專利名稱：纖維素酶,其編碼基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的領域本發(fā)明涉及編碼新中性纖維素酶的基因及含新中性纖維素酶的組合物。這些組合物在紡織品，去污劑和紙漿及造紙工業(yè)中特別有用。相關技術纖維素是由β-1，4鍵連接的葡萄糖殘基的線型多糖。在自然界，纖維素通常與木質素以及諸如木聚糖和葡甘露聚糖的半纖維素相聯(lián)。已知纖維素酶的特性妨礙了纖維素酶的實際應用，這些纖維素酶通常是具有各種活性和底物特異性的纖維素酶的混合物。因此，需要鑒定可獲得僅具有所需活性的纖維素酶的來源。
在本領域中已知有眾多種類的纖維素酶，其中大多數(shù)是酸性纖維素酶。然而，也鑒定了一些中性和堿性纖維素酶。Celluzyme_是商業(yè)上可獲得的來自Humicola insolens的纖維素酶制品(Novo Nordisk，A／S)。GB2，075，028和EP406，314描述了Humicola insolens纖維素酶用作洗滌去污劑中的酶添加劑以降低含棉織物的粗糙度(僵硬度)。來自Humicola insolens含葡聚糖內切酶活性的纖維素酶的克隆在WO93／11249和EP531，372中描述。EP510，091描述了在去污劑組合物中有用的來自芽孢桿菌NCIMB 40250的纖維素酶。EP220，016，描述了作為著色織物的澄清劑有用的纖維素酶。WO94／07998描述了具有提高堿性活性的修飾的纖維素酶。WO95／02675描述了含有兩種不同纖維素酶的去污劑組合物第一種纖維素酶在催化上起去塵粒作用；第二種纖維素酶在催化上起顏色澄清的作用。WO92／18599描述了含纖維素酶和蛋白酶的去污劑制品。纖維素酶也已在工業(yè)上用于幫助除去紡織品印染后的印染糊增稠劑和多余的染料(EP576，526)。
EP383，828描述了顆粒狀去污劑組合物，它含有表面活性劑，織物軟化粘土物質，和含碳酸鈣的纖維素酶顆粒。US5433750描述了含表面活性劑，增加清潔作用的物質系統(tǒng)，軟化粘土，粘土絮凝劑和高活性纖維素酶，優(yōu)選Humicola insolens纖維素酶的去污劑組合物。US5520838描述的顆粒狀去污劑組合物包含表面活性劑，增加清潔作用的物質和纖維素酶，優(yōu)選Humicola insolens纖維素酶，所說的組合物是一種緊密的形式，具有相當高的密度且含有少量的無機填充鹽。
除紡織品工業(yè)外纖維素酶還用于許多種類的工業(yè)中。例如，纖維素酶在工業(yè)上用于報紙和雜志的脫墨(EP521，999)。用于改進紙漿的污水(WO91／14822，WO91／17243)及作為對動物飼料的處理。
各纖維素酶的獨特特性使有些纖維素酶比其它更適用于某種目的。盡管該酶以許多方式相區(qū)別，但一個最重要的區(qū)別是pH量適值。中性纖維素酶在pH范圍6-8中具有有用的纖維素酶活性，堿性纖維素酶在pH范圍7．5-10中具有有用的纖維素酶活性。酸性纖維素酶在pH4．5-6范圍內具有活性，但在更高pH值時具有很小的纖維素酶活性。
中性和酸性纖維素酶在紡織品工業(yè)中特別有用。Klahorst，S．等，紡織品化學師和配色師，2613-18，1994；Nilsson，T．E．，Aachen紡織品會議，DWI報道11485-88(1995)；Videbrek，T等，ITB染色／印染／拋光，1994年1月，第25-29頁；Klahorst，S，等，AATCC國際會議和展覽，1992年10月4-7日，第243頁，Atlanta，GA；Kochavi，D等，美國染料信息，1990年9月，第26-28頁；Tyndall，R．Michad，紡織品化學師和配色師2423(1992)；Lange，N．K，Trichoderma reesei纖維素酶和其它水解酶的第二次TRICEL專題討論會的會議錄，Espoo，F(xiàn)inland，1993，編輯。P．Suominen等，生物技術和工業(yè)發(fā)酵研究基金會，第8卷，1993，第263-272頁。當用于處理織物時，纖維素酶攻擊形成綿纖維的纖維素分子鏈，從而影響織物的特性。
傳統(tǒng)上，在“磨洗”中，浮石用于改變織物的特性。逐漸地，纖維素酶代替了浮石，浮石也使織物產生所需的最終外觀，但它能引起對機械，服裝和污水加工裝置的損傷。US4832，864，US4912056，US5006126，US5122159，US5213581和EP307564公開了纖維素酶在生物磨洗中的應用。
纖維素酶對于磨洗用靛藍染色的斜紋粗棉布特別有用，因為該染料大多數(shù)位于紗線的表面且不穿透纖維孔。當用于處理棉織物時，一般來說中性纖維素酶比酸性纖維素酶需要更長的洗滌時間。然而，可獲得的中性纖維素酶比酸性纖維素酶對綿織物具有更小的進攻性(活性)，且據(jù)報道不象酸性纖維素酶那樣容易損傷織物強度。中性纖維素酶具有更寬的pH范圍，因此在生物磨洗期間出現(xiàn)的pH增加對中性酶活性影響很小。
由于酸性纖維素酶促進織物的復染(back staining)及易破的傾向妨礙了其應用。另外，必須將pH調到適合于酸性纖維素酶發(fā)揮功能的范圍內。因此，很明顯需要一種不引起織物復染或易破的中性纖維素酶制品。
盡管在紡織品工業(yè)中使用纖維素酶變得越來越普遍，但簡單地改變所使用的纖維素酶混合物可產生不同的拋光結果。這些問題將越來越多的注意力集中于對具有所需特征的可重復的纖維素酶混合物的研究上。因此，很清楚在紡織品和去污劑工業(yè)中特別需要在中性和堿性pH植時有活性，不損傷織物強度，具有較好的清潔和／或織物保護及降低粗糙度特性的新纖維素酶。
本發(fā)明小結由于認識到了鑒定在紡織品生物拋光和生物磨洗及在去污劑應用中有用的酶的重要性，本發(fā)明人篩選了真菌種類中在該技術中有用的具有酶促特征的中性和堿性纖維素酶。
這些研究產生了來自毀絲霉屬，Myriococcum，Melanocarpus，孢子絲菌屬和毛殼霉屬的新纖維素酶。
本發(fā)明進一步涉及從產生該新纖維素酶的的天然宿主制備的用過的培養(yǎng)基或酶制品。
本發(fā)明進一步涉及該培養(yǎng)基或該酶制品在紡織品和去污劑工業(yè)中及在紙漿和紙工業(yè)中的應用。
這些研究進一步導致鑒定了在紡織品和去污劑工業(yè)中特別有用的3種新的纖維素酶。從Melanocarpus種類或Myriococcum種類的純化制品揭示了一種具有葡聚糖內切酶活性的20kDa的纖維素酶(本文命名為“20K-纖維素酶”)，一種50kDa纖維素酶(“50K-纖維素酶”)，及第二種50kDa纖維素酶(“50K-纖維素酶B”)。還公開了與纖維素酶家族具有高度同源性的新基因產物，本文稱為“具有CBD的蛋白質”(其中CBD指“纖維素結合區(qū)”)。
本發(fā)明的一個目的是提供含有一個或多個本發(fā)明的新纖維素酶，特別是20K-纖維素酶，50K-纖維素酶，50K纖維素酶B和／或具有CBD的蛋白質的酶制品。
本發(fā)明的另一個目的是提供使用該制品用于紡織品的拋光。特別是斜紋粗棉布生物磨洗的方法，使用所說的制品用于去污劑組合物的方法，特別是使用20K-纖維素酶，50K纖維素酶，50K-纖維素酶B和／或具有CBD的蛋白質的方法。
本發(fā)明還涉及具有本文所述的一個或多個氨基酸序列的其它中性和／或堿性纖維素酶。
本發(fā)明還涉及編碼20K-纖維素酶，50K-纖維素酶，50K-纖維素酶B和具有CBD的蛋白質的基因。
本發(fā)明還涉及含有該基因的新表達載體并涉及用該載體轉化的新宿主，特別是能高水平地表達由該基因編碼的蛋白質的宿主。
本發(fā)明還涉及該轉化的宿主的用過的培養(yǎng)基，含新20K-纖維素酶，50K-纖維素酶，50K纖維素酶B和／或具有CBD的蛋白質的培養(yǎng)基，或含有從該培養(yǎng)基制備的一種或多種該蛋白質的酶組合物(酶制品)。
本發(fā)明進一步涉及使用該培養(yǎng)基或該酶制品在紡織品和去污染工業(yè)中和在紙漿和紙工業(yè)中的應用。
附圖的簡要描述

圖1(A和B)顯示了ALKO 4179，CBS 689．95的葡聚糖內切酶活性的pH(圖1A)和溫度(圖1B)依賴性。
圖2(A和B)顯示了ALKO 4124，CBS 687．95的葡聚糖內切酶活性的pH(圖2A)和溫度(圖2B)依賴性。
圖3(A和B)顯示了ALKO 4237，CBS 685．95的葡聚糖內切酶活性的pH(圖3A)和溫度(圖3B)依賴性。
圖4(A和B)顯示了ALKO 4265，CBS 730．95的葡聚糖內切酶活性的pH(圖4A)和溫度(圖4B)依賴性。
圖5(A和B)顯示了ALKO 4125，CBS 688．95的葡聚糖內切酶活性的pH(圖5A)和溫度(圖5B)依賴性。
圖6(A和B)顯示了用中性纖維素酶的洗滌效應和復染(圖6A)及染蘭(圖6B)。
圖7(A和B)顯示了用逐漸增加酶劑量的Ecostone L的洗滌效果和復染(圖7A)和染蘭(圖7B)。1×相應于圖6A和6B中中性纖維素酶的酶劑量。
圖8顯示了以SP-SepharoseTM色譜法從峰Ⅱ純化20K-纖維素酶。含11．7g蛋白質和576，000 ECU的樣品過按實施例9所述形成的4．5×31cm柱。收集15ml餾分。餾分148-161的峰中葡聚糖內切酶活性被低估、因為在充分稀釋該酶用于試驗前出現(xiàn)結晶。這些餾分的結晶物質含486，000ECU。
圖9(A和B)顯示了20K纖維素酶的SDS-PAGE分析。標準品的分子量以kDa顯示。
A．從活性S-SepharoseTM餾分沉淀的部分結晶物質(泳道1)。
B．在G50 Sephadex上對部分結晶物質進行色譜的餾份。在泳道19和25中顯示的餾分不含葡聚糖內切酶活性。對于其它餾分，加至凝膠的活性量(以ECU)如下餾分27，0．4；29，2．4(作為3．0μg蛋白質)；3．0，2．1；31，1．9；33，0．46；和35，1．1。
圖10顯示了經SP-SepharoseTM色譜對峰Ⅲ／Ⅳ的50K纖維素酶和50K纖維素酶B的分離。含200mg蛋白質和14，800ECU的樣品過按實施例9所述形成的2．5×11cm柱。收集6．8ml餾分。在NaCl梯度前洗脫了少量的50K-纖維素酶，而大多數(shù)50K-纖維素酶在大約50mM NaCl處洗脫。發(fā)現(xiàn)50K-纖維素酶B在大約80mM NaCl的主要蛋白質峰中。
圖11顯示了純化的50K-纖維素酶(11A)和50K-纖維素酶B(11B)的SDS-PAGE分析。泳道號顯示了從Phenyl-Sepharose洗脫的餾分(3．3ml)。對于餾分36-41，將2．5μl各餾分過凝膠。對于其它餾分，將2μl過凝膠。在餾分37-38中發(fā)現(xiàn)50K-纖維素酶峰(11A)(分別含780和880ECU／ml)。50K纖維素酶B峰在餾分30和31中(11B)，它含有可忽略的活性(不足4ECU／ml)。
圖12顯示了在pH7．0和60分鐘的反應時間內50K-纖維素酶葡聚糖內切酶活性的溫度依賴性。
圖13顯示了在50℃(◆)和70℃(□)時50K-纖維素酶葡聚糖內切酶活性的pH依賴性。
圖14顯示了使用20K-纖維素酶抗血清作探針的Western分析。泳道1，2和3分別含有來自DEAE-Sepharose峰Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ的25μg蛋白質。泳道4和5含2．0和0．2μg純的50K-纖維素酶，泳道6含0．6μg純50K-纖維素酶B。泳道7和8分別含來自ALKO 4237和ALKO 4124的全生長培養(yǎng)基的大約25μg蛋白質。
圖15顯示了20K-纖維素酶在pH7(10分鐘反應時間)的葡聚糖內切酶活性的溫度依賴性。
圖16(A和B)顯示了20K-纖維素酶在10分鐘(a)或60分鐘(b)反應時間的葡聚糖內切酶活性的pH依賴性。
圖17顯示了測序本文舉例性物質中所述的20K-纖維素酶得到的氨基酸序列資料。序列429來自蛋白質的N端，而其它序列來自內部胰酶消化的肽。
圖18顯示了在攜帶20K-纖維素酶基因的質粒pALK1221，pALK1222和pALK1223中Melanocarpus albomyces DNA的限制性圖譜。
圖19顯示了20K纖維素酶基因的DNA序列。箭頭表示預測的信號肽酶加工位點。
圖20顯示了在攜帶50K-纖維素酶基因的質粒pALK1233，pALK1234，pALK1226和pALK1277中Melanocarpus albomyces DNA的限制性圖譜。
圖21(A和B)顯示了50K-纖維素酶基因的DNA序列。箭頭表示預測的信號肽酶加工位點。
圖22顯示了在攜帶50K-纖維素酶B基因的質粒pALK1229和pALK1236中Melanocarpus albomyces DNA的限制性圖譜。
圖23(A和B)顯示了50K-纖維素酶B基因的DNA序列。箭頭表示表示預測的信號肽酶加工位點。
圖24顯示了pTTcO1的質粒圖譜。
圖25顯示了pMS2的質粒圖譜。
圖26顯示了在攜帶編碼具有CBD的蛋白質的DNA的質粒pALK1230中Melanocarpus albomyces DNA的限制性圖譜。在圖27中提供的序列在圖26中用箭頭標記。
圖27顯示了在pALK1230中的具有CBD的蛋白質的纖維素酶基因的DNA序列。
圖28顯示了pALK1231的質粒圖譜。
圖29顯示了pALK1235的質粒圖譜。
圖30顯示了使用20K-纖維素酶抗血清作探針的Western分析。泳道1和2含有來自轉化子ALKO 3620／pALK1235／49和ALKO 3620／pALK1235／40的全生長培養(yǎng)基的大約10μg蛋白質。泳道3含有來自ALKO 3620的全生長培養(yǎng)基的大約10μg蛋白質。泳道4和5含有來自轉化子ALKO 3620／pALK1231／16和ALKO 3620／pALK1231／14全生長培養(yǎng)基的大約10μg蛋白質。泳道6含100ng純20K纖維素酶。
圖31顯示了pALK1238的質粒圖譜。
圖32顯示了pALK1240的質粒圖譜。
保藏物ALKO 4179 Myceliophthora thermophila于1995年10月12日在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P．O．Box273，3740 AG BAARN作為CBS 689．95保藏。
ALKO 4124，Myriococcum sp．于1995年10月12日在Centraalbureauvoor Schimmelcultures，P．O．Box 273，3740 AG BAARN作為CBS 687．95保藏。
ALKO 4237 Melanocarpus albomyces(=Myriococcum albomyces=Thielavia albomyces；Guarro等，1996，Mycol．Res．100(1)75)于1995年10月11日在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P．O．Box273，3740 AG BAARN以CBS 685．95保藏。
ALKO 4125，Sporotrichum thermophile于1995年10月12日在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P．O．Box 273，3740 AG BAARN作為CBS 688．95保藏。
ALKO 4265，Chaetomium thermophilum La Touche于1995年11月8日在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P．O．Box 273，3740 AGBAARN作為CBS 730．95保藏。
質粒pALK1221于1996年6月21日以DSM11024保藏，λ4237／5．1于1996年6月21日以DSM11012保藏，均保藏于德國DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1B，D-38124 Braunschweig。兩質粒均含有來自Melanocarpusalbomyces CBS 685．95的20K纖維素酶基因。
在德國Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，質粒pALK1227于1996年6月21日以DSM 11025保藏，λ4237／35于1996年6月21日以DSM 11014保藏。兩者均含有來自Melanocarpus albomyces CBS685．95的50K纖維素酶基因。
在德國Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，質粒pALK1229于1996年6月21日以DSM 11026保藏。λ4237／3于1996年6月21日以DSM11011保藏。pALK1229含編碼50K-纖維素酶B的DNA，λ4237／3和λ4237／18含來自Melanocarpus albomyces CBS 685．95的50K纖維素酶B基因。
質粒pALK1230于1996年6月21日以DSM 11027保藏在德國Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig。pALK 1230含來自Melanocarpus albomyces CBS 685．95的具有CBD的蛋白質的基因。
優(yōu)選實施方案的詳細描述在下面的描述中，廣泛使用了在紡織品工業(yè)技術中所使用的許多術語。為了提供對說明書和權利要求書，包括由這些術語給定的范圍的清楚和一致的理解，提供了下面的定義。
生物磨洗織物或服裝的“生物磨洗”指使用酶來代替使用浮石或作為使用浮石的添加步驟處理織物或服裝，特別是斜紋粗棉布。
生物拋光“生物拋光”指酶用于纖維素纖維的控制水解以改變織物或紗線表面，使其防止永久起球，改進纖維手感，如柔軟性和光滑性，經減少起絨毛而清潔表面結構，導致顏色澄清，改進織物的懸垂性，改進水汽吸收力且也可改進染色性。
復染釋放的染料具有再次沉積到織物纖維的表面的傾向，這種效應稱為“復染”。
去污劑去污劑指一種清潔劑，它可含有表面活性劑(陰離子，非離子，陽離子和兩性表面活性劑)，增加清潔作用的物質和其它任選的成分，如抗再沉積和土壤懸浮劑，光亮劑，漂白劑，染料和色素及水解酶。去污劑成分的合適的描述在美國專利號5433750中給出，表面活性劑的合適的描述在美國專利號3664961中給出。
酶制品，“酶制品”指含酶組合物。優(yōu)選的是從微生物或用于生長該微生物的培養(yǎng)基中提取(部分或完全純化)該酶?！皬摹刑崛　敝笍募毎麍F中分離所需的酶?？捎眠_到該目的任何方法進行該操作，包括破碎細胞，也可簡單地從消耗的細胞中取出培養(yǎng)基。因此，術語“酶制品”包括含有以前用于培養(yǎng)所需微生物的培養(yǎng)基和在培養(yǎng)或下游加工步驟期間從微生物細胞釋放進該培養(yǎng)基的任何酶。
“基本上不能”合成一種或多種酶的宿主指與野生型相比，一種或多種所述酶的活性受抑制，有缺陷或缺乏的宿主。
作為特定氨基酸序列“等價物”的氨基酸序列指與特定氨基酸序列不相同，但含有用于所需目的時與特定氨基酸序列的相似活性相比基本上不影響該蛋白質的生物學活性的至少一些氨基酸改變(缺失，取代，顛倒，插入等)。纖維素酶的生物學活性指其催化活性和／或其結合纖維素物質的能力。50K-纖維素酶B的生物學活性還包括其與纖維素酶協(xié)同作用的能力。優(yōu)選的是，“等價”氨基酸序列與特定氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少80％-99％的相同性，最優(yōu)選至少90％，在特別高度優(yōu)選的實施方案中，在氨基酸水平上至少有95％的相同性。
克隆載體，克隆載體是一種質粒或噬菌體DNA或其它DNA序列(如線型DNA)。它為將目的基因轉移進宿主細胞提供合適的核酸載體環(huán)境。本發(fā)明的克隆載體可設計成在原核和真核宿主中自主復制。在諸如Trichoderma的真菌宿主中，克隆載體一般不能自主復制且代之以僅提供將目的基因運輸進Trichoderma宿主以便隨后插入Trichoderma基因組的載體?？寺≥d體還可用一個或少數(shù)核酸內切酶識別位點來鑒定，可在該位點以可測定的方式酶切該DNA序列而不喪失載體的基本生物學功能，且為了產生復制和克隆該DNA可將DNA剪接進該位點?？寺≥d體還可含有適用于鑒定用克隆載體轉化的細胞的標記。例如，標記是抗生素抗性。另外，該標記可在克隆載體上提供，且與提供的目的基因分離。術語“載體”有時用于“克隆載體”。
表達載體。表達載體是一種克隆載體或相似于克隆載體的載體，但它在轉化進所需宿主后能表達目的基因。當使用真菌宿主時，優(yōu)選將目的基因作為克隆或表達載體的一部分提供給真菌宿主，該載體整合進真菌染色體，或使目的基因整合進宿主染色體。作為克隆載體或表達載體一部分的序列也可在整合過程中與目的基因整合。在T．reesei中，可指導目的基因整合的位點包括cbh和／或egl基因座。最優(yōu)選的是，目的基因涉及取代一個或多個編碼不需要的特征的基因。
目的基因還優(yōu)選放在載體提供的諸如啟動子序列的某些控制序列(與目的基因整合)的控制下(即，與其有效連接)。另外，控制序列可以是在插入位點的那些序列。
根據(jù)將載體設計成是在原核還是在真核宿主中表達某基因可改變表達載體的表達控制序列(例如，穿梭載體可提供用于在細菌宿主中選擇的基因)。表達控制序列可含有轉錄調節(jié)元件，如，啟動子，增強子元件，和轉錄終止序列，和／或翻譯調節(jié)元件。例如，翻譯起始和終止位點。
根據(jù)本發(fā)明，提供了中性和堿性纖維素酶，及用于生產處理紡織品材料所需的該有用的中性和堿性纖維素酶的方法。
產生本發(fā)明的蛋白質的天然宿主有1)ALKO 4179，Myceliophthora thermophila；在Centraalbureau voorSchimmelcultures，P．O．Box 273，3740 AG+BAARN以CBS 689．95保藏。
2)ALKO 4124，Myriococcum sp．；以CBS 687．95保藏；3)ALKO 4237，Melanocarpus albomyces，以CBS 685．95保藏；4)ALKO 4125，Sporotrichum thermophila，以CBS 688．95保藏；及5)ALKO 4265，Chaetomium thermophilum La Touche，以CBS730．95保藏；本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案是天然宿主的用過的培養(yǎng)基或從培養(yǎng)基制備的酶制品。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了純化的20K纖維素酶，50K-纖維素酶，50K-纖維素酶B和／或具有CBD的蛋白質。例如，可按本文，特別是在實施例9中所述從Melanocarpus種類或Myriococum種類獲得這些蛋白質。
已從本文所述的纖維素酶產生了氨基酸序列資料。因此，本發(fā)明還涉及含一個或多個本文所示氨基酸序列的中性或堿性纖維素酶。因此，本發(fā)明打算涉及在功能上等價于20K-纖維素酶，50K-纖維素酶，50K纖維素酶B和／或具有CBD的蛋白質且具有一個或多個本文所述的氨基酸序列，或基本上相同的序列的任何中性或堿性纖維素酶。該中性或堿性纖維素酶可來自相同種類的其它菌株或來自趨異進化生物。
在另一優(yōu)選的實施方案中，用來自在舉例性純化程序期間形成的分離峰的物質(例如，在本文表Ⅷ中的DEAE-Sepharose合并液Ⅰ，Ⅲ或Ⅳ)提供了20K-纖維素酶。在還有一個實施方案中，可單獨或與其它這類蛋白質結合使用在Melanocarpus albomyces ALKO 4237培養(yǎng)基中的其它蛋白質。
在另一優(yōu)選的實施方案中，來自在舉例性純化程序期間形成的分離峰的物質提供50K-纖維素酶。在另一實施方案中，可單獨或與其它這類蛋白質結合使用ALKO 4237培養(yǎng)基中的其它蛋白質。
在另一優(yōu)選的實施方案中，來自在舉例性純化程序期間形成的分離峰的物質提供50K-纖維素酶B。在另一實施方案中，可單獨或與其它這類蛋白質結合使用ALKO 4237培養(yǎng)基中的其它蛋白質。
如本文所述，以CBS 730．95保藏的ALKO 4265，Chaetomiumthermophilum La Touche在本文中用作中性纖維素酶的例子，它在本發(fā)明的生物磨洗方法中不是優(yōu)選的，因為它引起復染。然而，有證據(jù)表明它在其它應用(例如，在去污劑)中有用。
通過克隆編碼所需蛋白質的遺傳序列和通過表達該遺傳序列有助于用于遺傳改造本發(fā)明的宿主的方法。本文所用的術語“遺傳序列”試圖指核酸分子(優(yōu)選DNA)。編碼所需蛋白質的遺傳序列來自各種來源。這些來源包括基因組DNA，cDNA，合成DNA及其組合?？墒褂幂d體系統(tǒng)產生用于生產本發(fā)明的酶制品的宿主。該載體構建體(a)可進一步提供一種分離的載體構建體(b)，構建體(b)編碼至少一種待整合進宿主基因組的所需基因和與(a)或(b)偶聯(lián)的(c)選擇標記。另外，分離的載體可用于標記。
如果諸如DNA的核酸分子含有表達控制序列，則稱為“能表達”多肽，其中該表達控制序列含轉錄調節(jié)信息且該序列“有效連接到”編碼多肽的核苷酸序列上。
有效連接是某一序列與一個調節(jié)序列(或多個調節(jié)序列)的連接方式使該序列的表達在該調節(jié)序列的影響或控制下的連接。如果啟動子功能的誘導導致編碼蛋白質的序列mRNA轉錄且如果兩個DNA序列間的連接性質不會(1)導致導入移碼突變，(2)干擾表達調節(jié)序列指導mRNA，反義RNA或蛋白質表達的能力或(3)干擾被啟動子區(qū)域序列轉錄的模板能力，則稱兩DNA序列(如蛋白質編碼序列和連接到編碼序列5＇端的啟動子區(qū)域序列)有效連接。因此，如果啟動子能影響DNA序列的轉錄則該啟動子區(qū)與DNA序列有效連接。
基因表達所需的調節(jié)序列的確切性質在種類或細胞類型間有變化，但一般必須包括分別涉及轉錄和翻譯起始的5＇非轉錄和5＇非翻譯(非編碼)序列。在轉化宿主中蛋白質的表達需要使用在該宿主中有功能的調節(jié)區(qū)域。可采用許多各種各樣的轉錄和翻譯調節(jié)序列。在真核生物中，如果轉錄與翻譯不相連，根據(jù)克隆的序列是否含有該甲硫氨酸，該控制區(qū)可以提供或不提供起始甲硫氨酸(AUG)密碼。一般來說，該區(qū)域包括足以指導宿主細胞起動RNA合成的啟動子區(qū)域。
眾所周知，真核mRNA的翻譯在編碼第一甲硫氨酸的密碼子處啟動。因此，優(yōu)選保證真核啟動子與編碼蛋白質或其功能性衍生物的DNA序列之間的連接區(qū)不含能編碼甲硫氨酸的任何間插的密碼子。該密碼子的存在導致形成融合蛋白(如果AUG密碼子與編碼蛋白質的DNA序列在同一閱讀框中)或移碼突變(如果AUG密碼子與編碼蛋白質的序列不在同一閱讀框中)。
在優(yōu)選的實施方案中，所需蛋白質由于存在分泌信號序列而分泌進周圍培養(yǎng)基中。如果所需蛋白質不是有本身的信號序列，或如果該信號序列不能在宿主中很好地發(fā)揮功能，那么可將編碼蛋白質的序列有效連接到與宿主同源或異源的信號序列上。所需的編碼序列可與允許從宿主中分泌該蛋白質的任何信號序列相連。該信號序列可設計成含有或不含特異性蛋白酶位點，使該信號肽序列容易隨后被去掉。另外，可使用將蛋白質泄露到培養(yǎng)基中的宿主，例如，在其膜上具有突變的宿主。
如果需要，可按上述克隆方法獲得編碼蛋白質的序列3＇不轉錄和／或不翻譯區(qū)。可保留3＇-非轉錄區(qū)的轉錄終止調節(jié)序列元件；可保留3＇-非翻譯區(qū)的翻譯終止調節(jié)序列元件或其在真核細胞中指導多腺苷酸化的那些元件。
本發(fā)明的載體還可包含其它有效連接的諸如增強子序列的調節(jié)元件。
在優(yōu)選的實施方案中，構建遺傳上穩(wěn)定的轉化子，以此將所需的蛋白質DNA整合進宿主染色體中。所需蛋白質的編碼序列可來自任意來源。該整合可在細胞內從頭發(fā)生，或者，在大多數(shù)優(yōu)選的實施方案中，經過用載體轉化幫助該整合，該載體在功能上將其自身插入宿主染色體，例如，具有促進DNA序列在染色體中整合的DNA元件。
還經過導入允許選擇在染色體中含表達載體的宿主細胞的一個或多個標記來選擇將導入的DNA穩(wěn)定整合進其染色體的細胞，例如，該標記可提供殺生物劑抗性，例如，對抗生素，或重金屬，如銅等的抗性。選擇標記基因可直接與待表達的DNA基因序列相連或經共轉化導入相同細胞中。
在選擇特定質?；虿《据d體中重要的因素包括以其從不含載體的那些受體細胞中識別和選擇含有載體的受體細胞的方便性；在特定宿主中所需的載體拷貝數(shù)；是否需要能在不同種類的宿主細胞間“穿梭”該載體。
一旦制備了用于表達的載體或含DNA序列的構建體，可用各種任意的合適方式，包括如上所述的轉化將DNA構建體導入合適的宿主細胞。導入載體后，在選擇轉化細胞生長的選擇培養(yǎng)基中生長受體細胞?？寺〉幕蛐蛄械谋磉_導致產生所需的蛋白質或產生該蛋白質的片段?？稍谵D化細胞中以連續(xù)的方式或以控制的方式進行該表達。
因此，本文所述的編碼蛋白質的序列可有效連接到任意所需的載體上并轉化進選定的宿主中，以提供該蛋白質在宿主中的表達。
本發(fā)明的主題物質還有編碼具有纖維素酶生物學活性的蛋白質的核酸分子和與上面所述的任意核酸分子雜交的分子或其限定如下編碼具有纖維素酶的酶促活性的多肽的核酸分子，選自如下(a)編碼含有圖19或21所述氨基酸序列之多肽的核酸分子；(b)編碼含有圖23或27所述氨基酸序列之多肽的核酸分子(c)含有圖19或21所述核苷酸序列之編碼序列的核酸分子；(d)含有圖23或27所述核苷酸序列之編碼序列的核酸分子；(e)編碼含有由DSM11024，DSM11012，DSM11025或DSM11014所含之DNA插入片段編碼的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(f)編碼含有由DSM11026，DSM11011，DSM11013或DSM11027中所含之DNA插入片段編碼的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
(g)含有DSM11024，DSM11012，DSM11025或DSM11014所含之DNA插入片段的編碼序列的核酸分子；(h)含有DSM11026，DSM11011，DSM11013或DSM11027中所含之DNA插入片段的編碼序列的核酸分子；(i)與(a)，(c)，(e)或(g)中的任意一個分子雜交的核酸分子；(j)由于遺傳密碼的簡并性其編碼序列與(a)至(i)中任一核酸分子的編碼序列有區(qū)別的核酸分子；(k)編碼具有纖維素酶活性且具有與圖19，21，23或27所述的序列顯示出至少80％相同性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。
本文中的術語“雜交”指在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在嚴格條件下的雜交，如由例如Sambrook等(1989，分子克隆，實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港)所述。理論上與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子雜交的這些核酸分子可來自具有該核酸分子的任何生物。優(yōu)選的是，它們來自真菌，即來自Melanocarpus，Myriococcum，Sporotrichum，Myceliophthora和Chaltomium屬的那些真菌。與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子可從例如，各種生物，即真菌的基因組文庫或cDNA文庫中分離。
例如，經過使用根據(jù)標準技術(見Sambrook等，(1989))的雜交可使用本發(fā)明的核酸分子或這些分子的片段或這些分子的反向互補序列來鑒定和分離這些核酸分子。
作為雜交探針，例如，可使用具有與附圖所示完全或基本上相同的核苷酸序列或所說序列的片段的核酸分子。用作雜交探針的片段也可以是以常規(guī)合成技術獲得的合成片段和與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子基本上相同的序列。一旦鑒定并分離了與本發(fā)明的核酸分子雜交的基因，必須測定其序列并分析由所說序列編碼的蛋白質的特征。
術語“雜交DNA分子”包括編碼上述蛋白質或其生物學活性片段的上述核酸分子的片段，衍生物及等位變異體。
片段理解為長度足以編碼所述蛋白或其生物學活性片段的部分核酸分子。本文中術語“衍生物”指這些分子的核苷酸序列與上述核酸分子的序列在一個或多個位置有區(qū)別且與所說序列高度同源。同源性理解為指至少40％的序列相同性，特別是至少60％的相同性，優(yōu)選超過80％，且更優(yōu)選超過90％。上述核酸分子的衍生物可以是缺失，取代，插入，添加或組合的結果。
同源性還指各核苷酸序列或編碼的蛋白質在功能上和／或結構上相當。與上述核酸分子同源的及由所說核酸分子衍生的核酸分子通常是所說分子的變異形式，它代表具有相同生物學功能的修飾。它們可以是自然發(fā)生的變異，如其它生物或突變的序列。這些突變可自然發(fā)生或可經特定誘變實現(xiàn)。而且，這些變異體可以是經合成產生的序列。等位變異體可以是天然出現(xiàn)的變異體及合成產生的或遺傳加工的變異體。
由本發(fā)明的核酸分子的各種變異體編碼的蛋白質共享特定的共有特征，如酶活性，分子量，免疫學反應性，構象等，以及物理特征，如電泳遷移率，色譜行為，沉降系統(tǒng)，可溶性，光譜特性，穩(wěn)定性，pH最適值，溫度最適值、等。例如，可接第11頁及實施例1和25所述檢測纖維素酶的酶活性。
本發(fā)明還涉及由于遺傳密碼的簡并性其序列與上面鑒定的分子的序列有區(qū)別且編碼具有纖維素酶生物學活性的蛋白質的核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選是RNA或DNA分子，更優(yōu)選是基因組DNA或cDNA。
本發(fā)明還涉及特異性地識別根據(jù)本發(fā)明的上述蛋白質之一的抗體以及具有該特性的抗體。片段。這些抗體可以是單克隆或多克隆的。其生產方法是本領域熟知的且在例如Harlow和Lane“抗體，實驗手冊”，CSH出版，冷泉港實驗室(1988)中詳細描述。
而且，本發(fā)明涉及與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或與該核酸分子的互補鏈特異性雜交的寡核苷酸。在這方面，術語“特異性雜交”指該寡核苷酸在嚴格雜交條件下與本發(fā)明的核酸分子特異性地雜交，而在該條件下與編碼其它多肽的序列不顯示交叉雜交。優(yōu)選的是，該寡核苷酸具有至少10個核苷酸的長度，更優(yōu)選至少15個核苷酸，最優(yōu)選至少30個核苷酸。它們優(yōu)選不超過100個核苷酸，更優(yōu)選不超過80個核苷酸，最優(yōu)選不超過60個核苷酸。為了保證它們與本發(fā)明的核酸分子特異性地雜交，該寡核苷酸在其總長度上與本發(fā)明的核酸分子的相應核苷酸序列顯示至少80％的相同性，優(yōu)選至少95％的相同性，最優(yōu)選至少99％的相同性?？墒褂眠@些寡核苷酸，例如，作為在基因組或cDNA文庫中篩選編碼纖維素酶的序列的探針或作為PCR引物。
本文所述的編碼蛋白質的序列可在閱讀框中與其它序列融合以構建編碼融合蛋白質的DNA。例如，可按上面所述制備編碼50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質之基因的重組載體，除了編碼該蛋白質的序列與T．reesei纖維素酶，半纖維素酶或甘露聚糖酶，或該纖維素酶，半纖維素酶或甘露聚糖酶的至少一個功能區(qū)的序列融合，如在US5298405，WO93／24622和在GenBank submissionL25310中所述，本文引用各文獻以供參考。具體地說，纖維素酶，半纖維素酶或甘露聚糖酶選自CBHⅠ，CBHⅡ，EGⅠ，EGⅡ，XYLⅠ，XYLⅡ和MANⅠ或其功能域，如分泌信號或核心序列。甘露聚糖酶與纖維素酶具有相同的功能域結構含有活性位點的核心區(qū)，含有絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)的鉸合區(qū)及含結合區(qū)的尾。
可構建含有與本發(fā)明的編碼所需蛋白質的序列融合的甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶或木聚糖酶核心區(qū)或來自該酶的核心和鉸合區(qū)的融合肽。結果是該蛋白質含甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或內切葡聚糖酶或木聚糖酶核心或核心及鉸合區(qū)，和50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD序列的蛋白質。該融合蛋白質含有在融合構建體中所提供的甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶或木聚糖酶以及50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD活性的蛋白質的各區(qū)域。
也可構建融合蛋白質，使包含放在50K纖維素酶，20K纖維素酶，50K纖維素酶B或具有CBD序列的蛋白質之前的甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶或木聚糖酶尾序列或其所需片段，特別是使得允許使用該尾序列中的非特異性蛋白酶位點作為從表達的融合蛋白質中回收50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD序列的蛋白質的蛋白酶位點。另外可構建融合蛋白質，在連接序列中提供蛋白酶位點，該連接序列位于50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD序列的蛋白質之前，含有或不含尾序列。
經過將諸如纖維素結合區(qū)(CBD)的區(qū)域優(yōu)選以其接頭與本發(fā)明的蛋白質融合可產生20K和50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B的新特性。優(yōu)選的是，該CBD和接頭是Trichoderma纖維素酶，甘露聚糖酶或Melanocarpus albomyces具有CBS的蛋白質的相應CBD和接頭區(qū)域。
本發(fā)明提供了產生酶制品的方法，該酶制品具有部分或完全缺陷的不需要的纖維素裂解活性(即，降解纖維素的能力)且富含紡織品或去污劑工業(yè)或紙漿及紙加工所需的50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD蛋白質的蛋白質?！袄w維素裂解活性缺陷”指減小的，降低的或受抑制的將纖維素降解成更小的寡聚糖的能力。該纖維素裂解活性缺陷制品及以重組DNA方法對該制品的生產在US5298405中描述；本文引用作為參考。優(yōu)選的是，該制品為EG活性和／或CBHⅠ活性缺陷。
如本文所述，可用本發(fā)明的宿主直接提供50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質。另外，也可使用生長宿主的用過的培養(yǎng)基或從其純化的50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質。另外，如果所需活性存在于一種以上的重組宿主中，可從合適的宿主中分離該制品并在用于本發(fā)明的方法中之前結合。
為了獲得本發(fā)明的酶制品，在合適的條件下培養(yǎng)具有所需特征的上述天然或重組宿主(即能表達經濟上可行量的所需50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質的宿主及可任選的那些基本上不能表達一種或多種其它不需要的纖維素酶的宿主)，所需的酶從宿主分泌進培養(yǎng)基中，以本領域已知的方法從所說的培養(yǎng)基中回收該酶制品。
經過在發(fā)酵罐的合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主或天然菌株可生產本發(fā)明的酶制品(例如，在實施例1或在實施例30中所示)。
酶制品可以是含有或不含天然或轉化的宿主細胞的培養(yǎng)基，或是應用本領域熟知的方法從該培養(yǎng)基中回收的酶制品。然而，由于50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B分泌進培養(yǎng)基中并在纖維素裂解水溶液的環(huán)境條件下表現(xiàn)出活性，因此本發(fā)明的優(yōu)勢在于本發(fā)明的酶制品可無需進一步純化而直接從培養(yǎng)基中利用。如果需要，可將該制品凍干或濃縮其酶活性并／或穩(wěn)定化便于貯存。提供并使用本發(fā)明的酶制品非常經濟，因為(1)，該酶可以粗制品形式使用不必從培養(yǎng)基中分離具體酶，(2)由于該酶分泌進培養(yǎng)基中，只需回收培養(yǎng)基就可獲得所需酶制品；不需從宿主中提取酶。優(yōu)選的是，用于該生產的宿主是Trichoderma，特別是T．reesei。
本發(fā)明的酶制品可作為溶液或作為固體來提供，例如，以干粉或顆?；蛉芤盒问?，特別是無塵顆粒，或穩(wěn)定的液體，或可濃縮或穩(wěn)定酶制品，便于貯存或使用。可以想象到含一種或多種本發(fā)明的中性纖維素酶的酶制品可被進一步富集或制成在特定酶活性方面部分或完全缺陷，以便滿足在各種應用，如在紡織品工業(yè)中特定用途的需要。選擇由宿主且特別是真菌分泌的酶活性混合物在特定工業(yè)應用，如生物磨洗中具有優(yōu)勢。
可調節(jié)本發(fā)明的酶制品以滿足紡織品，去污染或紙漿及紙工業(yè)各種應用中特定需要的要求。
可與不完全由相同宿主分泌的其它大分子(例如，諸如葡聚糖內切酶，蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，氧化酶或淀粉酶)或可增強效果，穩(wěn)定性或緩沖所需酶制品的化學藥品制備混合物。無塵顆?？杀话??？筛鶕?jù)已形成的方法，經過加入諸如丙二醇的多元醇，糖類或糖醇，乳酸或硼酸穩(wěn)定液體酶制品。液體去污劑一般含高達90％的水和0-20％的有機溶劑?？砂碋P238216所述制備本發(fā)明的酶的保護形式。
特別是當用作去污劑組合物時，本發(fā)明的酶制品可含有表面活性劑，該表面活性劑可以是陰離子型，非離子型，陽離子型，兩性或這些類型的混合物。有用的去污劑組合物在例如，WO94／07998，US專利號5443750和US專利號3664961中描述。
如果需要，可按常規(guī)條件進一步純化所需酶，如提取，沉淀，色譜，親和色譜，電泳等。
本發(fā)明的酶制品在紡織品工業(yè)，優(yōu)選在生物磨洗和在生物拋光中或在去污劑工業(yè)中特別有用。其它有用的領域為紙漿和紙工業(yè)。
非酶促磨洗具有3個步驟脫漿，磨擦和后處理。第一步，脫漿，涉及用淀粉酶去掉淀粉覆蓋物，或其衍生物。第二步，磨擦，當不用纖維素酶進行時，一般用浮石洗滌斜紋粗棉布進行，且當需要調淡時進行漂白。磨擦效果不僅是浮石，而且還有斜紋粗棉布纖維一起磨擦的效果的結果。磨擦一般接著是第三步，洗滌步驟，洗滌步驟，以去掉多余的染料，其間可加入軟化劑或光亮劑。
在酶促磨洗或生物磨洗中，完全或部分除掉用浮石磨擦，加入纖維素酶幫助從纖維素表面磨掉靛蘭染料。該處理后，用去污劑洗滌去掉纖維素酶以保證纖維的機械強度不受酶持久存在的損害。用纖維素酶處理可完全代替用浮石處理(例如，每100kg浮石用1kg商品酶代替)。然而，當需要產生嚴重磨損結果時可將纖維素酶處理與浮石處理結合。經過結合中性纖維素酶與浮石洗滌也可實現(xiàn)桃色毛皮效果，其中產生細小的伸出毛發(fā)狀覆蓋物。本發(fā)明的纖維素酶特別是對于在生物磨洗中減小復染和增強發(fā)亮(磨損)有用。
生物磨洗優(yōu)選在大約pH4．5-9．5下進行，最優(yōu)選在pH6．0-8．5之間。反應溫度范圍為大約40-80℃，優(yōu)選50-70℃之間，最優(yōu)選在50-60℃之間。液體比率(每織物重的液體體積的比率)可在大約2∶1到20∶1之間變動，優(yōu)選4∶1-10∶1，最優(yōu)選4∶1-7∶1。酶劑量范圍為大約25-1500nkat／g織物，優(yōu)選50-500nkat／g織物，且最優(yōu)選75-300nkat／g織物。
本發(fā)明的纖維素酶在紡織品工業(yè)中用于織物或服裝的生物拋光，例如，脫毛，脫絨，顏色澄清，粗糙度降低，產生不同的結果(例如，“桃色毛皮”，“穿破的”“沙洗”，或“舊外觀”效果)以及紗線的生物拋光(例如，降低粗糙度，增加光滑性)。本發(fā)明的纖維素酶可用于酸性和中性條件的生物拋光。
本發(fā)明的纖維素酶在去污劑組合物中用于增加紡織品清潔效果，例如，除土，經過降低紡織品粗糙度增加織物保護特性，纖維素酶還具有去絨和顏色澄清及恢復效應。
可用含天然纖維素的纖維或含人造纖維素的纖維或其混合物生產用本發(fā)明的酶制品處理的紡織品材料。天然纖維素的例子是棉花，亞麻，大麻，黃麻，和苧麻。人造纖維素的例子是粘膠纖維，纖維素乙酸，纖維素三乙酸，人造絲，cupro和lyocell。上述纖維素也可用作合成纖維的混合物，如聚酯，聚酰胺或丙烯酸纖維。紡織品材料可以是紗線或編織或紡織或以任何其它方式形成的。
除了對處理織物特別有用外，本發(fā)明的纖維素酶一般在需要纖維素酶活性的任意領域中有用。在紙漿和紙工業(yè)中，可使用中性纖維素酶，例如用于不同再循環(huán)紙和具有中性或堿性pH的紙板的脫墨，用于改進纖維質量，或改進紙生產中的排水。其它例子包括在紡織品印染后去掉印跡膏增稠劑和多余的染料，以及作為對動物飼料的處理。例如，如果所需應用是增加紙漿的機械強度，那么本發(fā)明的50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質制品可提供一種或多種這類蛋白質以增強或有利于纖維素纖維結合在一起的能力。以相似的方式，在紙漿精煉應用中，本發(fā)明的50K-纖維素酶，20K-纖維素酶，50K-纖維素酶B或具有CBD的蛋白質制品可提供一定水平的一種或多種這類蛋白質以增強或利于這類膨脹。
在下面實施例中以更詳細的方式描述本發(fā)明。這些實施例僅顯示了本發(fā)明的一些具體應用。它是本領域的技術人員產生一些相似應用的證據(jù)。因此，這些實施例不應解釋為縮小了本發(fā)明的范圍，而僅僅是為解釋清楚本發(fā)明的應用。
實施例實施例1搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)為了維持，將菌株ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237，AlKO 4265和ALKO 4125劃線于孢子形成瓊脂(ATCC培養(yǎng)基5，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，絲狀真菌目錄，第18版，S．C Jong和M．J．Edwards編輯，(1991)1升含1g酵母提取物，1g牛肉膏，2g胰蛋白胨，痕量FeSO4，10g葡萄糖和15g瓊脂；pH為7．2)上。瓊脂斜面在45℃培養(yǎng)3-6天。
對于ALKO 4237的應用試驗(實施例3和4)，將菌落接種于500ml下列礦質培養(yǎng)基(Moloney，A．P．等，生物技術及生物工程，251169(1983))中1升含15gKH2PO4，15g(NH4)2SO4，2．4ml 1M MgSO4×7H2O，5．4ml 1M CaCl2，20g SOlKa floc，15g玉米粉，1g酵母提取物和10ml100×痕量元素溶液1，其中1升100×痕量元素溶液含0．5gFeSO4×7H2O，0．156gMnSO4×H2O，0．14gZnSO4×7H2O和0．49gCoSO4×7H2O；pH調為pH6．5。培養(yǎng)在搖床(250rpm)中45℃下進行3天。獲得了大約20-25nkat／ml的內切葡聚糖酶活性。
根據(jù)Bailey，M J．等，酶微生物學技術，3153(1981)使用1％(w／v)羥乙基纖維素，HEC(FlukaAG#54290)作底物以葡聚糖內切酶活性按常規(guī)測量纖維素酶活性。除非另有說明，該試驗條件是pH7．0和50℃下反應10分鐘。一個葡萄糖內切酶單位(1nkat 1ECU)定義為在測定條件下在1秒鐘內從HEC產生相應于1納摩爾葡萄糖的具有還原能力的還原糖的酶量。然而，用實施例9-12所述的純化酶時，Bailey等，酶微生物學技術3152(1981)的測定條件超出了線型范圍，因此按實施例10所述修改該測定法。對每一種菌株，濾紙活性測定(測定纖維素的總水解且表明存在纖維素生物水解酶活性)要么在可信的檢測極限之下，要么極低。
為了測定pH和溫度依賴性(實施例2)以及為了進行菌株ALKO4179，ALKO 4124，AlKO 4265和ALKO 4125的應用檢測(實施例3和4)，將菌落接種在500ml改良的熱培養(yǎng)基B(G．Szakacs，匈牙利，布達佩斯技術大學)1升含6g Solka floc，6g蒸餾器耗費的小麥，3g燕麥spelt木聚糖，2g CaCO3，1．5g大豆粉，1．5g(NH4)2HPO4，1g大麥糠，0．5g KH2PO4，0．5g MgSO4×7H2O，0．5g NaCl，0．5ml痕量元件溶液1(1升含1．6g MnSO2，3．45g ZnSO4×7H2O，和2．0g CoCl4×6H2O)和0．5ml痕量元素溶液2(1升含5．0g FeSO4×7H2O和2滴濃H2SO4)；pH調至pH6．5。培養(yǎng)在搖床(250rpm)中45℃進行3天。由于在熱培養(yǎng)基B中菌株ALKO 4179，ALKO 4124和ALKO 4237的葡聚糖內切酶活性為大約5nkat／ml，使用截留30kDa的Amicon濃縮器濃縮培養(yǎng)物濾液大約10倍。用ALKO 4265獲得的葡聚糖內切酶活性為大約20nkat／ml，用ALKO 4125為30-40nkat／ml。
在下面培養(yǎng)基中進行ALKO 4179的1升發(fā)酵罐培養(yǎng)1升含10gSolka floc，3g纖維二糖，4g玉米粉，1．5g(NH4)2HPO4，0．3gMgSO4×7H2O，0．5g NaCl，2g CaCO3，0．5ml痕量元素溶液1和0．5ml痕量元素溶液2，0．5g KNO3，0．3g CaCl2，1g Tween 80；將pH調為pH6．5。
在改良的熱培養(yǎng)基B中進行ALKO 4124的1升發(fā)酵罐培養(yǎng)1升含10g Solka floc，1g Roth’s木聚糖，40g乳清，30g大豆粉，2gCaCO3，5g(NH4)2SO4，0．5g KH2PO4，1．0g MgSO4×7H2O，1．0g NaCl，1g抗泡劑，0．5ml痕量元素溶液1和0．5ml痕量元素溶液2。
在上面所述的礦質培養(yǎng)基中進行ALKO 4237的1升發(fā)酵罐培養(yǎng)。使用10％(v／v)接種物。經過加入氨[12．5％(v／v)]和磷酸[1．7％(v／v)]將pH維持在pH6．5±0．4。發(fā)酵溫度為45℃。發(fā)酵罐(Biostat M．B．Braun，Melsungen，德國)以400rpm攪拌且氣流為1vvm。所得的葡聚糖內切酶活性如下ALKO 4179為大約40nkat／ml，ALKO 4124為大約90nkat／ml，ALKO 4237為大約30nkat／ml。ALKO 4265和ALKO 4125不在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237和ALKO 4125在上述培養(yǎng)基和條件下在100升中試發(fā)酵罐中培養(yǎng)。獲得的葡聚糖內切酶活性對于ALKO 4179和ALKO 4237為大約40nkat／ml，ALKO 4124為大約90nkat／ml，ALKO 4125為大約100nkat／ml。使用截留10kDa在MilliporePUF 100超濾膜和Pellicon US盒式濃縮器中將培養(yǎng)物濾液濃縮10-20倍。
實施例2在培養(yǎng)物濾液中測定葡聚糖內切酶活性的pH和溫度依賴性為了測定pH和溫度依賴性，將菌株ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO4237，ALKO 4265和ALKO 4125在改良的熱培養(yǎng)基B中生長。將來自搖瓶培養(yǎng)的樣品(培養(yǎng)物濾液)在pH范圍為4．5-8．5的5．0mM McIlvain’s緩沖液(50mM檸檬酸-100mM Na2HPO4)中稀釋。對于菌株ALKO 4179，培養(yǎng)物濾液緩沖液混合物的最終pH值為4．3，5．4，6．3，7．3，8．1和8．7，對菌株ALKO 4124為4．3，5．4，6．4，7．3，8．1和8．5；對于菌株ALKO 4237為4．4，5．3，6．2，7．1，8．0和8．5；對于菌株ALKO 4265為4．3，5．4，6．3，7．2，8．1和8．5，對于菌株ALKO 4125為4．3，5．4，6．4，7．3，8．1和8．5。加入BSA作為蛋白質載體至濃度為100μg／ml。作為蛋白酶抑制劑，加入胃蛋白酶抑制劑A和苯甲基磺酰氟(PMSF)分別為1．0μg／ml和174μg／ml。在各pH下，在50℃60分鐘反應時間下測量葡聚糖內切酶活性。在大約4．5-7．5的pH范圍內，ALKO 4179表現(xiàn)出超過其最大值90％的葡聚糖內切酶活性，在大約pH5．4-6．3檢測到最大活性(圖1A)。在大約5．5-7．5的pH范圍內ALKO 4124表現(xiàn)出超過其最大活性80％的葡聚糖內切酶活性，在大約pH6．4下檢測到最大活性(圖2A)。在大約4．5-7．0的pH范圍內ALKO 4265表現(xiàn)出超過其最大活性80％的葡聚糖內切酶活性，在大約pH5．5-6．5時檢測到最大活性(圖4A)。在大約4．5-6．0的pH范圍內ALKO 4237表現(xiàn)出超過其最大活性80％的葡聚糖內切酶活性，在大約pH5．3時檢測到最大活性(圖3A)。在大約4．5-7．5的pH范圍內ALKO 4125表現(xiàn)出超過其最大活性90％的葡聚糖內切酶活性，在大約pH6．5時檢測到最大活性(圖5A)。
為了進行葡聚糖內切酶活性的溫度依賴性測定。來自培養(yǎng)物濾液的樣品在50mM McI lvain’s緩沖液，pH7．0中稀釋。加入BSA作為蛋白質載體至濃度為100μg／ml。加入胃蛋白酶抑制劑A和苯甲基磺酰氟(PMSF)作為蛋白酶抑制劑至分別為10μg／ml和174μg／ml。培養(yǎng)物濾液緩沖液混合物的最終pH值為7．3(ALKO 4179，ALKO 4124和ALKO4125)和7．2(ALKO 4237和ALKO 4265)。樣品在40℃，50℃和60培養(yǎng)60分鐘。在50℃和60℃檢測到ALKO 4179的最大葡聚糖內切酶活性，在40℃保留大約30％的該活性(圖1B)。在60℃檢測到ALKO 4124的最大葡聚糖內切酶活性，在50℃保留大約70％的活性，在40℃保留30％(圖2B)。在60℃檢測到ALKO 4237的最大葡聚糖內切酶活性，在50℃保留大約60％的活性，在40℃保留40％(圖3B)。在60℃檢測到ALKO 4265的最大葡聚糖內切酶活性，在50℃保留大約50％的活性，在40℃保留30％(圖4B)。在60℃檢測到ALKO 4125的最大葡聚糖內切酶活性，在50℃保留大約80％的活性，在40℃保留70％(圖5B)。
實施例3在中性條件下靛蘭染料的釋放檢驗來自菌株ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237，ALKO 4265和ALKO 4125的纖維素酶制品(實施例1和2)在中性條件下從靛蘭染色的含棉斜紋粗棉布織物中釋放染料以產生磨洗外觀的能力。商用酸性纖維素酶產物Ecostone L (Primalco Ltd，Biotec，F(xiàn)inland)用作對照。
斜紋粗棉布織物從Lauffenmuehl(德國)獲得。試驗織物在60℃用Ecostone A 200(1ml／升，Primalco Ltd_Biotec，F(xiàn)inland)預洗10分鐘。然后將織物切成12×12cm的小塊布樣。用Minolta(Osaka，Japan)Chroma Meter CM 1000 RL*a*b系統(tǒng)測量織物布樣兩面的顏色作為反應值。
按如下方法在LP-2 Launder-Ometer(Atlas，Illinois，USA)中進行纖維素酶處理。將大約7g斜紋粗棉布布樣裝入含200ml pH7的0．05M檸檬酸／磷酸的鹽緩沖液，或pH5．2的0．05M檸檬酸緩沖液的1．2升容器中，加入0．06ml 10％ Berolo8 (Berol Nobel AS，Sweden)作為表面活性劑。
將一定量的鋼球加入各容器中以幫助除去纖維。最后后容器中加入纖維素酶溶液作為葡聚糖內切酶活性單位(實施例1)。然后封閉該容器并放入50℃Launder-Ometer水浴中。以42rpm運行Launder-Ometer 2小時。
從容器中取出布樣后，將它們在200ml 0．01NaOH中浸泡10分鐘并用冷水漂洗10分鐘。布樣在105℃下干燥1小時并在空氣中干燥過夜。用Minolta Chroma Meter測量布樣兩面的顏色。處理的斜紋粗棉布織物的顏色測量結果在表Ⅰ中顯示。
表Ⅰ．用不同纖維素酶制品處理的斜紋粗棉布的顏色測量值
為了比較用不同纖維素酶制品洗滌后斜紋粗棉布織物的最終外觀，測量織物兩側(反面和正面)的顏色。從表Ⅰ所示的結果可見在用ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237和ALKO 4125纖維素酶制品洗過的服裝正面光亮度和蘭色單位明顯增加，顯示較好的磨洗效果。在用ALKO 4265制品洗過的織物亞面蘭色單位也增加但光亮度單位不增加。這可能是因為該酶在該pH下起作用但同時引起一些復染。用商品酸性產物Ecostone L在pH7下在該ECU活性時對織物無磨洗效應。
在該試驗中，在織物反面的復染用作織物正面復染程度的指標。為了定量復染水平，在纖維素酶處理前和后測量織物反面的顏色。如表Ⅰ所示，當ECU量相同時，與用ALKO 4265或Ecostone L(pH5．2和7)制品處理的織物相比，在用ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237和ALKO 4125制品處理的織物上實際上無復染。
實施例4在中性條件下無Berol時的染料釋放除了不使用Berol外，本實驗方案如實施例3中所述。處理的斜紋粗棉布織物的顏色測量結果在表Ⅱ中所示。
表Ⅱ．用不同纖維素酶制品-無Berol處理的斜紋粗棉布織物的顏色測量。
與含有Berol獲得的結果(實施例3)相比，表Ⅱ的數(shù)據(jù)表明在無輔助劑Berol時用ALKO 4179，ALKO 4124，ALKO 4237和ALKO 4125纖維素酶制品可達到幾乎相同的磨洗效果。
實施例5用不同纖維素酶在斜紋粗棉布洗滌中的復染在本說明書中，報道了復染取決于pH和／或酶類型。然而，如本文所示，發(fā)現(xiàn)復染僅簡接取決于pH(圖6A和6B和7A和7B)。
在小規(guī)模斜紋粗棉布洗滌中以相等的酶劑量在pH5和pH7下研究來自ALKO 4237和來自ALKO 4265的2種中性纖維素酶制品和酸性纖維素酶產物Ecostone L。經過測量光亮度和蘭色的增強作為纖維正面的反射單位來確定磨洗效果，復染(纖維表面靛蘭的再沉積)測定為反面蘭色增強和光亮度下降。在pH7時，ALKO 4237的中性纖維素酶引起正面亮度和藍色明顯增強且未觀察到復染(圖6A和6B)。在pH5時發(fā)現(xiàn)相似的磨洗效果但有輕微的復染。在pH7時，另一中性纖維素酶ALKO 4265增強正面的藍色但在反面強烈復染。在pH5時用ALKO 4265和ALKO 4237制品觀察到相似的效果。在pH7時，酸性纖維素酶不復染或降低正面亮度(當使用與ALKO 4265和ALKO 4237相似的葡聚糖內切酶活性劑量時，圖7A和7B，1×劑量)，很可能是因為在該pH下它不發(fā)揮作用。另一方面，在pH5時，正面的亮度和蘭色增強且在反面明顯地觀察到復染。根據(jù)這些結果，在兩種pH值下根據(jù)所用的纖維素酶制品可出現(xiàn)復染。
實施例6含中性纖維素酶的酶制品在含棉紡織物的生物拋光中的應用用ALKO 4237(實施例1)和ALKO 4467纖維素酶在Launder-Ometer中處理100％棉紡織物。ALKO 4467是來自ALKO 4125具有更高纖維素酶活性的UV-突變體。
按實施例7預處理100％棉紡織物(從Pirkanmaan Vusi VarjaamoLtd)。纖維素酶處理條件如實施例3所述，除了未使用Berol，且液體比率為1∶15(每份織物重量的液體體積)。以ECU活性單位(實施例1)定量纖維素酶。
下面的方法用于評價酶制品在棉織物的生物拋光中的效果處理的織物的重量損失定義為試驗前和后織物重量的百分數(shù)(稱重前，織物控制在2H 2℃及50+5％RH的大氣中)。由3人組成的一組進行酶處理的織物的表面清潔效果的評價。織物以1到5的得分分等級，其中5產生清潔的表面。Martindale摩擦方法(SFS-4328)用于評價起球。以摩擦200到2000個循環(huán)后的一組評價起球(1=許多球，5=不起球)。
表Ⅲ顯示用ALKO 4237和ALKO 4467纖維素酶制品處理棉織物在pH5和7下均產生較好的表面清潔且顯著減少起球傾向。
表Ⅲ．在Launder-Ometer中用中性纖維素酶處理的棉織物的重量損失，表面清潔效果及起球傾向制品劑量 時間 pH 重量損失 表面清潔 起球ECU／ h ％ 效果200 2000g 循環(huán)循環(huán)- 150 1．0 1．01．0ALKO4237200152．3 3．5 4．03．8ALKO4237400153．2 3．5 4．03．8ALKO4467200151．2 2．5 3．73．4ALKO4467400151．9 2．8 3．73．4-- 250．1 1．0 1．01．0ALKO4237200254．4 4．0 4．24．1ALKO4237400256．0 4．3 4．24．3ALKO4467200253．0 3．5 4．03．8ALKO4467400254．0 3．8 4．03．9-- 170 1．0 1．01．0ALKO4237200172．5 3．0 3．73．5ALKO4237400173．8 4．0 4．03．9ALKO4467200170．8 2．0 3．53．3ALKO4467400171．4 2．0 3．63．7-- 270．1 1．0 1．21．1ALKO4237200274．8 4．0 3．84．0ALKO4237400276．0 4．3 4．04．3ALKO4467200272．2 2．5 4．03．4ALKO4467400273．0 3．3 3．83．7實施例7在生物拋光中使用本發(fā)明的含中性纖維素酶的酶制品7a．酶制品在紡織品和編織品的生物拋光中的應用。
用本發(fā)明的纖維素酶(實施例1)在半工業(yè)桶式洗衣機(Esteri20HS-P)中處理100％的棉紡織物或100％棉編織品。處理條件如下A．預處理(僅對紡織物)。
60℃，10分鐘，Ecostone A 200(Primalco Ltd．Biotec，F(xiàn)inland)1ml／l水。B．酶處理。
溫度50-60℃，pH7；液體比率5-20∶1(每份織物重量的液體體積)；處理時間20-90分鐘，優(yōu)選30-60分鐘；酶劑量50-900hKat／g織物或編織品，優(yōu)選200-600nKat／g織物或編織品。C．“洗滌后”處理40℃，10分鐘，堿性去污劑，D．干燥處理下列標準方法用于評價酶制品的表面清潔效應Martindale摩擦法(SFS-4328)和耐洗力試驗(SFS-3378)。用本發(fā)明的纖維素酶制品處理導致產生表面清潔效果，織物和編織品柔軟性和光滑性增強且減小了起球傾向。7b．酶制品在lyocell織物和編織物的拋光中的應用。
本發(fā)明的纖維素酶制品可用于原纖維形成控制及100％ lyocell織物和編織品及其混合物的不同拋光方法中。為了在lyocell織物上產生桃色效果可在半工業(yè)桶式洗衣機(Esteri 20 HS-P)中使用下面處理條件A．碳酸鈉2．5g／l，60℃，60分鐘的處理時間；B．漂洗；C．酶處理溫度50-60℃，pH7，液體比率5-20∶1，處理時間40-120分鐘，優(yōu)選40-90分鐘，酶劑量為100-1500nKat／g織物，優(yōu)選400-800nKat／g織物；D．后處理40℃堿性去污劑洗滌10分鐘E．漂洗；F．干燥。
結果產生桃色毛皮效果。
實施例8在生物磨洗中使用酶制品在半工業(yè)桶式洗衣機(Esteri 20 HS-P)中用中性纖維素酶制品(實施例1)處理斜紋粗棉布服裝使該服裝產生磨洗外觀。每次機器負荷使用大約1．0kg斜紋粗棉布服裝(含2種不同類型的織物)。
處理條件如下A．脫漿。100升水，60℃，10分鐘；100ml Ecostone A200(Primalco Ltd_Biotec，F(xiàn)inland)。
B．纖維素酶處理。100升水，50℃，45分鐘；10g Berol 08(BerolNobel AS，瑞典)；30g檸檬酸+128g Na2HPO4×2H2O，使達到pH7。
以葡聚糖內切酶活性單位(ECU，實施例1)定量中性纖維素酶制品1．ALKO 4237，260 ECU／g服裝，2．ALKO 4179，260 ECU／g服裝，3．ALKO 4124，300 ECU／g服裝，4．ALKO 4125，250 ECU／g服裝，C．后洗滌，堿性去污劑洗滌，40℃，10分鐘。
D．干燥。
以服裝的肉眼外觀和經過用Minolta Chroma Meter CM 100RL*a*b*系統(tǒng)以反射值測量顏色(表Ⅳ)評價結果。所有這些纖維素酶處理的服裝獲得較好的磨洗效果。在這些纖維素酶處理的服裝中經肉眼未見復染(檢查服裝內面)。
從表Ⅳ顯示的顏色測量結果可見用中性纖維素酶制品洗滌的服裝外表面亮度和蘭色單位明顯增加，顯示出較好的磨洗效果。
表Ⅳ．以不同纖維素酶制品處理的斜紋粗棉布服裝的顏色測量
L=處理后服裝的亮度單位(值越高，服裝越亮)。
b=處理后服裝的蘭色單位(負值越大，服裝越蘭)。
實施例9中性纖維素酶的純化在7℃ DEAE瓊脂糖CL6B上用在25mM Tris／HCl pH7．2中從0到0．5M NaCl的線型梯度分離來自ALKO 4237的濃縮生長培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)4個pH4．8時的葡聚糖內切酶活性峰。峰Ⅰ，含大約10％的回收的ECU，在大約150mM NaCl處洗脫，峰Ⅱ(大約30％的ECU)在230mM NaCl，峰Ⅲ(大約20％的ECU)在270mM NaCl處，峰Ⅳ(大約40％的ECU)在320mM NaCl處。
表Ⅴ顯示了試驗這些峰在中性pH和50℃的生物磨洗中其應用的結果。
這些結果顯示，根據(jù)ECU和總蛋白質，峰Ⅱ比任何其它峰或比未分離的濃縮物更有效。還試驗了各含70ECU／g斜紋粗棉布的峰Ⅰ和Ⅱ的混合物。結果L(正面)值為7．3，b(反面)為2．5。因此，該混合物比任一單獨的峰更有效。
增加純化程序以獲得在這些峰中一些所需蛋白質的均一性樣品。用硫酸銨分離濃縮的ALKO 4237生長培養(yǎng)基(4．5升)。每100ml濃縮物用17g至42g硫酸銨沉淀的蛋白質懸浮于0．9升含0．25mM EDTA的25mM Tris／HCl pH7．2中，然后用水稀釋至傳導率為4ms／cm且用1MNaOH調成pH8．0。所得的溶液(大約45升)在室溫下，以150ml／分泵過6．3升的DEAE-Sepharose FFTM柱。在這類條件下峰Ⅰ的葡聚糖內切酶活性不結合。用在20升含0．25mM EDTA的25mM Tris／HCl pH7．7中的從0．0到0．5M NaCl的線型梯度以110ml／分洗脫結合的蛋白質。峰Ⅱ的葡聚糖內切酶在大約14ms／cm處洗脫。在冷藏室中在DEAE中用小批量制品可見在大約25ms／cm處洗脫稱為峰Ⅲ／Ⅳ的單一峰，代替分離的峰Ⅲ和Ⅳ。
表Ⅴ．在中性條件下以DEAE-SepharoseTM合并液釋放靛蘭染料
參數(shù)L(正面)表示蘭色斜紋粗棉布正面的亮度，b(反面)表示反面的蘭色(即，復染)?？椢镌贚P-2Launder-Ometer中洗滌，然后除了不使用Berol且所用的緩沖液為0．05M McIlvaine pH7(見生化研究，Dawson，R，等編輯，1969，牛津大學出版社的數(shù)據(jù))外，按實施例3所述用Minolta ChromaMeter測量。劑量表示為ECU／g斜紋粗棉布和mg蛋白質／g斜紋粗棉布。
用硫酸銨(450g／升)沉淀峰Ⅱ(3．5升)中的蛋白質并懸浮于170ml含1mM EDTA的25mM PIPES／KOH pH6．0中。經過在G25SephadexTM的5×29cm柱上凝膠過濾(粗制)將部分該物質轉換成在25mM含1mM EDTA的乙酸鈉pH4．0中，然后在SP-SepharoseTM上分級分離。圖8顯示了當11．7g該蛋白質上樣到150ml／h的含1mM EDTA的25mM乙酸鈉pH4．0的SP-SepharoseTM的4．5×31cm柱上和在3．4升相同緩沖液中的具有從0．0獲得0．4M NaCl的線型梯度以75ml／l形成的柱上獲得的結果。在0．2M NaCl處洗脫出大部分葡聚糖內切酶。使用在實施例10中所述的改良測定。當活性餾分貯存于7℃時，在其中出現(xiàn)結晶沉淀幾乎含全部葡聚糖內切酶活性。結晶緩慢的活性餾分(15ml)經過接種來自已含有結晶之餾分的30μl懸液誘導形成晶體。2至3天后，經離心收集晶體，用含1mM EDTA的25mM PIPES／KOHpH6．0洗滌并溶于含0．25mM EDTA的25mM Tris／HCl pH7．2。經SDS-PAGE分析顯示洗滌的結晶含表觀分子量接近20kDa的基本上勻質的蛋白質(分子量的SDS-PAGE評價中的誤差至少為±10％，對于異常的蛋白質可能更大)。該蛋白質稱為20K-纖維素酶。經過在含1mM EDTA的50mM PIPES／KOH pH6．0中的G50 SephadexTM上凝膠過濾也可去掉污染蛋白質。其例子在圖9中顯示，其中經凝膠過濾純化未洗滌的晶體。在細胞色素C(11．2kDa)體積后與20kDa蛋白質共同洗脫的葡聚糖內切酶活性顯示該20kDa蛋白質經過與SephadexTM相互作用而異常延遲。
用硫酸銨沉淀峰Ⅲ／Ⅳ中的蛋白質并以與對峰Ⅱ蛋白質所述相同的方式轉換成含1mM EDTA的25mM乙酸鈉pH4．0。在轉換成25mM乙酸鈉pH4．0時，形成大量沉淀并被棄去?；钚陨锨逶赟P-SepharoseTM上分級分離。如圖10所示以小量蛋白質(例如200mg蛋白質)上樣到2．5×11cm柱上，大多數(shù)葡聚糖內切酶活性結合于柱上并以大約50mMNaCl的NaCl梯度洗脫。該活性峰接著是無活性蛋白質的第二峰。
SDS-PAGE分析顯示活性和無活性峰均含有一些蛋白質，包括以SDS-PAGE不能互相區(qū)分的表觀分子量接近50kDa的蛋白質。以在Phenyl SepharoseTM上的色譜進一步純化兩峰。
合并活性餾分(圖10中的餾分15至18)，調至50mM PIPES／KOHpH6．0(經加入0．25M PIPES／KOH pH6．0)及15g％硫酸銨(經過加入固體硫酸銨)并上樣到用含1mM EDTA和15g％硫酸銨的25mMPIPES／KOH pH6．0平衡的Phenyl SepharoseTM的1．5×8．5cm柱上。用在104ml 25mM PIPES／KOH pH6．0中的從15到0g％硫酸銨的線型梯度過柱。在梯度結束時，用25mM PIPES／KOH pH6．0進一步洗滌柱。在梯度中洗滌出兩個蛋白質峰，第一個是無活性蛋白質的小峰，然后是含大多數(shù)葡聚糖內切酶活性的主峰。SDS-PAGE分析(圖11A和B)顯示兩個峰含有表觀分子量接近50kDa的基本上勻質的蛋白質(即，它們比表觀分子量為47kDa的BioRad預染的卵清蛋白標準品遷移略慢)。經本發(fā)明人的SDS-PAGE分析不能區(qū)分這兩種蛋白質，即使當它們作為混合物一起走電泳也不能區(qū)分?；钚苑逯械牡鞍踪|稱為50K纖維素酶，非活性峰中的蛋白質稱為50K-蛋白質B。經過分離按上面對活性餾分所述完全相同的方式在Phenyl SepharoseTM上從SP-SepharoseTM洗脫的第二(非活性)峰(圖10中餾分19至23)獲得更大量的50K-纖維素酶B。
經過上樣SP-SepharoseTM柱幫助生產更大量的50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B。例如，當15g蛋白質上樣到4．5×31cm SP-SepharoseTM上時，50K-纖維素酶明顯被更強結合的蛋白質代替而不與柱結合并在NaCl梯度前被洗脫出。該物質已被高度純化，且經過如上所述在PhenylSepharoseTM上層析從中分離出勻質的50K-纖維素酶。
為了加速50K-纖維素酶的大量純化，顛倒SP-Sepharos和PhenylSepharose柱。調節(jié)硫酸銨濃度至大約15g％后，將在峰Ⅲ／Ⅳ中沉淀的蛋白質如前所述上樣到Phenyl Sepharose上。上樣量較高時(例如，17g蛋白質上樣到3．2×25cm Phenyl Sepharose柱上)，大部分總蛋白質流過柱，但50K-纖維素酶(含大多數(shù)葡聚糖內切酶活性)結合，且在25mMPIPES／KOH pH6．0中的15到0g％硫酸銨的線型梯度末端洗脫。用識別50K-纖維素酶B的兔抗血清的Western分析表明，50K纖維素酶B剛好在50K-纖維素酶之前洗脫。經過按前面所述在SP-Sepharose上分離實現(xiàn)進一步純化。在這種SP-Sepharose和Phenyl Sepharose順序顛倒的情況中，可將用硫酸銨沉淀的峰Ⅲ／Ⅳ中的蛋白質不經去鹽直接上樣到下一純化步驟中。這樣也可避免峰Ⅲ／Ⅳ中濃縮的蛋白質直接轉換成用于SP-Sepharose的25ml乙酸鈉pH4．0時出現(xiàn)的大量蛋白質沉淀。由于50K-纖維素酶僅結合SP-Spharose，前面在Phenyl Sepharose上進行的分離顯著減少對SP-Sepharose上上樣的總蛋白質的明顯干擾。
在Launder-Ometer中分別試驗了50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B以觀察它們是否負責實施例10中所報道的峰Ⅳ的有益效果。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質均具有有益效果(表Ⅵ)。在本實驗中使用低濃度時，它們本身不增加靛蘭染料從斜紋粗棉布外表面的釋放(即，L正面不增加)，但它們有效減小染料復染到斜紋粗棉布的內表面(L反面變得更正值且b反面變得更小)，特別是當與20K-纖維素酶一起使用時。
在Launder-Ometer試驗中在pH5及在pH7時20K-纖維素酶效果較好。在pH5時，每克斜紋粗棉布0．2mg的20K-纖維素酶將L正面從3．2增加到5．2。與20K纖維素酶一起以0．1mg每克斜紋粗棉布的量加入50K-纖維素酶也減小在pH5時的復染(L反面和b反面從僅用20K-纖維素酶時的0．0和2．6分別變?yōu)橛?0K-和50K-纖維素酶的混合物時的1．3和1．5)。
表Ⅵ．用20K-纖維素酶，50K-纖維素酶和50K纖維素酶B釋放靛蘭染料。
條件與表Ⅴ相同，劑量以每克斜紋粗棉布的mg蛋白質數(shù)表示。
樣品 劑量L正面L反面b反面(mg／g)只有緩沖液- 2．8-0．6 1．620K-纖維素酶 0．185．6-1．0 4．00．094．8-1．5 3．350K-纖維素酶 0．152．6-0．3 1．00．075 3．0 0．4 1．350K-纖維素酶B 0．312．8 1．3 0．80．152．7 1．5 0．520K-纖維素酶+ 0．18+0．0755．6 0．3 2．550K-纖維素酶 0．09+0．0755．1 0．3 2．120K-纖維素酶+ 0．18+0．15 4．7 0．0 3．050K-纖維素酶B
實施例1020K-纖維素酶的特征盡管針對從Trichoderma reesei純化的纖維素酶制備的多克隆抗體(命名為抗-EGⅠ，抗-CBHⅠ和抗-CBHⅡ抗體)識別ALKO 4237生長培養(yǎng)基中的蛋白質，但在相同條件下的Western印跡分析中與純20K-纖維素酶僅有極弱的交叉反應。
當用兔中產生的針對純20K纖維素酶的抗血清在Western分析中探測來自ALKO 4237的生長培養(yǎng)基時，除了20kDa帶外還觀察到在大約35kDa處的強帶。對該35kDa蛋白質未檢測到明顯的葡聚糖內切酶活性。另外，在緊靠20kDa帶上面看見一條較弱的帶(圖14)。
ALKO 4124產生幾乎與ALKO 4237相同的帶型，表明它和其它真菌很可能含有與本發(fā)明的20K-纖維素酶非常相似的纖維素酶。
來自20K-纖維素酶胰酶肽的氨基酸序列在圖17中顯示。
在不加其它酶活性時純化的20K-纖維素酶在中性pH的生物磨洗中，效果較好，如表Ⅶ所示。
表Ⅶ，以純化的20K-纖維素酶進行生物磨洗條件如在表Ⅴ中所示的實驗。劑量表示為mg蛋白質／g斜紋粗棉布織物?！叭囵B(yǎng)基”指未分離的ALKO 4237濃縮的生長培養(yǎng)基。
與未分離的培養(yǎng)基相比，20K-纖維素酶在1／80th蛋白質劑量時產生相同程度的亮度(L正面=6．0-6．1)。而且較少復染到織物反面(L反面=-0．5，相對于-2．9，b反面=3．6，相對于5．5)。用20K纖維素酶處理的織物具有愜意的柔軟質地。
盡管無其它添加物的20K-纖維素酶產生令人驚奇的好效果，但當20K與DEAE-Sepharose合并液Ⅰ，Ⅲ或Ⅳ一起使用時產生更好的織物外觀和質地(表Ⅷ)。
表Ⅷ．20K纖維素酶與從DEAE-Sepharose洗脫的葡聚糖內切酶合并液在生物磨洗中的協(xié)同作用。
條件與表Ⅴ相同
20K-纖維素酶與合并液Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ的混合物比任一單獨的成分產生更亮(增加L正面)的外觀。至少對于20K-纖維素酶與合并液Ⅳ的組合，很清楚是由于協(xié)同作用而不僅僅是增加的效果。而且，用所有混合物的復染實際上比僅用20K-纖維素酶觀察到的復染要小(L反面更正，b面較小)。20K與合并液Ⅳ的組合特別有效。合并液Ⅳ含許多蛋白質，其中之一(50kDa多肽)在Sephadex G100和S-Sepharose上對合并液Ⅳ的色譜期間與葡聚糖內切酶活性共同純化。盡管僅用20K-纖維素酶實現(xiàn)了較好的生物磨洗，但用20K纖維素酶加上一個或多個從合并液Ⅳ純化的蛋白質很可能產生更好的結果。用20K纖維素酶與從合并液Ⅲ／Ⅳ純化的50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B的混合物進行的生物磨洗已提供(在實施例9的表Ⅵ中)。因此，本發(fā)明不限于僅使用20K-纖維素酶。在ALKO 4237培養(yǎng)基中的其它蛋白質單獨或以合適的組合也是有用的。
在Bailey等描述的標準葡聚糖內切酶測定(1981，loc．cit)中，選擇酶量，它在10分鐘及pH4．8(0．05M Na-檸檬酸緩沖液)下從1％羥乙基纖維素酶產生大約0．6mM還原對應物，導致最終吸光率變化(ΔA540)為0．2到0．25。這遠遠超出了A540與20K-纖維素酶的量成比例的范圍。
因此，按下列修改程序。使用足夠的酶在0．05M HEPES緩沖液(pH7．0)中10分鐘產生大約0．2mM還原對應物。為了達到還原對應物的臨界濃度，在該臨界濃度上在DNS系統(tǒng)中形成顏色，向貯存的DNS試劑中新加入0．12mM葡萄糖。在鑒定20K纖維素酶和50K-纖維素酶的葡聚糖內切酶活性時使用該方法(稱為“改良”方法)。用1％羥乙基纖維素作底物，ΔA540與20K-和50K-纖維素酶的量成比例的范圍相當窄，因此2％羧甲基纖維素用作可供選擇的底物。用2％羧甲基纖維素時，ΔA540與20K和50K纖維素酶量線型相關的范圍比用1％羥乙基纖維素要寬。用2％羧甲基纖維素測定的葡聚糖內切酶活性與用1％羥乙基纖維素測定的相比對于20K纖維素酶為大約8-10倍，對于50K-纖維素酶大約為50倍。
對于纖維素生物水解酶的特征性底物4-methylumbelliferyl-β-D-乳糖苷檢測不到20K-纖維素酶活性。對濾紙的活性也極低，但可檢測到。
20K纖維素酶具有相當大的熱穩(wěn)定性。以7μg／ml在25mM Tris-HCl，0．2mM EDTA中100℃對其保溫30或60分鐘，然后在pH7．0和50℃下測定。在pH7．2時分別保留葡聚糖內切酶活性的52％和35％，在pH8．8時分別保留40％和22％。(在室溫下測量這些pH值；在100℃的實際pH較低)。在80℃，pH7．2時，60分鐘內保留70％的活性。
這些結果表明該酶適合于其中酶可能(例如，偶然)受到升溫的應用。由于在高溫進對不可逆失活有抗性，該酶在pH7．0 10分鐘的試驗期間表現(xiàn)出最適溫度為70℃(圖15)。高于70℃觀察到的活性減小主要是由于酶構象的可逆改變，當恢復到50℃時該酶恢復其大部分活性。
在50℃時，20K纖維素酶在4至9的pH范圍內表現(xiàn)出80℃或更大的其最大活性，在pH10時幾乎為50％。在10分鐘(圖16A)和60分鐘(圖16B)的測定中均如此。這些圖也顯示了在70℃時該酶的pH依賴性。在10分鐘測定中，在pH4．5至8的范圍內，該酶在70℃比在50℃具有更大活性，但在pH10時大約活性相等(圖16A)。在60分鐘的測定(即，接近商用條件)中，在pH5．5和7．5之間，該酶在70℃比在50℃具有更大活性。然而，pH10時，該酶在70℃時僅比在50℃時活性略低。實際上，這意味著在較大的pH范圍內及在高達至少70℃的溫度下使用該酶效果同樣好。
實施例1150K-纖維素酶的特征純的50K-纖維素酶具有葡聚糖內切酶活性(對羥乙基纖維素)和纖維素生物水解酶活性(對4-methylumblliferyl-β-D-乳糖苷，基本上按van Tilbeurgh等，在酶學方法vol．160，pp45-59中所述測定)。A280為1．8的純酶樣品在pH7．0和50℃時含2030 ECU／ml和300PCU／ml(1PCU是每秒釋放1nmol甲基傘形酮的活性量)。
在Western分析中，50K-纖維素酶被針對T．reesei葡聚糖內切酶Ⅰ產生的抗血清(KH1057)強烈識別，但僅被抗T．reesei纖維素生物水解酶Ⅰ和Ⅱ的抗血清(分別為KH1050和KH1053)微弱識別。針對20K纖維素酶產生的抗血清不識別該酶(圖14)。當用針對50K纖維素酶本身產生的兔抗血清在Western分析中探測ALKO 4237的生長培養(yǎng)基時，除了在大約50kDa處非常強的帶外還看見僅一條明顯的帶(分子量在33和47kDa之間)。
當該蛋白質用內切葡萄糖苷酶Hf處理時，經SDS-PAGE測定的50K-纖維素酶的表觀分子量減小大約2到5kDa，表明該酶含有可被這種內切葡萄糖苷酶去掉的糖。
50K-纖維素酶對胰酶消化具有異?？剐?，表明它具有異常的穩(wěn)定結構。然而，它可經過用溴化氫處理而裂解，然后所得的片段可用胰酶或賴氨酰內切肽酶C消化。如此獲得的一些肽的序列在表Ⅸ中顯示。
表Ⅸ從50K-纖維素酶分離的肽序列(不確定的殘基以小寫字母表示)#507 VYLLDETEHR#509 XXLNPGGAYYGT#563 MsEGAECEYDGVCDKDG
#565 NPYRVXITDYYGNS#603 DPTGARSELNPGGAYYGTGYXDAQ#605 XXVPDYhQHGVda#610 NEMDIXEANSRA#611 LPXGMNSALYLSEMDPTGARSELNP#612 VEPSPEVTYSNLRXGEIXgXF#619 DGCGWNPYRVvITtDYYnN#620 LPCGMXSALY#621 ADGCQPRTNYIVLDdLIHPXXQ50K-纖維素酶是一種穩(wěn)定的酶，在較大的pH值范圍內及在高溫下表現(xiàn)出葡聚糖內切酶活性，因此，適用于許多工業(yè)條件。在pH7．0及60分鐘的反應時間時。最適溫度為65至70℃，即使以這樣長的反應時間，它在75℃時仍表現(xiàn)出在50℃所觀察到的50％的活性(圖12)。
在60分鐘反應時間下，在50℃時pH最適值極寬，在pH4．4至7．0之間具有基本上恒定的活性，在pH9和10時的活性分別等于pH7．0時的50％和30％。在70℃時，具有明確的pH6的最適值，在pH5和7之間，該活性(具有60分鐘反應時間)比50℃時高3倍或更大。然而，在pH4．4及pH值高于8時，該活性在50℃在70℃更高(在60分鐘測定中)，表明在70℃時pH范圍5至7．5兩側的酶穩(wěn)定性下降。pH依賴性在圖13中表示。
實施例1250K-纖維素酶B的特征用羥乙基纖維素或羧甲基纖維素對50K-纖維素酶B(以前稱為50K-蛋白質B)測量不到可檢測的葡聚糖內切酶活性。在酸性pH時，50K-纖維素酶B具有低纖維素生物水解酶活性，在pH5時它(用4-methylumbelliferyl-β-D-乳糖苷測量)不超過50K纖維素酶的0．1％。另外，50K纖維素酶B對pH4．8的濾紙和用于酶活性測定的pH5和7時的酸性膨脹的無定形Scolca Floc-纖維素具有可檢測的活性。
在Western分析中，50K-纖維素酶B被針對T．reesei纖維素生物水解酶Ⅰ產生的抗血清(KH1050)強烈識別，但僅被抗T．reesei纖維素生物水解酶Ⅱ或葡聚糖內切酶Ⅰ或抗50K-纖維素酶的抗血清微弱識別。不能被抗20K-纖維素酶的抗血清識別(圖14)。表Ⅹ顯示了從50K-纖維素酶B分離的肽序列。
表Ⅹ從50K-纖維素酶B分離的肽序列(不確定的殘基以小寫字母表示)#534 vGNPDFYGK#535 FGPIGSTY#631 LSQYFIQDGeRK#632 FTVVSRFEENK#636 HEYGTNVGSRFYLMNGPDK實施例13中性纖維素酶在不同去污劑中的穩(wěn)定性在3種不同的去污劑溶液中測定了中性纖維素酶制品的穩(wěn)定性。去污劑溶液為OMO_Total(或OMO_Neste，Lever UK)，OMO_Color(Lever S．A)和Colour Detergen Liquid(Unilever，The Netherlands)。試驗的纖維素酶制品是ALKO 4125，ALKO 4179，ALKO 4237和ALKO4265(實施例1)的濃縮培養(yǎng)物過濾液及從ALKO 4237菌株純化的20K-和50K-纖維素酶(實施例9)。
纖維素酶制品在40℃，0．25％去污劑溶液中培養(yǎng)。培養(yǎng)5-30分鐘后取樣測量(pH7，50℃)對羥乙基纖維素酶的活性(ECU／ml實施例1)。
試驗的制品如下培養(yǎng)物過濾液ALKO 4125 780 ECU/ml (pH7，50℃)ALKO 4179 830 ECU/mlALKO 4265 760 ECU/ml
ALKO 4237650 ECU／ml純化蛋白質20K-纖維素酶9423 ECU／ml50K-纖維素酶10100 ECU／ml結果在表Ⅺ-ⅩⅢ中顯示。
在所有3種試驗的去污劑中ALKO 4179，ALKO 4265和ALKO 4237纖維素酶制品和20K及50K纖維素酶在40℃保溫30分鐘幾乎保留100％的穩(wěn)定性。在Colour Detergent Liquid和在OMO_Neste中40℃保溫30分鐘ALKO 4125具有穩(wěn)定性。
表Ⅺ．不同纖維素酶在0．25％ Colour Detergent Liquid中的穩(wěn)定性(pH7．5-7．9)制品 酶制劑pH*％剩余活性％(ml)0＇5＇10＇20＇30＇培養(yǎng)物過濾液ALKO41256 7．310097 98 98 99ALKO41796 7．110099 100 100 10ALKO42656 7．2100100100 100 100ALKO42376 7．110010082 95 100從ALKO4237中純化的蛋白質20K-纖維素酶1 7．810098 99 97 10050K-纖維素酶1 7．6100100100 100 100*保溫30＇后0．25％去污劑+酶溶液的pH表Ⅻ．不同纖維素酶在0．25％OMO_Total(或OMO_Neste pH8．5)中的穩(wěn)定性制品 酶制劑 pH*％剩余活性％(ml) 0＇ 5＇ 10＇ 20＇30＇培養(yǎng)物過濾液ALKO4125 6 7．8100 98 96 86 87ALKO4179 6 7．3100 98 96 96 99ALKO4265 6 7．1100 100 100 100 100ALKO4265 4 7．8100 99 97 100 100ALKO4237 4 7．8100 100 100 99 100ALKO4237 2 7．3100 99 97 99 99從ALKO4237中純化的蛋白質20K-纖維素酶 1 8．2100 100 99 93 10050K-纖維素酶 1 7．8100 95 92 95 94*保溫30＇后0．25％去污劑+酶溶液的pH表ⅩⅢ．不同纖維素酶在0．25％OMO_Colour(pH9．6-10)中的穩(wěn)定性制品 酶制劑pH* ％剩余活性％(ml)0＇5＇10＇20＇30＇培養(yǎng)物過濾液ALKO412569．6100 (15)(15) (13)(14)ALKO417968．310097 100 97 99ALKO426569．1100100100 100 100ALKO426548．510093 95 99 98ALKO423748．510098 96 96 99ALKO423729．110093 95 99 98從ALKO4237中純化的蛋白質20K-纖維素酶19．810099 100 100 10050K-纖維素酶18．9100100100 100 100*保溫30＇后0．25％去污劑+酶溶液的pH
實施例14中性纖維素酶在去污劑中對HEC底物的作用使用羥乙基纖維素(HEC)作底物測定不同中性纖維素酶在去污劑中的作用。試驗的纖維素酶制品是ALKO 4265和ALKO 4237濃縮的培養(yǎng)物濾液及從ALKO 4237菌株純化的20K-和50K-纖維素酶。經過將1％HEC溶于0．25％去污劑溶液中制備HEC底物。經過使用這些底物按實施例1所述在40℃測量各纖維素酶制品對HEC的活性(ECU／ml)。在這些實驗中使用的去污劑和纖維素酶制品在實施例13中描述。
底物的pHHEC／緩沖液 pH7HEC/Colour Detergent LiquidpH7．5HEC/OMO_TotalpH7．8HEC/OMO_ColorpH9．7表ⅩⅣ．在不同去污劑中纖維素酶制品的ECU(比較為在pH7緩沖液中測量的ECU活性％)活性％ECU／ ECU／ ECU／ ECU／制品緩沖液 col．det．liquid OMO_Total OMO_Color培養(yǎng)物濾液ALKO4265100 8996 59ALKO4237100 9795 40純化的蛋白質20K-纖維素酶10010093 8150K-纖維素酶100 9279 46當使用HEC作底物時，ALKO 4237和ALKO 4265纖維素酶制品和20K-和50K-纖維素酶在所有3種試驗的去污劑中具有功能。
實施例15在棉紡織品上使用在去污劑中的中性纖維素酶在本實驗中描述了中性纖維素酶用作織物軟化劑并防止起絨從而減少在去污劑重復洗滌后棉織物起球傾向的能力。試驗的纖維素酶制品是ALKO 4237濃縮培養(yǎng)物濾液及從ALKO 4237菌株純化的20K-和50K-纖維素酶(實施例1和9)。
用Launder-Ometer LP-2(Atlas，Illinois，USA)進行洗滌實驗。將大約10g預洗的(實施例3)未漂白的棉紡織物片裝入含150ml有或無纖維素酶的0．25％去污劑溶液的1．2升容器中。纖維素酶劑量以蛋白質量為基礎。去污劑溶液是OMO_Total(Lever，UK)和Colour DetergentLiquid(Unilever，The Netherlands)。向各容器中加入一定量的鋼球以增加機械作用。Launder Ometer在40℃以42rpm運行0．5或1小時。用間隔的漂洗和干燥洗滌織物4次。
重量損失(以實施例6)用于描述從織物表面去掉的絨量。
表ⅩⅤ．用中性纖維素酶在去污劑中第一次洗滌后織物的重量損失。樣品號制品 以蛋白質／g織物 時間 ％重量損失表示的酶劑量 h在Colour Detergent Liquid1 -- - 0．052ALKO4237 11 1 0．33ALKO4237 22 1 0．74 20K-纖維素酶2 1 0．15 20K-纖維素酶5 1 0．56 20K-纖維素酶8 1 1．07 50K-纖維素酶2 1 0．18 50K-纖維素酶5 1 0．29- - 0．50．210 20K-纖維素酶8 0．50．5在OMO_Total11 - - 1 0．0312 20K-纖維素酶8 1 1．113 - - 0．50．114 20K-纖維素酶8 0．50．7在表ⅩⅤ中，顯示了在Launder-Ometer中第一次洗滌后用纖維素酶處理的織物比僅用去污劑處理的織物重量損失明顯增加更多。而且重量損失隨纖維素酶劑量的作用而增加，當洗滌時間從0．5小時延長到1小時時用20K纖維素酶使重量損失進一步增加。20K-纖維素酶在ColourDetergent Liquid和在OMO_Total中效果一樣好。這些結果表明，尤其是20K-纖維素酶和ALKO 4237纖維素酶制品在已洗滌一次后在去污劑中充當去絨劑。
用樣品1，2，4和7(表ⅩⅤ)再洗滌3次后，由3人組成的一組進行織物評價。要求組員按下面評價處理的織物的柔軟度和肉眼外觀。
織物的柔軟度A．用纖維素酶處理的織物比未用纖維素酶處理的織物更柔軟。
B．用纖維素酶處理的織物比未用纖維素酶處理的織物一樣柔軟。
C．用纖維素酶處理的織物比未用纖維素酶處理的織物更硬。
結果在表ⅩⅥ中表示。
以從1到5的得分對織物分等級來評價織物的肉眼外觀。5分表示無絨或球且織物質地更明顯。1分表示有許多球和絨。計算各織物的總分并除以組員人數(shù)。各織物的肉眼外觀的平均得分在表ⅩⅥ中顯示。
表ⅩⅥ．用中性纖維素酶在去污劑中次重復洗滌后織物的柔軟度和肉眼外觀制品 以蛋白質／g織時間柔軟性肉眼外觀物表示的酶劑量h在Colour DetergentLiquid中-1 1ALKO 4237 11 1100％用纖維3．2素酶更柔軟20K-纖維素酶21100％用纖維3．7素酶更柔軟50K-纖維素酶21100％無區(qū)別1．74次處理后，纖維素酶處理的織物比僅用去污劑處理的織物肉眼外觀明顯更好。因此用這些纖維素酶處理的織物保持較好的外觀，且與未用纖維素酶處理的織物相比重復洗凈后防止起絨。洗滌4次后，ALKO4237和20K-纖維素酶處理的織物比僅用去污劑處理的織物更柔軟。
實施例16在綿毛編織品上使用在去污劑中的中性纖維素酶在本實驗中描述了中性纖維素酶用作織物軟化劑和防止起絨從而減少在去污劑中重復洗滌后從染色的綿毛編織品上起球的傾向。試驗的纖維素酶制品是ALKO 4237濃縮的培養(yǎng)物濾液及從ALK0 4237菌株純化的20K-纖維素酶(實施例1和9)。
綠色棉毛編織片按實施例15所述在Launder-Ometer上在含有或不含纖維素酶的Colour Liquid Detergent或OMO_Total中洗滌1小時3或10次。
由3人組成的評委進行編織品的評價。要求評委按實施例15所述評價處理的編織品的柔軟性和肉眼外觀(正面和反面)。按實施例15所述測定編織品的重量損失。結果在表ⅩⅦ中顯示。
洗滌3次后，20K-纖維素酶處理的編織品比僅用去污劑處理的編織品正反兩面的肉眼外觀更好。用ALKO 4237纖維素酶制品處理編織品10次比僅用去污劑處理編織品具有明顯更好的肉眼外觀及更亮的綠色。洗滌1次后已檢測到纖維素酶處理的編織品具有更好的肉眼外觀(特別是在反面)，且在增加的洗滌過程中進一步改善。用纖維素酶處理的編織品也比僅用去污劑處理的編織品更柔軟。
表ⅩⅦ．用含有或不含纖維素酶的去污劑經3或10次重復洗滌后毛編織品的柔軟性，重量損失和肉眼外觀。洗滌前，0．25％Colour Detergent溶液的pH為7．9，0．25％OMO_Total溶液為8．4。制品 以蛋白質／g織物洗滌時間洗滌后的pH重量損失％ 柔軟性 肉眼外觀表示的酶劑量 正面 反面Colour Detergent Liquid- - 3 7．9 0．46 1 120K*5 3 7．4 0．88 33％用纖維素酶更柔軟1．5 2．7- - 10 8．0 1．46 100％用纖維素酶更柔軟 1 1A4237 20 10 7．9 2．80 2．5 2．8OMO_Total- - 10 8．3 0．57 1 1A4237 20 10 8．2 1．57 100％用纖維素酶更柔軟 2．3 2．8*=20K-纖維素酶實施例17在陳舊棉毛編織品上使用在去污劑中的中性纖維素酶在本實驗中描述了中性纖維素酶作為織物換新和軟化劑的能力。
在Cylinda洗衣機中以程序3在60℃，10ml OMO_Colour (Lever，UK)中洗滌綠棉毛編織品10次，中間具有干燥步驟。這模擬了實際中編織品的洗滌。
10次處理后，這種陳舊編織品具有無吸引力的及褐色的外觀，在表面有一些絨毛。
經過這10次重復洗滌后，毛絨編織品用于使用或不使用纖維素酶的洗滌實驗。按實施例15所述在Launder Ometer中用Colour LiquidDetergent洗滌編織片1小時一至3次并具有中間漂洗和干燥步驟。使用的纖維素酶制品是ALKO 4237濃縮的培養(yǎng)物濾液和來自ALKO 4237的純化20K-和50K-纖維素酶(實施例9)。
由3人組成的評委進行編織品的評價。要求評委按實施例15所述評價處理的編織品的柔軟性和肉眼外觀(正面和反面)。按實施例15所述測定編織品的重量損失。結果在表ⅩⅦ中表示。
洗滌一次后，ALKO 4237和20K-纖維素酶處理的編織品具有比僅用去污劑處理的編織品更好的肉眼外觀。洗滌2至3次后，20K-纖維素酶處理的編織品進一步形成較好的肉眼外觀及更具吸引力的外觀。洗滌2次后，與僅用去污劑處理的編織品相比，用50K-纖維素酶處理的編織品也改進了肉眼外觀。一般來說，用纖維素酶處理的編織品明顯改善且具有引人注目的外觀，而未用纖維素酶處理的編織品仍具有無吸引力及褪色的外觀。
表ⅩⅧ．用含有或不含纖維素酶的去污劑重復洗滌1至3次后陳舊的毛絨編織品的柔軟性，重量損失和肉眼外觀。洗滌前，0．25％Colour Detergent溶液的pH為7．9。制品 以mg蛋白質／g織洗滌次數(shù)洗滌后的pH重量損失％柔軟性 肉眼外觀物表示的酶劑量正面 反面- - 1 ND0． 11ALKO4237 20 1 ND0．61 100％無區(qū)別 11．520K*5 1 ND0 100％無區(qū)別 1．5 1．5- - 2 7．9 0．101120K*5 2 7．7 0．46 100％用纖維素酶更柔軟2．5 2．250K*5 2 7．7 0．26 100％無區(qū)別 11．250K*15 2 7．3 0．49 100％無區(qū)別 11．3- - 3 ND0．311120K*5 3 ND0．88 100％用纖維素酶更柔軟3．0 2．2ND=未測定*=20K-或50K-纖維素酶實施例18ALKO 4237染色體DNA的分離和基因組文庫的構建Melanocarpus albomyces ALKO 4237在搖瓶培養(yǎng)物的土豆葡萄糖(PD，Difco，USA)培養(yǎng)基中42℃，250rpm生長3天。根據(jù)Raeder和Broda，應用微生物學通訊，117-20(1985)分離染色體DNA。簡單地說，用20mM EDTA洗滌菌絲體并在提取緩沖液(200mM Tris-HCl(pH8．5)，250mM NaCl，25mM EDTA，0．5％SDS)中裂解。用酚和氯仿異戊醇(241 v／v)的混合物提取DNA。用RNA酶消化RNA。
用Sau3A(Boehringer Mannheim，德國)部分消化染色體DNA并用小牛腸堿性磷酸酶處理。使用β-瓊脂糖(Boehringer Mannheim，德國)從瓊脂糖凝膠中分離5-15Kb范圍的DNA并用于構建基因組ALKO 4237文庫。
使用預消化的λDASH_Ⅱ BamHⅠ載體試劑盒(Stratagene，USA)來構建該文庫并在所有隨后的步驟中按廠家說明書進行。簡單地說，大約200ng大小分離的DNA連接進1μg DASH_Ⅱ制備的臂中，并用Gtgapack Ⅱ包裝提取物(Stratagene，USA)包裝。經過用包裝的噬菌體的系列稀釋液感染大腸桿菌XL1-Blue MRA(P2)-細胞并在NZY平板上涂板測定該文庫的滴度。該文庫在含4％(v／v)氯仿的SM-緩沖液中于40℃貯存。它不需擴增用于篩選。
實施例19用簡并引物擴增，克隆并測序20K-纖維素酶為了以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增20K-纖維素酶基因，合成了以肽序列(圖17)為基礎的一對簡并引物。引物1(429-32)來自N-端肽#429的氨基酸#8-14(圖17)，引物2(fr28-16)設計成肽fr28的氨基酸#2-8的反義鏈(圖17)。在5＇端添加另一EcoRI限制性位點以利于克隆擴增的片段。引物1(429-32)EcoRI5＇ -ATA GAATTC TA(C/T) TGG GA(C/T) TG(C/T) TG(C/T) AA(A/G) CCY W D C C K P引物2(fr28-16)EcoRI5＇-ATA GAATTC TT(A/G)TC (A／C/G/T)GC (A/G)TT (C/T)TG (A/G)AAN DA N Q FCCAW在PCR反應中，1μg純化的ALKO 4237基因組DNA(實施例18)用作模板。根據(jù)廠家說明書使用Dynazyme DNA聚合酶(Finnzymes Ltd，F(xiàn)inland)。模板DNA(0．7μg／μl)1．4μl引物1 (0．5μg／μl)1 μl引物2 (0．5μg／μl)1 μldNTPs (2mM) 5 μl10×PCR緩沖液10 μldH2O 82 μlDynazyme (2U／μl) 1 μl共計 101．4 μl在下列條件下進行PCR反應步驟195℃5分鐘步驟295℃1分鐘步驟356℃1分鐘步驟472℃1分鐘步驟5再進行“步驟2”29次步驟672℃8分鐘步驟7 4℃維持以瓊脂糖凝膠電泳分析10μl反應混合物，檢測到相應于大約600bp長的單條帶。用EcoRⅠ限制性核酸內切酶消化剩余的PCR產物并走瓊脂糖電泳。切下含該DNA片段的瓊脂塊并用Magic PCR Prps(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書純化。分離的片段與同樣用EcoRⅠ切割的pBluescriptⅡ SK+(Stratagene，USA)質粒連接。用連接混合物轉化感受態(tài)的大腸桿菌XL-Blue細胞(Stratagene，USA)。以Magic Minipreps(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書分離一些所得菌落的質粒DNA。以瓊脂糖電泳分析質粒DNA，具有預期特征的一個克隆命名為pALK549。
使用以熒光標記的T3和T7引物或含熒光標記的雙脫氧核苷酸的序列特異性引物為基礎的ABⅠ(應用生物系統(tǒng)USA)試劑盒以Tag染料引物循環(huán)測序法根據(jù)廠家說明書測序來自pALK549的MelanocarpusDNA。由于Melanocarpus DNA的高GC含量，在58℃的退火溫度下，用5％(v／v)DMSO進行測序反應。測序反應在ABⅠ 373A測序儀(應用生物系統(tǒng)，USA)上分析，使用遺傳學計算型序列分析軟件包，7．2版鑒定獲得的序列。
發(fā)現(xiàn)在pALK549中的插入片段(594bp)編碼大多數(shù)20K-纖維素酶產生的肽(圖17)。PCR擴增的DNA(除引物外)相應于圖19的核苷酸175-716。
按實施例18所述分離Myriococcum種類ALKO 4124的染色體DNA。用引物429-32和fr28-16及ALKO 4124染色體DNA作模板的PCR反應產生與來自ALKO 4237的DNA大小相同的片段。部分測序該片段，它幾乎與ALKO 4237序列相同?？赏茢郙yriococcum種類的ALKO 4124具有幾乎與Melanocarpus albomyces ALKO 4237的20K-纖維素酶相同的蛋白質。該結果與在Western分析中ALKO 4237 20K-纖維素酶特異性抗體也識別來自ALKO 4124生長培養(yǎng)基的20K蛋白質帶(圖14)的觀察結果一致。來自兩菌株的酶在生物磨洗實驗(實施例3和4)中產生同樣好的結果。
實施例20克隆和測序Melanocarpus albomycesALKO 4237 20K纖維素酶基因在LB+0．2％麥芽糖+10mM MgSO4中生長大腸桿菌XL1-BlueMRA(P2)-細胞(Stratagene，USA)并稀釋成OD600=0．5。用Melanocarpus albomyces ALKO 4237基因組文庫(實施例18)37℃感染細胞15分鐘并用NZY頂級瓊脂糖涂布在NZY平板上。平板在37℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)Stratagene說明書資噬菌斑轉移到尼龍濾紙(Hybond，Amersham，UK)上。
根據(jù)Boehringer，DIG DNA標記和檢測非放射性應用手冊用洋地黃毒苷標記純化的PCR片段(實施例19)。在68℃進行雜交。在SM緩沖液／氯仿中挑出陽性克隆并用第二篩選純化。
在這些條件下發(fā)現(xiàn)了4個陽性克隆。根據(jù)Sambrook等在分子克隆，實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，1989所述進行從克隆大規(guī)模分離噬菌體λDNA。經過用一些限制性酶消化DNA分析噬菌體DNA，用PCR探針雜交消化的DNA。分離出3個雜交片段；大約2．6 kb EcoRⅠ-XhoⅠ片段，大約4．9kb XhoⅠ片段和大約3kb SocⅠ片段。將它們插入同樣切割的pBluescript Ⅱ Sk+載體(Stratagene，USA)中，分別產生質粒pALK1221，pALK1222和pALK1223(圖18)。
按實施例19所述測序pALK1221中的Melanocorpus albomycesDNA。編碼Melanocarpus albomyces 20K-纖維素酶的DNA序列在圖19中顯示。該序列長936bp，具有一個編碼235個氨基酸的開放閱讀框(ORF)；該基因具有2個內含子。推斷的信號肽加工位點在丙氨酸-21之后，成熟蛋白質的N端以丙氨酸-22開始，正如肽測序結果所表明的(圖17、肽#429)。該ORF預期產生分子量為25．0kDa的蛋白質的全長蛋白前體，且成熟蛋白為22．9kD。這與蛋白純化工作獲得的結果(實施例10)較好地吻合。這些結果還證實以前用20K-纖維素酶抗血清檢測到的大約35kDa蛋白質(實施例10)是非20K-纖維素酶的不同基因產物。
Melanocarpus albomyces的20K-纖維素酶似乎屬于纖維素酶K家族和葡萄糖基水解酶45家族(Henrissat和Bairoch，生化雜志，293781-788(1993))。20K-纖維素酶顯示出與Humicola insolens葡聚糖內切酶V(embla 23635)具有同源性(在235個氨基酸重疊中有大約76％的相同性)，但20K-纖維素酶具有令人驚奇的特征，它不含纖維素結合區(qū)(CBD)和其連接物，該CBD和連接物是Humicola insolens葡聚糖內切酶V和其它相關葡聚糖內切酶的特征(Schulein等1993，在Suominen和Reinikainen(編輯)，生物技術和工業(yè)發(fā)酵研究基礎，Helsinki，第8卷，109；Saloheimo等，1994，分子微生物學，13，219)。20K纖維素酶的這一特征可能是在生物磨洗實驗中(實施例10)該酶產生優(yōu)良效果的原因。
實施例21用簡并引物擴增，克隆和測序50K-纖維素酶DNA50K-纖維素酶產生的肽(表Ⅸ)與Humicola grisea葡聚糖內切酶Ⅰ(DDBJD63516)具有一些同源性。為了以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增50K-纖維素酶基因，合成了一對以肽序列(表Ⅸ)為基礎的簡并引物。引物1(507-128)來自肽#507的氨基酸#5-10，引物2(509-rev)設計成肽509的氨基酸#4-9的反應鏈(表Ⅸ)。從與Humicola grisea葡聚糖內切酶Ⅰ的比較推導蛋白質中兩個肽的順序及相應的引物有義-反義特征。
引物1(507-128)5＇-GA(C/T) GA(A/G) AC(A/C/G/T) GA(A/G) CA(C/T) (A/C)GD E T E H R引物2(509-rev)5＇-TA(A/C/G/T) GC(A/C/G/T) CC(A/C/G/T) CC(A/C/G/T) GG(A/G)TTY AG G P N在PCR反應中，1．5μg的純化的ALKO 4237基因組DNA(實施例18)用作模板。根據(jù)廠家說明書使用Dynazyme DNA聚合酶(Finnzymes Ltd_Finland)。模板DNA (0．3μg／μl) 5μl引物1(0．5μg／μl) 1μl引物2(0．5μg／μl) 1μldNTPs(2mM)5μl10×PCR緩沖液 10 μldH2O 79 μlDynazyme (2U／μl)1μl共計 102 μl在下列條件下進行PCR反應步驟195℃5分鐘步驟295℃1分鐘步驟356℃1分鐘步驟472℃1分鐘步驟5再進行“步驟2”29次步驟672℃8分鐘步驟74℃ 維持以瓊脂糖凝膠電泳分析10μl反應混合物，檢測到相應于長度大約為160bp的單條帶。將剩余的PCR產物上樣到電泳的瓊脂糖凝膠上，切下含該DNA片段的瓊脂糖塊，以Magic PCR Preps(Promega USA)方法根據(jù)廠家說明純化。
將分離的片段與已用EcoRV核酸內切酶消化且按Holteon和Graham(1990)，核酸研究，19，1156所述加上ddT尾的pBluescript ⅡSk+(Seratagene，USA)質粒連接。用該連接混合物轉化感受態(tài)的大腸桿菌XL-Blue細胞(Stratagene，USA)。以Magic Minipres(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書從一些所得的菌落中分離質粒DNA。以瓊脂糖電泳分析質粒DNA、具有預期特征的一個克隆命名為pALK1064。
按實施例19所述測序pALK1064中的插入片段(161bp)，且發(fā)現(xiàn)含有一個ORF，預期它是與Hunicola grisea葡聚糖內切酶Ⅰ(DDBJD63516)同源的肽。該ORF也編碼來自純化的50K-纖維素酶的肽#612(表Ⅸ)。PCR擴增的DNA(除引物外)相應于圖21中的核苷酸404-530。
用引物507和590-rev及用ALKO 4124染色體DNA作模板(實施例19)進行的PCR產生與來自ALKO 4237 DNA的相同大小的片段。這表明Myriococcum sp．ALKO 4124具有極相似于Melanocarpusalbomyces ALKO 4237 50K-纖維素酶的蛋白質。來自兩菌株的酶在生物磨洗實驗中產生相似的好結果的事實也支持這一點。
實施例22克隆和測序Melanocarpus albomycesALKO 4237 50K-纖維素酶基因按實施例20所述制備用于雜交的Melanocarpus albomycws ALKO4237的基因庫。按照Boehringer，DIG DNA標記和檢測非放射性，應用手冊用洋地黃毒苷標記攜帶部分50K-纖維素酶基因的純化PCR片段(實施例21)。雜交在68℃進行。在SM緩沖液／氯仿中挑出陽性克隆，用第二輪篩選進行純化。
在這些條件下發(fā)現(xiàn)10個陽性克隆。根據(jù)Sambrook等，1989進行從克隆中大規(guī)模分離噬菌體λDNA。經過用一些限制性酶消化DNA分析噬菌體DNA，消化的DNA與50K-纖維素酶特異性PCR探針進行雜交。分離出4個雜交片段大約2．8kb SacⅠ-XhoⅠ片段，大約5kb SacⅠ片段，大約3．2kb XhoⅠ片段和大約2kb EcoRⅠ片段。將它們插入同樣酶切的pBluescriptⅡ SK+載體(Stratagene，USA)中，分別產生質粒pALK1234，pALK1233，pALK1226和pALK1227(圖20)。
從上述50K-纖維素酶特異性質粒測序Melanocarpus albomycesALKO 4237 DNA。其測序方法已在實施例19中描述。
編碼Melanocarpus albomyces 50K-纖維素酶的DNA在圖21(A和B)中顯示。該序列揭示了一個長度大約為1363bp的一個ORF，被一個內含子打斷。ORF編碼428個氨基酸。預期的蛋白質分子量為46．8kDa且信號肽裂解后為44．8kDa。表Ⅸ中的所有肽在預期的蛋白質序列(圖2)中發(fā)現(xiàn)，盡管在肽測序期間鑒定不確定的一些氨基酸被證實是不正確的。該蛋白質表現(xiàn)出與Humicola grisea葡聚糖內切酶Ⅰ(DDBJD63516)具有同源性。
實施例23用簡并引物擴增，克隆和測序50K-纖維素酶B DNA來自50K-纖維素酶B的肽(表Ⅹ)與Humico1a grisea纖維素生物水解酶Ⅰ(DDBJD63515)具有一定的同源性。為了以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增50K-纖維素酶B基因，合成了一對以肽序列(表Ⅹ)為基礎的簡并引物。引物1(636)來自肽#636的氨基酸#1-5(表Ⅹ)(猜測第一個氨基酸是賴氨酸，因為在賴氨酸后用蛋白酶裂解消化后分離出該肽)，引物2(534-rev)設計為肽#534的氨基酸#3-8(表Ⅹ)的反義鏈。與Humicola grisea纖維素生物水解酶Ⅰ相比推斷出在該蛋白質中2個肽的順序及相應的引物有義-反義性質。
引物1(636)5＇ -AA(A/G) CA(C/T) GA(A/G) TA(C/T) GG(A/C/G/T) ACK H E Y G T引物2(534-rev)5＇-CC(A/G) TA(A/G) AA(A/G) TC(A/C/G/T) GG(A/G)TTG Y F D P N在PCR反應中，將1．5μg純化的ALKO 4237基因組DNA(實施例18)用作模板。根據(jù)廠家說明書使用Dynazyme DNA聚合酶(Finnzyme Ltd_Finland)模板DNA(0．3μg／μl)5 μl引物1 (0．3μg／μl)1．7μl引物2 (0．3μg／μl)1．7μldNTPs (2mM) 5 μl10×PCR緩沖液10 μldH2O 80 μlDynazyme (2U／μl) 1 μl共計 104．4 μl
在下列條件下進行PCR反應步驟195℃5分鐘步驟295℃1分鐘步驟348℃1分鐘步驟472℃2分鐘步驟5再進行“步驟2”34次步驟672℃8分鐘步驟74℃ 維持以瓊脂糖凝膠電泳分析20μl反應混合物，檢測到一些帶。其中一條帶表觀大小為700bp，該大小與當與Humicola grisea纖維素生物水解酶基因比較時可預期的大小一致，特別是如果該片段含1或多個內含子。以Magic PCR Preps(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書純化PCR產物。
分離的片段與已用EcoRV核酸內切酶消化的，且按Holton和Graham，核酸研究191156(1990)所述加ddT尾的pBluescriptⅡSK+(Stratagene，USA)質粒連接。用連接混合物轉化感受態(tài)的大腸桿菌XL-Blue細胞(Stratagene，USA)。以Magic Minipreps(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書分離一些所得菌落的質粒DNA。以瓊脂糖電泳分析質粒DNA，具有大約700bp插入片段的一個克隆命名為pALK1224。
按實施例19所述測序pALK1224中的插入片段，發(fā)現(xiàn)它含有編碼來自50K-纖維素酶B的全肽#636(表Ⅹ)的ORF。ORF預期為與Humicola grisea纖維素生物水解酶Ⅰ(DDBJD63515)同源的肽。PCR擴增的DNA(除引物外)相應于圖23中的核苷酸371-1023。
實施例24克隆和測序Melanocarpus albomycesALKO 4237 50K-纖維素酶B基因按實施例20所述制備用于雜交的Melanocarpus albomyces ALKO4237的基因組庫。經過用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化質粒取出pALK1224中的插入片段。將消化的質粒DNA走瓊脂糖電泳。切下含大約700bp DNA片段的瓊脂糖塊，以Magic PCR Preps(Promega，USA)方法根據(jù)廠家說明書純化。
根據(jù)Boehringer，DIG DNA標記和檢測非放射性，應用手冊用洋地黃毒苷標記從攜帶部分50K纖維素酶B基因的pALK 1224純化的PCR片段(實施例23)。在68℃進行雜交。在SM緩沖液／氯仿中挑出陽性克隆，并用第二輪篩選純化。
在這些條件下發(fā)現(xiàn)3個陽性克隆。按照Sambrook等，在分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989進行從克隆大規(guī)模分離噬菌體λDNA。經過用一些限制性酶消化DNA來分析噬菌體DNA，用50K-纖維素酶B特異性PCR探針雜交消化的DNA。分離雜交的3．5kb NotⅠ片段并插入同樣酶切的pBluescriptⅡ SK+載體(Stratagene，USA)中，產生質粒pALK1229(圖22)。
經過用pALK1229的0．2kb NotⅠ-PstⅠ-片段與噬菌體DNA雜交發(fā)現(xiàn)該基因的最5＇端。分離雜交的2．4kb PstⅠ-片段并插入同樣酶切的pBluescriptⅡ SK+載體(Stratagene，USA)中，產生質粒pALK1236(圖22)。
按實施例19所述測序pALK1229和pALK1236中的部分插入片段。編碼Melanocarpus albomyces 50K-纖維素酶B的DNA在圖23(A和B)中表示。
該序列揭示了一個被5個內含子打斷的長度為1734bp的ORF。ORF編碼452個氨基酸。預期的蛋白質分子量為49．9kDa且裂解信號肽后為47．6kDa。在預期的蛋白質序列(圖23A和B)中發(fā)現(xiàn)了表Ⅹ中的所有肽，盡管在肽測序期間以不確定性鑒定的一些氨基酸被證實為是錯誤的。預期的蛋白質顯示出與Humicola grisea纖維素生物水解酶Ⅰ(DDBJD63515)和其它纖維素生物水解酶具有同源性。然而，50K-纖維素酶B具有令人驚奇的特征，它不含纖維素結合區(qū)(CBD)和其連接物，而該CBD和連接物是Humicola grisea纖維素生物水解酶Ⅰ和許多其它纖維素生物水解酶的特征。
實施例25用Trichoderma reesei纖維素酶基因篩選Melanocarpus albomyces ALKO 4237基因組文庫按實施例20所述制備用于雜交的Melanocarpus albomyces ALKO4237的基因組庫。
經過用限制性核酸內切酶HincⅡ切割質粒pTTcO1(圖24)并在電泳后從瓊脂糖凝膠分離大約1．6kb片段來分離攜帶Trichoderma reeseicbh 1特異性DNA的DNA片段。經過用限制性核酸內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ切割質粒pMSZ(圖25)并從電泳后的瓊脂糖凝膠分離大約1．5kb片段來分離攜帶Trichoderma reesei egl2特異性DNA的DNA片段。cbh1基因的克隆在Teeri等，生物／技術1696-699(1983)中描述且該DNA序列在Shoemaker等，生物／技術1691-696(1983)中描述。gel2(最初稱為“egl3”)基因在Saloheimo等，基因6311-21(1988)中描述。
根據(jù)Boehringer，DIG DNA標記和檢測非放射性，應用手冊洋地黃毒苷標記該片段。用cbh1探針在68℃并用egl2探針在60℃進行雜交。在SM緩沖液／氯仿中挑出陽性克隆，并用第二輪篩選純化。
在這些條件下發(fā)現(xiàn)了13個cbh1陽性和6個egl2陽性克隆。一個克隆與兩種探針均雜交。按上面所述從該克隆分離λDNA。經過用一些限制性酶消化DNA來分離噬菌體DNA，消化的DNA與cbh1和egl2探針雜交。該克隆也與20K-纖維素酶特異性PCR片段(實施例19)雜交。一個克隆(λ-16)為明顯陽性，2個其它克隆(λ-8／1和λ-5／2)為微弱陽性；所有這些克隆最初用cbh1探針挑出。
電泳后從瓊脂糖凝膠分離與Trichoderma reesei cbh1探針和與20K-纖維素酶特異性PCR片段均雜交的來自λ-16的大約4kb EcoRⅠ片段并插入同樣切割的pBluescriptⅡ SK+中。所得的質粒命名為pALK1230(圖26)。
按實施例19所述測序pALK1230中的部分插入片段。該DNA似乎不編碼20K-纖維素酶，但編碼與一些纖維素酶，特別是纖維素結合區(qū)(CBD)同源的蛋白質。因此，該基因產物很可能與纖維素物質具有親和力，因此該基因產物命名為具有CBD的蛋白質。該序列在圖27中顯示。
用來自19λ克隆的DNA作模板用引物636和534-rev(實施例23)進行PCR反應。一個λ克隆，即λ-3產生一條大約700bp大小的帶，相似于在實施例23中ALKO 4237染色體DNA用作模板時的情況。該克隆最初用Trichoderma cbh1探針挑出。用一些限制性核酸內切酶消化λDNA，并與50K-纖維素酶B特異性探針雜交。該克隆顯示出與實施例24中的3個克隆相似的限制性酶圖譜。可推斷λ-3也攜帶50K-纖維素酶B基因。
實施例26融合蛋白質經過將編碼纖維素酶的序列與Trichoderma reesei纖維素酶或半纖維素酶或所說的纖維素酶或半纖維素酶的至少一個功能區(qū)的序列融合制備編碼20K-纖維素酶，50K-纖維素酶或50K-纖維素酶B的重組載體，如在US 5，298，405，WO 93／24621和在Genbank登記號L25310中所述，本文引用以供參考。具體地說，該酶選自CBHⅠ，CBHⅡ，EGⅠ，EGⅡ，XYLⅠ，XYLⅡ和MANⅠ或其功能區(qū)，如分泌信號或核心序列。
可構建融合蛋白質，它含有與一個Melanocarpus纖維素酶序列融合的N端甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶核心區(qū)或其核心及鉸合區(qū)。結果是該蛋白質含有一個N端甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶核心或核心及鉸合區(qū)，以及一個C端Melanocarpus纖維素酶。融合蛋白質含有在融合構建體中所提供的各區(qū)域的Trichoderma甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶以及Melanocarpus纖維素酶活性。另外，在構建體中可包含修飾Trichoderma甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶的活性或Melanocarpus纖維素酶活性的突變。在這種情況下，融合蛋白質含有在融合構建體中提供的各區(qū)域的修飾的Trichoderma酶活性和Melanocarpus纖維素酶活性。
也可構建融合蛋白質，使甘露聚糖酶或纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶尾或其所需片段放在一個Melanocarpus纖維素酶序列之前，特別是允許使用在尾部的非特異性蛋白酶位點作為從表達的融合蛋白質中回收Melanocarpus纖維素酶部分的蛋白酶位點。另外，可構建融合蛋白質，它提供放在一個Melanocarpus纖維素酶之前的位于合成連接物中的蛋白酶位點，且含有或不含尾序列。
實施例27宿主按上述制備編碼所需融合蛋白質或Melanocarpus蛋白質的重組構建體并轉化進諸如曲霉屬種類，優(yōu)選木霉屬種類的絲狀真菌中。
實施例28用于20K-纖維素酶生產的木霉屬背景在本實施例中描述了磨洗實驗以確定用于20K纖維素酶生產的木霉素纖維素酶的最合適的背景。這些實驗的目的是為了測定哪一種木霉屬纖維素酶在中性條件下在磨洗中會引起復染。
選擇Trichoderma reesei菌株ALKO 3620(缺失葡聚糖內切酶2基因)作為這些實驗的宿主。在以前的研究中，已顯示木霉屬EGⅡ(葡聚糖內切酶Ⅱ)酶引起對棉纖維結構的不利影響，從而削弱含棉織物的強度特性(在Miettinen-Oinonen等纖維素酶對棉纖維和織物的影響，在TIWC96會議錄，1996，Vol．1(2)，pp．197中)。
除了不使用Berol外按實施例3所述在pH6．5和7下進行磨洗實驗。
試驗的木霉屬纖維素酶制品ALKO3133(egl2和cbh2缺失)ALKO3269(egl2和egL1缺失)ALKO3268(egl2和cbh1缺失)木霉屬制品的劑量為每g織物大約2．5mg(二低劑量，L)或大約5mg(二高劑量，H)總蛋白質。當需要時使用每g織物0．4mg純化的20K-纖維素酶。
處理的斜紋粗棉布織物的顏色測量結果在表ⅩⅨ中表示。
磨洗結果表明ALKO 3269(egl2和egL1缺失)背景比ALKO3268(egl2和cbh1缺失)或ALKO 3133(egL2和cbh2缺失)背景在中性條件下引起較少的復染。因此，用于生物磨洗的20K-纖維素酶生產的優(yōu)選宿主是ALKO3269一類菌株。盡管具有更高的20K-纖維素酶濃度，但木霉屬背景很可能具有極小的重要性。ALKO3269類背景很可能在生物磨洗中對50K-纖維素酶和50K-纖維素酶B生產與其對20K-纖維素酶生產一樣好。表ⅩⅨ。用含有(+)或不含(-)20K-纖維素酶的不同木霉屬纖維素酶制品處理的斜紋粗棉布織物的顏色測量制品／劑量20K pH正面 ΔE 反面 ΔE+／- Lb L b- - 6．52．21．13．1 0．70．1 1．4ALKO3620／L - 6．52．22．63．0-0．72．6 2．9ALKO3620／L + 6．55．54．07．7-1．35．0 5．5ALKO3133／L - 6．51．92．23．7 0．21．6 2．3ALKO3133／H - 6．54．21．94．5-1．53．3 4．8ALKO3133／L + 6．55．74．37．8 0．34．5 5．0ALKO3133／H + 6．58．54．09．4-1．45．9 7．8ALKO3269／L - 6．52．91．94．4 0．80．8 1．6ALKO3269／H - 6．54．31．54．5 0．61．3 2．6ALKO3269／L + 6．56．64．28．7 1．14．0 4．3ALKO3269／H + 6．57．93．98．5 0．73．7 5．1ALKO3268／L - 6．52．91．73．7 0．11．8 3．0ALKO3268／H - 6．54．22．04．3-0．73．4 5．0ALKO3268／L + 6．55．93．27．7-1．24．5 6．0ALKO3268／H + 6．57．13．77．7-2．05．8 7．3- - 7．02．90．82．6 0．70．5 1．5ALKO3620／L - 7．03．31．21．9 1．70．3 1．1ALKO3620／L + 7．06．73．45．6 1．13．2 2．9ALKO3133／L - 7．03．21．01．4 0．60．6 0．9ALKO3133／L + 7．05．93．75．5 0．14．3 3．1ALKO3269／L - 7．03．61．22．2 1．3 -0．3 1．3ALKO3269／L + 7．06．43．45．9 1．23．2 2．8ALKO3268／L - 7．02．91．43．9 0．50．4 2．5ALKO3268／L + 7．08．43．19．6 1．13．5 4．6實施例29在T．reesei中生產Melanocarpus albomycesALKO 4237 20K-纖維素酶構建Trichoderma reesei菌株用于Melanocarpus albomyces ALKO4237 20K-纖維素酶的生產。菌株產生Melanocarpus 20K纖維素酶且不能產生T．reesei的葡聚糖內切酶Ⅱ和纖維素生物水解酶Ⅰ域葡聚糖內切酶Ⅰ。這類木霉屬纖維素裂解活性缺陷的制品，及以重組DNA方法生產該制品在US 5，298，405或Suominen等(1993)。在Trichoderma reesei中高頻率的一步基因取代。Ⅱ．單個纖維素酶基因的缺失效應。普通分子遺傳學，241523，中描述，本文引用以供參考。
在生產Melanocarpus albomyces 20K-纖維素酶的菌株的構建中，用來自質粒pALK1231或pALK1235的表達盒(圖28和29)轉化親本Trichoderma reesei菌株ALKO3620。在表達盒中，從強cbh1啟動子表達20K-纖維素酶。表達盒的整合導致取代親本cbh1(pALK 1231)或egl1(pALK1235)基因。
在宿主菌株ALKO3620中，使用US 5298405(本文引用以供參考)中所述的重組DNA方法用來自印度斯坦鏈異壁菌ble基因的3．3kbXbaI-BglⅡ片段取代egl2基因(Mattern等(1998)，賦予腐草霉素抗性的曲霉屬轉化的載體。真菌遺傳學通訊，3525Drocourt等(1990)，用于轉化低等和高等真核生物以獲得腐草霉素抗性的印度斯坦鏈異壁菌ble基因的表達盒。核酸研究，184009)。
用于構建產生Melanocarpus纖維素酶的菌株的質粒pALK1231和pALK1235關于cbh1啟動子，20K纖維素酶基因和cbh1終止子互相相同，對其描述如下*T．reesei cbh 1(纖維素生物水解酶1)啟動子該啟動子來自Trichoderma reesei VTT-D-80133(Teeri等，(1983)，來自Trichodermareesei的主要纖維素酶基因的分子克隆。生物／技術1696)。在該構建體中使用2．2kb EcoRⅠ-SacⅡ片段(Karhunen等，(1993)，在Trichodermareesei中高頻率的一步基因取代。Ⅰ．葡聚糖內切酶Ⅰ的過度生產。分子普通遺傳學，241515)。在ATG前的啟動子區(qū)的序列由Shoemaker等(1983)，來自Trichoderma reesei菌株L27的外切纖維素生物水解酶的分子克隆。生物／技術1．691)。T．reesei(2)cbh1啟動子的最后15個核苷酸(SacⅡ位點下面劃線)是CCGCGGACTGCATC(Shoemaker等，1983)。來自T．reesei菌株VTT-D-80133的cbh1啟動子已在ALKO研究實驗室被測序，且注意到在上述區(qū)域內在DNA序列中有一個核苷酸差異。在T．reesei菌株VTT-D-80133中，在ATG前的序列是CCGCGGACTG／C／GCATC(SacⅡ位點下面劃線，在DNA序列中添加的胞嘧啶在斜線間)。
加入啟動子中丟失的核苷酸(在SacⅡ之后到ATG的10bps)并精確地將啟動子融合到Melanocarpus 20K-纖維素酶的第一個ATG上(見下面)，經過使用PCR(聚合酶鏈式反應)方法做到這點。測序融合物和PCR片段以保證在反應中不出現(xiàn)錯誤。在pALK1231中，啟動子區(qū)域也作為同源DNA(與cbh1 3＇-片段一起，見下文)而發(fā)揮功能以靶向將轉化DNA整合進cbh1基因座。
*Melanocarpus albomyces 20K纖維素酶基因編碼20kDa纖維素酶的20K-纖維素酶基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列在實施例20中提供(圖19)。在兩個質粒中使用從ATG-密碼子開始的0．9kb片段。
*T．reesei cbh1終止子將在cbh1基因終止密碼子之前113bp開始的739bp AvaⅡ片段(Karhunen等，(1993)，在Trichoderma reesei中高頻率的一步基因取代。Ⅰ．葡聚糖內切酶Ⅰ的過度生產。分子普通遺傳學，241515)加到20K-纖維素酶基因后以保證轉錄終止。
除了上述物質外，質粒pALK1231含有*amdS基因已從構巢曲霉VH1-TRS×6分離該基因，它編碼乙酰胺酶(Hynes等，(1983)，含構巢曲霉amdS基因的基因組克隆的分離及其在結構和調節(jié)密度的分析中的應用，分子細胞生物學，31430)。乙酰胺酶使得該菌株經過使用乙酰胺作為唯一氮源生長，且這一特征用于選擇轉化子。來自質粒p3SR2的3．1kb片段(SpeⅠ-XbaⅠ)(Kelly J．和Hynes M．(1985)，以構巢曲霉的amdS基因轉化黑色曲霉，EMBO J．4475)用于該質粒。該片段含有amdS基因的1007bp的啟動子區(qū)域，1897bp的編碼區(qū)(包括內含子)和183bp的終止子區(qū)域。
*cbh1 3＇-片段經過使用質粒拯救從T．reesei ALKO2466分離該片段(1．7kb，BamHⅠ-EcoRⅠ，從該基因終止子之后起始1．4kb，Suominen等，(1993)，在Trichoderma reesei中高頻率的一步基因取代。Ⅱ．單個纖維素酶基因的缺失效應。分子普通遺傳學，241523)。菌株ALKO 2466來自菌株ALKO 233(Harkki等(1991)，遺傳改造木霉屬以產生具有新纖維素酶特征的菌株。酶微生物學技術，13227)。3＇片段與啟動子區(qū)一起使用以便經過同源重組將20K-纖維素酶基因靶向到cbh1基因座。
質粒pALK1235含*ph基因編碼HmB磷酸轉移酶的基因最初從大腸桿菌K-12JM109中分離出(Yanish-Perron等，(1985)，改進的M13噬菌體克隆載體和宿主菌株M13 mp18和pUC19載體的核苷酸序列，基因33103)且它賦予對潮霉素B(HmB)的抗性。對潮霉素的抗性(以HmB磷酸轉移酶磷酸化滅活)用于選擇轉化子。hph基因與pKi啟動子和cbh2終止子(見下面)一起作為2．2kb NotⅠ-PvuⅡ片段從質粒pRLMex30中分離出(Mach等，(1994)，使用同源表述信號根據(jù)潮霉素B抗性轉化Trichoderma reesei，普通遺傳學，25567)。
*pKi啟動子使用T．reesei QM9414 DNA作模板經PCR合成用于表達hph的大約0．75kb pKi(丙酮酸激酶)啟動子(Schindler等(1993)，Trichoderma reesei編碼丙酮酸激酶的基因(pkil)的鑒定，基因，130271)。
*cbh2終止子cbh2終止子序列緊接cbh2基因終止密碼子之后開始(從終止密碼子到PvuⅡ位點0．5kb；Mach等(1994)，使用同源表達信號根據(jù)潮霉素B抗性轉化Trichoderma reesei。普通遺傳學，25567)且來自質粒pRLMex 30。
*egl1 5＇-片段從T．reesei QM6a分離1．8Kb egl1 5＇-片段(ScaⅠ-StuⅠ)(Mandels和Reese(1957)，受碳源和金屬的影響誘導Trichodermaviridae中的纖維素酶，細菌學雜志，73269)。該片段位于egl1編碼區(qū)上游大約1．35kb處且它用于靶向將轉化DNA整合進egl1基因座中。
*egl1 3＇-片段與5＇-片段一樣，從T．reesei QM6a中分離1．6kb egl13＇-片段(ScaⅠ-XhoⅠ)。該片段位于egl1基因下游0．3kb處，且它用于靶向轉化DNA進入egl1基因座。
在載體構建中使用Sambrook等，(1989)．在分子克隆，實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約所述的標準DNA方法。限制性酶，T4DNA連接酶，DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，多核苷酸激酶和Taq聚合酶來自Boehringer Mannheim(德國)和新英格蘭生物實驗室(USA)。根據(jù)廠家說明書使用各酶。經過使用Qiagen柱(Qiagen GmbH，德國)或Promega Magic Minipreps(Promega，USA)根據(jù)廠家的方案分離質粒DNA。在PCR-反應中和在測序反應中使用的寡核苷酸用ABI(應用生物系統(tǒng)，USA)381ADNA合成儀合成。DNA測序按實施例19所述進行。
經過β-瓊脂糖酶Ⅰ處理(新英格蘭生物實驗室，USA)或使用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen GmbH，德國)根據(jù)廠家說明書從低熔點瓊脂糖凝膠(FMC生物產品，USA)分離用于克隆或轉化的DNA片段。
按Penttila等，(1987)，用于纖維素裂解的絲狀真菌Trichodermareesei多用途轉化系統(tǒng)，基因，61155所述并按Karhunen等，(1993)，在Trichoderma reesei中高頻一步基因取代，Ⅰ，葡聚糖內切酶Ⅰ的過度生產。分子普通遺傳學，241515所述進行的修改轉化T．reesei ALKO3620。將T．reesei轉化子轉移到選擇培養(yǎng)基上并通過分子孢子純化。在土豆葡萄糖瓊脂上形成孢子前將它們在選擇斜面上生長2代來穩(wěn)定轉化子。
實施例30Melanocarpus albomyces ALKO423720K-纖維素酶產生轉化子的表征在搖瓶內含4％乳清，1．5％來自谷物的復合氮源，5％KH2PO4和0．5％(NH4)2SO4的培養(yǎng)基中生長純化的轉化子。在30℃以250rpm生長培養(yǎng)物7天。
以斑點印跡裝置將培養(yǎng)物上清直接印跡到硝酸纖維素濾膜上。使用CBHⅠ特異性單克隆抗體CⅠ-258的免疫染色和以特異性單克隆抗體EⅠ-2(Aho等，(1991)，抗Trichoderma reesei纖維素生物水解酶Ⅰ和Ⅱ和葡聚糖內切酶Ⅰ核心和纖維素結合區(qū)的單克隆抗體，歐洲生物化學雜志，200643)的EGⅠ及Proto Blot Western印跡AP系統(tǒng)(Promega，USA)根據(jù)廠家建議檢測CBHⅠ。
T．reesei菌株ALKO 3620／pALK1231／14，ALKO3620／pALK1231／16，ALKO 3620／pALK 1231／20和ALKO 3620／pALK 1231／59不含cbh1基因。cbh1基因被pALK 1231表達盒中的amds標記基因和20K-纖維素酶構建體取代。在Southern雜交中證實cbh1基因的取代。T．reesei菌株ALKO 3620／pALK 1235／40和ALKO 3620／pALK 1235／49不含egl1基因。egl1基因被pALK 1235表達盒中的hph標記基因和20K-纖維素酶構建體取代。在Southern雜交中證實了egl1基因取代。用于轉化的宿主菌株ALKO 3620是egl2基因缺陷型(被來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因(Mattern等，1988，Drocount等，1990)取代)。因此，這些菌株不生產木霉屬纖維素酶成分EGⅡ和CBHⅠ或EGⅠ。
來自培養(yǎng)物上清的樣品在Bio-Rad Mini ProteanⅡ電泳系統(tǒng)(美國)上在含0．1％SDS的聚丙烯酰胺板凝膠上走電泳。針對純化的20K-纖維素酶制備的多克隆抗體用于在Western印跡中檢測產生的蛋白質。在檢測中，使用Promega’s ProtoBlot_AP系統(tǒng)。Western結果在圖30中顯示。轉化子ALKO 3620／pALK 1235／49，ALKO 3620／pALK 1235／40，ALKO3620／pALK 1231／14和ALKO 3620／pALK1231／16(泳道1，2，4和5)產生與多克隆20K-纖維素酶抗血清反應的蛋白質。轉化子產生的蛋白質大小與純化的20K-纖維素酶(泳道6)的大小相同。ALKO 3620(泳道3)不產生相應的蛋白質。
按實施例10所述測定轉化子的葡聚糖內切酶活性。當使用2％羧甲基纖維素(CMC)作底物時，反應溫度上升到70℃，因此ALKO 3620的葡聚糖內切酶活性是熱滅活的。當使用1％羥經纖維素作底物時，在酶活性測量前進行熱滅活。來自生長培養(yǎng)基的樣品在0．05M HEPES，pH7．0緩沖液中稀釋并在70℃保溫20分鐘。幾乎完全熱滅活了葡聚糖內切酶Ⅰ(在ALKO 3620中剩余的主要葡聚糖內切酶。在熱滅活中egl1-陰性轉化子的活性下降大約30％，表明對20K-纖維素的熱滅活較小。葡聚糖內切酶活性在表ⅩⅩ中提供。當HEC是底物時，20K-纖維素酶活性推斷為經過將熱處理后獲得的活性除以0．7得到的熱處理前的活性。表ⅩⅩ．產生Melanocarpus albomyces 20K-纖維素酶的T．reesei轉化子的葡聚糖內切酶活性。
20K-纖維素酶活性(人工單位／ml)CMC HEC底物70℃，pH7．050℃，pH7．0ALKO4237_* 100**ALKO362050*** 38***ALKO3620/pALK1231/142400350ALKO3620/pALK1231/162600350ALKO3620/pALK1231/206500750ALKO3620/pALK1231/596800750ALKO3620/pALK1231/402400325ALKO3620/pALK1231/492100350*未測量**未熱滅活的，也含有50K-纖維素酶，50K纖維素酶B和其它纖維素酶活性。
***由木霉屬纖維素酶產生的活性。
T．reesei宿主菌株ALKO 3620的葡聚糖內切酶活性在70℃幾乎完全滅活。產生Melanocarpus albomyces 20K-纖維素酶的轉化子產生大量相對熱穩(wěn)定的20K-纖維素酶。轉化子的葡聚糖內切酶生產水平比20K-纖維素酶親本菌株ALKO 4237高幾倍。
實施例31在T．reesei中生產Melanocarpus albomycesALKO 4237 50K纖維素酶構建Trichoderma reesei菌株用于Melanocarpus albomyces ALKO4237 50K-纖維素酶生產。該菌株生產Melanocarpus 50K-纖維素酶且不能生產T．reesei葡聚糖內切酶Ⅱ和纖維素生物水解酶或葡聚糖內切酶Ⅰ。在產生Melanocarpus albomyces 50K-纖維素酶的菌株的構建中，用來自質粒pALK 1238或pALK 1240(圖31和32)的表達盒轉化親本Trichoderma reesei菌株ALKO 3620。在表達盒中，50K纖維素酶從強cbh1啟動子下表達。表達盒的整合導致取代親本cbh1(pALK 1238)或egl1(pALK 1240)基因。除了用實施例22所述的50K-纖維素酶基因(從ATG密碼子起1．7kb片段)取代20K-纖維素酶基因外。按實施例29所述進行克隆和轉化。然后與實施例30相似以對本領域的技術人員顯而易見的修改鑒定產生Melanocarpus albomyces 50K-纖維素酶的轉化子。與實施例29和30相似，以對本領域的技術人員顯而易見的修飾制備產生Melanocarpus albomyces 50K-纖維素酶B和具有CBD的蛋白質的轉化子。
由于現(xiàn)在充分描述了本發(fā)明，本領域的技術人員應明白可在不影響本發(fā)明或其任意實施方案的精神或范圍的前提下在條件，參數(shù)等的廣泛且相當?shù)姆秶鷥冗M行本發(fā)明。本文引用的所有參考文獻充分引入本文作為參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱Primalco Ltd(B)街道Valta-akseli(C)城市Rajamaki(E)國家Finland(F)郵編(ZIP)05200(G)電話+358 9 13311(H)電傳+358 9 133 1236(ⅱ)發(fā)明題目新纖維素酶，編碼它們的基團及其應用(ⅲ)序列數(shù)37個(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1．0，Version#1．30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(ⅰ)序列描述(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…30
(D)其它信息／標記=No_429(ⅹⅰ)SEQ ID NO1的序列描述Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys1 5 10 15Gly Trp Arg Gly Lys Gly Pro Val Asn Gln Pro Val Tyr Ser20 25 30(2)SEQ ID NO2信息(ⅰ)序列描述(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…7(D)其它信息／標記=No_430(ⅹⅰ)SEQ ID NO2的序列描述Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg1 5(2)SEQ ID NO3信息(ⅰ)序列描述(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源
(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…4(D)其它信息／標記=No_431(ⅹⅰ)SEQ ID NO3的序列描述Cys Gly Trp Arg1(2)SEQ ID NO4信息(ⅰ)序列描述(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…6(D)其它信息／標記=No_432(ⅹⅰ)SEQ ID NO4的序列描述Pro Ser Cys Gly Trp Arg1 5(2)SEQ ID NO5信息(ⅰ)序列描述(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…6(D)其它信息／標記=No_433(ⅹⅰ)SEQ ID NO5的序列描述Tyr Trp Asp Cys Cys Lys15(2)SEQ ID NO6信息(ⅰ)序列描述(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…17(D)其它信息／標記=No_439(ⅹⅰ)SEQ ID NO6的序列描述Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp1 5 10 15Arg(2)SEQ ID NO7信息(ⅰ)序列描述(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…8(D)其它信息／標記=fr9(ⅹⅰ)SEQ ID NO7的序列描述Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala1 5(2)SEQ ID NO8信息(ⅰ)序列描述(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…7(D)其它信息／標記=fr14(ⅹⅰ)SEQ ID NO8的序列描述Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro1 5(2)SEQ ID NO9信息(ⅰ)序列描述(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…18(D)其它信息／標記=fr16(ⅹⅰ)SEQ ID NO9的序列描述Gly Lys Gly Pro Val Asn Gln Pro Val Tyr Ser Cys Asp Ala Asn Phe1 5 10 15Gln Arg(2)SEQ ID NO10信息(ⅰ)序列描述(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces
(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…10(D)其它信息／標記=fr17(ⅹⅰ)SEQ ID NO10的序列描述Val Gln Cys Pro Glu Glu Leu Val Ala Arg1 5 10(2)SEQ ID NO11信息(ⅰ)序列描述(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…15(D)其它信息／標記=fr28(ⅹⅰ)SEQ ID NO11的序列描述Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO12信息(ⅰ)序列描述(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…30(D)其它信息／標記=fr30(ⅹⅰ)SEQ ID NO12的序列描述Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn1 5 10 15His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Leu Phe20 25 30(2)SEQ ID NO13信息(ⅰ)序列描述(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…10(D)其它信息／標記=No_507(ⅹⅰ)SEQ ID NO13的序列描述Val Tyr Leu Leu Asp Glu Thr Glu His Arg1 5 10(2)SEQ ID NO14信息(ⅰ)序列描述(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…12(D)其它信息／標記=No_509(ⅹⅰ)SEQ ID NO14的序列描述Xaa Xaa Leu Asn Pro Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr1 5 10(2)SEQ ID NO15信息(ⅰ)序列描述(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…17(D)其它信息／標記=No_563(ⅹⅰ)SEQ ID NO15的序列描述Met Ser Glu Gly Ala Glu Cys Glu Tyr Asp Gly Val Cys Asp Lys Asp1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO16信息(ⅰ)序列描述(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…14(D)其它信息／標記=No_565(ⅹⅰ)SEQ ID NO16的序列描述Asn Pro Tyr Arg Val Xaa Ile Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser1 5 10(2)SEQ ID NO17信息(ⅰ)序列描述(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…24(D)其它信息／標記=No_603(ⅹⅰ)SEQ ID NO17的序列描述Asp Pro Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro Gly Gly Ala Tyr Tyr1 5 10 15Gly Thr Gly Tyr Xaa Asp Ala Gln20(2)SEQ ID NO18信息(ⅰ)序列描述(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…13(D)其它信息／標記=No_605(ⅹⅰ)SEQ ID NO18的序列描述Xaa Xaa Val Pro Asp Tyr His Gln His Gly Val Asp Ala1 5 10(2)SEQ ID NO19信息(ⅰ)序列描述(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…12(D)其它信息／標記=No_610(ⅹⅰ)SEQ ID NO19的序列描述Asn Glu Met Asp Ile Xaa Glu Ala Asn Ser Arg Ala1 5 10(2)SEQ ID NO20信息(ⅰ)序列描述(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…25(D)其它信息／標記=No_611(ⅹⅰ)SEQ ID NO20的序列描述Leu Pro Xaa Gly Met ASn Ser Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Asp Pro1 510 15Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro20 25(2)SEQ ID NO21信息(ⅰ)序列描述(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…21(D)其它信息／標記=No_612(ⅹⅰ)SEQ ID NO21的序列描述Val Glu Pro Ser Pro Glu Val Thr Tyr Ser Asn Leu Arg Xaa Gly Glu1 5 10 15Ile Xaa Gly Xaa Phe20(2)SEQ ID NO22信息(ⅰ)序列描述(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…19(D)其它信息／標記=No_619(ⅹⅰ)SEQ ID NO22的序列描述Asp Gly Cys Gly Trp Asn Pro Tyr Arg Val Val Ile Thr Thr Asp Tyr1 5 10 15Tyr Asn Asn(2)SEQ ID NO23信息(ⅰ)序列描述(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…10(D)其它信息／標記=No_620(ⅹⅰ)SEQ ID NO23的序列描述Leu Pro Cys Gly Met Xaa Ser Ala Leu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO24信息(ⅰ)序列描述(A)長度22個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(a)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…22(D)其它信息／標記=No_621(ⅹⅰ)SEQ ID NO24的序列描述Ala Asp Gly Cys Gln Pro Arg Thr Asn Tyr Ile Val Leu Asp Asp Leu1 5 10 15Leu His Pro Xaa Xaa Gln20(2)SEQ ID NO25信息(ⅰ)序列描述(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…9(D)其它信息／標記=No_534(ⅹⅰ)SEQ ID NO25的序列描述Val Gly Asn Pro Asp Phe Tyr Gly Lys1 5(2)SEQ ID NO26信息(ⅰ)序列描述(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…8(D)其它信息／標記=No_535(ⅹⅰ)SEQ ID NO26的序列描述Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Tyr1 5(2)SEQ ID NO27信息(ⅰ)序列描述(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…12(D)其它信息／標記=No_631(ⅹⅰ)SEQ ID NO27的序列描述Leu Ser Gln Tyr Phe Ile Gln Asp Gly Glu Arg Lys1 5 10(2)SEQ ID NO28信息(ⅰ)序列描述(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…11(D)其它信息／標記=No_632(ⅹⅰ)SEQ ID NO28的序列描述Phe Thr Val Val Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys1 5 10(2)SEQ ID NO29信息(ⅰ)序列描述(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞肽(B)位置1…19(D)其它信息／標記=No_636(ⅹⅰ)SEQ ID NO29的序列描述His Glu Tyr Gly Thr Asn Val Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Asn Gly1 5 10 15Pro Asp Lys(2)SEQ ID NO30信息(ⅰ)序列特征(A)長度936個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置33…115(D)其它信息／密碼子_起始=33／產物=“20K-纖維素酶”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置187…435(D)其它信息／產物=“20K-纖維素酶”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置506…881(D)其它信息／產物=“20K-纖維素酶”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO30的序列描述TCGCCCCTAA CCGAGAACCA AAGACTCCAA GAATGCGCTC TACTCCCGTT CTCCGCGCCC60TCCTGGCCGC AGCATTGCCC CTCGGGGCCC TCGCCGCCAA CGGTCAGTCC ACGAGGTAAC 120TGATCACCCG CCTCATTACG CGTGCCGACC GGACCGCGTT CAGGGCTCAC TGCTCACCGC 180ATCCAGATAC TGGGACTGCT GCAAGCCGTC GTGCGGCTGG CGCGGAAAGG GCCCCGTGAA 240CCAGCCCGTC TACTCGTGCG ACGCCAACTT CCAGCGCATC CACGACTTCG ATGCCGTCTC 300GGGCTGCGAG GGCGGCCCCG CCTTCTCGTG CGCCGACCAC AGCCCCTGGG CCATTAATGA 360CAACCTCTCG TACGGCTTCG CGGCGACTGC ACTCAGCGGC CAGACCGAGG AGTCGTGGTG 420CTGTGCCTGC TACGCGTGAG TGTGCTTGGG CCCAACGTCG GTGATTCCGG AGTTCAGACC 480ACTGACCCAG CGACCCGCTC GCCAGTCTGA CCTTTACATC GGGTCCCGTG GCCGGCAAGA 540CCATGGTCGT CCAGTCGACC AGCACGGGCG GCGACCTCGG CAGCAACCAC TTCGACCTCA 600ACATCCCCGG CGGCGGCGTC GGCCTCTTCG ACGGCTGCAC TCCCCAGTTC GGCGGCCTCC 660CGGGCGCACG GTACGGCGGC ATCTCGTCGC GCCAGGAGTG CGACTCGTTC CCCGAGCCGC 720TCAAGCCCGG CTGCCAGTGG CGCTTCGACT GGTTCCAGAA CGCCGACAAC CCGTCCTTTA 780CCTTCGAGCG GGTCCAGTGC CCCGAGGAGC TGGTCGCTCG GACCGGCTGC AGGCGCCACG 840ACGACGGCGG 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His Val Ala Pro His Thr Cys Asn Gln Thr Gly Leu Tyr Met Cys225 230 235 240Glu Gly Ala Glu Cys Glu Tyr Asp Gly Val Cys Asp Lys Asp Gly Cys245 250 255Gly Trp Asn Pro Tyr Arg Val Asn Ile Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser260 265 270Asp Ala Phe Arg Val Asp Thr Arg Arg Pro Phe Thr Val Val Thr Gln275 280 285Phe Pro Ala Asp Ala Glu Gly Arg Leu Glu Ser Ile His Arg Leu Tyr290 295 300Val Gln Asp Gly Lys Val Ile Glu Ser Tyr Val Val Asp Ala Pro Gly305 310 315 320Leu Pro Arg Thr Asp Ser Leu Asn Asp Glu Phe Cys Ala Ala Thr Gly325 330 335Ala Ala Arg Tyr Leu Asp Leu Gly Gly Thr Ala Gly Met Gly Asp Ala340 345 350Met Thr Arg Gly Met Val Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp Asp Glu Ser355 360 365Gly Phe Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Glu Ala Gly Pro Cys Leu Pro370 375 380Asp Glu Gly Asp Pro Lys Asn Ile Val Lys Val Glu Pro Ser Pro Glu385 390 395 400Val Thr Tyr Ser Asn Leu Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr Phe Glu405 410 415Ala Glu Ser Asp Asp Asp Gly Asp Gly Asp Asp Cys420 425(2)SEQ ID NO34信息(ⅰ)序列特征(A)長度2000個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置154…729(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置810…946(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置1018…1230(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置1308…1551
(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置1637…1767(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置1831…1888(D)其它信息／產物=“50K-纖維素酶B”(ⅹⅰ)SEQ ID NO34的序列描述CCCGGTCTGG AGACGGGGAG CGCGCCAGCG ACGCAGGATA AGAAGGCGAC GACCGCGCCT 60CCGAGCCAGG CCCAGGACAG CAGGAGAACT CGCCACGCGC AAGCAGCACG CCCGATCGAC120AGTGTCCCGC TCTGCCCACA GCACTCTGCA ACCATGATGA TGAAGCAGTA CCTCCAGTAC180CTCGCGGCCG CGCTGCCGCT CGTCGGCCTC GCCGCCGGCC AGCGCGCTGG TAACGAGACG240CCCGAGAACC ACCCCCCGCT CACCTGGCAG AGGTGCACGG CCCCGGGCAA CTGCCAGACC300GTGAACGCCG AGGTCGTCAT TGACGCCAAC TGGCGCTGGC TGCACGACGA CAACATGCAG360AACTGCTACG ACGGCAACCA GTGGACCAAC GCCTGCAGCA CCGCCACCGA CTGCGCTGAG420AAGTGCATGA TCGAGGGTGC CGGCGACTAC CTGGGCACCT ACGGCGCCTC GACCAGCGGC480GACGCCCTGA CGCTCAAGTT CGTCACCAAG CACGAGTACG GCACCAACGT CGGCTCGCGC540TTCTACCTCA TGAACGGCCC GGACAAGTAC CAGATGTTCA ACCTCATGGG CAACGAGCTT600GCCTTTGACG TCGACCTCTC GACCGTCGAG TGCGGCATCA ACAGCGCCCT GTACTTCGTC660GCCATGGAGG AGGACGGCGG CATGGCCAGC TACCCGAGCA ACCAGGCCGG CGCCCGGTAC720GGCACTGGGG TGAGTTGAGC TCCGCTTTGT TTCGAGTCGC AACGAGGCAC TTTCTGGGCG780CCGGCTAACT CTCTCGATTC CTCCGACAGT ACTGCGATGC CCAATGCGCT CGTGATCTCA840AGTTCGTTGG CGGCAAGGCC AACATTGAGG GCTGGAAGTC GTCCACCAGC GACCCCAACG900CTGGCGTCGG CCCGTACGGC AGCTGCTGCG CTGAGATCGA CGTCTGGTGA GTGCGAGACC960GTCCACCCAG GTTCGGATGC GGGGTGGAAA TTTCGCGGCT AACGGAGCAC CCCCCAGGGA 1020GTCGAATGCC TATGCCTTCG CTTTCACGCC GCACGCGTGC ACGACCAACG AGTACCACGT 1080CTGCGAGACC ACCAACTGCG GTGGCACCTA CTCGGAGGAC CGCTTCGCCG GCAAGTGCGA 1140CGCCAACGGC TGCGACTACA ACCCCTACCG CATGGGCAAC CCCGACTTCT ACGGCAAGGG 1200CAAGACGCTC GACACCAGCC GCAAGTTCAC GTGCGTGACC CCTTGTGGCG CAACCTTTCT 1260CTGCCTGCCT GGACACACTG AAACTGACAC GTCGTTTTCG GCTGCAGCGT CGTCTCCCGC 1320TTCGAGGAGA ACAAGCTCTC CCAGTACTTC ATCCAGGACG GCCGCAAGAT CGAGATCCCG 1380CCGCCGACGT GGGAGGGCAT GCCCAACAGC AGCGAGATCA CCCCCGAGCT CTGCTCCACC 1440ATGTTCGATG TGTTCAACGA CCGCAACCGC TTCGAGGAGG TCGGCGGCTT CGAGCAGCTG 1500AACAACGCCC TCCGGGTTCC CATGGTCCTC GTCATGTCCA TCTGGGACGA CGTAAGTACC 1560CGCCGACCTC CCTAGCCACA CAAGCCGCAT CCGGCGAGGC ACGCCATCGC TGCTGCTAAC 1620ACGAGACCGT TCGTAGCACT ACGCCAACAT GCTCTGGCTC GACTCCATCT ACCCGCCCGA 1680GAAGGAGGGC CAGCCCGGCG CCGCCCGTGG CGACTGCCCC ACGGACTCGG GTGTCCCCGC 1740CGAGGTCGAG GCTCAGTTCC CCGACGCGTA AGACTTGCCC CCGACCCCAA GCTTCCACTT 1800CTGGATGCCG AATGCTAACA CGCGAAACAG CCAGGTCGTC TGGTCCAACA TCCGCTTCGG 1860CCCCATCGGC TCGACCTACG ACTTCTAAGC CGGTCCATGC ACTCGCAGCC CTGGGCCCGT 1920CACGCCCGCC ACCTCCCCTC GCGGAAACTC TCCGTGCGTC GCGGGCTCCA AAGCATTTTG 1980GCCTCAAGTT TTTTTCGTTC 2000(2)SEQ ID NO35信息(ⅰ)序列描述(A)長度452個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞蛋白質(B)位置1…452(D)其它信息／標記=50K-纖維素酶-B(ⅹⅰ)SEQ ID NO35的序列描述Met Met Met Lys Gln Tyr Leu Gln Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu1 5 10 15Val Gly Leu Ala Ala Gly Gln Arg Ala Gly Asn Glu Thr Pro Glu Asn20 25 30His Pro Pro Leu Thr Trp Gln Arg Cys Thr Ala Pro Gly Asn Cys Gln
35 40 45Thr Val Asn Ala Glu Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His50 55 60Asp Asp Asn Met Gln Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Gln Trp Thr Asn Ala65 70 75 80Cys Ser Thr Ala Thr Asp Cys Ala Glu Lys Cys Met Ile Glu Gly Ala85 90 95Gly Asp Tyr Leu Gly Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ala Leu100 105 110Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Val Gly Ser115 120 125Arg Phe Tyr Leu Met Asn Gly Pro Asp Lys Tyr Gln Met Phe Asn Leu130 135 140Met Gly Asn Glu Leu Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Val Glu Cys145 150 155 160Gly Ile Asn Ser Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly165 170 175Met Ala Ser Tyr Pro Ser Asn Gln Ala Gly Ala Arg Tyr Gly Thr Gly180 185 190Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Ala Arg Asp Leu Lys Phe Val Gly Gly Lys195 200 205Ala Asn Ile Glu Gly Trp Lys Ser Ser Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly210 215 220Val Gly Pro Tyr Gly Ser Cys Cys Ala Glu Ile Asp Val Trp Glu Ser225 230 235 240Asn Ala Tyr Ala Phe Ala Phe Thr Pro His Ala Cys Thr Thr Asn Glu245 250 255Tyr His Val Cys Glu Thr Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp260 265 270Arg Phe Ala Gly Lys Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr275 280 285Arg Met Gly Asn Pro Asp Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Leu Asp Thr290 295 300Set Arg Lys Phe Thr Val Val Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys Leu Ser305 310 315 320Gln Tyr Phe Ile Gln Asp Gly Arg Lys Ile Glu Ile Pro Pro Pro Thr
325 330 335Trp Glu Gly Met Pro Asn Ser Ser Glu Ile Thr Pro Glu Leu Cys Ser340 345 350Thr Met Phe Asp Val Phe Asn Asp Arg Asn Arg Phe Glu Glu Val Gly355 360 365Gly Phe Glu Gln Leu Asn Asn Ala Leu Arg Val Pro Met Val Leu Val370 375 380Met Ser Ile Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser385 390 395 400Ile Tyr Pro Pro Glu Lys Glu Gly Gln Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp405 410 415Cys Pro Thr Asp Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gln Phe Pro420 425 430Asp Ala Gln Val Val Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser435 440 445Thr Tyr Asp Phe450(2)SEQ ID NO36信息(ⅰ)序列特征(A)長度887個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞外顯子(B)位置351…455(D)其它信息／產物=“protein-with-CBD”(ⅹⅰ)SEQ ID NO36的序列描述CCATGGACGC GAACTGCGAC GTCTTCTGCC CCGAGCTGAA GACCCAGAGC ATCCAGACCG 60GCAACCAGTG CACCCAGGAG ATGAAGGTCT ACGAGAACAT TGACGGCTGG CTCGACAGCC 120TGCCCGGCAA CGTCCCCATC ACCGGTCCGC AGCCCGGCTC TGGTAAGTCA AAGAGATGAT 180GCCTACCTAC CTTCCCACCT TCCCACCCAG CCGCAAATAC CTTTCTCCCT CCCCGTGCCC 240CGTATTCTTT CAACGCCCCG AGACTGACAG ACCCGCTCGT CCCAGGCGGC AACCCCGGCA 300ACGGCGGCGG CAGCAACCCG GGCAACGGCG GCGGCGGCGG CTGCACCGTC CAGAAGTGGG 360GCCAGTGCGG CGGCATCGGC TACTCGGGCT GCACCACCTG CAAGGCCGGC TCGACCTGCC 420CGGCCCAGAA CGAGTACTAC TCGCAGTGCC TGTAAAGCGG CCGTGGGCTA GGTGGCCGAG 480CGGGGGGGTT TCTTCATTGG TTGAGCAAAT AGAACAGGAT TTCCGGCTCG TTGGCAGCGG 540CGCGCCGCGG GGATGGTGTT GTACAATTCA AGACCTCAGT ACCGAGGGAC CTGGAAAGGA 600GTCAGTCTGC TTGTACGGAG GCTGGCTGCC CCGTGGCGGC GCTGGCAAGG TAGATAGCCC 660TTCATTGCTG TAACTAGTAT GCTATATACC TCTGCACATT TGCAGCCCCA TGGTGTGAAC 720AACAAGTGAC AAGGCTTCCA GTTCCAGCCT CGCGCAATTG TCACGATATC CTTGGTCCAT 780CTATATGTAT GGGCATGAGC GAGTCGAGAA AATGTACCGC GAAAAATCGT AGTGACCTGC 840GCACTGCGCC GTTCTACCAC CGTAGGATTG AAGTGAATCT CGAATTC 887(2)SEQ ID NO37信息(ⅰ)序列描述(A)長度34個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)原始來源(A)生物Melanocarpus albomyces(B)菌株ALKO4237(ⅸ)特征(A)名稱／關鍵詞蛋白質(B)位置1…34(D)其它信息／標記=prot-with-CBD(ⅹⅰ)SEQ ID NO37的序列描述Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Thr Thr1 5 10 15Cys LyS Ala Gly Ser Thr Cys Pro Ala Gln Asn Glu Tyr Tyr Ser Gln20 25 30Cys Leu
權利要求
1．編碼具有纖維素酶的酶促活性之多肽的核酸分子，選自(a)編碼包含圖19或21所述之氨基酸序列的多肽的核酸分子；(b)編碼包含圖23或27所述之氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)包含圖19或21所述之核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(d)包含圖23或27所述之核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(e)編碼含有由DSM11024，DSM11012，DSM11025或DSM11014中所含之DNA插入片段編碼的氨基酸的序列的多肽的核酸分子；(f)編碼含有由DSM11026，DSM11011，DSM11013或DSM11027中所含之DNA插入片段編碼的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(g)包含DSM11024，DSM11012，DSM11025或DSM11014中所含之DNA插入片段的編碼序列的核酸分子；(h)包含DSM11026，DSM11011，DSM11013或DSM11027中所含之DNA插入片段的編碼序列的核酸分子；(i)與(a)，(c)，(e)或(g)中任一項的分子雜交的核酸分子；(j)由于遺傳密碼的簡并性其編碼序列與(a)至(i)中任一項的核酸分子的編碼序列有區(qū)別的核酸分子；(k)編碼具有纖維素酶活性且具有與圖19，21，23或27所述的序列顯示出至少80％相同性之氨基酸序列的多肽的核酸分子。
2．權利要求1的核酸分子，它是一種RNA。
3．權利要求1的核酸分子，它是一種DNA。
4．權利要求3的DNA，它是基因組DNA或cDNA。
5．一種載體，含有權利要求1至4中任一項的核酸分子。
6．權利要求5的載體，其中該核酸分子有效地連接到允許在原核或真核宿主細胞中表達的表達控制序列上。
7．用權利要求1至4中任一項的核酸分子或用權利要求5或6的載體轉化的宿主細胞。
8．權利要求7的宿主細胞，它屬于絲狀真菌。
9．權利要求7至8的宿主細胞，它屬于木霉屬或曲霉屬。
10．權利要求9的宿主細胞，它是Trichoderma reesei。
11．一種生產具有纖維素酶活性的多肽的方法，包含培養(yǎng)權利要求7至10中任一項的宿主細胞并從培養(yǎng)基中回收蛋白質的步驟。
12．一種具有纖維素酶活性的，由權利要求1至4中任一項的核酸分子，權利要求5或6的載體編碼的且可由權利要求11的方法獲得的多肽。
13．特異性地識別權利要求12的多肽的抗體。
14．與權利要求1至4中任一項的核酸分子特異性地雜交的寡核苷酸。
15．制備含有權利要求12的多肽的酶制品的方法，包括培養(yǎng)權利要求7至10中任一項的宿主細胞并從細胞中回收多肽或從培養(yǎng)基中分離細胞并獲上清的步驟。
16．以權利要求15的方法可獲得的酶制品。
17．一種酶制品，包含至少一種屬于選自Melanocarpus，Myriococcum，Sporotrichum，毀絲霉屬或毛殼霉屬的真菌屬的真菌種類的纖維素酶。
18．權利要求17的酶制品，其中真菌種類是Melanocarpusalbomyces，Myriococcum albomyces，由CBS 687．95所代表的Myriococcum種類，Sporotrichum thermophile，Myceliophthorathermophila或Chaetomium thermophilum。
19．權利要求17或18的酶制品，其中真菌是Melanocarpusalbomyces或Myriococcum albomyces CBS 685．95，Myriococcum種類CBS 687．95，Sporotrichum thermophile CBS 688．95或Myceliophthorathermophila CBS 689．95或Chaetomium thermophilum CBS 730．95。
20．權利要求16至19的酶制品，它是液體。
21．權利要求16至19中任一項的酶制品，它是干燥的。
22．一種生物磨洗的方法，它包含向含棉織物或服裝中加入權利要求16至19中任一項的制品的步驟。
23．權利要求22的方法，其中織物或服裝是斜紋粗棉布。
24．一種生物拋光的方法，它包含向象織物或服裝或紗線的紡織品材料中加入權利要求16至19中任一項的制品的步驟。
25．權利要求24的方法，其中紡織品材料是由含天然纖維素的纖維或含人造纖維素的纖維或其混合物生產的。
26．權利要求24的方法，其中的紡織品材料是合成纖維和含纖維素的纖維的混合物。
27．一種去污劑組合物，包含權利要求16至19的酶制品和一種表面活性劑或表面活性物質。
28．一種處理含有纖維素纖維的紡織品材料的方法，其中所說的方法包含將所說的紡織品材料與權利要求27的去污劑組合物混合。
29．一種處理來源于木頭的紙漿或纖維的方法，包含向來源于木頭的機械或化學紙漿或次級纖維中加入權利要求16至19中任一項的酶制品的步驟。
30．一種改進動物飼料質量的方法，包含用權利要求16至19中任一項的酶制品處理植物材料。
全文摘要
描述了編碼纖維素的基因,編碼有助于該纖維素酶作用的蛋白質的基因,纖維素酶和有助于該纖維素酶作用的蛋白質以及含該蛋白質的酶制品。還公開了天然宿主及含所說纖維素酶的所說宿主的培養(yǎng)基。這些蛋白質在紡織品和去污劑工業(yè)及紙漿和紙工業(yè)中特別有用。
文檔編號C12N15/80GK1204368SQ96199092
公開日1999年1月6日 申請日期1996年10月17日 優(yōu)先權日1995年10月17日
發(fā)明者A·米蒂仁－奧伊諾仁, J·羅德斯波柔, J·維馬安佩雷, H·哈卡納, A·梅泰雷, R·蘭托, M·埃羅維尼奧, V·約茨約基, M·帕羅海莫, P·梭米仁 申請人:羅姆·恩齊姆芬蘭有限公司