酚氧化酶(1.1.3.14)、膽紅素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脫氫酶(1.4.1.1)、谷氨酸脫氫酶(1.4.1.2)、谷氨酸脫氫酶(NAD(P)+)(1.4.1.3)、谷氨酸脫氫酶(NADP+)(1.4.1.4)、L-氨基酸脫氫酶(1.4.1.5)、絲氨酸脫氫酶(1.4.1.7)、纈氨酸脫氫酶(NADP+)(1.4.1.8)、亮氨酸脫氫酶(1.4.1.9)、甘氨酸脫氫酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、6-賴氨酸蛋白質(zhì)氧化酶(1.4.3.13)、L-賴氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脫氫酶(1.4.99.1)、蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(1.6.4.4)、硫氧還蛋白還原酶(1.6.4.5)、蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、過氧化氫酶(1.11.1.6)、過氧化物酶(1.11.1.7)、脂氧合酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。
所說的葡萄糖氧化酶可來源于黑曲霉。
所說的漆酶可來源于Polyporus pinsitus、Myceliophtorathermophila、灰蓋鬼傘、立枯絲核菌、Rhizoctonia praticola、Scytalidiumthermophilum和Rhus vernicifera。
膽紅素氧化酶可來源于Myrothechecium verrucaria。
例如，過氧化物酶可來源于大豆、辣根或灰蓋鬼傘。
蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶可以是任何DK專利申請no.768/93,265/94和264/94(Novo Nordisk A/S)中論及的任意一種，這些本文一并參考，也包括牛來源的蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶、來源于米曲霉或黑曲霉的蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶及來源于大腸桿菌的DsbA或DsbC。
易于得到的市售氧化還原酶的特定例子包括GluzymeTM(由NovoNordisk A/S提供的酶)。然而其它氧化還原酶可由其它公司得到。
人們將理解氧化還原酶變體也期待作為興趣多肽。
氧化還原酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第3卷中描述的測定。
在本文中，轉(zhuǎn)移酶按照國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的提議(1992)，屬于酶分類號E.C.2的酶。
轉(zhuǎn)移酶可以是轉(zhuǎn)移酶亞組的任何轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1)、轉(zhuǎn)移醛或殘基的轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.2)、酰基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.3)、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4)、轉(zhuǎn)移烷基或芳基基團(tuán)、其它甲基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.5)、轉(zhuǎn)移含氮基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶(2.6)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶E.C 2.3.2.13(谷氨酰胺蛋白質(zhì)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是能夠催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，其中結(jié)合肽的谷氨酰胺殘基的γ-甲酰氨基是酰基供體。在各種化合物中，伯氨基基團(tuán)可作為?；荏w起作用，隨后形成結(jié)合肽的谷氨酸的單一取代的γ-酰胺。當(dāng)肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基用作酰基受體時(shí)，轉(zhuǎn)移酶形成分子內(nèi)或分子間γ-谷氨?；?ε-賴氨酰交叉連接。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的例子在未決的DK專利申請990/94(Novo Nordisk A/S)中描述。
轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶可以是來源于人、動(dòng)物(例如牛)或微生物的。
這類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的例子是動(dòng)物衍生的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、FXⅢa；來源于Physarum polycephalum的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Klein等，細(xì)菌學(xué)雜志，174,p.2599-2605)；來源于Streptomyces sp.(包含Streptomycelavendulae、利迪鏈霉菌(以前的黎巴嫩鏈霉菌)及Streptoverticillium sp.(包括茂原鏈輪絲菌、肉桂鏈輪絲菌和灰肉色鏈輪絲菌)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Motoki等，US5,156,956；Andou等，US5,252,469；Kaempfer等，普通微生物學(xué)雜志，137,1831-1892；Ochi等，國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，44，285-292；Andou等，US5,252,469；Williams等，普通微生物學(xué)雜志，129,1743-1813)。
人們將理解轉(zhuǎn)移酶變體也期待作為興趣多肽。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第1-10卷中描述的測定。
在本文中，植酸酶依據(jù)國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的提議(1992)，屬酶分類號E.C.3.1.3(磷酸單酯水解酶)的酶。
植酸酶是由微生物產(chǎn)生的酶，該酶催化植酸酯轉(zhuǎn)化為肌醇和無機(jī)磷。
產(chǎn)生植酸酶的微生物包含細(xì)菌(如枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和假單胞桿菌)、酵母(如釀酒酵母)及真菌(如黑曲霉、無花果曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、土曲霉或構(gòu)巢曲霉以及各種其它曲霉屬物種)。
植酸酶的例子包括選自屬于酶分類(E.C.)號3-植酸酶(3.1.3.8)和6-植酸酶(3.1.3.26)的那些植酸酶。
植酸酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷描述的測定，或可按照EP-A1-0 420 358，實(shí)施例2A中描述的方法測定。
在本文中，抗微生物多肽可以是任何顯示抗微生物活性(如抗真菌、抗細(xì)菌和/或抗殺蟲劑活性)的多肽。
這類多肽也可以顯示其它活性，如酶活性。
按照本發(fā)明，抗微生物的多肽的例子包括WO 94/01459(NovoNordisk A/S)中描述的，來源于霉菌彎孢霉屬的殺真菌活性多肽；EP403.458(Kabigen AB)描述的抗細(xì)菌多肽；WO 92/15691(ImperialChem Ind.PLC)中描述的從Mirabilis種子分離的抗微生物蛋白質(zhì)；WO92/22578(Boman等)中描述的從豬小腸的抽提物中分離的抗細(xì)菌多肽；如JP-60130599中描述的，具有由Hansenula spp.的酵母積累的酵母致死作用的多肽；Phytolacca insularis抗病毒蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)可用作美國專利no.5,348,865(Jin Ro有限公司)中描述的抗微生物劑；來源于美國專利no.5,354,681(Novo Industri A/S)中描述的達(dá)松維爾擬諾卡氏菌的細(xì)菌裂解酶制劑。
其它抗微生物多肽的例子是爪蟾抗菌肽、protegrin、防衛(wèi)素、假霉菌素、mutanolysin和N-乙酰溶菌酶。
另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)突變體文庫用上述方法產(chǎn)生，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所說的文庫以產(chǎn)生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質(zhì)的所說的變體多肽，以及鑒定并分離產(chǎn)生所需變體的宿主，(ⅳ)分離編碼所說的變體的DNA。
另一方面，本發(fā)明涉及用于測定編碼興趣多肽所需變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)如上述的產(chǎn)生突變體文庫，
(ⅱ)把所說的文庫在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質(zhì)的所說的變體多肽，及鑒定并分離產(chǎn)生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
本發(fā)明的這一方面可通過稀釋(例如，在微滴定板上)并培養(yǎng)文庫完成，因此，形成每一源于文庫的一個(gè)成員的群體，篩選每個(gè)群體中產(chǎn)生的具有所需性質(zhì)的變體多肽。作為選擇，可把文庫在包含所需的生長培養(yǎng)基的瓊脂板上培養(yǎng)，其中所說的培養(yǎng)基可使得篩選或選擇具有所需性質(zhì)的變體多肽。
如果利用噬菌體顯示方法，篩選或選擇直接由噬菌體完成。
用于選擇的標(biāo)準(zhǔn)將按照興趣多肽變體的最終用途變化，但典型地，檢驗(yàn)的性質(zhì)可包括各種培養(yǎng)基的溶解性和半衰期、抗原性和變應(yīng)原性、熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、存儲(chǔ)穩(wěn)定性、底物特異性和親和性、對非水溶劑的穩(wěn)定性、pH輪廓、離子強(qiáng)度依賴性、催化效率以及與其它預(yù)見的終產(chǎn)品的組分的相容性，其中，多肽變體將形成終產(chǎn)品的一部分。
對將用于去污劑的酶，調(diào)查的進(jìn)一步性質(zhì)是洗滌性能和與各種表面尤其是織物的相容性。
其它的許多標(biāo)準(zhǔn)可能論及。
一經(jīng)鑒定產(chǎn)生滿足選擇的標(biāo)準(zhǔn)的變體多肽的群體，便可利用本領(lǐng)域眾所周知的方法，分離編碼興趣多肽變體的DNA，并測序。
本發(fā)明還包含用于產(chǎn)生所需的多肽變體的方法，其中ⅰ)把如上表明的測定的DNA序列以一定方式引入合適的宿主中，因此，此序列可在所說的宿主中表達(dá)，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所說的宿主，并且(ⅲ)回收所說的多肽變體。
本發(fā)明可以任何細(xì)胞，尤其是以任何微生物細(xì)胞利用，但通常適合于利用原核生物，尤其是細(xì)菌，優(yōu)選地為芽孢桿菌屬的細(xì)菌等。
在芽孢桿菌中，優(yōu)選的是利用選自遲緩芽孢桿菌、地衣型芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等的菌株。
對于某些用途，優(yōu)選的是利用微生物細(xì)胞，該細(xì)胞是真菌，尤其是絲狀真菌，優(yōu)選地是曲霉屬、木霉屬等的細(xì)胞。
在曲霉屬中，優(yōu)選的是利用選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等的菌株。
在木霉屬中，優(yōu)選的是利用選自T.reseei等的菌株。
在其它的情況下，更有利的是利用選自BHK等細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明不應(yīng)該僅限于以上說明書中提及的特定例子或?qū)嵤┓桨富蛞韵聦?shí)施例。
材料和方法實(shí)施例實(shí)施例1利用的系統(tǒng)是大腸桿菌宿主細(xì)胞，該細(xì)胞由許多染色體突變來表征，這些突變是ⅰ)poIC基因的ts(溫敏)突變，其中所說的基因編碼DNA聚合酶Ⅲ，該酶是主要的復(fù)制聚合酶ⅱ)poIA基因的突變，其中所說的基因編碼DNA聚合酶Ⅰ，其中所說的突變3’-5’外切核酸酶活性的降低導(dǎo)致錯(cuò)誤率增加。
ⅲ)由于mutL突變的修復(fù)缺陷。
體內(nèi)誘變的靶是具有(ⅰ)讀框變換突變或(ⅱ)引入到tet基因中的終止密碼子的質(zhì)粒pBR322(colEl起點(diǎn))，編碼具有抗四環(huán)素抗性的蛋白質(zhì)。
每一種情況下，突變的修復(fù)導(dǎo)致一種顯性四環(huán)素抗性表型。
pBR322也含有編碼具有抗氨芐青霉素抗性的bla基因。平板培養(yǎng)暴露在“引入突變”的條件下的培養(yǎng)物后，靶區(qū)域的高頻誘變被看作是四環(huán)素抗性菌落的高頻出現(xiàn)。
把在37℃下生長至660nm處測得光密度為1的大腸桿菌培養(yǎng)物暴露于限制性溫度(例如42℃)下2、4或16小時(shí)。在所述的這些時(shí)間點(diǎn)，把培養(yǎng)物的稀釋系列鋪覆在以1)氨芐青霉素(AmpR菌落)，2)四環(huán)素和氨芐青霉素(AmpR和tetR菌落)補(bǔ)充的LB瓊脂平板上。
四環(huán)素抗性菌落與氨芐青霉素抗性菌落的比率表明在含有修復(fù)的tet基因的一個(gè)拷貝的培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目，其中所說的修復(fù)的tet基因表明一個(gè)特異性誘變事件。
這意指，如果克隆具有四環(huán)素抗性，至少已發(fā)生一種特異性突變，以修復(fù)最初引入的基因缺損。
說明書中引用的參考文獻(xiàn)Greg Winter，現(xiàn)代免疫學(xué)方法5:253-255,1993Griffiths,A.D.等，1994,EMBO雜志，14:3245-3260Clackson等，自然352:624-628,1991Bryan,P等，蛋白質(zhì)1:326-334,1986Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NYScopes,R.K.，蛋白質(zhì)純化(1987),Springer-Verlag Kim和Loeb(1995,PNAS 92:684-688)φrum,P等，核酸研究21:4491-4498,1993EP130.756(Genentech),EP214.435(Henkel),WO87/04461(Amgen),WO 87/05050(Genex),EP251.446(Genencor),EP260.105(Genencor),Thomas等(1985)自然318,375-376,Thomas等(1987)，分子生物學(xué)雜志，193:803-813,Russel等，(1987)，自然328:496-500,WO 88/08028(Genex),WO 88/08033(Amgen),WO89/06279(Novo Nordisk A/S),WO 91/00345(Novo Nordisk A/S),EP525610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.),US4,810,414,WO89/04361，美國專利no.4,950,417(Solvay enzymes),EP218 272,WO88/09367,US 5,389,536,EP130,064,WO 90/09446),EP238 023,WO 88/02775,WO 94/01541,WO 89/02916,Schimada等，(1989),生物化學(xué)雜志106,383-388,Yamaguchi等，(1991)，基因103,61-67,Hass等，(1991)，基因109,107-113,Kugimiya等，(1992)，生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物化學(xué)56,716-719,Dartois等，(1993)，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1131,253-260,JP 64/7744992,WO 91/16422,WO93/01285,WO 95/22615,DK專利申請no.768/93、265/94和264/94(Novo Nordisk A/S),DK專利申請no.990/94(Novo Nordisk A/S),Klein等，細(xì)菌學(xué)雜志，174,p.2599-2605,Motoki等，US 5,156,956；Andou等，US 5,252,469；Kaempfer等，普通微生物學(xué)雜志，137,1831-1892；Ochi等，國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，44,285-292；Andou等，US 5,252,469；Williams等，普通微生物學(xué)雜志，129,1743-1813,WO 94/01459(Novo Nordisk A/S),EP403.458(Kabigen AB),WO92/15691(Imperial Chem Ind.PLC),WO 92/22578(Boman等)，JP-60130599，美國專利no.5,348,865(Jin Ro有限公司)，美國專利no.5,354,681(Novo Industri A/S)。
酶促分析方法，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷。
AF 95/5 GB(可以向Novo NordiskA/S請求獲得)。
權(quán)利要求
1．一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生文庫的方法，其中，一種易錯(cuò)聚合酶用于各祖代細(xì)胞復(fù)制所有或部分遺傳元件，該遺傳元件包括ⅰ)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從此開始，ⅱ)可有可無的遺傳標(biāo)記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，ⅲ)編碼興趣多肽的基因，該基因不依賴于宿主染色體的復(fù)制機(jī)制。
2．一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生文庫的方法，該方法包括A)提供微生物細(xì)胞，該細(xì)胞具有ⅰ)易錯(cuò)聚合酶，該酶不依賴于所說的細(xì)胞的染色體復(fù)制機(jī)制，復(fù)制全部或部分遺傳元件，該遺傳元件包含a)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從此開始，b)可有可無的遺傳標(biāo)記，例如，賦予對抗生素的抗性的基因，c)編碼興趣多肽的基因，ⅱ)染色體的復(fù)制機(jī)制，此機(jī)制可以可逆地誘導(dǎo)為實(shí)質(zhì)上無功能，B)在利于這類細(xì)胞復(fù)制的條件下，培養(yǎng)這類細(xì)胞以獲得許多祖代細(xì)胞，C)在所說的祖代細(xì)胞中可逆地誘導(dǎo)所說的染色體復(fù)制機(jī)制以成為實(shí)質(zhì)上無功能的，達(dá)一段時(shí)間以使得足可通過所說的易錯(cuò)聚合酶復(fù)制所說的遺傳元件，以在所說的遺傳元件中產(chǎn)生突變，D)在這類突變細(xì)胞中可逆地誘導(dǎo)所說的染色體復(fù)制機(jī)制成為實(shí)質(zhì)上無功能的，E)在利于這類突變細(xì)胞復(fù)制的條件下，培養(yǎng)這類突變細(xì)胞。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的細(xì)胞還包含缺損修復(fù)系統(tǒng)。
4．權(quán)利要求1-3之任一的方法，其中所說的遺傳元件是質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。
5．權(quán)利要求1-4之任一的方法，其中所說的細(xì)胞是微生物細(xì)胞。
6．權(quán)利要求1-5之任一的方法，其中所說的易錯(cuò)聚合酶選自DNA polⅠ、DNA pol Ⅱ、逆轉(zhuǎn)錄酶，更具體地說選自大腸桿菌DNA polⅠ、枯草芽孢桿菌DNA polⅠ、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶。
7．權(quán)利要求1-6之任一的方法，其中所說的可以可逆誘導(dǎo)為實(shí)質(zhì)上無功能的染色體復(fù)制機(jī)制是溫敏大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ。
8．一種用于測定編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)用權(quán)利要求1-7之任一的方法產(chǎn)生突變體文庫，其中所說的遺傳元件包含編碼所說的興趣多肽的基因，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所說的文庫以產(chǎn)生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質(zhì)的所說的變體多肽，鑒定并分離產(chǎn)生所需變體的宿主，(ⅳ)對所說的宿主中所說的遺傳元件測序，以闡明編碼所需變體的突變基因的DNA序列。
9．一種用于產(chǎn)生編碼所需的興趣多肽的變體的DNA序列的方法，其中(ⅰ)用權(quán)利要求1-7之任一的方法產(chǎn)生突變體文庫，其中所說的遺傳元件包含編碼所說的興趣多肽的基因，(ⅱ)在利于所說的興趣基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所說的文庫以產(chǎn)生變體多肽，(ⅲ)篩選或選擇具有所需性質(zhì)的所說的變體多肽，鑒定并分離產(chǎn)生所需變體的宿主，(ⅳ)分離編碼所說變體的DNA。
10．一種產(chǎn)生所需多肽變體的方法，其中(ⅰ)把按照權(quán)利要求9獲得的或按照權(quán)利要求8測定的DNA序列以一定方式引入合適的宿主中，以便該DNA序列可在所說的宿主中表達(dá)，(ⅱ)在利于所說的DNA序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所說的宿主，(ⅲ)回收所說的多肽變體。
11．權(quán)利要求1-10之任一的方法，其中所說的興趣多肽是一種酶。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所說的酶是羰基水解酶、糖酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、植酸酶、連接酶、裂合酶及抗微生物多肽。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所說的羰基水解酶是蛋白酶或脂酶。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所說的糖酶是淀粉酶、葡糖苷酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、殼多糖酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、乳糖酶、殼質(zhì)酶、木糖異構(gòu)酶、果膠酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶、內(nèi)葡聚糖酶。
15．權(quán)利要求12的方法，其中所說的氧化還原酶是脫氫酶、氧化酶、還原酶、漆酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、脂氧合酶、超氧化物歧化酶。
16．權(quán)利要求12的方法，其中所說的轉(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移醛或殘基的轉(zhuǎn)移酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移烷基或芳基、其它甲基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移含氮基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶。
17．權(quán)利要求1-16之任一的方法，其中所說的細(xì)胞是原核生物，尤其是細(xì)菌，優(yōu)選的是芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、葡萄球菌屬及鏈球菌屬細(xì)菌。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所說的埃希氏桿菌屬是從大腸桿菌中選擇的菌株。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所說的芽孢桿菌是選自遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的菌株。
20．權(quán)利要求1-16之任一的方法，其中所說的細(xì)胞是真菌，尤其是酵母或絲狀真菌，優(yōu)選的是曲霉屬、木霉屬的真菌。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所說的曲霉屬選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉。
22．權(quán)利要求20的方法，其中所說的木霉屬選自T.reseei。
23．權(quán)利要求1-16之任一的方法，其中所說的細(xì)胞是選自BHK細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
本文描述了一種用于在包含許多突變的遺傳元件的細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生文庫的方法,其中,一種易錯(cuò)聚合酶用于各祖代細(xì)胞復(fù)制所有或部分不依賴于宿主染色體復(fù)制機(jī)制的遺傳元件。這些遺傳元件包括:i)復(fù)制起點(diǎn),從該起點(diǎn)開始復(fù)制,ii)可有可無的遺傳標(biāo)記,例如,賦予對抗生素的抗性的基因,iii)編碼興趣多肽的基因。本文也描述了用于產(chǎn)生編碼所需的興趣多肽變體的DNA序列以及測定這類DNA序列的方法。
文檔編號C12N15/10GK1210557SQ9719197
公開日1999年3月10日 申請日期1997年1月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月10日
發(fā)明者T·V·伯徹特, S·D·埃爾利克 申請人:諾沃挪第克公司