專利名稱：Aur－1和/或aur-2相關(guān)疾病的診斷與治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被稱為AURORA1和AURORA2(AUR-1和AUR-2)的新的蛋白質(zhì)、編碼AUR-1和／或AUR-2的核苷酸序列、以及用于診斷和治療與AUR-1和／或AUR-2相關(guān)的疾病的各種產(chǎn)品和方法。
下文對(duì)本發(fā)明背景的描述是為了有助于理解本發(fā)明，并不是承認(rèn)它們?yōu)橐延屑夹g(shù)。
細(xì)胞的信號(hào)傳遞是一種基本的機(jī)制，通過該機(jī)制，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的外界刺激被傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。信號(hào)傳遞中重要的生物化學(xué)機(jī)制之一涉及蛋白質(zhì)的可逆磷酸化，它通過改變其結(jié)構(gòu)和功能來調(diào)節(jié)成熟的蛋白質(zhì)的活性。
真核細(xì)胞中被明確表征的蛋白質(zhì)激酶在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的醇部分使蛋白質(zhì)磷酸化。這些激酸大體上可分為兩類，一類特異于絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化，一類特異于酪氨酸的磷酸化。一些激酸，被稱為“雙重特異性激酶”，能夠?qū)野彼嵋材軌驅(qū)z氨酸／蘇氨酸殘基磷酸化。
蛋白質(zhì)激酶也可以其在細(xì)胞中的定位進(jìn)行表征。一些激酸為跨膜受體型蛋白質(zhì)，它們?cè)趹?yīng)答例如配體的結(jié)合的外界環(huán)境時(shí)直接改變其催化活性。其它為非受體型蛋白質(zhì)，它們?nèi)狈缒^(qū)域。它們可存在于從細(xì)胞膜的內(nèi)表面到細(xì)胞核的各種細(xì)胞空間中。
許多激酶參與了調(diào)節(jié)的梯級(jí)反應(yīng)，它們的底物可包括其它激酶，其活性由其磷酸化狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。最后，一些下游效應(yīng)子的活性通過磷酸化而被調(diào)節(jié)，導(dǎo)致這一反應(yīng)通道的激活。
絲氨酸／蘇氨酸激酶家族包括發(fā)現(xiàn)于各種信導(dǎo)梯級(jí)反應(yīng)所有步驟中的成員，包括參與了控制細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、分化和激素分泌、導(dǎo)致基因表達(dá)改變、肌肉收縮、葡萄糖代謝的轉(zhuǎn)錄子的磷酸化、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的控制、和細(xì)胞周期的控制的那些成員。
本發(fā)明涉及AUR-1和／或AUR-2多肽、編碼這些多肽的核苷酸、含有這種核苷酸的細(xì)胞，針對(duì)這些多肽的抗體，使用這種多肽的檢測(cè)方法，以及與上述各項(xiàng)相關(guān)的方法。本發(fā)明基于我們稱做AUR-1和／或AUR-2的新的蛋白質(zhì)的分離和表征。當(dāng)?shù)弥疚奶峁┑男蛄泻螅摱嚯暮秃塑账峥赏ㄟ^公知的和標(biāo)準(zhǔn)的合成方法來制備。AUR-1和／或AUR-2與具有短的N-末端鏈的絲氨酸／蘇氨酸激酶同類。其果蠅和酵母中的同系物好象參與了有絲分裂的調(diào)節(jié)。人類中的這一蛋白質(zhì)好象與癌癥和／或其它信號(hào)傳遞紊亂相關(guān)。AUR-1 RNA在來源于正常和腫瘤細(xì)胞的迅速分裂中被大量表達(dá)。但AUR-2 RNA的表達(dá)僅限于有限的細(xì)胞類型，在大多數(shù)正常組織中很低或沒有，僅在來自腫瘤細(xì)胞系的一個(gè)亞群中，特別是來自結(jié)腸直腸的那些細(xì)胞中，被大量表達(dá)。AUR-1和AUR-2兩者在胎兒肝臟、成人精巢、和胸腺中有中等程度的表達(dá)，提示這些蛋白質(zhì)在有絲分裂中具有正常作用。AUR-1和AUR-2好象均可調(diào)節(jié)細(xì)胞核分裂。阻斷其信導(dǎo)則產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。這一表型的產(chǎn)生可能是由于染色體錯(cuò)誤分離造成的，如從其酵母同系物IPL1所觀察到的那樣。由于多倍性是腫瘤細(xì)胞以及缺失p53腫瘤抑制物細(xì)胞中的標(biāo)志，我們正在測(cè)試AUR-1和AUR-2在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。
初步的人類基因序列分析表明，它們包含一個(gè)高度保守的C末端蛋白質(zhì)激酶區(qū)域和74至130個(gè)氨基酸的低度保守N-末端區(qū)域，該區(qū)域可能作為底物結(jié)合基序具有調(diào)節(jié)作用或功能。該人類基因在激酶區(qū)域的活化環(huán)中含有一個(gè)cAMP／PKA磷酸化位點(diǎn)R／KR／KXS／T，這提示存在一個(gè)類似于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的CDC2／CDK相關(guān)的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)途徑。
使用來自于AUR-1和／或AUR-2獨(dú)特的N-末段區(qū)段的探針進(jìn)行Southern分析的結(jié)果表明，它們以單拷貝基因存在于人類細(xì)胞中。但在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，我們可檢測(cè)到與AUR1探針輕度雜交的1．3kb和3．2kb的SacⅠ片段?？寺『托蛄蟹治龅慕Y(jié)果表明，該區(qū)段編碼一個(gè)無內(nèi)含子的AUR1相關(guān)的假基因(被稱作AUR3)，具有多重移框。而且，緊接在AUR3假基因的上游是一個(gè)復(fù)雜的反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)段，推測(cè)可形成非常穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)。AUR3DNA序列與起始于AUR-1 cDNA的第一個(gè)核苷酸的AUR1具有同源性。緊接在這一位點(diǎn)的上游是推測(cè)的AUR3的發(fā)夾環(huán)。我們目前正在測(cè)定AUR1基因組克隆，以確定這個(gè)與AUR3的同源性是否延伸至該核苷酸的上游，以及該AUR1 cDNA是否包括或在其前端存在一個(gè)類似的發(fā)夾環(huán)。
本發(fā)明的功用包括檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制物的能力以及開發(fā)治療癌癥的小分子藥物。
一方面，本發(fā)明的特征在于分離、富集成純化了的編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸。
“AUR-1和／或AUR-2多肽”意指基本上類似于SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示序列或其片段的氨基酸序列?；旧项愃频男蛄凶詈门cSEQ IDNO3或SEQ ID NO4具有至少90％的等同性(更佳為不少于95％，最佳為99-100％)。
“等同性”意指序列的一種性質(zhì)，用以度量序列間的相似性或關(guān)系。等同性是將相同殘基的數(shù)目除以殘基總數(shù)，再將所得結(jié)果乘以100來計(jì)算的。這樣，具有完全相同序列的兩個(gè)拷貝具有100％的等同性，但具有缺失、增加、或替換的具有較低保守性的序列卻可能具有較低程度的等同性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知可用以計(jì)算序列等同性的幾種計(jì)算機(jī)程序。
關(guān)于核酸的“分離”是指一種相互共價(jià)連接的6個(gè)(優(yōu)選21個(gè)，更優(yōu)選39個(gè)，最優(yōu)選75個(gè))或更多個(gè)核苷酸的聚合體，包括DNA或RNA被從其自然狀態(tài)下或合成后的狀態(tài)下分離出來。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用較長(zhǎng)的核酸，例如具有300，600，900或更多個(gè)核苷酸和／或與SEQID NO1或SEQ ID NO2所示的全長(zhǎng)序列具有至少50％、60％、75％、90％、95％或99％等同性的那些核酸。本發(fā)明的分離的核酸在自然界中不是以純凈的或分離的狀態(tài)存在，從這個(gè)意義上說它是獨(dú)特的。術(shù)語“分離的”表明一個(gè)自然存在的序列被從其正常的細(xì)胞(即染色體)環(huán)境中分離出來。因而，該序列可以存在于無細(xì)胞溶液中或被置于不同的細(xì)胞環(huán)境中。這一術(shù)語并不意味著該序列是唯一存在的核苷酸鏈，但意味著它基本上不含有自然狀態(tài)下與它相關(guān)的物質(zhì)(至少約90-95％的純度)，并因而意味著它不同于被分離的染色體。
有關(guān)核酸的術(shù)語“富集”意指特定的DNA或RNA序列在細(xì)胞中或溶液中比在正?；蚣膊〖?xì)胞中或比在該序列被提取的細(xì)胞中占有顯著較高的比例(2-5倍)。這可通過人們優(yōu)先減少其它DNA或RNA的存在量，或通過優(yōu)先增加該特定的DNA或RNA序列的存在量，或通過該兩個(gè)過程的結(jié)合來達(dá)到。但請(qǐng)注意，富集并不意味著沒有其它DNA或RNA序列存在，而只是所關(guān)心的序列的相對(duì)量顯著增大。這里所說的顯著是表明增長(zhǎng)的水平相對(duì)于做到這一增長(zhǎng)的人來說是有用的，并通常意味著相對(duì)于其它核酸來說這一增長(zhǎng)為約至少2倍，最好是至少5至10倍或更多。該術(shù)語也不意指不存在其它來源的DNA或RNA。其它來源的DNA可以，例如，包括酵母或細(xì)菌基因組的DNA，或者如pUC19的克隆載體。這一術(shù)語將自然發(fā)生的現(xiàn)象區(qū)別開來，這些自然發(fā)生的現(xiàn)象有例如病毒感染，或腫瘤型生長(zhǎng)，其中一種mRNA的水平相對(duì)于其它種類的mRNA可能會(huì)自然增加。即，這一術(shù)語僅指其中由于人為的干預(yù)發(fā)生了目的核酸的比例增高的情況。
對(duì)于某些目的來說，一種核苷酸序列為純化形式時(shí)是有利的。有關(guān)核酸的術(shù)語“純化的”并不需要絕對(duì)的純凈(例如同源制備)；只是表示該序列比自然環(huán)境中相對(duì)較純(與自然水平相比，這一水平應(yīng)至少高出2-5倍，如以mg／ml計(jì))。從cDNA文庫分離出的單個(gè)克隆可以被純化至電泳時(shí)的單一物質(zhì)。從這些克隆中得到的要求保護(hù)的DNA分子可直接從總DNA或總RNA獲得。該cDNA克隆不是自然存在的，但卻相反最好通過部分純化的天然存在的物質(zhì)(mRNA)的遺傳學(xué)操作來獲得。從mRNA構(gòu)建cDNA文庫涉及創(chuàng)建一種合成的物質(zhì)(cDNA)，并且純化的單個(gè)cDNA克隆可通過對(duì)攜帶該cDNA文庫的克隆篩選從該合成文庫中分離出來。因而，包括從mRNA的cRNA文庫構(gòu)建和單個(gè)的cRNA克隆分離的過程導(dǎo)致了該天然信息物質(zhì)的約106倍的純化。這樣，預(yù)想有至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的純化，最好4或5個(gè)數(shù)量級(jí)的純化。
“一種AUR-1和／或AUR-2多肽”是指SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的全長(zhǎng)氨基酸序列中的25個(gè)(優(yōu)選30個(gè)，更優(yōu)選35個(gè)，最優(yōu)選40個(gè))或更多個(gè)相鄰接的氨基酸，或本文所述的它們的功能衍生物。在某些方面優(yōu)選100、200、300或更多個(gè)氨基酸的多肽。該AUR-1和／或AUR-2多肽可由全長(zhǎng)核酸序列或全長(zhǎng)核酸序列的任一部分編碼，只要能夠保留該肽的功能活性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的核酸包含一種核酸序列、基本上由該核酸序列組成或由該核酸序列組成，該核酸序列為SEQ ID NO3或SEQID NO4全長(zhǎng)的氨基酸序列所示的核酸序列，其功能衍生物，或編碼它們中25、30、35、40、50、100、200或300個(gè)相鄰接的氨基酸的核酸序列；該AUR-1和／或AUR-2多肽包含下述物質(zhì)，基本上由下述物質(zhì)組成，或由下述物質(zhì)組成，該物質(zhì)為AUR-1和／或AUR-2多肽的至少25、30、35或40個(gè)相鄰接的氨基酸。該核酸可通過cDNA克隆或減去雜交(substractivehybridization)從天然原料中被分離出來；該天然原料可以是哺乳動(dòng)物(人類)血液，精液，或組織，并且該核酸可通過三酯方法(triestermethod)或通過使用自動(dòng)化DNA合成儀被合成出來。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是一個(gè)保守的或獨(dú)特的區(qū)段，例如，用來設(shè)計(jì)雜交引物以便于另外的多肽的鑒別和克隆的那些區(qū)段，用來設(shè)計(jì)PCR引物以便于另外的多肽的克隆，并獲得針對(duì)該多肽區(qū)段抗體的那些區(qū)段。本發(fā)明的氨基酸序列的例子包括下列氨基酸序列(編碼它們的分離的、純化的或富集的核酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi))ENSYPWPYGRQ(SEQ ID NO5)CISGP(SEQ ID NO6)QFPO(SEQ ID NO7)VNSGQ(SEQ ID NO8)RKEPVTPSA-LV(SEQ ID NO9)LMSRSNVQPTAAP(SEQ ID NO10)VQNQKQKQLQATSVPH(SEQ ID NO11)PVSRPLNNTQK(SEQ ID NO12)VMENSSGTPD(SEQ ID NO13)ILTRHFTID(SEQ ID NO14)SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK(SEQ ID NO15)“保守的核酸區(qū)段”是指存在于兩個(gè)或更多個(gè)編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸上的區(qū)段，在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，一個(gè)特定的核酸序列可與之雜交。適用于篩選編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸的適度嚴(yán)謹(jǐn)條件的例子請(qǐng)參閱Abe，et al．，J．Biol，Chem．，1913361(1992)(全文引入本文，包括附圖
)。優(yōu)選保守區(qū)段之間20個(gè)核苷酸中不同的核苷酸不超過5個(gè)。
“獨(dú)特的核酸區(qū)段”是指存在于編碼AUR-1和／或AUR-2多肽而不存在于編碼任一種天然存在的多肽的序列。這一區(qū)段在編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的全長(zhǎng)核酸中最好包括30個(gè)或45個(gè)相鄰接的核苷酸。尤其是獨(dú)特的核苷酸區(qū)段最好來源于浦乳動(dòng)物。
本發(fā)明的特征也在于檢測(cè)一個(gè)樣品中AUR-1和／或AUR-2多肽或編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸的核酸探針。該核酸探針含有與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物雜交的核酸。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸探針與編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示全長(zhǎng)序列或其功能衍生物中至少12，75，90，105，120，150，200，250，300或350相鄰接的氨基酸的核酸雜交。根據(jù)所需的特異性和選擇性，可以使用各種低度的或高度的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，只有高度互補(bǔ)的核酸序列雜交。優(yōu)選這種條件阻止在20個(gè)相鄰接的核苷酸中具有1或2個(gè)錯(cuò)配的核酸的雜交。
使用該探針的方法包括在一個(gè)樣品中檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2 RNA的存在和存在量，這是通過在發(fā)生雜交的條件下將核酸探針與該樣品接觸并檢測(cè)結(jié)合到AUR-1和／或AUR-2上的探針的存在或存在量來進(jìn)行的。在探針和編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸序列之間形成的核酸雙螺旋可被用來鑒別被檢測(cè)的核酸序列(例如參見，Nelson et al．，非放射性DNA探針技術(shù)，第275頁，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，San Diego(Kricka，ed．，1992)全部引入本文作為參考，包括附圖)?？梢詷?gòu)建進(jìn)行這一方法的試劑盒，該試劑盒包括一個(gè)容器，其中裝有一種核酸探針。
本發(fā)明的特征也在于重組核酸，優(yōu)選該核酸存在于細(xì)胞或機(jī)體中。該重組核酸可含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物以及能夠在宿主細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的載體或啟動(dòng)子。該重組核酸或者可含有在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)段，一個(gè)與編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的RNA序列互補(bǔ)的序列和一個(gè)在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)段。
另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的、富集的、或純化的AUR-1和／或AUR-2多肽。
有關(guān)多肽的“分離的”是指一種2個(gè)(優(yōu)選7個(gè)，更優(yōu)選13個(gè)，最優(yōu)選25個(gè))或更多個(gè)相互鄰接的氨基酸的聚合體，包括從天然原料分離出來的或合成的多肽。在某些方面，優(yōu)選較長(zhǎng)的多肽，如SEQ ID NO3或SEQ IND NO4所示的具有402，407，413，或425個(gè)相鄰接的氨基酸的那些多肽。本發(fā)明的分離的多肽從它們不以純化的或分離的形態(tài)存在于自然界中這個(gè)意義上來說，它們是獨(dú)特的。術(shù)語“分離的”表明一種天然存在的序列已被從其正常的細(xì)胞環(huán)境中分離出來。因而，該序列可以是存在于一個(gè)無細(xì)胞溶液中或被置于一個(gè)不同的細(xì)胞環(huán)境中。該術(shù)語并不代表該序列是唯一存在的氨基酸鏈，但它基本上不含有自然狀態(tài)下與其相聯(lián)的非氨基酸物質(zhì)(至少約90-95％的純度)。
有關(guān)多肽的術(shù)語“富集的”是指特定的氨基酸序列在細(xì)胞或感興趣的溶液中的總氨基酸中存在的量與正常或疾病細(xì)胞或該序列被提取的細(xì)胞中的總氨基酸中存在的量相比較構(gòu)成了一個(gè)顯著高的級(jí)分(2-5倍)。這可通過人們優(yōu)先減少其它氨基酸的存在量或通過優(yōu)先增加該感興趣的特定氨基酸序列的存在量或通過二者的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。但應(yīng)當(dāng)指出，富集并不意味著不存在其它的氨基酸序列，只是感興趣的序列的相對(duì)量已經(jīng)顯著增加。這里的術(shù)語顯著的是用以表明對(duì)于實(shí)現(xiàn)這一增加的人來說該增長(zhǎng)的水平是有用的，并且通常情況下意味著相對(duì)于其它氨基酸增加了約至少2倍，最好增加至少5至10倍甚至更多。該術(shù)語也不意味著不存在其它來源的氨基酸。其它來源的氨基酸可以包括，例如，由酵母或細(xì)菌基因組，或如pUC19那樣的克隆載體編碼的氨基酸。該術(shù)語僅適用于通過為干預(yù)提高所需的核酸組分增長(zhǎng)的情況。
對(duì)于某些目的來說，氨基酸序列以純化形式存在是有利的。有關(guān)多肽的“純化的”并不需要絕對(duì)的純凈(例如同源制備)，而是說它只是表示該序列比自然環(huán)境中的相對(duì)較為純凈(與自然狀態(tài)下的水平相比較，這一水平應(yīng)至少高2-5倍，如以mg／ml計(jì))。預(yù)想至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的純化，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選四個(gè)或五個(gè)數(shù)量級(jí)的純化。該物質(zhì)最好沒有在功能顯著水平上的污染，例如純度為90％，95％，或99％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，AUR-1和／或AUR-2多肽含有至少25，30，35，40，50，100，150，200，250，300，或350個(gè)SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示的全長(zhǎng)序列中相鄰接的氨基酸或其功能衍生物。
又一方面，本發(fā)明的特征在于對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有特異的結(jié)合親和性的抗體(如，單克隆或多克隆抗體)。該抗體含有一種可特異地與AUR-1和／或AUR-2多肽特異地結(jié)合的氨基酸序列?！疤禺惖慕Y(jié)合親和性”是指在特定條件下該抗體與AUR-1和／或AUR-2多肽的結(jié)合比它與其它多肽的結(jié)合具有更大的親和性。
對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有特異的結(jié)合親和性的抗體可用于檢測(cè)樣品中AUR-1和／或AUR-2多肽的存在和／或存在量的方法中，這是通過在免疫復(fù)合體形成的條件下將樣品與該抗體接觸并檢測(cè)與AUR-1和／或AUR-2多肽偶聯(lián)的抗體的存在和／或存在量來進(jìn)行的?？蓸?gòu)建實(shí)現(xiàn)這一方法的診斷試劑盒，它包括一個(gè)含有該抗體的第一容器和一個(gè)第二容器，該第二容器具有一個(gè)該抗體的結(jié)合對(duì)應(yīng)物和一個(gè)標(biāo)記物的偶聯(lián)體。
另一方面，本發(fā)明的特征在于一種雜交瘤，該雜交瘤產(chǎn)生一種與AUR-1和／或AUR-2具有特異結(jié)合親和性的抗體?！半s交瘤”是指一種能夠分泌抗體，如AUR-1和／或AUR-2抗體的永生細(xì)胞系。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該AUR-1和／或AUR-2抗體包含一種能夠特異地結(jié)合AUR-1和／或AUR-2多肽的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明描述了一種多肽，它包含一種重組的AUR-1和／或AUR-2多肽或其獨(dú)特的片段?！蔼?dú)特的片段”是指一種存在于全長(zhǎng)AUR-1和／或AUR-2多肽中而不存在于任何其它的來自天然原料的多肽中的氨基酸序列。優(yōu)選這樣一種序列包含存在于該全長(zhǎng)序列中的6個(gè)相鄰接的氨基酸。更優(yōu)選這樣一種序列包含存在于該全長(zhǎng)序列中的12個(gè)相鄰接的氨基酸。更進(jìn)一步優(yōu)選這樣一種序列包含存在于該全長(zhǎng)序列中的18個(gè)相鄰接的氨基酸。
“重組AUR-1和／或AUR-2多肽”是指一種包括通過重組DNA技術(shù)生長(zhǎng)的多肽，使它在其定位(如與自然狀態(tài)相比，它存在于不同的細(xì)胞或組織中)，純度或結(jié)構(gòu)上明顯不同于天然存在的多肽。通常，這樣一種重組多肽將以不同于正常情況下在自然界中觀察到的量存在于細(xì)胞中。
另一方面，本發(fā)明描述了一種重組細(xì)胞或組織，它含有一種編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的純化的核酸。在這種細(xì)胞中，該核酸可以是在其基因組調(diào)節(jié)元件的控制之下，或可以是在包括一個(gè)外源啟動(dòng)子的外源調(diào)節(jié)元件的控制之下?！巴庠础笔侵敢环N啟動(dòng)子在正常情況下在體內(nèi)不與AUR-1和／或AUR-2多肽的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。
另一方面，本發(fā)明描述了一種AUR-1和／或AUR-2多肽結(jié)合劑，它能夠與AUR-1和／或AUR-2多肽結(jié)合。該結(jié)合劑優(yōu)選為一種純化的抗體，它識(shí)別存在于AUR-1和／或AUR-2多肽上的抗原決定部位。其它的結(jié)合劑包括與AUR-1和／或AUR-2多肽結(jié)合的分子和與AUR-1和／或AUR-2結(jié)合的類分子。這種結(jié)合劑可通過使用檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2結(jié)合對(duì)應(yīng)物活性的檢測(cè)方法來識(shí)別，如測(cè)定PDGFR活性的那些檢測(cè)方法。
有關(guān)抗體的“純化的”是指該抗體不同于自然存在的抗體，如以純化的形式存在。更可取的是該抗體是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以同源制劑提供的。針對(duì)該克隆的多肽的抗體的應(yīng)用包括那些作為治療，或作為診斷工具的應(yīng)用。
本發(fā)明描述了一種用于篩選含有AUR-1和／或AUR-2多肽或等同序列的人類細(xì)胞的方法。該方法涉及使用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的和標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)在人類細(xì)胞中識(shí)別新的多肽，例如本文描述的用于鑒別AUR-1和／或AUR-2的那些技術(shù)(例如，無性繁殖，Southern或Northern印跡分析，PCR原位雜交，PCR擴(kuò)增等)。
本發(fā)明也描述了在人類細(xì)胞中篩選AUR-1和／或AUR-2多肽的結(jié)合對(duì)應(yīng)物和在其它機(jī)體中篩選AUR-1和／或AUR-2或相應(yīng)的結(jié)合對(duì)應(yīng)物的方法。本發(fā)明也描述了通過上述方法識(shí)別的這種多肽的純化的，分離的或富集的形式。
另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒別能夠干擾AUR-1和／或AUR-2與AUR-1和／或AUR-2結(jié)合物之間相互作用的制劑的檢測(cè)方法。這種檢測(cè)方法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行，并在本文中進(jìn)行了詳細(xì)描述，或可通過改變已有的檢測(cè)方法來進(jìn)行，例如NO．08／487，088，申請(qǐng)日1995年6月7日中描述的生長(zhǎng)檢測(cè)法，(引入本文作為參考，包括其中的附圖)，或NO．60／005，167，申請(qǐng)日1995年10月13日描述的檢測(cè)方法(引入本文作為參考，包括其中的附圖)。另一種可被修改以使用本發(fā)明的基因的檢測(cè)方法描述于國際申請(qǐng)NO．WO94／23039，公開于1994年10月13日。其它的可能性包括在自磷酸化檢測(cè)中檢測(cè)激酶的活性或?qū)?biāo)準(zhǔn)底物如組蛋白、髓鞘質(zhì)堿性蛋白、伽馬微管蛋白、或中心體蛋白質(zhì)的檢測(cè)激酶活性。結(jié)合對(duì)應(yīng)物可通過將蛋白質(zhì)的N-末端置于雙-雜種篩選中或檢測(cè)雙重特異性激酶的磷酸酪氨酸來進(jìn)行識(shí)別。Fields和Song的美國專利NO．5283173，1994年2月1日頒發(fā)，引入本文作為參考。
對(duì)Aurora活性的抑制物進(jìn)行限定的一種方法是使用一種溫度敏感型酵母突變體的篩選系統(tǒng)，如Chan和Botstein(遺傳學(xué))135677-691，1993)所述；也請(qǐng)參見Francisco et al．，分子細(xì)胞生物學(xué)。14(7)4731-4740，1994)，其全文引入本文作為參考，包括其中的附圖。簡(jiǎn)言之，酵母品系CCY72-3D-1(ipl 1-2)，它編碼一種溫度敏感型的Aurora(ipl1)的酵母同系物，雖然在26℃可以存活，但在37℃時(shí)不能生長(zhǎng)。將該品系用一種含有一個(gè)雜種Aurora基因的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該雜種Aurora基因是由ipl1的N-末端部分，它含有推測(cè)的底物相互作用區(qū)域，和Aurora1或2的C-末端部分，它含有催化區(qū)域，所組成。這一轉(zhuǎn)染克服了這種生長(zhǎng)溫度的敏感性。然后將該Aurora表達(dá)酵母品系在37℃和在檢測(cè)物質(zhì)存在的情況下生長(zhǎng)。在抑制Aurora催化功能的物質(zhì)存在下顯然不會(huì)生長(zhǎng)。潛在的抑制物包括小分子量的化學(xué)品和／或從各種有機(jī)體，如真菌、海洋生物、植物等分離的天然產(chǎn)物。
上述對(duì)本發(fā)明的概述不是限制性的，本發(fā)明的其它的特征和優(yōu)點(diǎn)可從下文對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求的描述將是顯而易見的。
本發(fā)明涉及AUR-1和／或AUR-2多肽，編碼這種多肽的核酸，含有這種核酸的細(xì)胞、組織和動(dòng)物，針對(duì)這種多肽的抗體，使用這種多肽的檢測(cè)方法，和與上述各項(xiàng)相關(guān)的方法。Ⅰ．編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸本發(fā)明的范圍包括本文描述的分離的核酸分子的功能等同物。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許一些密碼子被編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子所替換，而產(chǎn)生同一種蛋白質(zhì)。由于除甲硫氨酸和色氨酸之外所有已知的氨基酸可由一個(gè)以上的密碼子編碼，核酸序列可有大幅度的變化。這樣，AUR-1和／或AUR-2基因的部分或全部可被合成出來，而其核酸序列明顯不同于SEQID NO1或SEQ ID NO2所示的序列。但是其所編碼的氨基酸序列完全相同。
此外，該核酸序列可以包含一個(gè)產(chǎn)生于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物的5’端和／或3’-端至少一個(gè)核苷酸的增加、缺失或替換的序列。在這方面可以使用任何一種核苷酸或多核苷酸，只要其增加，缺失或替換不改變?cè)摵塑账嵝蛄芯幋a的SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。例如，本發(fā)明包括任一種產(chǎn)生于在本發(fā)明核酸序列或其功能衍生物的5’-端增加ATG作為起始密碼子，或產(chǎn)生于在本發(fā)明的核酸序列或其功能衍生物的3’-端增加TTA，TAG或TGA作為終止密碼子的核苷酸序列。此外，本發(fā)明的核酸分子如果需要在其5’-端和／或3’-端增加限制性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。
這種給定核酸序列的功能變換提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，促進(jìn)由與其融合的外源核酸序列編碼的異源蛋白質(zhì)的分泌和／或加工。因而，遺傳密碼所允許的AUR-1和／或AUR-2基因和其片段的所有核苷酸序列的變化均包括在本發(fā)明中。
而且，可以缺失密碼子或由不是簡(jiǎn)并密碼子的密碼子替換一個(gè)或更多個(gè)密碼子，以產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)上被修飾的多肽，但該被修飾的多肽具有與沒有修飾的核酸分子所產(chǎn)生的多肽基本上相同的作用或活性?，F(xiàn)有技術(shù)中已知，這兩種多肽是功能等效的，如同產(chǎn)生它們的兩種核酸分子是等效的一樣，雖然該兩種核酸分子之間的差別與遺傳密碼的簡(jiǎn)并性無關(guān)。Ⅱ．用于檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2的核酸探針本發(fā)明的核酸探針可通過通常的雜交方法用于探測(cè)一個(gè)適當(dāng)?shù)娜旧w或cDNA文庫，以獲得本發(fā)明的另一種核酸分子?？筛鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法從合適的細(xì)胞制備染色體DNA或cDNA文庫(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，＆ Maniatis編，Cold SpringHarbour Laboratory，1989)。
或者，為了獲得具有相應(yīng)于感興趣多肽的氨基酸序列N-末端和C-末端部分的核苷酸序列的核酸探針，可進(jìn)行化學(xué)合成。這樣，該合成的核酸探針可被用作引物，用于按照已知的PCR技術(shù)，主要是按照“方法和應(yīng)用指導(dǎo)”Michael等編，Academic Press，1990，中的PCR方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，使用適當(dāng)?shù)娜旧w或cDNA文庫，以獲得本發(fā)明的片段。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文公開的序列，使用現(xiàn)有技術(shù)已知的計(jì)算機(jī)排列和序列分析方法(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，& Maniatis編，Cold Spring Harbour Laboratory，1989)，可容易地設(shè)計(jì)這種探針。本發(fā)明的雜交探針可通過標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記，如使用放射性標(biāo)記，酶標(biāo)記，熒光標(biāo)記，生物素-抗生物素蛋白標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等。雜交以后，探針可通過已知方法看到。
本發(fā)明的核酸探針包括RNA，也包括DNA探針，這種探針是通過使用已知方法產(chǎn)生的。該核酸探針可被固定在固相支持物上。這種支持物的例子包括，但不限于，塑料例如聚碳酸酯，復(fù)合碳水化合物如瓊酯糖及其凝膠和丙烯酸樹脂，如聚丙烯酰胺和橡漿珠。將核酸探針與這種固相支持物相偶聯(lián)的技術(shù)為本領(lǐng)域公知技術(shù)。
適用于本發(fā)明的核酸探測(cè)方法的待測(cè)樣品包括，例如，細(xì)胞或從細(xì)胞中提取的核酸，或生物液。用于上述方法的樣品根據(jù)檢測(cè)程序，檢測(cè)方法和待測(cè)組織、細(xì)胞或提取物的性質(zhì)會(huì)有不同。制備細(xì)胞的核酸提取物的方法是已知技術(shù)，并可被容易地加以調(diào)整，以獲得與所使用的方法相容的樣品。Ⅲ．用于檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2的方法和試劑盒的探針一個(gè)檢測(cè)樣品中AUR-1和／或AUR-2存在的方法包括(a)在發(fā)生雜交的條件下將所說樣品與上述核酸探針接觸，和(b)檢測(cè)與所說核酸分子結(jié)合的所說探針的存在。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將按照上述的已知技術(shù)選擇核酸探針。待測(cè)樣品包括但不限于人類組織的RNA樣品。
一個(gè)檢測(cè)樣品中AUR-1和／或AUR-2存在的試劑盒包括至少一個(gè)其中放置有上述核酸探針的容器。該試劑盒可進(jìn)一步包括其它容器，所述其它容器包括下述的一種或多種洗滌劑和可檢測(cè)結(jié)合的核酸探針存在的試劑。檢測(cè)試劑的例子包括，但不限于，放射標(biāo)記探針，酶標(biāo)記探針(辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶)，和親和標(biāo)記探針(生物素，抗生物素蛋白，或鏈菌素)。
更詳細(xì)地說，一個(gè)分隔化的試劑盒包括任何其中試劑被存放于分開的容器中的試劑盒。這種容器包括小的玻璃容器，塑料容器或塑料條或紙條。這種容器允許試劑從一個(gè)分隔間到另一個(gè)分隔間的高效率的轉(zhuǎn)送，并使樣品和試劑不發(fā)生交叉感染，并且每個(gè)容器中的試劑或溶液可以定量的方式從一個(gè)分隔間到另一個(gè)分隔間的加入。這種容器將包括一個(gè)接收測(cè)試樣品的容器，一個(gè)盛裝用于檢測(cè)的探針或引物的容器，盛裝洗滌劑(如磷酸緩沖液，Tris-緩沖液等)的容器，和盛裝用于檢測(cè)雜交探針，結(jié)合的抗體，擴(kuò)增產(chǎn)物等試劑的容器。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將很容易地看到本發(fā)明描述的核酸探針可容易地與現(xiàn)有技術(shù)中已知的已建立的試劑盒程式相結(jié)合。Ⅳ．含有AUR-1和／或AUR-2核酸分子的DNA構(gòu)建體和含有這些構(gòu)建體的細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及一種重組DNA分子，它從5’至3’包括能夠在宿主細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和上述核酸分子。此外，本發(fā)明涉及一種含有一種載體和上述核酸分子的重組DNA分子。本發(fā)明也涉及一種核酸分子，它含有一種在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄區(qū)段，一種與編碼相應(yīng)于上述多肽的氨基酸序列的RNA序列相互補(bǔ)的序列，和一種在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)段。上述分子可以是分離的和／或純化的DNA分子。
本發(fā)明也涉及一種含有上述核酸分子并從而能夠表達(dá)一種肽的細(xì)胞或生物體。該多肽可以從被進(jìn)行了改造以表達(dá)該多肽的細(xì)胞中純化出來。一種細(xì)胞當(dāng)它通過遺傳操作進(jìn)行改造以產(chǎn)生它在正常情況下不產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或在正常情況下以低水平產(chǎn)生該蛋白質(zhì)時(shí)被稱作“被改造以表達(dá)所需的蛋白質(zhì)”。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地調(diào)整程序，以在真核或原核細(xì)胞中引入并表達(dá)基因組、cDNA或合成序列。
一種核酸分子，例如DNA，如果它含有的核苷酸序列含有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息并且這種序列為“可操縱地連接”于編碼一種多肽的核苷酸序列上，即被稱作是“能夠表達(dá)”一種多肽?？刹倏v連接是一種連接，其中調(diào)節(jié)DNA序列和尋求表達(dá)的DNA序列的連接方式允許基因序列的表達(dá)?；蛐蛄斜磉_(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)段的準(zhǔn)確性質(zhì)在不同的生物之間不相同，但一般包括一啟動(dòng)子區(qū)段，該啟動(dòng)子區(qū)段在原核細(xì)胞中含有啟動(dòng)子(它的作用是起始RNA轉(zhuǎn)錄)以及當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA后即起始合成的DNA序列。這些區(qū)段通常包括那些參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始的5’-非編碼序列，如TATA盒，加帽序列(capping sequence)，CAAT序列等。
如果需要，編碼AUR-1和／或AUR-2基因序列3’側(cè)的非編碼區(qū)段可通過上述方法獲得。該區(qū)段可以保留其轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列，如終止和聚腺苷酸化。這樣，通過保留自然狀態(tài)下與編碼AUR-1和／或AUR-2基因的DNA序列相鄰接的3’-區(qū)段，可以提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。當(dāng)在宿主細(xì)胞中該轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能不佳時(shí)，可用在宿主細(xì)胞中具有功能的3’區(qū)段替換。
兩個(gè)DNA序列(如啟動(dòng)子區(qū)段序列和AUR-1和／或AUR-2序列)被稱為可操縱連接的條件是，如果該兩個(gè)DNA序列之間連接的性質(zhì)不會(huì)(1)引致移框突變的引入，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)段序列引導(dǎo)AUR-1和／或AUR-2基因序列轉(zhuǎn)錄的能力，或者(3)干擾AUR-1和／或AUR-2被啟動(dòng)子區(qū)段序列轉(zhuǎn)錄的能力。這樣，如果一個(gè)啟動(dòng)子能夠使一個(gè)DNA序列轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子區(qū)段與該DNA序列為可操縱連接。因而，為了表達(dá)AUR-1和／或AUR-2基因，需要有由適當(dāng)?shù)乃拗髯R(shí)別的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號(hào)。
本發(fā)明包括AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)在原核或真核細(xì)胞中的表達(dá)。原核宿主細(xì)胞在一般情況下對(duì)于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)來說非常有效和方便，因而為優(yōu)選的AUR-1和／或AUR-2基因表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)類型。原核生物常常由各種品系的大腸桿菌作為代表，但也可使用其它的微生物品系，包括其它的細(xì)菌品系。
在原核系統(tǒng)中，可以使用一種質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體含有來自與宿主相容的品種的復(fù)制位點(diǎn)和控制序列。適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體的例子可以包括pBR322，pUC118，pUC119等；適當(dāng)?shù)氖删w或噬菌體載體可以包括γgt10，γgt11等，適當(dāng)?shù)牟《据d體可以包括pMAM-neo，pKRC等；更可取的是本發(fā)明選擇的載體在選擇的宿主細(xì)胞中具有復(fù)制的能力。
公知的原核宿主包括細(xì)菌，如大腸桿菌，桿菌，鏈霉菌，假單孢菌，沙門氏菌，沙雷氏菌等。但是在這些條件下，該多肽不被糖基化。該原核宿主必須與該表達(dá)質(zhì)粒中的復(fù)制子和控制序列相容。
為了在原核細(xì)胞中表達(dá)AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)，必須將該AUR-1和／或AUR-2序列與具有功能的原核啟動(dòng)子進(jìn)行可操縱連接。這一啟動(dòng)子可以是組成型的，或者最好為可調(diào)節(jié)型的(即可誘導(dǎo)或可抑制)。組成型啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λ的int啟動(dòng)子，pBR322的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)基因序列的bla啟動(dòng)子，和pPR325的氯霉素?；D(zhuǎn)移酶基因序列的CAT啟動(dòng)子，等等。可誘導(dǎo)型原核啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λ的主要的右和左啟動(dòng)子(PL和PR)，大腸桿菌的trp recA、λacZ、λacI，和gal啟動(dòng)子，枯草桿菌(Gilman等，基因序列3211-20(1984))的α-淀粉酶(Ulmanen等，微生物學(xué)雜志，162176-182(1985))和ζ-28-特異性啟動(dòng)子，桿菌的噬菌體啟動(dòng)子(Gryczan，桿菌的分子生物學(xué)Academic Press，Inc．，NY(1982))，和鏈霉菌啟動(dòng)子(Ward等，分子基因遺傳學(xué)，203468-478(1986))。原核啟動(dòng)子已由GLICR(工業(yè)微生物技術(shù)雜志．，1277-282(1987))；Cenatiempo(生物化學(xué)68505-516(1986))；和Gottesman(遺傳學(xué)年度評(píng)論，18415-442(1984))進(jìn)行綜述。
原核細(xì)胞中的正常表達(dá)也需要在基因序列-編碼序列上游存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)。這種核糖體結(jié)合位點(diǎn)由，例如，Gold等，(微生物學(xué)年度評(píng)論35365-404(1981))公開?？刂菩蛄小⒈磉_(dá)載體、轉(zhuǎn)化方法等的選擇有賴于用于表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞類型的選擇。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可交換使用，并且所有這些稱謂包括其子代。這樣，術(shù)語“轉(zhuǎn)化物”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由此衍生的培養(yǎng)物，與傳代的次數(shù)無關(guān)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，由于有意或無意的突變，所有的子代在DNA內(nèi)含物上可能不完全相同。但是，正如限定的那樣，突變的子代具有與原始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相同的功能。
可用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞沒有嚴(yán)格限制，只要它們適用于本發(fā)明的感興趣的AUR-1和／或AUR-2肽的表達(dá)。適用的宿主可通常包括真核細(xì)胞。優(yōu)選的真核宿主包括，例如，酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們或是在體內(nèi)，或是在組織培養(yǎng)物中?？梢杂米魉拗鞯牟溉閯?dòng)物細(xì)胞包括HeLa細(xì)胞，來源于成纖維細(xì)胞的細(xì)胞，例如VERO或CHO-K1，或淋巴來源的細(xì)胞和它們的衍生物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括SP2／0和J558L，以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系如IMR332，它具有更強(qiáng)的正確轉(zhuǎn)譯后加工能力。
此外也可使用植物細(xì)胞作為宿主，與植物細(xì)胞相容的控制序列已可得到，例如花椰菜花葉病毒35S和19S，以及胭脂堿合成酶啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)序列。另一種優(yōu)選的宿主為昆蟲細(xì)胞，例如果蠅幼蟲。用昆蟲細(xì)胞作為宿主，可使用果蠅乙醇脫氫酶啟動(dòng)子。Rubin，科學(xué)2401453-1459(1988)?；蛘撸蓪U狀病毒(baculovirus)載體進(jìn)行遺傳改造以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)大量的AUR-1和／或AUR-2(Jasny，科學(xué)2381653(1987))；Miller等，遺傳工程(1986)，SetloW，J．K．，等編，Plenum，第8卷，第277-297頁。
可使用一系列的酵母基因序列表達(dá)系統(tǒng)中的任何一種，它整合了來自活躍表達(dá)的編碼糖酵解酶的基因序列的啟動(dòng)和終止元件，當(dāng)酵母在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)該糖酵解酶會(huì)大量產(chǎn)生。已知的糖酵解基因序列也可提供非常有效的轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)。酵母也可進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后肽修飾，這提供了相當(dāng)有利的條件。存在一些重組DNA策略，它們使用強(qiáng)的啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，這些質(zhì)?？稍诮湍钢杏糜诋a(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。酵母識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因序列產(chǎn)物上的引導(dǎo)序列并分泌攜帶引導(dǎo)序列的肽(即前肽)。對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主，已存在幾種可能的載體系統(tǒng)以用于AUR-1和／或AUR-2的表達(dá)。
根據(jù)宿主的性質(zhì)，可以使用品種繁多的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)序列。該轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信號(hào)可來源于病毒，如腺病毒，小牛乳頭瘤病毒，細(xì)胞肥大病毒，猿猴病毒等，其中該調(diào)節(jié)信號(hào)與具有高水平表達(dá)的特定基因序列相聯(lián)。或者，可以使用來自哺乳動(dòng)物表達(dá)產(chǎn)物，如肌動(dòng)蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白等的啟動(dòng)子。可選用可允許抑制或激活的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)信號(hào)，以便可對(duì)該基因序列的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。重要的是調(diào)節(jié)信號(hào)為溫度敏感型，從而通過變換溫度，表達(dá)可被抑制或被啟動(dòng)，或經(jīng)受化學(xué)品(如代謝物)的調(diào)節(jié)。
AUR-1和／或AUR-2在真核宿主中的表達(dá)需要使用真核調(diào)節(jié)區(qū)段。這種區(qū)段一般來說包括一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)段，該區(qū)段應(yīng)足以引導(dǎo)RNA合成的啟動(dòng)。優(yōu)選的真核啟動(dòng)子包括，例如，小鼠金屬硫因Ⅰ基因序列的啟動(dòng)子(Hamer等，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1273-288(1982))；瘡疹病毒的TK啟動(dòng)子(Mcknight，細(xì)胞31355-365(1982))；SV40早期啟動(dòng)子(Benoist等，自然(London)290304-310(1981))；酶母gal4基因啟動(dòng)子(Johnston等，美國科學(xué)院院刊796791-6975(1982)；Silver等，美國科學(xué)院院刊815951-5955(1984))。
真核mRNA的轉(zhuǎn)譯是在編碼第一個(gè)甲硫氨酸的密碼子開始的。由于這一原因，最好確保真核啟動(dòng)子和編碼AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)的DNA序列之間的連接沒有插入能夠編碼甲硫氨酸的密碼子(即AUG)。這種密碼子的存在或者導(dǎo)致融合蛋白的形成(如果AUG密碼子與編碼AUR-1和／或AUR-2的序列處于同一個(gè)閱讀框中)或?qū)е乱瓶蛲蛔?如果AUG密碼子與編碼AUR-1和／或AUR-2的序列不處于同一閱讀框)。
AUR-1和／或AUR-2核酸分子和可操縱連接的啟動(dòng)子導(dǎo)入受體原核或真核細(xì)胞的形式可以是非復(fù)制DNA(或RNA)分子，它可以是或者線性分子，或者最好是封閉共價(jià)環(huán)狀分子。由于這種分子不能自動(dòng)復(fù)制，基因的表達(dá)可以通過被導(dǎo)入序列的瞬間表達(dá)來進(jìn)行?；蛘?，通過被導(dǎo)入DNA序列與宿主染色體的整合可以進(jìn)行永久表達(dá)。
可以使用能夠?qū)⑺杌蛐蛄姓线M(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的載體。在其染色體中已被穩(wěn)定地整合進(jìn)被導(dǎo)入DNA的細(xì)胞可通過也導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因來選擇，該標(biāo)記基因可對(duì)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。該標(biāo)記基因可對(duì)營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)，殺生物素抗性，如抗生素，或重金屬，如銅等。該可選擇標(biāo)記基因序列可直接地與待表達(dá)的DNA基因序列相連，或者通過共轉(zhuǎn)染被導(dǎo)入同一個(gè)細(xì)胞。對(duì)于單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)mRNA的最理想的合成來說也可能需要另外的元件。這些元件可以包括剪切信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止信號(hào)。整合了這些元件的cDNA表達(dá)載體包括由Okayama，在Molec．Cell Biol．，3280(1983)中描述的那些表達(dá)載體。
該被導(dǎo)入的核酸分子可被整合進(jìn)能夠在受體宿主中自動(dòng)復(fù)制的質(zhì)?；虿《据d體中。種類繁多的載體中的任一種均可用于這一目的。選擇特定的質(zhì)粒或病毒載體的重要因素包括應(yīng)可容易地將含有該載體的受體細(xì)胞從不含有該載體的受體細(xì)胞中識(shí)別和分離出來；在特定的宿主中所需的載體的拷貝數(shù)；是否需要該載體能夠在不同種類的宿主細(xì)胞之間“穿梭”。
優(yōu)選的原核載體包括質(zhì)粒，例如能夠在大腸桿菌中復(fù)制的那些質(zhì)粒(如，pBR322，ColEl，pSC101，pACYC184，πVX)。這種質(zhì)粒公開于，例如，Sambrook分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，＆Maniatis編，Cold Spring Harbour Laboratory，(1989))。桿菌質(zhì)粒包括pC194，pC221，pT127等。這種質(zhì)粒公開于Gryczan(桿菌的分子生物學(xué)，Academic Press，NY(1982)，pp．307-329)。合適的鏈霉菌質(zhì)粒包括pIJ101(Kendall等，微生物學(xué)雜志1694177-4183(1987))，和鏈霉菌噬菌體，如φC31(Chater等，第六屆放線菌國際研討會(huì)Akademiai Kaido，Budapest，Hungary(1986)，第45-54頁)。假單孢菌質(zhì)粒已由John等，(傳染病評(píng)論8693-704(1986))和Izaki(日本微生物學(xué)雜志33729-742(1978)進(jìn)行綜述。
優(yōu)選的真核質(zhì)粒包括，例如，BPV，牛痘疫苗(Vaccinia)，SV40，2-微米環(huán)等，及它們的衍生物。這種質(zhì)粒為公知的(Botstein等，邁阿密冬季研討會(huì)19265-274(1982)；Broach，酵母菌的分子生物學(xué)生活周期和遺傳，Cold Spring Harbour laboratory，Cold Spring Harbor，NY，第445-470頁(1981)；Broach，細(xì)胞，28203-204(1982)；Bollon等，監(jiān)床血液癌證學(xué)雜志1039-48(1980)；Maniatis，細(xì)胞生物學(xué)綜合論文，第3卷，基因表達(dá)，Academic Press，NY，第563-608頁(1980)。
制備出用于表達(dá)的載體或含有該構(gòu)建體的核酸分子之后，可將該DNA構(gòu)建體通過任一種適當(dāng)方式導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，即通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，接合，原生質(zhì)體融合，電穿孔，粒子槍技術(shù)，磷酸鈣沉淀，直接顯微注射等。載體導(dǎo)入之后，將受體細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，選擇培養(yǎng)基選擇出含有載體的細(xì)胞。該克隆的基因分子的表達(dá)導(dǎo)致AUR-1和／或AUR-2或其片段的產(chǎn)生。這可在這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中進(jìn)行，或在這些細(xì)胞被誘導(dǎo)分化之后進(jìn)行(如對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞等施用5-溴脫氧尿苷)?？墒褂枚喾N溫育條件來形成本發(fā)明的肽。最優(yōu)選的條件為模擬生理環(huán)境的那些條件。Ⅴ．純化的AUR-1和／或AUR-2多肽多種已知的方法均可用于獲得本發(fā)明的肽。該肽可從自然狀態(tài)下產(chǎn)生它細(xì)胞或組織中分離出來?；蛘撸鲜龇蛛x的核酸片段可被用來在任一種生物體中表達(dá)AUR-1和／或AUR-2蛋白質(zhì)。本發(fā)明的樣品包括細(xì)胞，細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物或膜提取物，或生物液。根據(jù)檢測(cè)程式，檢測(cè)方法以及用作樣品的組織，細(xì)胞或提取物性質(zhì)的不同，該樣品可有不同。
任一種真核生物體可被用作本發(fā)明肽的來源，只要這種原料生物體在天然狀態(tài)下含有這種肽。本文所用的術(shù)語“原料生物體”是指產(chǎn)生該亞單位的氨基酸序列的原始生物體，與該亞單位在其中表達(dá)并最終從其中分離的生物體無關(guān)。
普通技術(shù)人員能很容易地按照已知的蛋白質(zhì)分離方法來獲得不含天然污染物的這種肽。這些包括，但不限于排除尺寸色譜法(Size-exclusion chromatography)，高壓液相色譜法(HPLC)，離子交換色譜法，以及免疫親和色譜法。Ⅵ．對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有結(jié)合親和性的抗體和含有這種抗體的雜交瘤。
本發(fā)明涉及一種對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有結(jié)合親和性的抗體。該多肽可具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或其中至少9個(gè)相鄰接的氨基酸(優(yōu)選其中的至少20，30，35或40個(gè)相鄰接的氨基酸)。
本發(fā)明也涉及一種對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有特異的結(jié)合親和性的抗體。這種抗體可通過將其與AUR-1和／或AUR-2多肽的結(jié)合親和性與其與另一種多肽的結(jié)合親和性相比較來分離。那些對(duì)AUR-1和／或AUR-2有選擇性的結(jié)合的抗體將被用于需要在AUR-1和／或AUR-2和其它多肽之間進(jìn)行區(qū)分的方法之中。這種方法可包括，但不限于，分析在含有其它多肽的組織中AUR-1和／或AUR-2的表達(dá)發(fā)生變化的方法。
本發(fā)明的AUR-1和／或AUR-2蛋白質(zhì)可被用于多種方法中，如用于產(chǎn)生抗體，以用于鑒別藥物組合物，和用于研究DNA／蛋白質(zhì)相互作用。
本發(fā)明的AUR-1和／或AUR-2肽可被用于產(chǎn)生抗體或雜交瘤。本專業(yè)普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，如需要一種抗體，將如本文所述生產(chǎn)出的肽用作免疫原。本發(fā)明的抗體包括單克隆和多克隆抗體，和這些抗體的片段，及其人源化形式。本發(fā)明抗體的人源化形式可通過使用已知方法之一產(chǎn)生，如嵌合成CDR移植。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生上述單克隆抗體或其結(jié)合片段的雜交瘤。雜交瘤是一種能夠分泌特定單克隆抗體的瘤化細(xì)胞系。
總之，制備單克隆抗體和雜交瘤的技術(shù)是公知的(Campbell，單克隆抗體技術(shù)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)；Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1984)；St．Groth等，免疫學(xué)方法雜志351-21(1980))。任何一種已知可產(chǎn)生抗體的動(dòng)物(小鼠，兔等)可用選擇的多肽進(jìn)行免疫。免疫方法是公知的。這種方法包括皮下和腹膜內(nèi)注射該多肽。普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到用于免疫的多肽的量將依受免疫動(dòng)物、該多肽的免疫原性及注射部位的不同而不同。
為提高肽的免疫原性，可對(duì)其進(jìn)行修飾或與輔藥一起施用。提高多肽免疫原性的方法是公知的。這種方法包括將抗原與一種異源蛋白質(zhì)(如球蛋白或半乳糖苷酶)相偶聯(lián)或與輔藥一起進(jìn)行免疫。
對(duì)于單克隆抗體來說，切除被免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞，如SP2／O-Ag／4骨髓瘤細(xì)胞相融合，使其成為產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞?？墒褂枚喾N公知方法中的任意一種來識(shí)別產(chǎn)生具有所需特征的抗體的雜交瘤細(xì)胞。這些方法包括用ELISA檢測(cè)、Western印跡、或放射免疫檢測(cè)來篩選雜交瘤(Lutz等人．，細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)，175109-124(1988))。將分泌所需抗體的雜交瘤進(jìn)行克隆，抗體的類和亞類是用已知方法進(jìn)行確定的(Campbell，單克隆抗體技術(shù)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，同上文獻(xiàn)(1994))。
對(duì)于多克隆抗體來說，將含有抗體的抗血清從被免疫動(dòng)物中分離出來，然后使用上述方法之一篩選具有所需特異性的抗體。對(duì)上述抗體可進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。抗體可通過下述方式進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記放射性同位素，親和標(biāo)記(如生物素、抗生物素蛋白等)，酶標(biāo)記(如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶等)，熒光標(biāo)記(如FITC或羅丹明等)，順磁性原子等。進(jìn)行這種標(biāo)記的方法是公知的，如，參見(Stemberger等，組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)雜志18315(1970)；Bayer等．，酶學(xué)方法，62308(1979)；Engval等，免疫學(xué)，109129(1972)；Goding，免疫學(xué)方法雜志13215(1976))。本發(fā)明的被標(biāo)記的抗體可被用于體外，體內(nèi)和原位檢測(cè)，以識(shí)別表達(dá)特定肽的細(xì)胞或組織。
上述抗體也可被固定于一種固相支持物上。這種固相支持物的例子包括聚碳酸脂，復(fù)合碳水化合物，如瓊脂糖和瓊脂糖凝膠，丙烯酸樹脂，如聚丙烯酰胺和膠乳珠。將抗體與這種固相支持物相偶聯(lián)的技術(shù)是公知的(Weir等，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，第4版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，England，第19章(1986)；Jacoby等，酶學(xué)方法34，Academic Press，N．Y．(1974))。本發(fā)明的固化的抗體可被用于體外、體內(nèi)及原位檢測(cè)以及免疫層析。
而且，本專業(yè)普通技術(shù)人員可容易調(diào)整現(xiàn)有的方法，以及上文所述的有關(guān)抗體的技術(shù)，方法和試劑盒，目的在于產(chǎn)生設(shè)計(jì)合理的抗肽的肽類來生產(chǎn)能夠與特定的肽序列相結(jié)合的肽，其例子請(qǐng)參閱Hurby等，合成肽的應(yīng)用反義肽，合成肽，使用手冊(cè)，W．H．Freeman，NY，第289-307頁(1992)，和Kaspczak等，生物化學(xué)289230-8(1989)。
抗肽的肽類可通過將AUR-1和／或AUR-2肽序列中存在的堿性氨基酸殘基用酸性殘基替換，同時(shí)保留疏水性的和不帶電荷的極性基團(tuán)來制備。例如，賴氨酸、精氨酸、和／或組氨酸殘基被無冬氨酸替換，或谷氨酸和谷氨酸被賴氨酸、精氨酸或組氨酸替換。Ⅶ．基于檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2的方法和試劑盒的抗體本發(fā)明包括檢測(cè)樣品中AUR-1和／或AUR-2多肽的方法，包括(a)在使免疫復(fù)合體形成的條件下將樣品與上述抗體接觸，和(b)檢測(cè)與該多肽結(jié)合的所說抗體的存在。詳細(xì)地說，該方法包括將測(cè)試樣品與本發(fā)明的一種或多種抗體一起溫育，并檢測(cè)該抗體是否與測(cè)試樣品結(jié)合。樣品中AUR-1和／或AUR-2的水平與正常水平相比較發(fā)生了變化可能表明疾病的發(fā)生。
用于抗體和測(cè)試樣品溫育的條件各不相同。溫育條件依賴于所使用的測(cè)試的程式、所使用的檢測(cè)方法和測(cè)試中使用的抗體的類型和性質(zhì)。普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到通?？墒褂玫拿庖叱淌街械娜我环N(如放射免疫測(cè)試，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試，diffusion based ouchterlony，或火箭免疫熒光檢測(cè))能很容易地使其適用于本發(fā)明的抗體。這種檢測(cè)方法的例子請(qǐng)參閱Chard，放射免疫和相關(guān)技術(shù)簡(jiǎn)單，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock等，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，Academic press，Orlando，F(xiàn)L Vol．(1982)，Vol．2(1983)，Vol．3(1985)；Tijssen，酶免疫檢測(cè)的實(shí)踐和理論，生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands(1985)。
本發(fā)明的免疫檢測(cè)樣品包括細(xì)胞，細(xì)胞的蛋白質(zhì)或膜提取物，或生物液如血液，血清，血漿或尿。用于上述方法的測(cè)試樣品按照檢測(cè)程式，檢測(cè)方法以及用作待測(cè)樣品的組織，細(xì)胞或提取物的不同而不同。制備細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物或膜提取物的方法為公知的，并且可容易地進(jìn)行調(diào)整以獲得可用于本系統(tǒng)的樣品。
試劑盒含有所有為進(jìn)行前述檢測(cè)方法的試劑。該試劑盒可以包括(ⅰ)含有上述抗體的第一容器，和(ⅱ)第二容器，它含有包括該抗體的結(jié)合對(duì)應(yīng)物和標(biāo)記物的結(jié)合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑盒還含有一個(gè)或多個(gè)其它容器，它們包括一個(gè)或多個(gè)下述產(chǎn)品洗滌劑和能夠檢測(cè)結(jié)合抗體存在的試劑。
檢測(cè)試劑的例子包括，但不限于標(biāo)記的第二抗體，或者，如果第一抗體是標(biāo)記的，能夠與該標(biāo)記抗體反應(yīng)的發(fā)色的、酶的、或抗體結(jié)合的試劑。該分隔式試劑盒可以如同上述核酸探針試劑盒。普通技術(shù)人員可容易認(rèn)識(shí)到本發(fā)明所述的抗體很容易同已知的試劑盒程式結(jié)合在一起。Ⅷ．與AUR-1和／或AUR-2相互作用的化合物的分離本發(fā)明也涉及一種檢測(cè)能夠與AUR-1和／或AUR-2多肽相互作用的化合物的方法，包括將該化合物與AUR-1和／或AUR-2一起溫育，并檢測(cè)與AUR-1和／或AUR-2相結(jié)合的化合物的存在。該化合物可能存在于一個(gè)復(fù)雜混合物中，如血清、體液、或細(xì)胞提取物。
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2活性或AUR-1和／或AUR-2結(jié)合對(duì)應(yīng)物活性的興奮劑或頡頏劑的方法，包括在一種化合物的存在下溫育產(chǎn)生AUR-1和／或AUR-2的細(xì)胞并檢測(cè)AUR-1和／或AUR-2活性或AUR-1和／或AUR-2結(jié)合對(duì)應(yīng)物活性水平的變化。經(jīng)這種方式鑒定的化合物將產(chǎn)生一個(gè)表明該化合物存在的活性變化。該化合物可能存在于一個(gè)復(fù)雜混合物中，例如，血清、體液、或細(xì)胞提取物中。一旦該化合物被鑒別，即可用公知的技術(shù)將其分離出來。
本發(fā)明也包括一種興奮(刺激)或頡頏哺乳動(dòng)物中與AUR-1和／或AUR-2相關(guān)活性的方法，包括給所說哺乳動(dòng)物施用一種對(duì)AUR-1和／或AUR-2的興奮劑或頡頏劑，施用量應(yīng)足以產(chǎn)生興奮效應(yīng)或頡頏效應(yīng)。一種用AUR-1和／或AUR-2相關(guān)活性的頡頏劑或興奮劑治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用該興奮劑或頡頏劑，其施用量足以興奮或頡頏AUR-1和／或AUR-2相關(guān)的功能。該方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。Ⅸ．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)與本發(fā)明相關(guān)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法已有多種可以使用。在雄性和雌性細(xì)胞核融合前將DNA注射進(jìn)受精卵的前核中，或者在細(xì)胞分裂起始之后注射進(jìn)胚胎細(xì)胞核中(例如，兩細(xì)胞胚胎的核中)(Brinster etal．，美國科學(xué)院院刊82，4438-4442(1985))?？捎眯揎椀牟《荆貏e是反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染胚胎，該修飾的病毒攜帶有本發(fā)明的無機(jī)離子受體核苷酸序列。
來自胚胎內(nèi)細(xì)胞群并在培養(yǎng)中穩(wěn)定化的多能干細(xì)胞可在培養(yǎng)中進(jìn)行遺傳操作，以整合進(jìn)本發(fā)明的核苷酸序列。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過將這種細(xì)胞植入一個(gè)移植進(jìn)養(yǎng)母的胚胞并使其完成孕期來生產(chǎn)。適用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物可通過標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)途徑獲得，如Charles River(Wilmington，MA)，Taconic(Germantown，NY)，Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)等。
對(duì)嚙齒類動(dòng)物胚胎進(jìn)行遺傳操作的方法和將DNA顯微注射進(jìn)合子的前核的方法是公知的(Hogan et al．，文獻(xiàn)同上)。對(duì)魚類，兩棲類卵和鳥類進(jìn)行顯微注射的方法在文獻(xiàn)(Houdebine和Chourrout，實(shí)驗(yàn)47897-905(1991))中有詳細(xì)描述。將DNA導(dǎo)入動(dòng)物組織的其他方法描述于美國專利NO．4945050(Sandford等，1990年7月30日)。
順便舉一例，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠，誘導(dǎo)雌性小鼠，使其排卵過度。將雌性和雄性放在一起，將交配的雌性用CO2窒息或斷頸法將其殺死，從切開的輸卵管中取出胚胎。除去周圍的丘細(xì)胞(Cumulus cell)。將前核胚胎洗凈并貯存起來，直至進(jìn)行顯微注射。將隨機(jī)循環(huán)的成年雌性小鼠與輸精管切除的雄性交配。受體雌性與供體雌性被同時(shí)交配。然后將胚胎進(jìn)行手術(shù)轉(zhuǎn)移。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大鼠的方法與生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的方法相似。參見Hammer等，細(xì)胞631099-1112(1990)。
培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES)的方法以及隨后的使用電穿孔法，磷酸鈣／DNA沉淀法和直接注射法將DNA導(dǎo)入ES細(xì)胞來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法均為公知技術(shù)。參見，例如，畸形癌和胚胎干細(xì)胞，一種實(shí)用方法，E．J．Robertson，ed．，IRL Press(1987)。
在涉及隨機(jī)基因整合的情況下，將含有本發(fā)明序列的克隆與編碼抗性的基因進(jìn)行共傳染?；蛘撸瑢⒕幋a新霉素抗性的基因與本發(fā)明的基因物理地連接在一起。所需克隆的傳染和分離可通過公知的幾種方法之一來進(jìn)行(E．J．Robertson，文獻(xiàn)同上)。
導(dǎo)入ES細(xì)胞的DNA分子也可通過同源重組被整合進(jìn)染色體。參見文獻(xiàn)(Capecchi，科學(xué)2441288-1292(1989)。對(duì)重組發(fā)生(即neo抗生)的正選擇的方法和雙重正負(fù)選擇(即neo抗性和gancyclovir抗性)的方法以及隨后的通過PCR對(duì)所需克隆的識(shí)別的方法已描述于Capcchi，文獻(xiàn)同上，和Joyner等，自然338153-156(1989)，其內(nèi)容引入本文作為參考。該方法的最后階段是將靶ES細(xì)胞注射進(jìn)胚胞內(nèi)并將該胚胞轉(zhuǎn)移進(jìn)假懷孕雌性體內(nèi)。培育所產(chǎn)生的嵌合動(dòng)物，將其子代通過Southern印跡進(jìn)行分析，來鑒別攜帶該轉(zhuǎn)基因的個(gè)體。生產(chǎn)非嚙齒動(dòng)物和其它動(dòng)物的方法已由他人描述。見Houdebine和Chourrout，文獻(xiàn)同上；Pursel等，科學(xué)，2441281-1288(1989)；和Simms等，生物技術(shù)6179-183(1988)。
這樣，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的非人類的哺乳動(dòng)物，它含有編碼AUR-1和／或AUR-2多肽的轉(zhuǎn)基因或使AUR-1和／或AUR-2表達(dá)的基因。這種轉(zhuǎn)基因非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可被用作體內(nèi)測(cè)試系統(tǒng)，來研究AUR-1和／或AUR-2多肽導(dǎo)入的效果，AUR-1和／或AUR-2多肽表達(dá)調(diào)節(jié)的效果(即通過導(dǎo)入額外基因、反義核酸、或核酶)。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是一種具有一種細(xì)胞的動(dòng)物，該細(xì)胞含有人工插入細(xì)胞的DNA，所說的DNA成為由這種細(xì)胞發(fā)展而來的動(dòng)物的基因組的一部分。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗和貓。該轉(zhuǎn)基因DNA可以編碼人的AUR-1和／或AUR-2多肽。在一種動(dòng)物中的天然表達(dá)可以通過提供一種對(duì)降低該受體的表達(dá)有效量的反義RNA或DNA來降低。Ⅹ．基因治療AUR-1和／或AUR-2或其遺傳序列也可被用于基因治療(見綜述Miller，自然357455-460，(1992))。Miller稱，在對(duì)人類基因治療的實(shí)用方面已取得進(jìn)展，已顯出積極的初步結(jié)果?；蛑委煹幕驹砻枋鲇贛ulligan，科學(xué)260926-931，(1993)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，一種含有AUR-1和／或AUR-2編碼序列的載體被插入細(xì)胞，該細(xì)胞被培養(yǎng)在體外，然后大量注入病人體內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將一個(gè)含有精選的啟動(dòng)子(如一種強(qiáng)啟動(dòng)子)的DNA片段轉(zhuǎn)入含有一種外源AUR-1和／或AUR-2的細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)入方式使該啟動(dòng)子片段增強(qiáng)該外源AUR-1和／或AUR-2基因的表達(dá)(例如，該啟動(dòng)子片段被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中并使它直接與該外源AUR-1和／或AUR-2基因相連)。
基因治療可以涉及一種靶擊腫瘤的腺病毒的使用，該腺病毒含有AUR-1和／或AUR-2 DNA，通過向適當(dāng)組織中植入工程細(xì)胞、注射AUR-1和／或AUR-2病毒、或注射裸露的AUR-1和／或AUR-2 DNA提高全身的AUR-1和／或AUR-2。
靶細(xì)胞群體可通過導(dǎo)入該蛋白質(zhì)復(fù)合體中一個(gè)或多個(gè)成分的變型而被修飾，以求調(diào)節(jié)這種復(fù)合體的活性。例如，通過降低或抑制靶細(xì)胞內(nèi)一種復(fù)合成分的活性，一個(gè)導(dǎo)致疾病的反常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件就可能會(huì)被降低、受抑制、或逆轉(zhuǎn)。一個(gè)成分的缺失或錯(cuò)義突變，該突變保留了它與該蛋白質(zhì)復(fù)合體中其它成份相互作用的能力，但不能發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)功能，可被用來抑制一個(gè)反常的、有害的信號(hào)傳導(dǎo)事件。
來自病毒的表達(dá)載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、瘡疹病毒、幾種RNA病毒，或小牛乳頭瘤病毒，可被用來將編碼重組AUR-1和／或AUR-2蛋白質(zhì)的核酸序列運(yùn)送至靶細(xì)胞群中(如腫瘤細(xì)胞)?？捎霉姆椒?gòu)建含有編碼序列的重組病毒載體。參見例如，Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1989)和Ausube1等，現(xiàn)代生物學(xué)方法，Greene PublishingAssociates and wiley Interscience，N．Y．(1989)?；蛘?，編碼蛋白質(zhì)序列的重組核酸分子可被用作裸露DNA或用于重新構(gòu)成系統(tǒng)，如用于轉(zhuǎn)送至靶細(xì)胞的脂質(zhì)體或其它脂系統(tǒng)(參見，例如，F(xiàn)elgner等，自然337387-8，1989)。已存在有幾種其它方法將質(zhì)粒DNA直接輸入細(xì)胞內(nèi)，以用于人類基因治療，并涉及通過將該質(zhì)粒DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)合，用該DNA靶擊細(xì)胞上的受體。參見Miller，文獻(xiàn)同上。
在最簡(jiǎn)單的方式中，基因轉(zhuǎn)移可通過顯微注射方法簡(jiǎn)單地將微量的DNA注射進(jìn)細(xì)胞核中來進(jìn)行。Capecchi MR，細(xì)胞，22479-88(1980)。一旦重組基因被導(dǎo)入細(xì)胞，定們可被細(xì)胞的正常機(jī)制識(shí)別，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，并表達(dá)基因產(chǎn)物。其它方法也曾試圖將DNA導(dǎo)入大量的細(xì)胞內(nèi)。這些方法包括轉(zhuǎn)染，其中DNA與CaPO4一起被沉淀并通過胞飲作用被導(dǎo)入細(xì)胞(見文獻(xiàn)Chen C．a(chǎn)nd Okayama H，分子細(xì)胞生物學(xué)72745-52(1987))；電穿孔，其中細(xì)胞被暴露于高壓脈沖并在膜上形成小洞(見文獻(xiàn)Chu G．等，核酸研究，151311-26(1987))；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染／脂質(zhì)體融合，其中DNA被包裝進(jìn)親脂載體中并與靶細(xì)胞融合(見文獻(xiàn)Felgner PL．等，美國科學(xué)院院刊847413-7(1987))；和使用結(jié)合在小槍彈上的DNA微粒轟擊法(見文獻(xiàn)Yang NS．等，美國科學(xué)院院刊，879568-72(1990)。另一種將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法是將DNA與化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)相偶聯(lián)。
腺病毒蛋白質(zhì)已顯示能夠使核內(nèi)體不穩(wěn)定，并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA的攝取。將腺病毒與含有DNA復(fù)合體的溶液混合，或者將DNA與使用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑與腺病毒共價(jià)連接的聚賴氨酸相結(jié)合大大改善了重組基因的攝取和表達(dá)。參見文獻(xiàn)Curiel DT等，美國呼吸細(xì)胞分子生物學(xué)雜志6247-52(1992)。
本文所用“基因轉(zhuǎn)移”是指將外源核酸分子導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)的過程。為使由基因編碼的特定產(chǎn)物能夠表達(dá)，常常進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。該產(chǎn)物可包括蛋白質(zhì)，多肽，反義DNA或RNA，或酶活性RNA?；蜣D(zhuǎn)移可在培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行或直接施用給動(dòng)物。通?；蜣D(zhuǎn)移涉及的過程包括核酸通過非特異性或受體介導(dǎo)的相互作用與靶細(xì)胞相接觸，通過膜或通過胞吞作用攝取核酸進(jìn)入細(xì)胞，核酸從質(zhì)膜或核內(nèi)體被釋放進(jìn)胞質(zhì)中。此外，表達(dá)可能需要核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并與適當(dāng)?shù)暮艘蜃咏Y(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
本文所說的“基因治療”是基因轉(zhuǎn)移的一種形式，并包括在本文所用的基因轉(zhuǎn)移的概念中，以處尤其指從體內(nèi)細(xì)胞或體外細(xì)胞中表達(dá)一種治療性產(chǎn)品的基因轉(zhuǎn)移。基因轉(zhuǎn)移可在體外的細(xì)胞上進(jìn)行，然后將其移植到病人體內(nèi)，或者可以通過將核酸或核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體直接施用給病人。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所提供的載體具有編碼AUR-1和／或AUR-2的核酸序列，其中該核酸序列僅在特定的組織中表達(dá)。獲得組織特異性基因表達(dá)的方法描述于國際申請(qǐng)NO．WO 93／09236，申請(qǐng)日1992年11月3日，
公開日1993年5月13日。
在前述的所有載體中，本發(fā)明的另一方面所提供的含在該載體中的核酸序列在該核酸的某些或全部核酸序列中可以包括增加、缺失或修飾，如上文定義的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種基因替換的方法。本文所說的“基因替換”是指提供一種能夠在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的核酸序列，從而提供或增強(qiáng)一種在動(dòng)物體內(nèi)或缺陷的內(nèi)源基因的功能。
實(shí)施例下述的實(shí)施例是非限定性的，僅是本發(fā)明各種特征的代表。下文的實(shí)施例描述了新的蛋白質(zhì)AUR-1和／或AUR-2的分離和表征。
蛋白質(zhì)激酶是真核蛋白質(zhì)中最大的家族之一，具有幾百個(gè)成員。這些蛋白質(zhì)共同享有一個(gè)250-300個(gè)氨基酸的區(qū)域，該區(qū)域可被細(xì)分成12個(gè)含有共同催化核心結(jié)構(gòu)的截然不同的亞區(qū)域。這些保守的蛋白質(zhì)基序最近使用導(dǎo)致該已知的激酶大量擴(kuò)增的PCR克隆策略而被開發(fā)出來。蛋白質(zhì)激酶催化區(qū)域的序列校準(zhǔn)排列的多重性及隨后的系統(tǒng)分析使它們之間相互分離成一個(gè)系統(tǒng)樹。以這種方式，相關(guān)的激酶被聚集在不同的分枝或亞群中，它們包括酪氨酸激酶、環(huán)核苷酸依賴的激酶、鈣／鈣調(diào)素激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和MAP-激酶，以及幾種其它較少表征的亞群。
我們是從鑒定CCK4的同系物開始的。它是一種代表酪氨酸激酶的一個(gè)獨(dú)特的家族的受體。多重校準(zhǔn)排列提示CCK4與受體酪氨酸激酶的ROS和TRK家族最為相關(guān)。我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)這些受體的激酶亞區(qū)域Ⅰ和Ⅸ中保守序列的簡(jiǎn)并引物。亞區(qū)Ⅰ位激酶區(qū)域的N-末端，并含有共有基序GXGXXGXV，它參與了ATP對(duì)所有種類激酶的催化單元的錨著，亞區(qū)域Ⅸ含有一個(gè)近乎常量的ASP，它通過與亞區(qū)域VIB中殘基的結(jié)合起著穩(wěn)定催化環(huán)的作用。該常量ASP和側(cè)接氨基酸常被用于PCR克隆策略中，因?yàn)樗鼘⒗野彼峒っ?DWSY／FGI／V)與絲氨酸／蘇氨酸激酶(DXWA／SXGI／V)區(qū)分開來?；趯?duì)所有已知的蛋白質(zhì)激酶的比較，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)亞區(qū)域Ⅰ和Ⅸ的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，它們通過PCR僅擴(kuò)增CCK4及其雞同系物KLG。
基于CCK4激酶區(qū)域內(nèi)保守的殘基，我們?cè)O(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物A和DVW，以用于使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒別新的激酶。當(dāng)使用HEPM細(xì)胞的sscDNA作為模板時(shí)，分離出了多拷貝的CCK4以及一個(gè)與其它激酶具有同源性的567bp的新的DNA片段(43-43)。該新的序列最接近于果蠅aurora激酶(基因庫查閱號(hào)#X83465)并將該克隆稱作人的Aurora1。將這一片段用作探針，我們篩查了來自一些結(jié)腸癌細(xì)胞系的RNA和人的多組織Northern印跡，發(fā)現(xiàn)Aurora1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯具有選擇性。
也將該Aurora1探針用于篩選一個(gè)從人胰癌細(xì)胞系mRNA構(gòu)建的cDNA文庫，以分離覆蓋Aurora1完全開放閱讀框的交迭克隆。在分離的多個(gè)克隆中，7個(gè)相應(yīng)于人的Aurora1。兩個(gè)額外的微弱雜交的克隆在這一篩選過程中也被分離出來，序列分析表明它們相應(yīng)于一個(gè)相關(guān)的但完全不同的激酶，我們稱之為人的Aurora2。
在COS細(xì)胞中表達(dá)的重組AURORA1和AURORA2以39000和46000的表觀分子量泳動(dòng)，這與基于其一級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)的分子量39264和46730相一致。這一分析證實(shí)了該重組蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被穩(wěn)定產(chǎn)生。對(duì)這一推測(cè)的激酶確定靶特異性磷酸化測(cè)試正在進(jìn)行中。
已在兔中產(chǎn)生了針對(duì)來自AUR1和AUR2的N-末端區(qū)域的肽序列具有特異性的免疫反應(yīng)劑，并將這些反應(yīng)劑用于在細(xì)胞內(nèi)定位內(nèi)源的和重組的Aurora的表達(dá)。而且，這些試劑可被用于鑒別該Auroro的底物，以更好地理解它們正常的生物學(xué)功能。
AUR-1和／或AUR-2的顯性陰性和組成型活動(dòng)形式可用于描述這些推測(cè)的絲氨酸／蘇氨激酶的提供和過量表達(dá)的生物學(xué)后果。用改變的DNA構(gòu)建體的初始研究表明，用AUR-1和／或AUR-2逆轉(zhuǎn)錄病毒原種感染NIH3T3或BALB／373細(xì)胞后僅2個(gè)小時(shí)內(nèi)，這些細(xì)胞就變成了多核的。這一表型持續(xù)下來，以致于感染2天后，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞具有多達(dá)20個(gè)核。這些多粒細(xì)胞一般具有增多的細(xì)胞質(zhì)和散開的細(xì)胞界限。用肌動(dòng)蛋白和DAPI二者進(jìn)行免疫染色，證實(shí)了這些細(xì)胞核全部被包含于一個(gè)單個(gè)細(xì)胞中，并且肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架明顯處于正常狀態(tài)。正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)將試圖闡明細(xì)胞核內(nèi)染色體的含量的完整性，中心體的數(shù)量和位置，以及微管網(wǎng)絡(luò)的總體組織形式。
對(duì)AUR-1和／或AUR-2正常的組成型活性和顯性陰性表達(dá)的長(zhǎng)期效應(yīng)的特性正在研究之中，尤其是它們是否誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。表達(dá)這些重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定克隆正在分離之中。它們將用生長(zhǎng)速率、DNA合成、細(xì)胞接觸抑制(焦點(diǎn)形成)、錨著不依賴性生長(zhǎng)(軟瓊脂測(cè)試)、和裸鼠中腫瘤引發(fā)性來表征。
在哺乳動(dòng)物中心體復(fù)制和分離中Aurora起什么作用呢 已知這一功能的阻斷和下調(diào)在酵母、果蠅和兩棲類中，會(huì)導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤，單極紡錘體和核的不均衡分裂。在人Aurora和酵母IPL1和果蠅aurora之間的同源性令人震驚。因此我們急需評(píng)估人aurora是否酵母IPL1的功能等同物。酵母IPL1對(duì)于在發(fā)面酵母(Saccharomyces cerevisiae)中高忠實(shí)性染色體分離是必需的(見義獻(xiàn)Francisco，L．et al，Mol，CellBiol．，144731-4740，1994)，并分離到一個(gè)溫度敏感性突變體。我們計(jì)劃確定是否各種全長(zhǎng)嵌合型的人Aurora可與酵母中的這一溫度敏感性互補(bǔ)。含有IPL1的N-末端和人Aurora的激酶區(qū)域的嵌合構(gòu)建體將使我們能夠確定該激酶是否功能等同，同時(shí)避開了由較低保守性的N-末端區(qū)域介導(dǎo)的潛在的調(diào)節(jié)或胞內(nèi)定位作用。如果該人類基因彌補(bǔ)了IPL1所缺乏的功能，然后我們可以使用這一細(xì)胞系來篩選人aurora激酶的小分子抑制物。實(shí)施例1分子克隆使用Chomczynski和Sacchi和胍鹽／酚抽提方法(見文獻(xiàn)P．Chomczynski和N．Sacchi，生物化學(xué)年報(bào)，162，156(1987))，從正常人前列腺、十二指腸、卵巢、肝、垂體、腦、胸腺、和唾液腺，從人HEPM細(xì)胞(腭間質(zhì))，從人原發(fā)腎胚胎瘤和卵巢癌，和從來自結(jié)腸／直腸(HT29，SW480，SW1463，SW1417，SW837，SW948，SW620，SW403，SW1116，T84，HTC15，LS123和Caco-2)，腎臟(CaKi-1，CaKi-2)，肝臟(SK-HEP-1)，胰臟(HS766T，ASPC，Capan-1)，和乳房(MCF7)人腫瘤細(xì)胞系中分離總RNA。
將這些RNA用作模板，使用單鏈合成的指數(shù)擴(kuò)增系統(tǒng)試劑盒(購自GibcoBRL，生命技術(shù)，U．S．A Gerard，GF等，(1989)，焦點(diǎn)11，66)，在制造商建議的條件下制備單鏈cDNA。一個(gè)典型的反應(yīng)在60μl的反應(yīng)體積中使用了10μg總RNA或2μg poly(A)+RNA和1．5μg寡(dT)12-18。將產(chǎn)物用RNase H處理并用H2O稀釋至100μl。對(duì)于隨后的PCR擴(kuò)增來說，每一反應(yīng)中使用了1-4μl的sscDNA。
寡核苷酸是在一個(gè)Applied Biosystems 394 DNA合成儀上合成的，使用的是已建立的氨基磷酸脂化學(xué)方法，并在用乙醇沉淀后以其非純化形式使用。簡(jiǎn)并寡核苷酸引物為A=5’-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3’(SEQ ID NO16)(有義鏈)和DVW=5’-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3’(SEQ ID NO17)(反義鏈)。
這些引物分別來自肽序列EFGEVFLA(SEQ ID NO18)(有義鏈來自激酶亞區(qū)域Ⅰ)和DVW(A／S)FGVL(反義鏈來自激酶亞區(qū)域Ⅸ)。簡(jiǎn)并核苷酸殘基的名稱為N=A，C，G或T；R=A或G，和Y=C或T。使用CCK4作為模板，這些引物產(chǎn)生了一個(gè)567bP的產(chǎn)物。
使用引物A和DVW及上列的單鏈原料進(jìn)行PCR反應(yīng)。加入的每一種引物的終濃度為5μm，混合物中含有10μm，Tris HCl(pH8．3)，50μm KCl，1．5μmMgCl2，200μm的每種脫氧核苷三磷酸，0．001％明膠，和1．5單位的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer／Cetus)，和1-4μl cDNA。在95℃變性3分鐘后，循環(huán)條件前3個(gè)循環(huán)為94℃30秒，37℃1分鐘，2分鐘提升至72℃，和72℃1分鐘，然后94℃30秒，50℃1分鐘和72℃1分鐘45秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。將2％瓊脂糖電泳膠上500-600bp之間的PCR片段分離，使用的是GeneClean(BiO101)，并按照制造商的說明T-A克隆至PCRⅡ載體(Invitrogen Corp．USA)中。
使用Qiagen核對(duì)選擇的菌落進(jìn)行微質(zhì)粒DNA制備，并使用循環(huán)測(cè)序染料一終止物試劑盒和AmpliTaq DNA聚合酶，F(xiàn)S(ABI，F(xiàn)oster City，CA)對(duì)該質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在ABI Prism 377DNA測(cè)序儀上電泳，并用BLAST校準(zhǔn)排列規(guī)則系統(tǒng)進(jìn)行分析(見文獻(xiàn)Altschul，S，F(xiàn)，et等，分子生物學(xué)雜志，215403-10)。通過使用引物A和DVW以及來自人胚胎腭間質(zhì)(HEPM或CRL1486)的單鏈cDNA作為模板分離到一個(gè)新的克隆(#43-43)。該克隆隨后被稱為人的Aurora1一個(gè)片段。
使用一種mRNA作為模板進(jìn)行第一鏈cDNA合成構(gòu)建了一個(gè)λZapⅡ(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)cDNA文庫，該mRNA來自一個(gè)胰癌細(xì)胞系的集合物。將噬菌作用隨機(jī)引發(fā)的32P標(biāo)記的插入物在硝酸纖維素膜上進(jìn)行篩選，該插入物來自編碼人的λAurora1的p43-43，雜交緩沖液的計(jì)數(shù)為2×1O6cpm／ml，該雜交緩沖液含有6×SSC，1×Denhardt’s試劑，0．1％SDS，以及0．1mg／ml片段化的鮭精DNA。65℃雜交過夜之后，將濾膜在0．1×SSC，0．1％SDS，65℃下洗滌。在兩條鏈上對(duì)全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，使用的是T7聚合酶和寡核苷酸引物的手工測(cè)序(見文獻(xiàn)Tabor和Richardson，美國科學(xué)院院刊844767-71)。實(shí)施例2Northern印跡分析Northern印跡含有來自16個(gè)不同的成人組織(脾、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、結(jié)腸粘膜、心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰臟、和外周血白細(xì)胞)，血種不同的胎兒組織(腦、肺、肝和腎)，和8種人癌細(xì)胞系(HL60，HeLa，K-562，MOLT-4，Raji，SW480，和G361)和每泳道2μg poly A+RNA。它是在電荷改性的尼龍膜上，得Clontech(PaloAlto，CA)。另外的Northern印跡的制備是通過將l0μg分離自人腫瘤細(xì)胞系的總RNA在變性甲醛1．2％瓊脂糖凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上來進(jìn)行的。
將濾膜用隨機(jī)引發(fā)的[32p]dCTP-標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，該探針是從來自人的Aurora1克隆43-43的527bp插入物和來自pSG20的1162bp的EcoRI片段中二者之一，和從人的Aurora2克隆11-1A的1kb EcoRI片段和來自pS621的1257bp BamHI-Notl片段中二者之一合成的。雜交是在60℃在6×SSC，0．1％SDS，1×Denhardt’s溶液，100mg／ml變性的鯡魚精DNA以及1-2×106cpm／ml的32P-標(biāo)記的DNA探針中過夜進(jìn)行的。將該濾膜在0．1×SSC／0．1％SDS中，65℃下洗滌，并在Kodak XAR-2膠片上曝光。
鑒別到一個(gè)約1．4kb的單一的AUR1 mRNA轉(zhuǎn)錄物，并發(fā)現(xiàn)它在胸腺和小腸中大量存在，而在精巢、卵巢、結(jié)腸、胎盤和脾中信號(hào)很弱。前列腺和外周血淋巴細(xì)胞為陰性。人胎兒肝和腎也為陰性，在胎兒肺中信號(hào)很弱，在胎兒腦中沒有表達(dá)(見表)。
對(duì)人AUR2表達(dá)進(jìn)行類似分析的結(jié)果顯示其表達(dá)的范圍更窄。一個(gè)單一的2．4kb AUR2轉(zhuǎn)錄物在成人精巢和胸腺中被強(qiáng)烈地檢測(cè)到，在心、胎和骨骼中以及胎兒肝和腎很弱，而其它來源的正常組織為陰性(見表)。
在人正常組織和癌細(xì)胞中對(duì)AUR-1和AUR-2的Northern分析
ND沒有檢測(cè)在幾種原發(fā)腫瘤和多種腫瘤來源的多細(xì)胞系中對(duì)AUR1 mRNA表達(dá)圖譜通過Northern分析和通過使用來自AUR1激酶區(qū)域中序列的引物的半定量PCR檢測(cè)進(jìn)行確定。結(jié)果示于表中。在每一種檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞系中在下述細(xì)胞系中檢測(cè)到AUR1轉(zhuǎn)錄物具有最高的表達(dá)值幾種人結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480，Colo320，SW620，SW1417，Caco2，SW12417)和肺癌(Calu3)，乳腺癌(T47D，MCF7)，黑素瘤(A375)，腎癌(Caki-1，CaKi-2)，肝癌(SK-HEP-1)，和中性腫瘤(SF767，T98G)。在其它結(jié)腸癌中觀察到較低的AUR1表達(dá)(HTC15，T84，SW948，SW1116，HT29)，中性腫瘤(Daoy)，卵巢癌(Ovcar3，原發(fā)癌)，胰癌(HS766T)，和原發(fā)腎癌。
在腫瘤細(xì)胞系中AUR2表達(dá)的圖譜比AUR1窄得多。僅在結(jié)腸癌細(xì)胞系(Caco2，SW480，SW1417，SW620)中觀察到AUR2的強(qiáng)表達(dá)，而在其它結(jié)腸(HTC15，Colo320)，乳腺(T47D，MCF7)和肺(Calu3)腫瘤細(xì)胞系中觀察到弱的信號(hào)。幾種其它種瘤細(xì)胞系中檢測(cè)不到AUR2轉(zhuǎn)錄物。實(shí)施例3AURORA1的半定量PCR檢測(cè)從許多人的細(xì)胞系、新鮮冷凍組織和原發(fā)腫瘤中分離出RNA。從10mg上述每種RNA，使用Superscript Preamplification System(GibcoBRL)合成單鏈cDNA。然后將這些單鏈模板用于35循環(huán)的PCR反應(yīng)，使用兩種AUTORA Ⅰ特異性寡核苷酸(34765’TTTGGCTCGGGAGAAGAAAAGCCAT-3’(SEQID NO19)，和35065-CAATACTCTGGGGGCAGGTAGT-3’)(SEQ ID NO20)。將反應(yīng)產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，用溴乙錠染色并在UV光盒中光攝影。對(duì)每一樣品的約475bp AURORA1特異性帶的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。實(shí)施例4Southern印跡分析用標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis et al．，)，從各種轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞系(Caco2，HTC15，LS147，SKCO4，SW480，SW403，SW620，SW948，SW1417，SW1116，MCF7，BT474)分離基因組DNA。將細(xì)胞用胰蛋白酶處理，用PBS洗滌，并以約108細(xì)胞／ml的濃度重新懸浮于消化緩沖液(100mM NaCl，10Mm TrispH8，25mM EDTA，pH8，0．5％SDS，0．1mg／ml蛋白酶K)。將細(xì)胞在50℃溫育12小時(shí)進(jìn)行裂解，然后用酚／氯仿提取并用等體積的7．5M乙酸氨和100％EtOH進(jìn)行沉淀。將DNAs重新懸浮于TE緩沖液。用HindⅢ或XhoⅡ在37℃將約20微克基因組DNA消化至少4小時(shí)，然后在1％瓊脂糖凝膠上分離。將DNA片段通過毛細(xì)轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(見文獻(xiàn)Southern，EM，J．Mol．Bio．98503，1975)，并用人的Aurora1和Aurora2特異性探針按照上述的Northern印跡分析進(jìn)行雜交。
DNA被HindⅢ酶，因AUR1和AUR2 cDNA二者均含有該限制性酶的單一位點(diǎn)。所有來源的AUR1均顯示一個(gè)單一的4．3kb強(qiáng)度相等的帶，提示它在所檢測(cè)的多種腫瘤類型中是單一拷貝的非重排基因。但是，在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，我們能夠檢測(cè)到與AUR1探針微弱雜交的1．3kb和3．2kb的SacⅠ片段?？寺『托蛄蟹治霰砻鳎@一區(qū)段編碼一個(gè)無內(nèi)含子的AUR1相關(guān)的假基因(稱作AUR3)，并具有多重移框突變。而且，緊接AUR3假基因的上游是一個(gè)具有復(fù)雜的反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)段，推測(cè)會(huì)形成一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)。AUR3 DNA序列與從AUR1 cDNA的第一個(gè)核苷酸開始的AUR1具有同源性。堅(jiān)持在這一位點(diǎn)上游，是推測(cè)的AUR3的發(fā)夾環(huán)。我們目前正在研究AUR1基因組克隆，以確定這一對(duì)AUR3的同源性是否從該核苷酸的上游繼續(xù)下來，以及AUR1 cDNA是否包括或在其前面有一個(gè)類似的發(fā)夾環(huán)。從所有的來源中AUR2顯示了在7．Okb和4．3kb的帶以及一個(gè)模糊的約10kb的較高分子量的帶。這些結(jié)果提示AUR2也為一單拷貝基因。在用AUR2探測(cè)的印跡上看的多重帶可能是由于使用了全長(zhǎng)cDNA探針的緣故。實(shí)施例5對(duì)人的AURORA1和AURORA2編碼cDNA克隆的序列分析人的AURORA1和AURORA2的全部序列是從它們的全長(zhǎng)克隆和從HEPM細(xì)胞分離的部分人AURORA1克隆確定的，這些全長(zhǎng)克隆分離自人胰癌、正常人十二指腸文庫。
1244bp的人Aurora1(AUR1-h)的核苷酸序列示于SEQ ID NO1或SEQID NO2，并包含一個(gè)編碼344個(gè)氨基酸的多肽的單一開放閱讀框。該AUR1-h編碼區(qū)段由一個(gè)54核苷酸的5人非轉(zhuǎn)譯區(qū)段和一個(gè)132核苷酸的3’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)段側(cè)接，終止于聚(A)尾。
2198bp的人Aurora2(AUR2-h)核苷酸序列示于SEQ ID NO1或SEQID NO2，并含有一個(gè)編碼403氨基酸的多肽的單一開放閱讀框。該AUR2-h編碼區(qū)段由一個(gè)200核苷酸的51’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)段和一個(gè)768核苷酸的3’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)段側(cè)接。
從人胰臟腫瘤和正常人十二指腸兩者中均對(duì)AUR1和AUR2 cDNA編成序列，除了一些可能的多態(tài)性位點(diǎn)外沒有序列差異。這種模板兩可的情況包括cDNA 核苷酸 注釋AUR1 1174一個(gè)克隆具有聚A插入873在所有十指腸克隆中為T，在胰癌中為C469一個(gè)克隆中為T，其它均為C848一個(gè)克隆中為G，其它均為A-氨基酸E變換成G1097一個(gè)克隆中為G，兩個(gè)其它克隆中為T956一個(gè)克隆中為G，兩個(gè)其它克隆中為A295個(gè)克隆中剪切至103，5個(gè)克隆中沒有剪切AUR2394一個(gè)克隆中為T，多個(gè)其它克隆中為C(氨基酸P變成L)396這 3個(gè)克隆中為A，多個(gè)其它克隆中為G(氨基酸Ⅴ變成Ⅰ)AUR1和AUR2的C-末端部分保留了作為真核蛋白質(zhì)激酶的所有12個(gè)亞區(qū)域。該AUR1和AUR2激酶前面的N-末端區(qū)域分別為74和130氨基酸。該AUR1和AUR2核苷酸和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ IDNO3或SEQ ID NO4)與可得到的DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的比較結(jié)果表明，除了幾個(gè)EST序列享有高的序列一致性外它們是獨(dú)特的。但它們?cè)贜-末端和催化區(qū)域中與果蠅aurora和發(fā)面酵母(SaccharomycesCerevisiae)ILP1基因具有驚人的同源性。而且，兩個(gè)沒有發(fā)表的數(shù)據(jù)庫條目可能是來自在Xenopus Laevis的相近的同系物(p46 APK-GBaccession #217206和p46 BPK-GB aceession #217207)。
來自人、蛙、果蠅和酵母的Auroras的N-末端區(qū)域共有很有限的序列一致性。要求AUR2要有大量的常成對(duì)存在并通過單一殘基分隔開的谷氨鹽。
這些蛋白質(zhì)催化區(qū)域相比較的結(jié)果表明，AUR1和AUR2具有7％氨基酸的一致性，與果蠅Aurora具有61％，與酵母IPL1基因具有4％。AUR2與該果蠅蛋白質(zhì)具有60％氨基酸一致性，與酵母IPL1具有45％一致性。AUR1和AUR2兩者與所有其它已知的哺乳動(dòng)物激酶具有45％以下的一致性(最接近的是cAMP-依賴性蛋白質(zhì)激酶A)，提示它們?yōu)檫@些果蠅和酵母激酶的同系物。
AUR1和AUR2二者均含有一個(gè)cAMP-依賴性蛋白質(zhì)激酶磷酸代位點(diǎn)(AUR1的THR232和AUR2的THR288)，它們?cè)诠壓徒湍竿滴镏惺潜Ｊ氐?，并且是一個(gè)在細(xì)胞周期蛋白-依賴性激酶p34cdc2中已知的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。AUR2在SER342處含有一個(gè)額外的PKA位點(diǎn)。該兩個(gè)蛋白質(zhì)也具有多個(gè)Casein激酶Ⅱ(AUR1和AUR2分別為5個(gè)和6個(gè))和蛋白質(zhì)激酶C(AUR1和AUR2分別為4個(gè)和10個(gè))磷酶化位點(diǎn)。AUR2也具有在TYK334處的單一酪氨酸磷酸化共有位點(diǎn)，它在果蠅Aurora中也是保守的，但不存在于AUR1或酵母IPL1中。
令人驚奇的是果蠅aurora AUR-dm和酵母IPL1基的自然突變物導(dǎo)致核的不均衡分裂，導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤，及不正常的單極紡綞體。這一表型好象產(chǎn)生于中心體分離失敗。相關(guān)的微管構(gòu)造好象沒受影響。在果蠅和酵母二者靶氨基酸殘基中的自然突變被嚴(yán)格地保留在這兩種人的AURORA之間，進(jìn)一步支持了它們可能是功能同系物。在AUR-dm或IPL1的自然突變物中發(fā)現(xiàn)的AUR1中相應(yīng)的殘基為GLU125、THR232、PRO312、HIS324。所有這些突變均位于催化區(qū)域之內(nèi)，并且值得注意的是，有一個(gè)是代表著保守的PKA-磷酸化位點(diǎn)。在AUR-dm中于ASP47的一個(gè)額外的突變是在N-末端區(qū)域中的一個(gè)非保守殘基上。
這些研究結(jié)果使人想到，該催化活性在低等生物中確實(shí)可能在中心體復(fù)制和分離的生物學(xué)中起著一個(gè)重要的作用，并想到人的Aurora在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可能起一個(gè)補(bǔ)充的作用。實(shí)施例6AURORA1和AURORA2的重組表達(dá)表達(dá)載體構(gòu)建通過PCR-協(xié)助的誘變制備表達(dá)構(gòu)建體，其中AURORA1和AURORA2的整個(gè)編碼區(qū)域的C-末端被連接上流感嗜血桿菌凝血素(hemophilusinfluenza hemaglutin，HA)抗原決定基YPYDVPDYAS(SEQ IDNO21)(Pati，1992)。將這些構(gòu)建體導(dǎo)入兩個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pLXSNC(見文獻(xiàn)Miller，A，D，& Rosman，G，J，Biotechniques 7，980-988，1989)，以制備出產(chǎn)病毒細(xì)胞系的生成；和pRK5，以進(jìn)行瞬間表達(dá)分析。插入物被設(shè)計(jì)成由獨(dú)特的BamHⅠ和NotⅠ位點(diǎn)側(cè)接并在5’-BamHⅠ和3’-NotⅠ位點(diǎn)被直接克隆進(jìn)pLXSN或pRK5。
該BamHⅠ-NotⅠ全長(zhǎng)AUR1和AUR2構(gòu)建體也被連接進(jìn)pRS316(Liu，H．etal．Genetics 132665-673，1992)。該載體含有一個(gè)在著絲粒穿梭載體中的半乳糖-可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以在發(fā)面酵母中表達(dá)。這是用來評(píng)估人的基因是否能互補(bǔ)相關(guān)的溫度敏感型酵母IPL1突變體，它與AUR1密切相關(guān)。此外，也制備了含有與AUR1和AUR2基因的C-末端區(qū)域相融合的酵母IPL1的N-末端區(qū)域的融合構(gòu)建體。這些是通過半人工ClaⅠ位點(diǎn)插入該激酶的激酶區(qū)域的5’-端，在保守的Asp-Asp-Phe-GLu序列中而產(chǎn)生的。
在pLXSN和pRK5二者中通過使PCR誘變將常量Lys(在AUR1和AUR2的氨基酸位置分別為106和162)突變成Met也制備了AUR1和AUR2的顯性陰性AUR1和AUR2構(gòu)建體。這些構(gòu)建體被稱為AUR1KM和AUR2KM。AUR1和AUR2的組成型活性形式是通過引導(dǎo)編碼磷酸化位點(diǎn)(232和288)的DNA突變成Asp而進(jìn)行的，產(chǎn)生AUR1TD和AUR2TD。
在pLXSN和pRK5二者中也制備了表達(dá)構(gòu)建體，它們僅含有AUR1和AUR2N-末端的非催化區(qū)域。它們是通過PCR從其親代構(gòu)建體產(chǎn)生的，并含有AUR1的N-末端的77個(gè)氨基酸和和AUR2的132個(gè)氨基酸。
該不含有起始甲硫氨酸的完整AUR1和AUR2開放閱讀框(沒有HA-標(biāo)簽)通過PCR而產(chǎn)生，并被連接進(jìn)pGEX載體，以通過細(xì)菌產(chǎn)生GST-融合蛋白質(zhì)，用于免疫兔子，產(chǎn)生抗體。實(shí)施例7制備產(chǎn)病毒的AURORA細(xì)胞系為制備高滴度的病毒原種，將含有AUR1和AUR2基因的pLXSN重組構(gòu)建體用CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染進(jìn)雙嗜性輔助細(xì)胞系PA317。在G418上選擇之后，將細(xì)胞在沒有G418的培養(yǎng)在上鋪板(500μg／ml)。將來自抗性細(xì)胞的上清液用于感染親嗜性輔助細(xì)胞系GP+E86，并將細(xì)胞再在G418上選擇。將抗性細(xì)胞再次除去G418，將每8-12小時(shí)收獲的上清液集中在一起作為病毒原種(見文獻(xiàn)RedemannN．，Holzmann，B．，Wagner，E．F．，Schlessinger，J．，& Ullrich，A．，Mol．Cell，Biol．12，491-498(1992)。病毒原種的滴度一般為約106／ml。實(shí)施例8具有AURORA的NIH-3T3細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將NIH-3T3和BALB／3T3細(xì)胞在含有10％小牛血清(FCS)的DMEM(Gibco)生長(zhǎng)于100mm平板上。將細(xì)胞用AUR1和AUR2逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行超感染，這是通過向15ml培養(yǎng)基中加入約3ml病毒上清液。進(jìn)行約24小時(shí)。然后將表達(dá)該逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體的細(xì)胞通過在添加了500μg／ml G418的DMEM／10％FCS中生長(zhǎng)而進(jìn)行選擇。實(shí)施例9AURORA特異性免疫試劑的制備AURORA特異性免疫試劑是在兔中針對(duì)KLH-結(jié)合的合成肽產(chǎn)生的，這些肽對(duì)應(yīng)于AUR2的N-末端區(qū)段(104SAPENNPEEQLASK117)(SEQ IDNO22)和(90RPLNNTQKSKQPL102)(SEQ ID NO23)或者人的AUR1的N-末端或N-末端區(qū)域(1MAQKENSYPWPYG13)(SEQ ID NO24)和(53PGQKVMENSSGTP65)(SEQ ID NO25)。另外的免疫試劑是用細(xì)菌表達(dá)的全長(zhǎng)AUR1和AUR2 GST-融合蛋白質(zhì)在兔中免疫而產(chǎn)生的。實(shí)施例10AURORA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的瞬間表達(dá)將含有HA-標(biāo)記的AUR1和AUR2基因的pRK5表達(dá)質(zhì)粒(10μgDNA／100mm平板)用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco BRL)導(dǎo)入COS和293細(xì)胞中。72小時(shí)之后，收獲細(xì)胞至0．5ml溶解緩沖液中(20mM HEPESpH7．35，150mM NaCl，10％甘油，1％ Triton X-100，1．5mM MgCl2，1mM EGTA，2mM苯基甲基磺酰氟，1μg／ml抑蛋白酶肽)。將等份樣品通過SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)在15％丙烯酰胺／0．5％雙丙烯酰膠凝膠上電泳并電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。非特異性結(jié)合通過在Blotto(含有5％w／v脫脂奶粉和0．2％v／v乙基苯基聚乙二醇p-40(sigma)的磷酸鹽緩沖液)中預(yù)溫育印跡來進(jìn)行封閉，使用鼠對(duì)HA+肽標(biāo)記物的單克隆抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)?；蛘?，重組蛋白質(zhì)可使用各種AUR1-或AUR2-特異性抗血清來檢測(cè)。實(shí)施例11髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)是一種AURORA1和AURORA2激酶的人工底物方法將人的染色腺癌(colorectal)SW480細(xì)胞培養(yǎng)在添加了10％小牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素的RPMI1640中。將SW480細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物用冰凍磷酸緩沖液(PBS)洗三次，然后在1ml冰凍PBS中打碎。將細(xì)胞在4℃1000rpm離心，取出PBS，將所得細(xì)胞團(tuán)貯存于-80℃。將來自3個(gè)15cm平板的細(xì)胞團(tuán)在冰上解凍，再懸浮于總體積1ml的激酶裂解緩沖液中(50mM HEPES pH7．4，100mM KCl，25mMNaF，1mM NaVO3，0．5％NP40，1mM DTT，2μg／ml抑蛋白酶肽，和1μg／ml亮抑酶肽)，然后在4℃徐徐旋轉(zhuǎn)20分鐘。然后將樣品在1000×g，4℃離心10分鐘，再將所得上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)潔凈的1．5ml離心管中并在冰上保存。用Bradford分析確定蛋白質(zhì)濃度。將1mg總蛋白質(zhì)用10μl蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(Boehringer)在4℃預(yù)清潔15分鐘，然后加入2μl兔的免疫前血清，親和純化的aurora1肽抗血清，親和純化的auroral肽抗血清加上6μg競(jìng)爭(zhēng)Aarora1肽，親和純化的aurora2肽抗血清，或者，親和純化的aurora2肽抗血清加上6μg的競(jìng)爭(zhēng)aurora2肽并在4℃溫育30分鐘。隨后加入10μl蛋白質(zhì)A-瓊脂糖，并繼續(xù)在4℃另外溫育45分鐘。將該試管短暫離心，使抗體-蛋白質(zhì)A-瓊脂糖復(fù)合體集中，并將所產(chǎn)生的上清液吸去。將該抗體-蛋白質(zhì)A-瓊脂糖團(tuán)塊用0．5ml激酶裂解緩沖液洗兩次，然后用0．5ml激酶緩沖液(20mM HEPESpH7．4，125mM KCl，10mM MgCl2，1mM NaF，1mM NaNO3，t 1mm DTT)洗一次。將該抗體-蛋白質(zhì)A-瓊脂糖團(tuán)塊再懸浮于20μl含有5μCi(γ-32P)ATP和0．5mg／ml髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)(Sigma)的激酶緩沖液中，在37℃溫育20分鐘，之后加入10μl蛋白質(zhì)樣品緩沖液(200mMTris-HCl pH6．8，40％甘油，730mM B-巰基乙醇，0．4％SDS，和0．05％溴酚藍(lán))。將該試管充分混合，并在100℃溫育5分鐘。將樣品在18％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過放射自影觀察結(jié)果。結(jié)果AURORA1和AURORA2免疫復(fù)合體能夠使髓鞘質(zhì)堿性蛋白磷酸化。當(dāng)在免疫沉淀中使用了競(jìng)爭(zhēng)肽時(shí)，aurora1或aurora2抗血清二者均不能比免疫前的對(duì)照血清更能使髓鞘質(zhì)堿性蛋白磷酸化。這提示觀察到的激酶活性是由aurora1和aurora2產(chǎn)生的，而不是免疫復(fù)合體中存在的其它蛋白質(zhì)。
這一現(xiàn)象使我們能夠使用髓鞘質(zhì)堿性蛋白作為底物按照激酶活性來純化有活性的aurora1和aurora2激酶。它也使我們能夠使用重組aurora1和2蛋白質(zhì)開發(fā)出體外激酶檢測(cè)方法。而且，aurora1和2的體外激酶檢測(cè)方法可使人們能夠篩選一個(gè)小的分子樣品中的aurora1和2的抑制物，這是通過測(cè)定髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)的磷酸化抑制來進(jìn)行的。
本發(fā)明在此作適度舉例說明，可能實(shí)踐起來缺少在此未曾專門公開的任何一種要素或多種要素，任何一種限制因素或多種限制因素。所使用的術(shù)語和表達(dá)方式只是一種說明方式，不是一種限定，并不意味著這些術(shù)語和表達(dá)方式的使用排除了所示和所描述的技術(shù)特征或其部分的任何等同物。應(yīng)認(rèn)識(shí)到可以進(jìn)行各種變換而不脫離本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。因而，雖然本發(fā)明通過優(yōu)先實(shí)施方案和可選擇方案進(jìn)行了公開，本文中公開的概念的各種變換可能被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用，而這種變換被認(rèn)為是處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
上文中沒有引入本文的參考文獻(xiàn)，包括專利和非專利文獻(xiàn)均引入本文作為參考。其它的實(shí)施方案描述于權(quán)利要求中。
序列表(1)總信息(ⅰ)申請(qǐng)人Mossie，Kevin G．Plowman，Gregory D．(ⅱ)發(fā)明名稱AUR-1和或AUR-2相關(guān)疾病的診斷與治療(ⅲ)序列數(shù)目6(ⅳ)通信地址(A)收信人Lyon & Lyon(B)街道633 West Fifth Street，Suite 4700(C)城市Los Angeles(D)州CA(E)國家USA(F)郵政編碼90071-2066(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1．0，Version#1．30(ⅵ)目前申請(qǐng)狀態(tài)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅷ)代理人信息(A)姓名Warburg，Richard J．(B)登記號(hào)32327(ⅸ)通訊資料(A)電話(213)489-1600(B)傳真(213)955-0440(C)電傳67-3510(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1244堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假定否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體人類(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID N01CGGGAGAGTA GCAGTGCCTT GGACCCCAGC TCTCCTCCCC CTTTCTCTCT AAGGATGGCC 60CAGAAGGAGA ACTCCTACCC CTGGCCCTAC GGCCGACAGA CGGCTCCATC TGGCCTGAGC120ACCCTGCCCC AGCGAGTCCT CCGGAAAGAG CCTGTCACCC CATCTGCACT TGTCCTCATG180AGCCGCTCCA ATGTCCAGCC CACAGCTGCC CCTGGCCAGA AGGTGATGGA GAATAGCAGT240GGGACACCCG ACATCTTAAC GCGGCACTTC ACAATTGATG ACTTTGAGAT TGGGCGTCCT300CTGGGCAAAG GCAAGTTTGG AAACGTGTAC TTGGCTCGGG AGAAGAAAAG CCATTTCATC360GTGGCGCTCA AGGTCCTCTT CAAGTCCCAG ATAGAGAAGG AGGGCGTGGA GCATCAGCTG420CGCAGAGAGA TCGAAATCCA GGCCCACCTG CACCATCCCA ACATCCTGCG TCTCTACAAC480TATTTTTATG ACCGGAGGAG GATCTACTTG ATTCTAGAGT ATGCCCCCCG CGGGGAGCTC540TACAAGGAGC TGCAGAAGAG CTGCACATTT GACGAGCAGC GAACAGCCAC GATCATGGAG600GAGTTGGCAG ATGCTCTAAT GTACTGCCAT GGGAAGAAGG TGATTCACAG AGACATAAAG660CCAGAAAATC TGCTCTTAGG GCTCAAGGGA GAGCTGAAGA TTGCTGACTT CGGCTGGTCT720GTGCATGCGC CCTCCCTGAG GAGGAAGACA ATGTGTGGCA CCCTGGACTA CCTGCCCCCA780GAGATGATTG AGGGGCGCAT GCACAATGAG AAGGTGGATC TGTGGTGCAT TGGAGTGCTT840TGCTATGAGC TGCTGGTGGG GAACCCACCC TTCGAGAGTG CATCACACAA CGAGACCTAT900CGCCGCATCG TCAAGGTGGA CCTAAAGTTC CCCGCTTCTG TGCCCACGGG AGCCCAGGAC960CTCATCTCCA AACTGCTCAG GCATAACCCC TCGGAACGGC TGCCCCTGGC CCAGGTCTCA020GCCCACCCTT GGGTCCGGGC CAACTCTCGG AGGGTGCTGC CTCCCTCTGC CCTTCAATCT080GTCGCCTGAT GGTCCCTGTC ATTCACTCGG GTGCGTGTGT TTGTATGTCT GTGTATGTAT140AGGGGAAAGA AGGGATCCCT AACTGTTCCC TTATCTGTTT TCTACCTCCT CCTTTGTTTA200ATAAAGGCTG AAGCTTTTTG TAAAAAAACA AAAAAAAAAA AAAA 1244(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2198堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假定否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GGGATATCTC AGTGGCGGAC GAGGACGGCG GGGACAAGGG GCGGCTGGTC GGAGTGGCGG 60ACGTCAAGTC CCCTGTCGGT TCCTCCGTCC CTGAGTGTCC TTGGCGCTGC CTTGTGCCCG120CCCAGCGCCT TTGCATCCGC TCCTGGGCAC CGAGGCGCCC TGTAGGATAC TGCTTGTTAC180TTATTACAGC TAGAGGCATC ATGGACCGAT CTAAAGAAAA CTGCATTTCA GGACCTGTTA240AGGCTACAGC TCCAGTTGGA GGTCCAAAAC GTGTTCTCGT GACTCAGCAA TTTCCTTGTC300AGAATCCATT ACCTGTAAAT AGTGGCCAGG CTCAGCGGGT CTTGTGTCCT TCAAATTCTT360CCCAGCGCGT TCCTTTGCAA GCACAAAAGC TTGTCTCCAG TCACAAGCCG GTTCAGAATC420AGAAGCAGAA GCAATTGCAG GCAACCAGTG TACCTCATCC TGTCTCCAGG CCACTGAATA480ACACCCAAAA GAGCAAGCAG CCCCTGCCAT CGGCACCTGA AAATAATCCT GAGGAGGAAC540TGGCATCAAA ACAGAAAAAT GAAGAATCAA AAAAGAGGCA GTGGGCTTTG GAAGACTTTG600AAATTGGTCG CCCTCTGGGT AAAGGAAAGT TTGGTAATGT TTATTTGGCA AGAGAAAAGC660AAAGCAAGTT TATTCTGGCT CTTAAAGTGT TATTTAAAGC TCAGCTGGAG AAAGCCGGAG720TGGAGCATCA GCTCAGAAGA GAAGTAGAAA TACAGTCCCA CCTTCGGCAT CCTAATATTC780TTAGACTGTA TGGTTATTTC CATGATGCTA CCAGAGTCTA CCTAATTCTG GAATATGCAC840CACTTGGAAC AGTTTATAGA GAACTTCAGA AACTTTCAAA GTTTGATGAG CAGAGAACTG900CTACTTATAT AACAGAATTG GCAAATGCCC TGTCTTACTG TCATTCGAAG AGAGTTATTC960ATAGAGACAT TAAGCCAGAG AACTTACTTC TTGGATCAGC TGGAGAGCTT AAAATTGCAG020ATTTTGGGTG GTCAGTACAT GCTCCATCTT CCAGGAGGAC CACTCTCTGT GGCACCCTGG080ACTACCTGCC CCCTGAAATG ATTGAAGGTC GGATGCATGA TGAGAAGGTG GATCTCTGGA140GCCTTGGAGT TCTTTGCTAT GAATTTTTAG TTGGGAAGCC TCCTTTTGAG GCAAACACAT200ACCAAGAGAC CTACAAAAGA ATATCACGGG TTGAATTCAC ATTCCCTGAC TTTGTAACAG260AGGGAGCCAG GGACCTCATT TCAAGACTGT TGAAGCATAA TCCCAGCCAG AGGCCAATGC320TCAGAGAAGT ACTTGAACAC CCCTGGATCA CAGCAAATTC ATCAAAACCA TCAAATTGCC380AAAACAAAGA ATCAGCTAGC AAACAGTCTT AGGAATCGTG CAGGGGGAGA AATCCTTGAG440CCAGGGCTGC CATATAACCT GACAGGAACA TGCTACTGAA GTTTATTTTA CCATTGACTG500CTGCCCTCAA TCTAGAACGC TACACAAGAA ATATTTGTTT TACTCAGCAG GTGTGCCTTA560ACCTCCCTAT TCAGAAAGCT CCACATCAAT AAACATGACA CTCTGAAGTG AAAGTAGCCA620CGAGAATTGT GCTACTTATA CTGGTTCATA ATCTGGAGGC AAGGTTCGAC TGCAGCCGCC680CCGTCAGCCT GTGCTAGGCA TGGTGTCTTC ACAGGAGGCA AATCCAGAGC CTGGCTGTGG740GGAAAGTGAC CACTCTGCCC TGACCCCGAT CAGTTAAGGA GCTGTGCAAT AACCTTCCTA800GTACCTGAGT GAGTGTGTAA CTTATTGGGT TGGCGAAGCC TGGTAAAGCT GTTGGAATGA860GTATGTGATT CTTTTTAAGT ATGAAAATAA AGATATATGT ACAGACTTGT ATTTTTTCTC920TGGTGGCATT CCTTTAGGAA TGCTGTGTGT CTGTCCGGCA CCCCGGTAGG CCTGATTGGG980TTTCTAGTCC TCCTTAACCA CTTATCTCCC ATATGAGAGT GTGAAAAATA GGAACACGTG040CTCTACCTCC ATTTAGGGAT TTGCTTGGGA TACAGAAGAG GCCATGTGTC TCAGAGCTGZ100TAAGGGCTTA TTTTTTTAAA ACATTGGAGT CATAGCATGT GTGTAAACTT TAAATATGCA160AATAAATAAG TATCTATGTC AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2198(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度344氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Gln Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Arg Gln Thr1 5 10 15Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gln Arg Val Leu Arg Lys Glu20 25 30Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu Val Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gln35 40 45Pro Thr Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Met Glu Asn Ser Ser Gly Thr50 55 60Pro Asp Ile Leu Thr Arg His Phe Thr Ile Asp Asp Phe Glu Ile Gly65 70 75 80Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu85 90 95Lys Lys Ser His Phe Ile Val Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ser Gln100 105 110Ile Glu Lys Glu Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Ile Glu Ile115 120 125Gln Ala His Leu His His Pro Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Asn Tyr Phe130 135 140Tyr Asp Arg Arg Arg Ile Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Arg Gly145 150 155 160Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Gln Lys Ser Cys Thr Phe Asp Glu Gln Arg165 170 175Thr Ala Thr Ile Met Glu Glu Leu Ala Asp Ala Leu Met Tyr Cys His180 185 190Gly Lys Lys Val Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu195 200 205Gly Leu Lys Gly Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His210 215 220Ala Pro Ser Leu Arg Arg Lys Thr Met Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu225 230 235 240Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg Met His Asn Glu Lys Val Asp Leu245 250 255Trp Cys Ile Gly Val Leu Cys Tyr Glu Leu Leu Val Gly Asn Pro Pro260 265 270Phe Glu Ser Ala Ser His Asn Glu Thr Tyr Arg Arg Ile Val Lys Val275 280 285Asp Leu Lys Phe Pro Ala Ser Val Pro Thr Gly Ala Gln Asp Leu Ile290 295 300Ser Lys Leu Leu Arg His Asn Pro Ser Glu Arg Leu Pro Leu Ala Gln305 310 315 320Val Ser Ala His Pro Trp Val Arg Ala Asn Ser Arg Arg Val Leu Pro325 330 335Pro Ser Ala Leu Gln Ser Val Ala340(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度403氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定否(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser Gly Pro Val Lys Ala Thr1 5 10 15Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Thr Gln Gln Phe Pro20 25 30Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu35 40 45Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu50 55 60Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln ASn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln65 70 75 80Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln
85 90 95Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu100 105 110Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp115 120 125Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe130 135 140Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe Ile Leu Ala145 150 155 160Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His165 170 175Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn180 185 190Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu195 200 205Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys210 215 220Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr Ile Thr Glu Leu225 230 235 240Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val Ile His Arg Asp245 250 255Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys Ile260 265 270Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr275 280 285Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg290 295 300Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr305 310 315 320Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln Glu325 330 335Thr Tyr Lys Arg Ile Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val340 345 350Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ile Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro355 360 365Ser Gln Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp Ile Thr370 375 380Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser385 390 395 400Lys Gln Ser
權(quán)利要求
1.一種分離的、富集的或純化的編碼AUR1和／或AUR2多肽的核酸分子。
2.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的核酸是人的核酸。
3.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少25個(gè)相鄰接的氨基酸。
4.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少50個(gè)相鄰接的氨基酸。
5.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少100個(gè)相鄰接的氨基酸。
6.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少200個(gè)相鄰接的氨基酸。
7.按照權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少300個(gè)相鄰接的氨基酸。
8.一種用于檢測(cè)樣品中編碼AUR1和／或AUR2多肽的核酸的探針。
9.按照權(quán)利要求8所述的探針，其特征在于所述的多肽包括SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少25個(gè)相鄰接的氨基酸。
10.按照權(quán)利要求8所述的探針，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少50個(gè)相鄰接的氨基酸。
11.按照權(quán)利要求8所述的探針，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少100個(gè)相鄰接的氨基酸。
12.按照權(quán)利要求8所述的探針，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少200個(gè)相鄰接的氨基酸。
13.按照權(quán)利要求8所述的探針，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少300個(gè)相鄰接的氨基酸。
14.一種重組核酸分子，其編碼AUR1和／或AUR2多肽以及一個(gè)在宿主細(xì)胞中對(duì)起始轉(zhuǎn)錄有效的載體或啟動(dòng)子。
15.一種重組核酸分子，其特征在于它含有一種在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄區(qū)段，一種與編碼AUR-1或AUR-2多肽的RNA序列互補(bǔ)的序列和一種在細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)段。
16.一種分離的、富集的或純化的AUR-1或AUR-2多肽。
17.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少25個(gè)相鄰接的氨基酸。
18.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少50個(gè)相鄰接的氨基酸。
19.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少100個(gè)相鄰接的氨基酸。
20.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少200個(gè)相鄰接的氨基酸。
21.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少300個(gè)相鄰接的氨基酸。
22.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是從哺乳動(dòng)物中分離的、純化的、或富集的。
23.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是從人中分離的、純化的、或富集的。
24.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是一種AUR-1多肽。
25.按照權(quán)利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是一種AUR-2多肽。
26.一種對(duì)AUR-1或AUR-2多肽具有特異的結(jié)合親和性的抗體。
27.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少3個(gè)相鄰接的氨基酸。
28.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少4個(gè)相鄰接的氨基酸。
29.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少25個(gè)相鄰接的氨基酸。
30.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少50個(gè)相鄰接的氨基酸。
31.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少100個(gè)相鄰接的氨基酸。
32.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的多肽是從哺乳動(dòng)物中分離的、純化的、或富集的。
33.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的多肽是從人中分離的、純化的、或富集的。
34.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的多肽是一種AUR-1多肽。
35.按照權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于所述的多肽是一種AUR-2多肽。
36.一種產(chǎn)生對(duì)AUR-1和／或AUR-2多肽具有特異的結(jié)合親和性的抗體的雜交瘤。
37.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少25個(gè)相鄰接的氨基酸。
38.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少50個(gè)相鄰接的氨基酸。
39.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少100個(gè)相鄰接的氨基酸。
40.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少200個(gè)相鄰接的氨基酸。
41.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少300個(gè)相鄰接的氨基酸。
42.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的多肽是從一種哺乳動(dòng)物中分離的、純化的、或富集的。
43.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的多肽是從人中分離的、純化的、或富集的。
44.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的多肽是一種AUR-1多肽。
45.按照權(quán)利要求36所述的雜交瘤，其特征在于所述的多肽是一種AUR-2多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及AUR－1和/或AUR－2多肽,編碼這種多肽的核酸,含有這種核酸的細(xì)胞組織和動(dòng)物,對(duì)這種多肽的抗體,使用這種多肽的檢測(cè)方法,以及與上述各項(xiàng)相關(guān)的方法。本發(fā)明也提供了用于治療,診斷和篩查與AUR－1和/或AUR－2相關(guān)的疾病的方法,這些疾病的特征為AUR－1和/或AUR－2與AUR－1和/或AUR－2結(jié)合對(duì)應(yīng)物之間的作用異常。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1205740SQ96199101
公開日1999年1月20日 申請(qǐng)日期1996年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月25日
發(fā)明者格雷戈里·D·普洛曼, 凱文·G·莫西 申請(qǐng)人:蘇根公司