專利名稱：重組仙臺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組仙臺病毒及其制備方法。
仙臺病毒也被命名為日本血凝病毒(HVJ)，分類到I型副流感病毒中，屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的副粘病毒(Paramyxovirus)屬。
仙臺病毒顆是多形的，其具有包裝在直徑為150-200nm的被膜中的無作為翻譯模板功能的基因組RNA(下文稱為“負鏈RNA”)。在歷史上，仙臺病毒也曾被看作是一種工業(yè)用病毒，通過利用病毒細胞融合能力而被廣泛使用，特別是用于生產異核體和雜交細胞。并且曾研制細胞融合脂質體來作為用于基因治療的載體。此外，仙臺病毒也被用作各種干擾素的誘導物。
根據基于基因組核酸的核型的分類，仙臺病毒屬于RNA病毒中的負鏈RNA病毒的負的單鏈RNA病毒這一類。RNA病毒被分成三類，dsRNA病毒(雙鏈RNA病毒)、正鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒。dsRNA病毒類包括呼腸孤病毒、輪狀病毒、phytoreovirus等，且具有分節(jié)段的多個絲狀dsRNA基因組。正鏈RNA病毒包括脊髓灰質炎病毒、新培斯病毒、Semliki forest病毒以及日本乙型腦炎病毒，其具有作為基因組的單條正義RNA?；蚪MRNA可起到mRNA的作用，并且能夠產生RNA復制和依賴于宿主細胞的翻譯作用的顆粒形成所需的蛋白。換句話說，正鏈RNA病毒的基因組RNA本身能夠傳播。本說明書中，“傳播能力”是指“形成感染顆?；蚱湎喈?shù)膹秃象w并在核酸通過感染或人工技術轉移至宿主細胞并且在所述核酸在細胞內復制以后繼續(xù)將其傳播至其他細胞的能力。歸入正鏈RNA病毒的新培斯病毒和歸入負鏈RNA病毒的仙臺病毒均有感染性和傳播能力。另一方面，歸入細小病毒種的腺伴隨病毒具有感染性但無傳播能力(病毒顆粒形成需要腺病毒的混合感染)。而且，來自體外人工轉錄的新培斯病毒的正鏈RNA是傳播性的(在轉染到細胞中時形成感染病毒顆粒)。相反，體外人工轉錄的仙臺病毒RNA，不僅其負鏈而且其正鏈都不是傳播性的(在轉染到細胞中時形成不感染的病毒顆粒)。
近來，已將病毒載體用作基因治療的載體。為了將其用作基因治療的載體，必需建立起用于重建病毒顆粒的技術。(“病毒顆粒的重建”是指病毒基因組核酸的人工形成以及原或重組病毒在體外或胞內的產生)。這是因為，為了將外源基因轉移至病毒載體，應該從病毒基因組和通過基因操作整合的外源基因重建病毒顆粒。一經建立起病毒重建技術，就可以產生攜帶目的外源基因或用缺失的或滅活的目的基因的病毒。
并且，一經建立起病毒重建體系，而且病毒基因操作成為可能，所述體系就似乎成了用于從遺傳上分析病毒功能的有力工具。從醫(yī)學上的疾病等的預防和治療的觀點看來，病毒功能的遺傳分析是很重要的。例如，如果通過利用病毒代謝和宿主-細胞代謝之間的差異，闡明病毒核酸的復制機制，可以研制作用于病毒核酸復制過程且對宿主細胞損傷更小的殺病毒劑。通過闡明病毒基因編碼的蛋白的功能，也可以研制出針對與病毒感染力和顆粒形成有關的蛋白的抗病毒藥物。此外，通過修飾涉及膜融合的基因并制備具有高度的膜融合能力的脂質體，可以將其用作基因治療的載體。又及，正如由干擾素所表現(xiàn)的那樣，病毒感染可能誘導宿主基因激活來抗病毒，導致宿主的抗病毒性增加。病毒功能的遺傳分析可以就宿主基因的激活提供更多重要的信息。
具有作為基因組核酸的DNA的DNA病毒的重建已進行了一些時間，并且可以通過導入純化的基因組本身，如將猴病毒(SV 40)導入猴細胞中來進行[“實驗細胞研究雜志”(J.Exp.Cell Res.)，43，415-425(1983)]。由于基因組RNA也起著mRNA的作用，已通過正鏈RNA病毒進行含有RNA基因組的RNA病毒的重建。例如，在脊髓灰質炎病毒的情況下，1959年已證實純化基因組RNA本身的傳播能力[“實驗醫(yī)學雜志”(Journal of ExperimentalMedicine)，110，65-89(1959)]。后來，達到了通過利用宿主細胞的依賴于DNA的RNA聚合酶的活性將克隆的cDNA導入宿主細胞來重組Semlikiforest病毒(SFV)[“病毒學雜志”(Journal of Virology)，65，4107-4113(1991)]。
而且，利用這些病毒重建技術，已研制出基因治療的載體[“生物技術”(Bio/Technology)，11，916-920(1993)；“核酸研究”(Nucleic Acids Research)，23，1495-1501(1995)；“人類基因治療”(Human Gene Therapy)，6，1161-1167(1995)；“細胞生物學方法”(Methods in Cell Biology)，43，43-53(1994)；“細胞生物學方法”，43，55-78(1994)]。
但是，如以上所述，雖然仙臺病毒有很多成為工業(yè)用病毒的優(yōu)點，還未建立起重建體系，因為其是負鏈RNA。這是由于通過病毒的克隆cDNA重建病毒顆粒有相當大的難度。
如上所述，已清楚地說明僅僅導入負鏈RNA病毒(vRNA)的RNA或其互補RNA鏈(cRNA)至宿主細胞不支持負鏈RNA病毒的增殖。這與正鏈RNA病毒的情況完全不同。雖然在Tokkai H4-211377中公開了“用于制備相應于負鏈RNA病毒基因組的cDNA和感染的負鏈RNA病毒的方法”，后來發(fā)現(xiàn)描述于“歐洲分子生物學聯(lián)合會雜志”(EMBO.J.)9，379-384(1990)中的所述文件的全部實驗不能再現(xiàn)，因而作者本人不得不撤回所有的文章內容[見EMBO.J.，10，3558(1991)]。因此，顯然Tokkai H4-211377中所述的技術與本發(fā)明的有關領域不一致。已報導了用于流感病毒的負鏈RNA病毒重建體系[“微生物學年評”(Annu.Rev.Microbiolo.)，47，765-790(1993)；“當今遺傳學和發(fā)育學觀點”(Curr.Opin.Genet.Dev.)，2，77-81(1992)]。流感病毒是具有8個分節(jié)段基因組的負鏈RNA病毒。根據這些文獻，首先將外源基因插入到一個所述基因組節(jié)段的cDNA中，并且隨后把由含外源基因的所有8個節(jié)段的cDNA轉錄的RNA和來自病毒的NP蛋白裝配成核糖核蛋白(RNP)。然后，通過向宿主細胞提供RNP和依賴于RNA的RNA聚合酶來達到重建病毒。后來，又報導了屬于彈狀病毒科的狂犬病毒的負的單鏈RNA病毒的重建[“病毒學雜志”(J.Virol.)，68，713-719(1994)]。
因而，雖然從根本上說來公眾已知道重建負鏈病毒的技術，但就仙臺病毒的情況而言，直接應用這些技術不支持病毒的重建。而且，就彈狀病毒報導的病毒顆粒的重建僅僅是通過標記基因、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)等來證實的。此外，產物不能滿足實際運用。另外，為提供病毒在宿主細胞中重建所需的因子，一般將諸如野生型病毒、重組痘苗病毒等輔助病毒與待重建的病毒的核酸一起導入宿主細胞中。因此，從那些有害病毒分離重建的目的病毒的難度提出了一個難題。
本發(fā)明的目的是建立一個有效的重建仙臺病毒體系，使仙臺病毒能進行基因操作并提供足以用于基因治療等領域的仙臺病毒載體。
為運用到仙臺病毒的重建試驗，本發(fā)明人首次用源自仙臺病毒缺損干擾(DI)顆粒[參考EMBO.J.，10，3079-3085(1991)中的缺損干擾顆粒]的cDNA或仙臺病毒的小基因組進行了各種研究。結果，他們發(fā)現(xiàn)了有關待導入宿主細胞的物質，包括cDNA、涉及轉錄和復制的cDNA以及提供T7RNA聚合酶表達單位的重組痘苗病毒之間的重量比的有效條件。此外，本發(fā)明人獲得了正鏈和負鏈的全長cDNA，構建了誘導仙臺病毒的正或負鏈RNA的細胞內生物合成的質粒，并將所述質粒轉移到表達涉及轉錄和復制的cDNA的宿主細胞。結果，他們成功地從仙臺病毒顆粒的cDNA重建了仙臺病毒顆粒。本發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)，對于有效重建病毒顆粒，環(huán)形的導入宿主細胞的cDNA比鏈形的更為優(yōu)選，并且在高度成功地重建病毒顆粒的細胞內轉錄方面，正鏈RNA優(yōu)于負鏈RNA。
另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)即使不用重組痘苗病毒作為T7RNA聚合酶表達單元，也可能重建仙臺病毒。即，在體外轉錄的仙臺病毒的全長RNA被轉移至細胞中且編碼用于初轉錄和復制的酶的cDNA在T7啟動子的控制下轉錄時，重建病毒顆粒。這表明，如果建立起表達初轉錄和復制所需的所有酶的細胞，可以完全不用諸如痘苗病毒的輔助病毒來產生重組的仙臺病毒。由于已描述表達初轉錄和復制所需的所有酶的細胞[“病毒學雜志”(J.Virology)68，8413-8417(1994)]，本領域的那些熟練技術人員能夠參考所述文章制成這樣的細胞。所述參考中描述的細胞是染色體上攜帶仙臺病毒基因的三種基因如NP，P/C和L并表達由這三種基因NP，P/C和L編碼的蛋白的293細胞系的一種衍生型。
如果能夠從核酸有效重建病毒顆粒，顯然由多例病毒載體本領域中的那些熟練技術人員能夠容易地替換所需的基因、插入外源基因或滅活或缺失目的病毒基因。即，對于本領域的那些熟練技術人員來說，顯然通過本發(fā)明在重建仙臺病毒顆粒方面的首次成功已使仙臺病毒的基因操作成為可能。
即，本發(fā)明包括下列內容1.一種重組的仙臺病毒，其具有帶有插入的目的外源基因或缺失或滅活的目的基因的基因組，并保留了傳播能力。
2.描述1的重組仙臺病毒，其中，一個以上的編碼功能蛋白的基因被修飾。
3.描述1或2的重組仙臺病毒，其含有能在宿主細胞中表達的外源基因。
4.一種RNA分子，其含有描述1-3中任一項的重組仙臺病毒中所具的RNA。
5.一種RNA分子，其含有描述1-3中任一項的重組仙臺病毒中所具的RNA的cRNA。
6.一種試劑盒，其由以下兩種成分組成a.一種DNA分子，其含有可轉錄描述4或5的RNA的模板cDNA，以及b.一種可在體外或胞內以所述DNA作模板轉錄描述4或5的RNA的單元。
7.一種試劑盒，其由以下兩種成分組成a.一種宿主，其表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白(每種蛋白均可被具相當活性的蛋白替代)，以及b.描述4或5的一種RNA分子。
8.一種用于產生描述1-3的重組仙臺病毒的方法，其包括把描述4或5的RNA分子導入宿主細胞，該宿主細胞表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白(每種蛋白均可被具相當活性的蛋白替代)。
9.一種試劑盒，其由以下三種成分組成a.一種表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白的宿主，b.一種含能轉錄描述4或5的RNA或cRNA的模板cDNA的DNA分子，以及c.一種能夠在體外或胞內以所述DNA作為模板轉錄描述4或5的RNA的單元。
10.一種用于產生描述1-3的重組仙臺病毒的方法，包括以將含有能轉錄描述4或5的RNA的模板cDNA的DNA分子和一種能在體外或胞外以所述DNA為模板轉錄描述4或5的RNA的單元導入表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白的宿主。
11.一種用于制備外源蛋白的方法，其包括用描述3的重組仙臺病毒感染宿主并回收所表達的外源蛋白的步驟。
12.一種培養(yǎng)基或絨毛膜尿囊液，其含有表達的外源蛋白，而該外源蛋白可通過把描述3的重組仙臺病毒導入宿主并回收所述培養(yǎng)基或絨毛膜尿囊液而得到。
13.一種DNA分子，其實現(xiàn)由整合到仙臺病毒載體中的外源基因編碼的蛋白表達，該仙臺病毒載體含有以轉錄編碼所述蛋白的反義RNA的方向插入到啟動子下游的所述外源基因，以及所述的啟動子。
可以獲得本發(fā)明的重組仙臺病毒載體，例如，通過體外轉錄編碼基因技術產生的重組仙臺病毒載體基因組的重組cDNA，產生重組仙臺病毒基因組DNA，并將所述RNA導入宿主并同時表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白(每種蛋白均可以是具有相當活性的蛋白)。或者可通過將a)編碼基因技術產生的重組仙臺病毒載體基因組的重組cDNA，以及b)一種能在胞內以所述DNA作模板轉錄RNA的單位導入宿主同時表達仙臺病毒的NP、P/C和L蛋白(每種蛋白均可以是具相當活性的蛋白)而獲得本發(fā)明的重組仙臺病毒載體。在這一情況下，所述重組cDNA a)可以插入到特異啟動子的下游，并且所述轉錄單位b)可以是表達作用于所述特異啟動子的依賴于DNA的RNA聚合酶的DNA分子。
作為插入所需外源基因，或者缺失或滅活所需基因的本發(fā)明起始材料，仙臺病毒可以是一個歸類于I型副流感病毒的毒株，如仙臺病毒Z毒株或Fushimi毒株。此外，諸如DI顆粒、合成的寡核苷酸等的不完全病毒可以是使用的部分材料。
而且，只要本發(fā)明的重組仙臺病毒保留傳播能力，任何外源基因都可以插入到所述重組子所含RNA的任何位點，并且可以缺失或修飾任何基因組基因。待插入的外源基因可以以編碼能在宿主中表達的各種細胞因子和肽類激素的基因為例。為表達所需的蛋白，插入了編碼所述所需蛋白的外源基因。優(yōu)選在仙臺病毒的RNA中于序列R1(5′-AGGGTCAAAGT-3′)和R2(5′-GTAAGAAAAA-3′)之間插入一段6個數(shù)目擴增的堿基的序列。[“病毒學雜志”(Journal of Virology)，67卷，第8(1993)，4822-4830頁]。插入到載體的外源基因的表面水平可以由基因插入位點和所述外源基因的側翼堿基序列來調節(jié)。例如，在仙臺病毒RNA的情況下，已知隨著所述基因離NP基因的距離減小，插入基因的表達量增加。優(yōu)選的用于表達所需蛋白的宿主可以是任何易受重組仙臺病毒感染的細胞，例如哺乳動物細胞和雞卵?？赡芡ㄟ^用整合可表達外源基因的重組仙臺病毒感染這些宿主并回收表達的基因產物來有效地產生外源基因產物。例如，這樣表達的蛋白可在培養(yǎng)的細胞是宿主時從培養(yǎng)基以及雞卵是宿主時從絨毛膜尿囊液用標準方法回收。
當外源基因插入用于表達負鏈仙臺病毒RNA的質粒時，需要以用于轉錄編碼蛋白的所述外源基因的反義RNA的方向將所述外源基因插在啟動子的下游。通過本發(fā)明，已首次使可以獲得這樣的“用于表達由整合到仙臺病毒載體的外源基因編碼的蛋白的DNA分子，其中該仙臺病毒載體含有以用于轉錄編碼所述蛋白的所述外源基因的反義RNA的反義方向插入在啟動子下游的外源基因和所述啟動子”，這樣構成所述發(fā)明的一部分。
例如，為滅活免疫原性基因或增加RNA轉錄和復制的有效性，也可以修飾部分與仙臺病毒RNA復制有關的基因。具體地說，例如，可以修飾至少一個復制因子，NP、P/C和L蛋白以增強或減弱轉錄和復制能力。HN蛋白，一種結構蛋白，具有如血凝素和神經氨酸酶的雙重活性。例如，前者活性的減弱可能增加血流中的病毒穩(wěn)定性，且后者活性的修飾可使能夠調節(jié)病毒感染性。介導膜融合的F蛋白的修飾也可能用于改善通過將重建的仙臺病毒和包裹所需藥物或基因的人工脂質體融合構建的膜融合脂質體。
本發(fā)明已使得能在基因組RNA的任何位點導入點突變和插入，并且被寄厚望加速有關病毒功功能的遺傳信息的累積。例如，一旦闡明病毒RNA復制機制，研制一種對宿主細胞損害小并通過利用病毒和宿主細胞的核酸代謝的差異而針對核酸復制過程的殺病毒劑就可以成為可能。另外，對病毒基因編碼蛋白的功能的闡明可能有助于研制針對涉及感染力和病毒顆粒形成能力的殺病毒劑。具體說來，例如，這些技術可被用于分析可能起著細胞表面的抗原分子的作用的F和HN蛋白的抗原逞遞表位。在關于病毒抗性的宿主細胞基因被病毒感染激活導致病毒抗性增加時，有關宿主基因的這種激活機制的重要資料可以通過對病毒功能的遺傳分析來獲得。由于仙臺病毒在誘導干擾素方面是有效的，其被用于各種基礎研究。通過分析誘導干擾素所需的基因區(qū)域，可以產生非病毒干擾素誘導物。本發(fā)明的技術可用于疫苗的研究。通過將弱化突變的重組仙臺病毒接種到含胚雞卵可產生活的疫苗。這樣獲得的信息可以應用到極需活疫苗的諸如麻疹病毒和腮腺炎病毒的其他負鏈病毒。此外，本發(fā)明也使得可用重組仙臺病毒作為基因治療的載體。由于本發(fā)明的衍生于仙臺病毒的病毒載體在臨床應用和傳播中是高度安全的，并且預計是以相對低劑量就有治療效果的。另外，在治療結束或在治療期間需要抑制病毒載體復制時，通過給藥依賴于RNA的RNA聚合酶的抑制劑，可僅特異抑制病毒載體復制而不損害宿主。


圖1是對質粒pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的圖示。
圖2是對質粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA.的圖示。
圖3是對用SeVgp120感染的CV-1細胞后的時間和HAU以及gp120表達量之間的關系的圖示。
在下文中，將參考到實施例來具體描述本發(fā)明但本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1仙臺病毒轉錄單元pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的制備。
通過順序地將含T7RNA聚合酶啟動子、設計的以待轉錄成負鏈RNA的仙臺病毒cDNA和核酶基因的DNA分子插入到pUC18載體，構建質粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA。并通過將順序地含T7RNA聚合酶啟動子、設計待轉錄成正鏈RNA的仙臺病毒cDNA和核酶基因的DNA分子插入pUC 18載體構建質粒pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA。pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的構建分別示于圖1和2中。
實施例2由cDNA重建仙臺病毒的實驗將以常規(guī)方式用胰蛋白酶消化的LLC-MK2細胞(2×106)置于直徑60mm的塑料平皿中，并在MEM培養(yǎng)基(補充10％FBS的MEM培養(yǎng)基)(2ml)中于5％CO2環(huán)境中37℃溫度下溫育24小時。除去培養(yǎng)基并用PBS(1ml)洗滌后，以感染復數(shù)(moi)2將表達T7聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3的PBS(0.1ml)懸液加入到細胞。每15分鐘將平皿輕攪一次以充分分散病毒溶液，感染1個小時。除去病毒溶液并用PBS(1ml)洗滌后，將如下制備的含cDNA的培養(yǎng)基加到平皿上。
把表1和2中所示核酸(含表達復制仙臺病毒、pGEM-L、pGEM-P/C和pGEM-NP所需因子的質粒)置于1.5ml的樣品管中，并用HBS(Hepes緩沖鹽水；20mM pH7.4的含150mM NaCl的Hepes)。這些表中，(-)和(+)cDNA分別表示質粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC18/T7(+)HVJRz.DNA，/C和/L分別表示在用限制酶MLuI處理后將環(huán)形和線形cDNA導入細胞中。
另一方面，在一枚聚苯乙烯管中放置Hanks平衡鹽溶液(HBS，0.07ml)，N-[1-(2，3二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸二甲酯(DOTAP)(Boehringer Mannheim)(0.03ml)。向此管加入上述核酸溶液，并將混合物如此靜置10分鐘。然后，向此混合物加入上述細胞培養(yǎng)基(2ml，補充10％FBS的MEM)，然后加入痘苗病毒抑制劑、利福平和阿糖胞苷C(C/Ara/C)至終濃度分別為0.1mg/ml和0.04mg/ml，結果制成含上述cDNA的培養(yǎng)基。
于37℃下把上述平皿于5％CO2環(huán)境中溫育40小時。用橡皮刮棒收獲平皿中細胞，轉移到Eppendorf管中，以6,000rpm離心5分鐘沉降并于PBS(ml)中重懸。將等份如此或稀釋后的細胞懸液接種到10天齡的發(fā)育著的含胚雞卵。即，用PBS將細胞懸液稀釋至表1中所示的細胞數(shù)目，并于35℃下溫育用0.5ml等份接種的卵72小時，然后于4℃下過夜。用帶有針管的注射器從這些卵回收絨毛膜尿囊液得病毒。
如下分析所回收的病毒溶液的血凝素單位(HAU)和蝕斑形成單位(PFU)。
如下測定(HAU)。于400×g離心雞血10分鐘并棄去上清。將如此獲得的沉淀懸浮于100體積的PBS中并于400×g離心10分鐘以棄去上清。重復這一過程兩次以制備0.1％血細胞溶液。制備病毒溶液兩倍系列稀釋液，將0.05ml的每種待測稀釋液分別加到96-孔微孔板的每孔中。再將血細胞溶液(各0.05ml)加到每孔中，輕搖以確保充分混合，并置于4℃下40分鐘。引起用肉眼可觀察到的血凝的最高病毒稀釋度被作為HAU。
如下測PFU。將CV-1細胞生長至在6-孔培養(yǎng)板上成單層。棄去培養(yǎng)基后，37℃下將10倍系列稀釋的病毒溶液(各0.1ml)分加到培養(yǎng)板的每孔中以感染細胞1小時。在感染中，制備無血清的2×MEM和熔化的2％瓊脂(55℃)的混合物，并把胰蛋白酶加到混合物中至終濃度為0.0075mg/ml。感染1小時并除去病毒溶液后，將與瓊脂混合的培養(yǎng)基(各3ml)加到培養(yǎng)板的各孔中，并于37℃下于5％CO2的環(huán)境中溫育3天。向每孔加入酚紅(0.1％)(0.2ml)，于37℃下溫育3小時并隨后除去。計數(shù)未染色的空斑以估計病毒滴度PFU/ml。
表1示轉染至LLC-2細胞中的仙臺病毒模板cDNA，RNA復制所需cDNA因子、pGEM-L、pGEM-P/C、和pGEM-NP的量、溫育時間、接種到雞卵中的細胞數(shù)目，HAU和PFU值。
表1模板cDNA 總量pGEMpGEMpGEM 培養(yǎng)細胞數(shù)目HAU PFU(微克)-L -P/C-NP時間(微克) (微克) (微克) (小時)(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105512 2×109(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105256 9×108(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×106256 9×108(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×104＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106＜2 ＜10(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×104＜2 ＜10(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×10648×103通過超離心沉淀顯示HAU和PFU的樣品、重懸、以20％-60％的蔗糖密度離心純化并通過12.5％SDS-PAGE分級分離。這些樣品中的每種蛋白的大小與仙臺病毒的相同。
這些結果證實可通過將cDNA導入細胞重建仙臺病毒，與那些轉錄負鏈RNA的cDNA相比，通過導入轉錄正鏈RNA的cDNA，更有效地重建了病毒顆粒，并且通過導入環(huán)形而不是線形cDNA更進一步有效地重建了病毒顆粒。
實施例3仙臺病毒重建所需的RNA復制因子的測定進行實驗以檢測表達L，P/C和NP蛋白的三種質粒是否全部為仙臺病毒的重建所需。除將pGEM-1，pEGM-P/C和pGEM-NP質粒中兩種的任意組合或僅其中一種而不是實施列2中的所有這三種組合被與模板cDNA一起導入細胞之外，實驗方法與實施例2中所述的那些相似。
表2示導入LLC-MK2細胞的仙臺病毒模板cDNA，包括pGEM-L，pEGM-P/C和pGEM-NP在內的為RNA復制所必需的cDNA因子的量，培養(yǎng)時間，接種到雞卵中的細胞數(shù)目以及HAU和PFU值。
表2模板cDNA 總量 pGEM pEGM pGEM 培養(yǎng) 培養(yǎng)細胞 HAU PFU(微克) -L -P/C -NP 時間 的數(shù)目(小時)(+)cDNA/C 1042 440 1.00×105256 6×108(+)cDNA/C 1042 440 1.00×106512 4×109(+)cDNA/C 1002 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1042 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1042 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1000 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA1000 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 040 1.00×106＜2 ＜10如表2中所示，通過將這三種因子中的兩種的任意組合導入細胞未觀察到任何重建，證實這三種蛋白L，P/C和NP都為病毒重建所需要。
實施例4在體外由轉錄的RNA重建仙臺病毒的實驗既然實施例2中描述了由功能cDNA克隆重建仙臺病毒，那么進一步檢測所述cDNA的體外轉錄產物，即，vRNA和cRNA是否能支持同樣的重建。
在用限制酶MluI將仙臺病毒轉錄單元pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA線性化后，用這些DNA作模板，用純化的T7聚合酶制劑(EPICENTRE TECHNOLOGIESAmpliscribe T7轉錄試劑盒)于體外進行RNA合成。用于體外合成RNA的方法實際上是按照隨試劑盒提供的方法。用這樣獲得的RNA產物替代實施例2中的cDNA，進行相似的實驗，通過HA實驗評估病毒產物。結果示于表3。
表3模板cDNA 總量 pGEM pEGM pGEM 培養(yǎng) 培養(yǎng)細胞 HAUPFU(微克) -L-P/C -NP時間的數(shù)目(微克) (微克) (微克) (小時)體外 104 2 4 401.00×106512 2×109(-)RNA體外 104 2 4 401.00×106512 ND(-)RNA體外 104 2 4 401.00×10625×103(+)RNA體外 104 2 4 401.00×106＜2 ND(+)RNA這些結果表明能夠通過將負或正義鏈RNA導入細胞來重建病毒。
實施例5插入到仙臺病毒載體中的外源基因在宿主細胞中的表達1.插入外源基因(HIV-1 gp120)仙臺病毒載體“pSe Vgp 120”的制備用含引物a(5′-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3′)(序列1)和引物d(5′-TTGCGCCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTTATTACTACGGCGTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3′)(序列2)的一套引物，用標準的PCR技術于“pN1432”上擴增HIV-lgp120基因。PCR產物被進行TA克隆，用NotI消化，并且然后插入到“pSeV18+”的NotI位點。然后用重組質粒轉化E.coli細胞。以“小量制備法”由E.coli的每一克隆提取DNA，用DraIII消化，然后電泳。通過證實含由該插入所預計大小的DNA片段來選擇陽性克隆。在證實DNA片段具真正的核苷酸序列后，通過氯化銫密度梯度離心純化DNA。下文將插入有gp120基因的pSeV18+稱作“pSe Vgp120”。
2.含pSeVgp120(SeVgp120)的仙臺病毒的重建和對gp120表達的分析除開在pGEM-NP，pGEM-P/C和pGEM-L之外，還將pSeVgp120轉染到LLCMK2細胞中，除此之外完全如實施例2中所述由含胚雞卵回收絨毛尿囊液并分析病毒HAU。再如下通過ELISA檢測回收病毒的gp120表達把樣品(各100μl)分加到已用抗HIV-1的單克隆抗體包被過的96-孔板的每一孔中，并于37℃下培養(yǎng)60分鐘。用PBS洗滌后，向每孔加入HRP-連結的抗HIV-1抗體(各100μl)，并于37℃下培養(yǎng)60分鐘。用PBS洗滌后，向每孔加入四甲基聯(lián)苯胺，通過按照450nm處的光密度測定酸性條件下由HRP作用轉化的反應產物的量來估計gp120的表達量。結果示于表4的左欄中。
把這樣獲得的病毒溶液接種到CV-1細胞中并如下同樣檢測。把CV-1細胞以5×105細胞/板分散到培養(yǎng)板，生長，然后棄去培養(yǎng)基。用PBS(-)洗滌后，以感染復數(shù)10將病毒溶液加到細胞中，并于室溫下培養(yǎng)1小時。棄去病毒溶液后，用PBS(-)洗滌，向細胞加入普通的(plain)MEM培養(yǎng)基(補充了抗生素阿糖胞苷和利福平和胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)基)，并于37℃下培養(yǎng)48小時。反應后回收培養(yǎng)基，測HAU(以與實施例2中所述相同的方法)并測gp120的表達(通過ELISA)。結果示于表4的欄中。此外，再把CV-1細胞培養(yǎng)基的上清液接種到含胚的雞卵中，對這樣獲得的病毒溶液測HAU并檢測gp120表達(通過ELISA)。結果示于表4的右欄中。
表4(微克/毫升)絨毛膜尿囊液 CV-1培養(yǎng)基 絨毛膜尿囊液(F1)gp120(HAU) (F1)gp120(HAU) (F2)gp120(HAU)0.10(4) 3.46(128)0.15(32) 1.81(128) 1.56，1.21(512，512)0.05(32) 2.20(128)如表4中所示，檢測到培養(yǎng)中CV-1細胞中相當高濃度的gp120(表的中欄)，在再用病毒接種的含胚雞卵的絨毛尿囊液中也一樣(表的右欄中)。表的左欄和中欄中示三個克隆的平均值。
此外，以Western印跡分析gp120的表達。于20,000rpm離心以SeVgp120感染的CV-1細胞的培養(yǎng)基1小時來沉淀病毒后，于冰上用TCA(10％，v/v)或于-20℃下用70％乙醇處理上清液后，于15,000rpm離心15分鐘。于90℃下混合這樣沉淀的蛋白質以和“SDS-PAGE樣品緩沖液”(DaiichiChemicals)反應3分鐘，然后于10％SDS-PAGE上進行電泳。把這樣分離的蛋白轉移到PVDF膜(Daiichi Chemicals)上，于室溫下和單克隆抗體902反應1小時，然后用T-TBS洗滌。于室溫下把該膜和抗-mIgG(Amersham)反應1小時，并用T-TBS洗滌。然后于室溫下把該膜與HRP-連接的蛋白A(Amersham)反應1小時，用T-TBS洗滌，加入4-氯-1-萘酚(4CNPLus)(Daiichi Chemicals)以檢測gp120。結果，在與預計的gp120分子量相應的位置顯色蛋白質帶。
此外，分析了用SeVgp120轉染的CV-1細胞的感染后時間對HAU值和gp120表達量的效應。以感染復數(shù)10用SeVgp120感染分散到10-厘米板的CV-1細胞(5×106)，于感染后30，43，53和70小時時回收培養(yǎng)基(各1ml)，與等體積新鮮培養(yǎng)基混合，進行HAU實驗，gp120表達檢測(通過ELISA)和Westem印跡。結果示于圖4。如圖3中清楚地所示，gp120的產量趨向于隨仙臺病毒的HA滴度增加而增加。
實施例6對各種類型的細胞中SeVgp120增殖以及gp120表達水平的分析除用不同類型的細胞外，使用與實施例5中的那些相同的方法，測試HAU和gp120表達水平(通過ELISA)。結果示于表5。
表5細胞類型 時間(感染后) HAUrgp120(微克/毫升)CV-1 96 322.5LLCMK2 48 160.5CHO55 4 0.46NTH3T3 48 4 0.25MT424 160.8MOLT4/ 24 161.2該表的左欄示用SeVgp120感染的各種類型的細胞的感染后時間。結果，在所有被測試的類型的細胞中檢測到了SeVgp120增殖和gp120表達。
實施例7對宿主細胞中插入到仙臺病毒載體中的熒光素酶基因的表達的研究為分離插入到載體的熒光素酶基因，用一套引物[5′-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3′](30個堿基(mer))(序列3)和[5′-TGCGGCCGCGATGAACTITCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3′(69個堿基)(序列4)，以“pHvluciRT4”作模板，通過標準的PCR構建在兩個末端連接有工程NotI位點的熒光素酶基因。將PCR產物克隆到pSeV18+的NotI窗口以獲得插入了熒光素酶基因的仙臺病毒載體。然后，將重組載體轉染到LLCMK2細胞中，并接種到含胚雞卵中。切下發(fā)育的卵的絨毛尿囊膜，用冷PBS(-)洗滌兩次，并在加入裂解緩沖液(Picagene WAKO)(25μl)并充分混合后，于15,000rpm離心2分鐘。向上清液(各5μl)加入底物(IATRON)(50μl)，并將混合物分散到96-孔板的各孔中。用發(fā)光計(Luminous CT-9000D，DIA-IATRON)測熒光強度，酶活性表達為每秒的計數(shù)(CPS)。結果，在感染后24小時時，以CV-1細胞檢測到了相當高的熒光素酶活性(表6)。在這些實驗中，將不攜帶熒光素酶基因的仙臺病毒用作對照(表中以“SeV”表示)。由兩個克隆得到的結果示于該表中。
表6熒光強度(計數(shù)/10秒)絨毛膜尿囊膜CV-1(感染后24小時)Luc/SeV 66918728915608707815SeV69 4823 49工業(yè)上的可應用性通過本發(fā)明，已建成了一個用于從仙臺病毒cDNA有效重建病毒顆粒的系統(tǒng)，這使得對能仙臺病毒的基因操作以生產含帶有插入的目的外源基因或缺失或滅活的目的基因的基因組但保持傳播能力的重組仙臺病毒。
序列表序列1長度38個堿基對類型核酸鏈型單鏈拓樸結構線性分子類型其他核酸(合成的DNA)序列TG CGGCCGCC GTACGGTGGC AATGAGTGAA GGAGAAGT38序列2長度69個堿基類型核酸鏈型單鏈拓樸結構線性分子類型其他核酸(合成的DNA)序列TTGCGGCCGC GATGAACTTT CACCCTAAGT TTTTVTTACTACGGCGTACG TCATCTTTTT TCTCTCTGC69序列3長度30類型核酸鏈型單鏈拓樸結構線性分子類型其他核酸(合成的DNA)序列AAGCGGCCGC CAAAGTTCAC GATGGAAGAC 30序列4長度69類型核酸鏈型單鏈拓樸結構線性分子類型其他核酸(合成的DNA)序列TGCGGCCGCC ATGAACTTTC ACCCTAAGTT TTTCTTACTACGGATTATTA CAATTTGGAC TTTCCGCCC69
權利要求
1.一種重組仙臺病毒，其含有具插入的目的外源基因或缺失或滅活的目的基因的基因組，但保留了傳播能力。
2.權利要求1的重組仙臺病毒，其中一或一個以上編碼功能蛋白的基因被改變。
3.權利要求1或2的重組仙臺病毒，其含有一個能在宿主中表達的外源基因。
4.一種RNA分子，其含有權利要求1-3中任一項的重組仙臺病毒中所具有的RNA。
5.一種RNA分子，其含有權利要求1-3中任一項的重組仙臺病毒中所具有的RNA的cRNA。
6.一種試劑盒，其含有a.一種DNA分子，其含有能轉錄權利要求4或5的RNA的模板cDNA，以及b.一種能在體外或胞內以所述DNA作模板轉錄權利要求4或5的所述RNA的單元。
7.一種試劑盒，其含有a.一種表達仙臺病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主(每種蛋白均可被其相當活性的蛋白替代)，以及b.權利要求4或5的RNA分子。
8.一種用于生產權利要求1-3中任一項的重組仙臺病毒的方法，包括把權利要求4或5的RNA轉染到表達仙臺病毒的NP，P/C和L蛋白(每種蛋白均可被具相當活性的蛋白替代)的宿主中。
9.一種試劑盒，其由以下三種成分組成，a.一種表達仙臺病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主，b.一種DNA分子，其含有能轉錄權利要求4或5中任一項的RNA或cRNA的模板cDNA，以及c.一種能在體外或胞內以所述DNA為模板轉錄權利要求4或5的RNA的單元。
10.一種用于生產權利要求1-3中任一項的重組仙臺病毒的方法，其中所述方法包括把一種含能轉錄權利要求4或5的RNA的模板cDNA的DNA分子和一種能在體外或胞內以所述DNA作模板轉錄權利要求4或5中的RNA的單元導入一種表達仙臺病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主中。
11.一種用于生產一種外源蛋白的方法，其包括用權利要求3的重組仙臺病毒感染宿主并回收表達的外源蛋白的步驟。
12.一種培養(yǎng)基或絨毛尿囊液，其含有可通過將權利要求3的重組仙臺病毒轉染到宿主并回收所述培養(yǎng)基或絨毛尿囊液而獲得的表達的外源蛋白。
13.一種用于表達由整合到仙臺病毒載體的外源基因編碼的蛋白的DNA分子，該仙臺病毒載體含有以插入到啟動子下游的所述外源基因，插入是以用于轉錄編碼所述蛋白和所述啟動子的反義RNA的(反義)方向。
全文摘要
一種用于重建仙臺病毒顆粒的方法,其包括將仙臺病毒基因組導入其中所有早期復制基因已經表達的宿主中。該方法使能進行仙臺病毒的基因操作,并因而使得可能有效利用仙臺病毒作為載體。
文檔編號C12N5/10GK1207124SQ9619947
公開日1999年2月3日 申請日期1996年10月22日 優(yōu)先權日1995年11月1日
發(fā)明者永井美之, 加藤篤, 村井深, 坂田恒昭, 長谷川護, 鹽田達雄 申請人:株式會社載體研究所