專利名稱：：細胞質(zhì)雄性不育甘藍植株和獲得這種植株的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種細胞質(zhì)雄性不育甘藍(Brassicaoleracea)植株，即這種植株的新親本系的開發(fā)。本發(fā)明還涉及獲得所說的雄性不育植株的方法，和從該新親本系獲得的雜交種子。芥屬(Brassica)作物作為糧食作物已經(jīng)栽培了幾個世紀，其種子內(nèi)含物是各種各樣糧食產(chǎn)品的基礎(植物油，芥子等)。從1970年起芥屬蔬菜作物一直作為雜交種子出售。這種種子產(chǎn)生雜交甘藍屬植株，它是兩個強近交親本系的雜交產(chǎn)物并結(jié)合了兩個親本系的遺傳特性。如果一個或兩個親本系(部分地)自花傳粉，必須采取措施防止自花傳粉以獲得純的雜交甘藍屬植株。一種抗自花傳粉方法是利用兩個親本系中之一的所謂的自交不親合性。以這種方法可以阻止可育花粉在特定植株的雌蕊中生長，包括產(chǎn)生花粉的甘藍屬植株的雌蕊本身。這種方法的一個缺點是在某些情況下自花傳粉還會發(fā)生。結(jié)果是產(chǎn)生的種子近交百分率很高。另外一個防止親本系中之一發(fā)生自花傳粉的方法是基于使用細胞質(zhì)雄性不育(CMS)。在小蘿卜(Raphanussativus)中發(fā)現(xiàn)一種可以誘導雄性不育的細胞質(zhì)，這種細胞質(zhì)還稱為OguraCMS細胞質(zhì)。通過原生質(zhì)體融合將OguraCMS細胞質(zhì)的線粒體導入甘藍植株，而細胞核來源于正?？捎母仕{植株，以這種途徑獲得CMS甘藍植株。通過融合除去OguraCMS細胞質(zhì)中的葉綠體，這些葉綠體包含負責具有這種細胞質(zhì)的植株的低溫敏感性的DNA。本發(fā)明的目的是獲得一種細胞質(zhì)雄性不育的甘藍植株，其中前面提到的現(xiàn)有技術方法的不利之處被克服了，并由此給出了OguraCMS細胞質(zhì)一種替換物，為了達到此目的，通過原生質(zhì)體融合，使此植株的細胞質(zhì)帶有包含起源于(至少部分如此)Brassicanapus植株、并與細胞質(zhì)雄性不育(的性質(zhì))相伴的，換言之，負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育的DNA的線粒體。進一步的研究令人吃驚地顯示，盡管B.napus植株是正常可育的，通過使用來源于B.napus植株的正常線粒體DNA，原生質(zhì)體融合可以在甘藍植株中有效地誘導細胞質(zhì)雄性不育。上面提到的原生質(zhì)體融合最好用來源于B.napus的葉片原生質(zhì)體(供體)和來源于甘藍植株的下胚軸原生質(zhì)體(受體)來實現(xiàn)。在一個本發(fā)明的較佳實施方案中，甘藍植株的細胞質(zhì)進一步帶有對該植株正常的種特異性核基因組。這使得它成為一個100％純的產(chǎn)品。在本發(fā)明的另一個實施方案中，細胞包括B.napus的種特異性線粒體。在本發(fā)明的一個進一步的實施方案中，通過體細胞雜交導入種特異性的線粒體。在細胞融合中，接收細胞質(zhì)的植物的核編碼遺傳成分保持不變(最好保持完整性)。因為可以一次獲得具有期望成分的細胞質(zhì)，所以不需要回交。在實踐中，顯而易見的是，原生質(zhì)體融合后獲得的甘藍植株經(jīng)常是四倍體或非整倍體。由此倍性水平可以增加到超過10倍C，C為單倍體基因組。非二倍體基因組的植株的特征在于其生長的不同以及雄性和雌性不育的發(fā)生。使用流式細胞計量術去除所有的通過融合獲得的甘藍植株群體中的非純二倍體植株。此融合過程后，將二倍體植株進行分子水平分析；通過此分析確定包含已知遺傳上與CMS緊密相關的線粒體DNA(或其片段)的植株。在本發(fā)明的一個進一步的實施方案中，甘藍植株是選自由下列組成的集合●花椰菜(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrytisL.)，●花莖甘藍(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.cymosaDuch.)，●Romanesco(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrytisL.)，●球芽甘藍(B.oleraceaL.convar.oleraceavar.gemniferaDC.)，●白甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●牛心甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●紅甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.rubraDC.)，●皺葉甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.sabaudaL.)，●蕪菁甘藍(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.gongyloides)，●卷葉羽衣甘藍(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.sabellicaL.)，●葡萄牙甘藍(B.oleraceavar.tronchudasyncostata)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植株的種子或植株的一部分。本發(fā)明進一步涉及一種甘藍植株的細胞，其細胞質(zhì)通過原生質(zhì)體融合而帶有包含至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)(的特性)相伴(即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育)的DNA的線粒體。雜交細胞包括作為細胞質(zhì)雄性不育(CMS)載體的線粒體DNA。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生一種甘藍植株的方法，包括通過原生質(zhì)體融合將包含至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)(的特性)相伴(即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育)的DNA的線粒體提供給其細胞質(zhì)的步驟。將B.napus植株(供體)和甘藍植株(受體)來源的種子消毒并在MS30培養(yǎng)基或類似的培養(yǎng)基上發(fā)芽；對供體來說此步驟在光下進行，通過剪下枝條并將其置于新鮮的生長培養(yǎng)基上而使植株生長。受體的種子在黑暗中發(fā)芽；從黃化的胚上取下胚軸以供使用。預質(zhì)壁分離處理后用細胞壁溶解酶如果膠酶和纖維素酶處理葉片和/或下胚軸材料以分離原生質(zhì)體；此步驟在一個質(zhì)壁分離溶液中進行。過濾并離心后，用γ射線照射供體的原生質(zhì)體。受體的原生質(zhì)體用IOA處理，然后將兩組原生質(zhì)體融合。融合過程中用PEG試劑加強凝集作用；融合過程中的高pH值是重要的。融合過程中，不能攪動原生質(zhì)體以避免影響融合進程。融合操作后洗掉PEG溶液并用再生培養(yǎng)基替換。原生質(zhì)體的再生在此培養(yǎng)基中進行，諸如蔗糖的糖類和諸如2，4-D，BA和NAA的激素等的存在具有決定性的重要作用。再生過程中通過相應地加入含較低濃度蔗糖的培養(yǎng)基逐步降低再生培養(yǎng)基的滲透壓。將長出的小愈傷組織轉(zhuǎn)移到固體再生培養(yǎng)基上。每兩星期將所說的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的再生培養(yǎng)基上。新長出的莖葉置于生根培養(yǎng)基上，其中通過諸如IAA的植物激素增強生根作用。通過取葉片樣品并用流式細胞計測定細胞核的相對DNA含量來檢測再生植株的倍性水平。保留包含純二倍體基因組的植株，其它植株棄掉。用分子技術的方法進一步分析保留的植株。使用從葉片樣品中分離的DNA和線粒體DNA特異性的探針，探查是否這些植株中存在所需的線粒體。將包括受體植株細胞質(zhì)的植株(被認為是漏網(wǎng)者)棄掉。在溫室和大田條件下通過交配繁殖保留的植株并研究其實用性。諸如不育，種子形成和植株質(zhì)量的問題受到特別關注。附圖簡述圖1為來自甘藍、作為可育供體的B.napus、具有ogura細胞質(zhì)的甘藍、具有anand細胞質(zhì)的油菜、具有polima細胞質(zhì)的B.napus和具有來自可育B.napus的線粒體的甘藍的細胞質(zhì)的偶聯(lián)熒光圖。用一個DNA探針進行雜交，此探針由從表現(xiàn)型為不育(CMS)植株中分離出來并經(jīng)EcoRI消化后克隆到大腸桿菌中的線粒體DNA片段組成。此條帶的特征為用EcoRI可以將其從大腸桿菌質(zhì)粒DNA上切下來并以特定的方式與甘藍來源的線粒體DNA雜交。圖中，泳道1為分子量標記物，由上至下依次為21226bp，7421bp，5804bp，5643bp，4878bp，3530bp(λDNA∷EcoRI；BoehringerMannheim)；泳道2為作為供體的可育的B.napus；泳道3為具有ogura的甘藍；泳道4為作為受體的甘藍，上端的條帶有時不存在，這取決于洗滌步驟的嚴格性；泳道5為融合產(chǎn)生的具有CMS的甘藍植株，其具有泳道2的供體的帶型；泳道6為融合產(chǎn)生的具有CMS的甘藍植株，其具有泳道2的供體和泳道4的受體的聯(lián)合帶型，因此，這種植株是不育的且還顯示具有CMS特性；泳道7為具有anand細胞質(zhì)的油菜(來自芥菜背景)；泳道8為具有polima細胞質(zhì)的B.napus；泳道9為具有ogura細胞質(zhì)的甘藍(＝泳道3)；泳道10為分子量標記物，由上至下依次為21226bp，7421bp，5804bp，5643bp，4878bp，3530bp(λDNA∷EcoRI；BoehringerMannheim)。用下面的實施例作參考，本發(fā)明將進一步被闡述，這些實施例都是本發(fā)明的較佳實施方案。實施例1種子的表面消毒將甘藍(B.oleracea)的種子包在濾紙中并浸入含70％乙醇/30％水的混合物中10秒鐘；然后浸入55℃無菌水5分鐘。接著用0.3％(w/v)NaOCl+Tween80處理20分鐘；此處理在層流箱內(nèi)進行。此處理結(jié)束后，將種子包用無菌水洗滌3次，分別為5，5和10分鐘。實施例2制備下胚軸原生質(zhì)體用的親本(起始)材料的播種最后一次洗滌步驟后，打開種子包并置于容器中的1/2MS15培養(yǎng)基上。將容器保持在25℃的黑暗條件中。約7天后，下胚軸即可用于原生質(zhì)體分離。實施例3制備葉片原生質(zhì)體用親本(起始)材料的播種按實施例2的方法播種消毒的種子。將容器置于25℃的光照條件下。14-18天后，植株葉片即可用于原生質(zhì)體分離；將植株的莖尖置于新鮮的BB上；將容器置于25℃的光照條件下。完全生長的葉片用于原生質(zhì)體分離。實施例4原生質(zhì)體分離將葉片和下胚軸材料切成小塊并置于含一薄層質(zhì)壁分離溶液(12ml)的玻璃培養(yǎng)皿(直徑11cm)或TC品質(zhì)的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中。所說的剪切后，加入另外12ml的質(zhì)壁分離溶液。將培養(yǎng)皿包在錫箔中并置于層流箱中至少一個小時。所說的一個小時后，用約24ml的新鮮酶溶液替換質(zhì)壁分離溶液。將培養(yǎng)皿在錫箔中25℃過夜保存；制備下胚軸原生質(zhì)體的酶混合物放在一個振蕩器上，而制備葉片原生質(zhì)體的酶混合物不能放在振蕩器上。將振蕩器設為30rpm，振幅15mm。溫育后將懸濁物用兩個尼龍過濾膜在Teflon濾膜架上過濾，濾膜孔徑相應為110μm和53μm。用1/3體積的CPW16(±8ml)重新沖洗濾膜。將懸濁物在110×g離心5分鐘。形成的含有原生質(zhì)體的小帶用無菌巴斯德吸管吸取并轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。小心加入9ml的W5后將原生質(zhì)體懸濁物在75×g離心5分鐘。將葉片原生質(zhì)體進一步用下述步驟處理倒掉每個離心管的上清并將沉淀物重新懸浮在1-2ml的W5中。合并不同離心管的內(nèi)含物，并加入W5至總體積為10ml。將含有原生質(zhì)體(供體)的離心管用Parafilm膜封閉，包裹在錫箔中并置于冰上直到用50kRad射線照射。下胚軸原生質(zhì)體用下述步驟處理倒掉每個離心管的上清并將沉淀物重新懸浮在1-2ml的W5+2mMIOA(4℃)中。合并不同離心管的內(nèi)含物并用W5+2mMIOA補加至總體積為10ml，接下來在4℃冰箱中保溫10分鐘。此處理后將懸濁物在75×g離心5分鐘(因此，在IOA中總的保溫時間是15分鐘)。將沉淀物重新懸浮在1-2ml的W5中并用W5補加至總體積為10ml，然后將其轉(zhuǎn)移到一個無菌的50ml燒瓶中。在原生質(zhì)體接受照射時，此燒瓶用錫箔包裹，在振蕩器上(約30rpm；振幅15mm)于25℃溫育。然后將燒瓶中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到一個離心管中。有葉片和下胚軸原生質(zhì)體的兩個離心管在75×g離心5分鐘，然后將沉淀物重新懸浮在1-3ml的W5中。原生質(zhì)體懸濁物的密度用血球計數(shù)板測定。實施例5原生質(zhì)體融合兩個懸浮原生質(zhì)體的原生質(zhì)體以9.105原生質(zhì)體/ml的密度混合以進行融合。用一個微升吸管將40μl的液滴轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。在一個直徑6cm的培養(yǎng)皿中加11滴40μl的液滴或在一個直徑9cm的培養(yǎng)皿中加25滴40μl的液滴。蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，然后關掉光線并關掉層流箱15分鐘以使原生質(zhì)體粘附在培養(yǎng)皿的底部。再打開層流箱并在每滴原生質(zhì)體中加入60μl的PEG溶液。3-5分鐘后在培養(yǎng)皿中加入下列數(shù)量的SVI4ml到一個直徑6cm培養(yǎng)皿9ml到一個直徑9cm培養(yǎng)皿3-5分鐘后吸去溶液并加入SVII4ml到一個直徑6cm培養(yǎng)皿9ml到一個直徑9cm培養(yǎng)皿3-5分鐘后吸去溶液并小心加入8p4ml到一個直徑6cm培養(yǎng)皿9ml到一個直徑9cm培養(yǎng)皿為了防止原生質(zhì)體過早地從培養(yǎng)皿的底部釋放出來，小心地加入8p培養(yǎng)基是重要的。3-5分鐘后吸去8p培養(yǎng)基并加入新的8p培養(yǎng)基?，F(xiàn)在原生質(zhì)體可以從培養(yǎng)皿的底部釋放下來4ml到一個直徑6cm培養(yǎng)皿9ml到一個直徑9cm培養(yǎng)皿用Parafilm膜封閉培養(yǎng)皿并在約500lux的光照下存放。實施例6再生在融合后的第8天，以至多為原始體積的三倍的數(shù)量在培養(yǎng)皿中加入8pA，即8ml到一個直徑6cm培養(yǎng)皿18ml到一個直徑9cm培養(yǎng)皿將培養(yǎng)皿置于光照下。在融合后的第15天，用一個無菌的刮鏟小心刮下在培養(yǎng)皿底部長出的小愈傷組織。用一個10ml吸管將培養(yǎng)皿中的內(nèi)含物分配到4個離心管中并在75×g離心5分鐘。同時在4個新的培養(yǎng)皿中加入6ml的K3PPS-V培養(yǎng)基。離心后棄掉上清并在沉淀物上加入6ml的K3PPS-V培養(yǎng)基。沉淀物由分散的細胞和小愈傷組織組成且可以容易地在K3PPS-V培養(yǎng)基中重新懸浮。用一個10ml吸管吸取培養(yǎng)基和沉淀物并加入培養(yǎng)皿中。從融合后的第21天開始，長出的小愈傷組織從K3PPS-V培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到K3PPS-R培養(yǎng)基中溫育。每兩星期將正在生長的(小)愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的K3PPS-R培養(yǎng)基中。一旦愈傷組織出現(xiàn)莖尖發(fā)育，就將其轉(zhuǎn)移到有K3PPS-R培養(yǎng)基的容器中。只要莖尖長到足夠大，就收獲并置于生根培養(yǎng)基(BB培養(yǎng)基)中。實施例7流式細胞計測量取待分析植株的±1cm2的葉片樣品并置于2ml的DAPI溶液中。用鋒利的剃刀刀片將此樣品切成小塊并通過一個15μm過濾器過濾。根據(jù)DeLaatetal.的方法用PartecCA-II細胞分析儀測定此樣品。通過比較融合植株和二倍體植株DNA的峰位置來測定植株的相對DNA含量。實施例8分子水平測定通過體細胞雜交獲得的具有細胞質(zhì)雄性不育的B.oleracea植株可以用一個DNA探針從具有不同細胞質(zhì)的甘藍植株(包括具有ogura，anand或polima細胞質(zhì)的不同甘藍種)中區(qū)分出來。此探針由從表現(xiàn)型為不育(CMS)植株中分離出來并經(jīng)EcoRI消化后克隆到大腸桿菌中的線粒體DNA片段組成。此條帶的特征為用EcoRI可以將其從大腸桿菌質(zhì)粒DNA上切下來并以特定的方式與甘藍來源的線粒體DNA雜交(參見圖示)。將200mg待分析植株的葉片材料收集在一個反應管中并用液氮冷凍。在這些管中加入750μl提取緩沖液并用一個Potterstick攪勻。將樣品在13000×g離心10分鐘，小心棄掉包括綠色材料的上清。在沉淀物中加入125μl提取緩沖液，重新懸浮后加入135μl裂解緩沖液和60μl月桂酰肌氨酸溶液。簡單混合后將混合物加熱到65℃20分鐘。加入375μl氯仿/異戊醇并搖動反應管至少40次。13000×g離心10分鐘，如有必要將上層轉(zhuǎn)移到一個新的反應管中并重復一次CHCl3/IAA步驟。最后，加入500μl異丙醇并搖動反應管幾次。13000×g離心5分鐘。將沉淀物重新懸浮于500μl的TE緩沖液中。用限制性內(nèi)切酶消化DNA按下列步驟進行RFLP分析需要約4μgDNA。限制酶反應的最終溶液由0.1體積的通用酶切緩沖液，如One-Phor-AllBufferPLUS(Pharmacia)，4μgDNA，4mM亞精胺和2單位的限制酶組成。37℃溫育至少3小時。通過從貯液中改變EDTA濃度到10mM來終止反應。通過加入0.1體積的3MNaAc和2.5體積-20℃的乙醇沉淀DNA。此混合物保持在-20℃2小時；10000×g離心10分鐘后，用預冷的70％乙醇/水洗滌沉淀物，干燥并溶解于TE緩沖液中。待分離DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳按下列步驟進行稱取2g瓊脂糖并在250ml的TAE緩沖液中煮沸。冷卻至微溫溫度時加入溴乙啶至終濃度為0.5mg/l。倒膠并冷卻至凝固。將樣品與上樣緩沖液混合并分離DNA片段。當前沿標記BFB到達距凝膠的末端約1cm時停止電泳。為了準備雜交，將凝膠按下述處理。0.25MHCl(1×)中5分鐘0.5MNaOH/1.5MNaCl(2×)中15分鐘1MNH4Ac/20mMNaOH(2×)中10分鐘將Hybond膜(Amersham)切成與凝膠同樣大小，在2×SSC中浸沒幾秒鐘然后在1MNH4Ac/20mMNaOH中浸濕。將3張Whatman3MM濾紙切成此大小。制作一個裝置使DNA通過液體轉(zhuǎn)運4小時從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)移在1MNH4Ac/20mMNaOH中進行。在膜干燥后，通過用UV照射1分鐘DNA即結(jié)合到膜的兩面上。所需的DNA探針按下列標記通過在95℃加熱10分鐘并迅速置于冰上冷卻來變性轉(zhuǎn)移的DNA。將下列物質(zhì)在一個反應管中混合10ng-3μgDNA2μl六核苷酸混合物2μldNTP’s(帶有地高辛配基-dUTP)1μlKlenow聚合酶混合后37℃溫育過夜。加入2μl的3MNaAc和44μl的乙醇(96％)沉淀DNA。將混合物置于-20℃30分鐘。10000×g離心15分鐘后，用溶于水的70％乙醇(v/v)洗滌沉淀，干燥的沉淀溶于50μl的TE。標記片段與膜的雜交將膜置于2×SSC幾秒鐘。然后將膜用20ml預雜交混合物封閉于一個雜交袋中。將膜在60-65℃溫育至少1小時。棄掉預雜交混合物，用4ml雜交混合物替換并溫育過夜。溫育后洗滌膜洗滌溶液1中4次2分鐘；洗滌溶液2中4次2分鐘，洗滌溶液3(60-65℃)中2次15分鐘。標記條帶的檢測在室溫下進行，雜交膜用漂洗緩沖液1沖洗，然后用每100cm2膜10ml漂洗緩沖液2封閉。在振蕩器上溫育30分鐘后，用每100cm2膜15mlanti-dig溶液替換漂洗緩沖液2。在振蕩器上溫育30分鐘后，在漂洗緩沖液2中洗滌膜2-3次10分鐘；漂洗緩沖液1中洗滌3-4次10分鐘，并在漂洗緩沖液3中洗滌1次。用每100cm2膜10ml的AMPPD溶液溫育膜20分鐘。將膜置于一個頂端有Polaroid膠片的盒中；曝光后，移走膠片并沖洗。實施例9具有來源于Brassicanapus的線粒體的一個細胞質(zhì)雄性不育甘藍的花表現(xiàn)型的描述花序花的主軸朝向頂端，有時縮短或扁化成一束，經(jīng)常分枝?；ò苌俪霈F(xiàn)，有時是翻轉(zhuǎn)的和卷曲的?；ū袝r縮短或扁化成一束?；ㄑ拷?jīng)常關閉，有時開放，萼片側(cè)面互不相連且是折疊的。膨脹表面光滑，頂端絕大多數(shù)是裹起來的，有時是出尖的。雌蕊經(jīng)常生長在頂端以外?；ㄝ嗥?-4mm寬，4-12mm長，直立，經(jīng)常有些翻轉(zhuǎn)，邊緣有時向內(nèi)彎曲，頂端向內(nèi)彎曲。存在蜜腺?；ò?個，有時多倍于此多至40個；4-7mm寬，11-19mm長。多于4時內(nèi)層花瓣經(jīng)常是更短一些。喙甲可能看上去扁化成一個管子?；ò逯饕皇窍蚧貜澢?jīng)常是強烈地向側(cè)面卷曲，有時是強烈地翻轉(zhuǎn)。顏色上側(cè)面白色或黃色RHS2A-3A-2C-3C-4A-5A-5B-6A，下側(cè)面白色或黃色RHS2A-2B-2C-3A-3C-4B-4C-4A，頂端的側(cè)面經(jīng)常平滑，有時是齒狀的。雄蕊6到2，且在此情況時有時扁化2個2次，長度至花瓣的一半，有時與花瓣等長?；ㄋ?，小且為三角形，無花粉。一個雌蕊，有時多至3個，其中一個長于其它的，主要是直立，沒有授粉時經(jīng)常生長至長度約為30mm。喙和雌蕊有時彎曲，有時輕微隆起。子房經(jīng)常翻轉(zhuǎn)和卷曲。在花束頂端的花有時幾乎沒有花瓣，萼片和雄蕊且子房強烈翻轉(zhuǎn)或卷曲，或看上去扁化2個2次；沿著扁化縫有開口，葉片以平行脈狀排列在苞片上。細胞融合所需的溶液</tables>細胞生物學所用的其它溶液酶溶液溶于K3PPS-I的1％(w/v)纖維素酶R-10溶于K3PPS-I的0.1％(w/v)果膠酶pH＝5.6PEG溶液PEG1500266.7mM葡萄糖300mMCaCl2.2H2O50mMpH＝7.0SVI50mlPEG溶液+100ml預質(zhì)壁分離溶液SVII20mlPEG溶液+100ml預質(zhì)壁分離溶液IOA(碘化乙酰胺)2mMIOA溶于W5；pH＝5.6溶于MilliQ純化水的1％瓊脂糖溶液。分子生物學用溶液提取緩沖液350M山梨醇100mMTris-堿5mMEDTA加新鮮的20mM硫酸氫鈉裂解緩沖液20mMTris-堿50mMEDTA2MNaCl2％(w/v)CTABN-月桂酰肌氨酸，Na鹽10％(w/v)氯仿/異戊醇24∶1(v∶v)異丙醇TE10mMTris-HCl；pH8.01mMEDTA4mM亞精胺EDTA貯液1M3MNaAc乙醇96％70％乙醇/水v/v溴乙錠溶液10mg/ml水TAE緩沖液4.84gTris堿/l1.14ml乙酸10mMEDTA；pH8.0上樣緩沖液24％Ficoll4000.1％SDS0.1％二甲苯藍0.1％溴酚藍0.25MHCl0.5MNaOH/1.5MNaCl1MNH4Ac/20mMNaOH2×SSC30mM二水檸檬酸鈉；pH7.2300mMNaCl0.2×SSC10×稀釋的2×SSC0.1×SSC20×稀釋的2×SSC六核苷酸混合物10×BoehringerMannheim的濃縮六核苷酸混合物dNTP0.1mMdATP0.1mMdCTP0.1mMdGTP0.1mMdTTP0.35mM地高辛配基-dUTP(Boehringer)封閉試劑BoehringerMannheim；貨號1175041預雜交混合物75mM檸檬酸鈉750mMNaCl0.5％封閉試劑0.1％N-月桂酰肌氨酸(w/v)0.2％SDS雜交混合物75mM檸檬酸鈉750mMNaCl0.5％封閉試劑0.1％N-月桂酰肌氨酸0.2％SDS40-50ng地高辛配基-dUTP標記的探針/ml洗滌溶液12×SSC+0.1％(w/v)SDS洗滌溶液20.2×SSC+0.1％(w/v)SDS洗滌溶液30.1×SSC+0.1％(w/v)SDS漂洗緩沖液1100mMTris-HClpH7.5150mMNaCl漂洗緩沖液2漂洗緩沖液10.5％封閉試劑(新鮮配制)漂洗緩沖液3漂洗緩沖液150mMMgCl2anti-dig-AP偶聯(lián)物BoehringerMannheim；貨號1175041AMPPD溶液每ml漂洗緩沖液3中10μlAMPPD(0.26μM)所用的縮寫2，4D2，4-二氯苯氧乙酸AMPPD3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧己烷-3，21-三環(huán)-[3.3.1.13.7]癸}-4-基)苯基磷酸二鈉AP酸性磷酸酶BA6-芐氨基嘌呤CMS細胞質(zhì)雄性不育DIG地高辛配基dATP脫氧腺苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dNTP脫氧核苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸DUTP脫氧尿苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸g重力加速度(9.8m.sec-2)IOA碘化乙酰胺kRad1000Rad，離子輻射的單位μg微克μl微升mM毫摩爾μM微摩爾M摩爾MSMurashige&amp;SkoogNAA萘乙酸PEG聚乙二醇pH酸度的度量單位rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)SSC檸檬酸鈉鹽水SDS十二烷基硫酸鈉TC組織培養(yǎng)UV紫外線v/v體積/體積w/v重量/體積對幾乎所有的處理來說都可以闡明應該保持在哪那個限定的pH值，濃度等范圍內(nèi)和實驗應該在那個水平上實施。下面給出了這些溶液/處理的三個水平組織培養(yǎng)用培養(yǎng)基1/2MS15，MS30enBB；諸如蔗糖的糖類；濃度0.5-600mM，正常為200-400mM。pH5-10；正常為5.5-6.0。培養(yǎng)溫度22-27℃，正常為25℃。射線照射0-60kRad；正常為50kRad。融合溫度20-25℃；通常為22℃。植物激素的濃度0-10μM；正常為0-3μM。權利要求1.甘藍植株，其細胞質(zhì)通過原生質(zhì)體融合而帶有包含至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的特性相伴即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育的DNA的線粒體。2.根據(jù)權利要求1的甘藍植株，其細胞帶有對此植株為正常的種特異性核基因組。3.根據(jù)權利要求1或2的甘藍植株，其細胞帶有對B.napus為正常的種特異性線粒體。4.根據(jù)權利要求3的甘藍植株，其中所說的種特異性線粒體通過體細胞雜交的方法導入。5.根據(jù)上述權利要求1-4的任何一個的甘藍植株，其中供體B.napus植株是正?？捎?。6.根據(jù)上述權利要求1-5的任何一項的甘藍植株，選自如下一組●花椰菜(B.oleraceaL.convar.botrytis(L.)Alef.var.botrvtisL.)，●花莖甘藍(B.oleraceaL.convar.botrvtis(L.)Alef.var.cymosaDuch.)，●Romanesco(B.oleraceaL.convar.botrvtis(L.)Alef.var.botrvtisL.)，●球芽甘藍(B.oleraceaL.convar.oleraceavar.gemniferaDC.)，●白甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●牛心甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.albaDC.)，●紅甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.rubraDC.)，●皺葉甘藍(B.oleraceaL.convar.capitata(L.)Alef.var.sabaudaL.)，●蕪菁甘藍(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.gongyloides)，●卷葉羽衣甘藍(B.oleraceaL.convar.acephala(DC.)Alef.var.sabellicaL.)，●葡萄牙甘藍(B.oleraceavar.tronchudasyncostata)。7.來源于上述權利要求1-6的任何一項的甘藍植株的種子或植株的一部分。8.甘藍植株的細胞，其細胞質(zhì)通過原生質(zhì)體融合而帶有包含至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的特性相伴即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育的DNA的線粒體。9.生產(chǎn)一種甘藍植株的方法，包括通過原生質(zhì)體融合將包含至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的特性相伴即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育的DNA的線粒體提供給其細胞質(zhì)的步驟。全文摘要甘藍植株,其細胞質(zhì)通過原生質(zhì)體融合而帶有包括至少部分起源于B.napus植株并與細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的特性相伴即負責甘藍植株中的細胞質(zhì)雄性不育的DNA的線粒體,且其細胞帶有對此植株為正常的種特異性核基因組。文檔編號C12N15/02GK1172579SQ9711241公開日1998年2月11日申請日期1997年5月29日優(yōu)先權日1996年5月31日發(fā)明者彼得·巴滕申請人:貝朱薩登公司