專利名稱：包含痘苗病毒載體和仙臺(tái)病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，特別是涉及能夠用于使細(xì)胞免疫和體液免疫的任一個(gè)均可激活的初免-加強(qiáng)(prime-boost)疫苗的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體。
背景技術(shù)：
人類是暴露于由于病毒、細(xì)菌、真菌及其他各種各樣的生物的感染以及由其引起的傳染病的危險(xiǎn)之中的?？朔@些傳染病的一種方法是接種疫苗。疫苗大致分為使用減毒細(xì)菌、病毒等病原微生物本身的活疫苗和使用通過(guò)化學(xué)處理等死去的病原微生物或者表現(xiàn)抗原性的其一部分的滅活疫苗。從賦予強(qiáng)的免疫力這點(diǎn)而言，期望疫苗能夠激活細(xì)胞免疫和體液免疫兩方，活疫苗能夠激活該兩方而在獲得免疫力強(qiáng)、免疫持續(xù)時(shí)間也長(zhǎng)等方面是有效的，但由于作為減毒病原的病原微生物本身被給予生物體，難以完全消除由病原微生物的感染引起的副反應(yīng)、由于減毒病原微生物的回復(fù)(reversion)而強(qiáng)毒化(回復(fù)突變或者返祖)等隱患。因此，對(duì)于像人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類肝炎病毒(HCV)等那樣，一旦感染則會(huì)患上極為嚴(yán)重的疾病那種病原微生物，利用滅活疫苗，特別是在對(duì)人類安全性高的感染性病毒的基因組中，通過(guò)基因重組方法重組編碼來(lái)自病原微生物的抗原蛋白質(zhì)的基因的病毒載體疫苗。對(duì)于這種病毒載體疫苗，必須為具備對(duì)生物體的高度安全性與重組基因的高表達(dá)性的病毒載體。作為這樣的病毒載體，利用具有在哺乳動(dòng)物中不能增殖性質(zhì)的病毒、改變基因組使其雖然感染但在宿主中不產(chǎn)生子代病毒的病毒等，具體地，已利用金絲雀痘病毒、痘苗病毒 MVA(Modif ied Vaccinia virus Ankara)、痕苗病毒 LC16m8 株、痕苗病毒 LC16m8 株的B5R基因缺失而不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒m8 A B5R株(專利文獻(xiàn)I)、載體亞型5的El基因和E3基因缺失的腺病毒、仙臺(tái)病毒等。另外，作為病毒載體疫苗，除了以痘苗病毒LC16m8株為載體的人類乙型肝炎疫苗(非專利文獻(xiàn)I)以外，正在多方開(kāi)發(fā)在痘苗病毒LC16m8株中重組有HIV包膜蛋白質(zhì)gpl60(GenBank編號(hào)U21135)的HIV疫苗(專利文獻(xiàn)2)、在仙臺(tái)病毒載體中重組有HIV的gag蛋白質(zhì)的HIV疫苗(專利文獻(xiàn)3)等各種在病毒載體(腺病毒載體、仙臺(tái)病毒載體(sendal virusvector)、痘苗病毒載體(vaccinia virus vector)、金絲雀痘病毒載體等)中重組有HIV-1的組成蛋白質(zhì)基因的HIV疫苗。主流正在從一種免疫方法僅使用一種疫苗的方法，向使用組合兩種以上的疫苗的初免-加強(qiáng)疫苗的方法轉(zhuǎn)變。作為初免-加強(qiáng)疫苗，除了大量正在嘗試的組合重組有抗原蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒(DNA 疫苗)與各種病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗以外，正在開(kāi)發(fā)用在安全性高的BCG中插入有HIV-1的gag基因的rBCG/HIV-1 gag E疫苗進(jìn)行初免、用在作為在人類體內(nèi)不增殖的弱毒痘苗病毒的痘苗病毒DIs株中插入有HIV-1的gag蛋白質(zhì)基因的痘苗DIs/HIV-lgag E疫苗進(jìn)行加強(qiáng)的初免-加強(qiáng)HIV疫苗(專利文獻(xiàn)4)、組合金絲雀痘病毒載體與HIV包膜蛋白質(zhì)gpl20的初免-加強(qiáng)HIV疫苗(非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，由于活化⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞、活化⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞等免疫細(xì)胞表達(dá)的⑶40配體(⑶40L)是使樹(shù)突狀細(xì)胞活化的因子，因此有報(bào)道用其激活免疫的方法，還報(bào)道了給予可溶性CD40L蛋白質(zhì)而激活免疫的方法，使用導(dǎo)入CD40L表達(dá)載體而活化的樹(shù)突狀細(xì)胞的惡性腫瘤的免疫療法,將可溶性CD40L蛋白質(zhì)和質(zhì)粒、非增殖性痘苗病毒載體混合給予而激活免疫的方法(非專利文獻(xiàn)3)，使⑶40配體(⑶40L)、以及其非切斷型突變體⑶40Lm在重組細(xì)胞中表達(dá)從而改變?cè)摷?xì)胞的免疫反應(yīng)性的方法(專利文獻(xiàn)5)等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第2005/054451號(hào)專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2003-321391號(hào)專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第2001/072340號(hào)專利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi)2006-149234號(hào)專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)第2005/100558號(hào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:橋爪壯，新的弱毒痘菌株LC16m8株的基礎(chǔ)，臨床與病毒，第3卷，第3號(hào)，第229頁(yè)，1975年非專利文獻(xiàn)2 =Perks-Ngarm S.等，N.Engl.J.Med.，第 361 卷，第 2209-2220 頁(yè)，2009 年 非專利文獻(xiàn)3:C.E.Gomez 等，Vaccine，第 27 卷，第 3165-3174 頁(yè)，2009 年

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題可是，在各種病毒載體中重組有HIV-1的組成蛋白質(zhì)基因的HIV疫苗雖然激活細(xì)胞免疫，但對(duì)體液免疫的激活微弱。另外，臨床試驗(yàn)表明，使用激活細(xì)胞免疫的腺病毒載體的HIV疫苗沒(méi)有抑制HIV-1的感染的效果(Science，第321卷，第530頁(yè)，2008年)。進(jìn)一步地，非專利文獻(xiàn)3中記載的、將可溶性CD40L蛋白質(zhì)和質(zhì)粒、非增殖性痘苗病毒載體混合給予而激活免疫的方法也是激活細(xì)胞免疫，而體液免疫的激活效果有限。另一方面，以往的組合質(zhì)粒與各種病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗也是激活細(xì)胞免疫，而抗體誘導(dǎo)能力微弱。臨床試驗(yàn)表明，非專利文獻(xiàn)2中記載的組合金絲雀痘病毒載體和HIV包膜蛋白質(zhì)gpl20的初免-加強(qiáng)H IV疫苗使HIV-1的感染率在某種程度上(30%)減少，但難以說(shuō)是充分的感染抑制效果。也就是說(shuō)，尚未完成對(duì)HIV、HCV等嚴(yán)重的疾病能夠決定性地激活體液免疫和細(xì)胞免疫兩方的載體疫苗、初免-加強(qiáng)疫苗。特別是對(duì)于HIV而言，當(dāng)激活體液免疫和細(xì)胞免疫兩方被認(rèn)為是必需時(shí)，現(xiàn)有的HIV用載體疫苗產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)低，難以說(shuō)是實(shí)用水平，因此期待開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫兩方的載體疫苗。另外，初免-加強(qiáng)疫苗免疫激活效果根據(jù)各種各樣的載體疫苗的組合、用哪一個(gè)進(jìn)行初免用哪一個(gè)進(jìn)行加強(qiáng)的順序、免疫原性蛋白質(zhì)的種類、表達(dá)量的調(diào)節(jié)等而不同，因此其選擇、決定，也就是疫苗設(shè)計(jì)依然是不得不經(jīng)過(guò)試驗(yàn)錯(cuò)誤而進(jìn)行的狀況。
進(jìn)一步地，除了病毒等的傳染病以外，在作為人類的主要死亡原因之一的惡性腫瘤的治療中，也正在開(kāi)發(fā)腫瘤抗原相關(guān)疫苗、所謂癌癥疫苗的利用。癌癥疫苗療法是確定在惡性腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞中特異性或者顯著表達(dá)的抗原性物質(zhì)，通過(guò)提高患者自身對(duì)該抗原性物質(zhì)的免疫力而治療惡性腫瘤的嘗試。在惡性腫瘤的情況下，由于實(shí)際上不能將惡性腫瘤直接作為活疫苗，因此期待開(kāi)發(fā)滅活疫苗、特別是能夠使腫瘤抗原在生物體內(nèi)表達(dá)的載體疫苗、尤其是針對(duì)惡性腫瘤的初免-加強(qiáng)疫苗。本發(fā)明的課題是，提供可以用于能夠激活細(xì)胞免疫和體液免疫兩方、對(duì)一般的疫苗療法存在困難的由病原微生物引起的傳染病、惡性腫瘤有效的初免-加強(qiáng)疫苗的制造的病毒載體。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人在為了制造針對(duì)病原微生物的初免-加強(qiáng)疫苗的疫苗設(shè)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體進(jìn)行初免、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體進(jìn)行加強(qiáng)，能夠激活細(xì)胞免疫和體液免疫兩方，并且通過(guò)在進(jìn)行初免時(shí)使CD40Lm與抗原蛋白質(zhì)一起表達(dá)，免疫激活效果增強(qiáng)，從而完成了下述各發(fā)明。( I)包含下述(a)和(b)的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體:·
(a)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，(b)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體。(2) (I)中記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，含有下述(C):(c)可表達(dá)地?cái)y帶編碼⑶40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。(3) (I)中記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體是可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因以及編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。(4) (I)至(3)中任一項(xiàng)記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，進(jìn)行初免用病毒載體為(a)或者(a)和(C)，并且加強(qiáng)用病毒載體為(b)。(5) (I)至(4)中任一項(xiàng)記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體,痘苗病毒載體是痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lcl6m0株，并且是B5R基因中I個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、添加、插入和/或缺失的不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒載體。(6) (I)至(5)中任一項(xiàng)記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，具有免疫原性的多肽是針對(duì)人類的病原微生物的抗原蛋白質(zhì)或其部分肽、或者人類腫瘤抗原蛋白質(zhì)或其部分肽。(7) (6)中記載的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，病原微生物是從由人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、圣路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒沙門(mén)氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風(fēng)菌、分支桿菌以及瘧原蟲(chóng)組成的組中選擇的病原微生物。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，除了病原微生物特異性的細(xì)胞因子的產(chǎn)生等細(xì)胞免疫的激活以外，還能夠進(jìn)行病原微生物特異性的抗體的產(chǎn)生等體液免疫的激活，因此能夠在初免-加強(qiáng)疫苗中使用。也就是說(shuō)，根據(jù)使用本發(fā)明的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗，能夠抑制以往不能進(jìn)行充分的感染抑制的HIV等病原微生物的感染。進(jìn)一步地，通過(guò)將本發(fā)明的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體攜帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因適當(dāng)變更為來(lái)自各種病原微生物、惡性腫瘤的基因，能夠制造對(duì)各種傳染病、惡性腫瘤的預(yù)防、治療有效的初免-加強(qiáng)疫苗。


圖1 是表不在 m8A-〈高 pro〉-env、m8A-〈低 pro〉_hCD40Lm、m8 A -〈高pro) -env-hCD40Lm以及m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm的基因組中插入的基因和啟動(dòng)子的構(gòu)成的示意圖。圖2 是表不在分別感染 m8 A -〈高 pro〉_env、m8 A -〈低 pro〉-hCD40Lm、m8 A -〈高pro) -env-hCD40Lm以及m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm的源自兔腎的細(xì)胞(RKl3細(xì)胞)中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)檢測(cè)env和hOMOLm的表達(dá)的結(jié)果的圖。圖3是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(DNA-env)初免后，各自用痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉)加強(qiáng)的小鼠(對(duì)照組)、用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env_hCD40Lm)加強(qiáng)的小鼠(A組)、以及用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-enV)加強(qiáng)的小鼠(B組)的脾臟中，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖4是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(DNA-env)初免后，通過(guò)雙叉針刺種法用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env-hCD40Lm)(小鼠A)、以及通過(guò)皮內(nèi)注射用共表達(dá)抗原 蛋白質(zhì)和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro) -env-hCD40Lm)(小鼠B)加強(qiáng)的小鼠的脾臟中，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖5是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(DNA-env)初免后、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)加強(qiáng)的小鼠(小鼠A)的血清中的抗env抗體的結(jié)合活性的測(cè)定結(jié)果的圖(左圖)，以及表示用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)進(jìn)行初免后、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(小鼠B)的血清中的抗env抗體的結(jié)合活性的測(cè)定結(jié)果的圖(右圖)。圖6是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(A組)、用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env-hCD40Lm)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(B組)、以及沒(méi)有接種任何物質(zhì)的小鼠(對(duì)照組)的脾臟中，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖7是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(A組)、以及用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和CD40Lm的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉-env-hCD40Lm)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(B組)的血清中，抗env抗體的結(jié)合活性的圖(右圖)，以及表示A組和B組的血清中，抗env抗體的中和活性的測(cè)定結(jié)果的圖(左圖)。圖8是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(DNA-env)初免后，各自用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達(dá)痘苗病毒載體(m8 A -〈低pro) -h⑶40Lm)加強(qiáng)的小鼠(A組)、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro) -env)和CD40Lm高表達(dá)痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm)加強(qiáng)的小鼠(B組)、以及用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-enV)和痘苗病毒載體(m8A-〈高pro〉)加強(qiáng)的小鼠(對(duì)照組)的脾臟中，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖9是表不用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(DNA-env)初免后，用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痕苗病毒載體(m8A-〈高pro〉-env)和CD40Lm高表達(dá)痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_hCD40Lm)加強(qiáng)的小鼠(A組)的血清中，抗env抗體的結(jié)合活性的測(cè)定結(jié)果中代表性的結(jié)果的圖。圖10是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉_env)和OMOLm低表達(dá)痘苗病毒載體(m8 A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(A組)、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉_env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(B組)、以及沒(méi)有接種任何物質(zhì)的小鼠(對(duì)照組)的脾臟中，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖11是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達(dá)痘苗病毒載體(m8A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(A組)、以及用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro) -env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(B組)的血清中，抗env抗體的結(jié)合活性(右圖)，以及A組和B組的血清中的抗env抗體的中和活性(左圖)的測(cè)定結(jié)果的圖。圖12是表示在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)和⑶40Lm低表達(dá)痘苗病毒載體(m8A-〈低pro〉_h⑶40Lm)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(A組)、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro) -env)和痘苗病毒載體(m8 A -〈高pro〉)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(B組)、用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和⑶40Lm的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro) -env-hOMOLm)初免 后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(C組)、用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體(m8 A-〈高pro〉-env)初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體(Sev-env)加強(qiáng)的小鼠(D組)、以及沒(méi)有接種任何物質(zhì)的小鼠(對(duì)照組)的脾臟中，⑶4陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)以及⑶4陽(yáng)性IL-4產(chǎn)生細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果的圖(分別為左圖和右圖)。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，是包含(a)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體以及(b)可表達(dá)地編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體。初免-加強(qiáng)疫苗是指由包含初次免疫(初免，prime, priming)中使用的疫苗與追加免疫(加強(qiáng)，boost，boosting)中使用的疫苗的兩種以上的疫苗形成的疫苗，通常，初次免疫中使用的疫苗與追加免疫中使用的疫苗是各不相同的疫苗。
本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體包含可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體。痘苗病毒載體除了其安全性以外，在對(duì)于人類誘發(fā)合適的免疫反應(yīng)這點(diǎn)上也是優(yōu)異的載體。作為在本發(fā)明中能夠使用的痘苗病毒載體，可以列舉例如LC16株、LC16m8株、LC16m0株、DIs株、MVA株等，特別優(yōu)選使用這些載體的B5R基因中I個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而不產(chǎn)生具有正常的功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒載體(上述專利文獻(xiàn)I)。通過(guò)不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物，能夠消除由于痘苗病毒的回復(fù)而產(chǎn)生的強(qiáng)毒化，即回復(fù)突變、所謂返祖等問(wèn)題。這樣的不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒載體，有B5R基因缺失的LC16株、m8 A B5R(LC16m8 A株)、m0 A B5R (LC16mOA株)、m8proB5RdTM、m0proB5RdTM等，其中特別優(yōu)選使用B5R基因缺失的LC16株、m8AB5R (LC16m8 A株)以及mOAB5R (LC16mOA株)。其中，專利文獻(xiàn)I記載了不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒載體的詳細(xì)信息。用于種痘的LC16m8株接種了約10萬(wàn)人的嬰幼兒和約3千人的成人，但沒(méi)有嚴(yán)重的副作用的報(bào)道。可是，由于LC16m8株具有遺傳不穩(wěn)定而產(chǎn)生強(qiáng)毒回復(fù)突變株的缺點(diǎn)，本發(fā)明人因此制備了不產(chǎn)生回復(fù)突變株的LC16m8 A株。LC16m8 A株與作為不能增殖的痘苗病毒株的DIs株、MVA株相比較，具有優(yōu)異的免疫誘導(dǎo)(M.Kidokoro等，Proc.Natl.Acad.Sc1.，第 102 卷，第 4152-4157 頁(yè)，2005 年；H.Suzuki 等，Vaccine，第 27 卷，第 966-971 頁(yè)，2009)，在猴子中也報(bào)道了預(yù)防高病原性的猴痘的感染(2006年日本病毒學(xué)會(huì))。根據(jù)以上情況，期待LC16m8 A株能夠誘導(dǎo)對(duì)人類安全且優(yōu)異的免疫力。這里，在本發(fā)明中，提及“ I個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、添加、插入和/或缺失”時(shí)的缺失、替換、插入和/或 添加的核苷酸的個(gè)數(shù)，只要在轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物，則沒(méi)有特殊限制，但可以列舉例如I 997個(gè)，優(yōu)選100 997個(gè)，更優(yōu)選300 997個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選500 997個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選700 997個(gè)的任意個(gè)數(shù)。本發(fā)明涉及的可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，也可以是同時(shí)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40配體非切斷型突變體(CD40Lm)的基因的痘苗病毒載體(共表達(dá)痘苗病毒載體)。其中，在專利文獻(xiàn)4中記載了⑶40Lm的功能、⑶40Lm基因的序列信息等的詳細(xì)信息。在本發(fā)明中，所謂具有免疫原性的多肽，是指在給予生物體時(shí)能夠在給予的生物體中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和/或體液免疫的免疫反應(yīng)的多肽，作為這種多肽，可以列舉例如針對(duì)人類的病原微生物的抗原蛋白質(zhì)、人類腫瘤抗原蛋白質(zhì)、或者這些蛋白質(zhì)的部分肽等。這里，在本發(fā)明中“激活”可以與“誘導(dǎo)”或者“活化”交換使用。另外，本發(fā)明中所謂多肽是指2個(gè)以上的氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的化合物，構(gòu)成的氨基酸數(shù)沒(méi)有特殊限制，包含例如由2個(gè)氨基酸形成的二肽、由3個(gè)氨基酸形成的三肽、由4個(gè)氨基酸形成的四肽、由10個(gè)左右的氨基酸形成的寡肽、由20個(gè)以上的氨基酸形成的肽、蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，作為針對(duì)人類的病原微生物，可以列舉例如人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、圣路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒沙門(mén)氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風(fēng)菌、分支桿菌以及瘧原蟲(chóng)、A組P型溶血性鏈球菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、李斯特菌、腦膜炎球菌、淋菌、病原性大腸桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、沙雷氏菌、朽1檬酸桿菌、不動(dòng)桿菌、腸桿菌、支原體、衣原體、梭狀芽孢桿菌等，作為針對(duì)人類的病原微生物的抗原蛋白質(zhì)，可以列舉例如人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白質(zhì)gpl60和gpl20 (env)、gp41、pol蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄酶、nef蛋白質(zhì)、tat蛋白質(zhì)、gag前體p55、p24蛋白質(zhì)、流感病毒的血凝素、神經(jīng)氨酸酶、M2、丙肝病毒的包膜蛋白質(zhì)El、E2、乙肝病毒的HBs抗原等。另外，作為人類腫瘤抗原蛋白質(zhì)，可以列舉例如作為黑素細(xì)胞組織特異性蛋白質(zhì)的gpl00(Bakker等,J.Exp.Med.，第179卷,第1005頁(yè)，1994年)、宮頸癌的人類乳頭瘤病毒E6 蛋白質(zhì)、E7 蛋白質(zhì)、MART-1 (Kawakami 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.，第 91 卷，第 3515 頁(yè)，1994年)、酪氨酸酶(Brichard等,J.Exp.Med.,第178卷,第489頁(yè)，1993年)等黑素小體相關(guān)抗原，HER2/neu (Fisk B.等，J.Exp.Med ，第 181 卷，第 2109 頁(yè)，1995 年)、CEA (TsangK.Y.等，J.Natl.Cancer Inst ,第 87 卷，第 982 頁(yè)，1995 年)，PSA( Correale P.等，J.Natl.Cancer Inst.,第 89 卷,第 293 頁(yè)，1997 年)等。在本發(fā)明中，可表 達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體能夠通過(guò)如下步驟制備:制備適于導(dǎo)入的連結(jié)有編碼具有免疫原性的多肽的基因的質(zhì)粒(轉(zhuǎn)移載體，transfer vector),將其導(dǎo)入感染痘苗病毒的細(xì)胞中,在該細(xì)胞中發(fā)生同源重組。另外作為其他方法，也可以通過(guò)如下步驟制備:將適于導(dǎo)入的編碼具有免疫原性的多肽的基因片段以適當(dāng)?shù)南拗泼赶?，直接連結(jié)入用同樣的酶消化的痘苗病毒基因組，將該重組痘苗病毒基因組導(dǎo)入病毒感染細(xì)胞。作為能夠在可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的制備中使用的質(zhì)粒，可以列舉例如 pSFJl-10、pSFJ2-16、pMM4、pGS20、pSCll、pMJ601、p2001、pBCBOl-3, 06、pTKgpt-Fl-3s、pTMl、pTM3、pPR34, 35、pgpt-ATA18-2、pHESl_3、pJW322、pVRl、pCA、pBHAR 等。編碼具有免疫原性的多肽的基因的導(dǎo)入?yún)^(qū)域?yàn)槎幻绮《镜纳芷诘姆潜匦杌騾^(qū)域，可以列舉例如血凝素(HA)基因、胸苷激酶(TK)基因、B5R基因(B4R基因與B6R基因之間)、F片段等區(qū)域。例如，在HA基因中導(dǎo)入有編碼具有免疫原性的多肽的基因的重組子中，HA基因被導(dǎo)入的外源基因打斷而失去功能。因此，噬斑由于不吸附雞紅細(xì)胞而呈現(xiàn)白色，從而能夠容易地篩選重組子。另外，在TK基因中導(dǎo)入有編碼具有免疫原性的多肽的基因的重組子中，TK基因的功能缺失，5-溴脫氧尿酐(BudR)沒(méi)有致死性作用，因而能夠通過(guò)BudR進(jìn)行篩選。另外，在B5R基因中導(dǎo)入有編碼具有免疫原性的多肽的基因時(shí)，重組子的噬斑變小，因而能夠通過(guò)噬斑的大小進(jìn)行篩選。這里，導(dǎo)入部分的基因優(yōu)選由于I個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而病毒的性狀變化、重組子的選擇變得容易的基因。作為可以感染痘苗病毒載體的細(xì)胞，可以使用Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、CVl細(xì)胞、COS細(xì)胞、RK13細(xì)胞、BHK細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、BSC-1細(xì)胞、HTK-143細(xì)胞、H印2細(xì)胞、MDCK細(xì)胞等痘苗病毒能感染的細(xì)胞。將編碼具有免疫原性的多肽的基因?qū)霑r(shí)，能夠在編碼具有免疫原性的多肽的基因的上游將適當(dāng)?shù)膯?dòng)子以能夠發(fā)揮功能的方式連接。這種啟動(dòng)子沒(méi)有特殊限制，例如能夠使用ATl啟動(dòng)子、PSFJl-10、PSFJ2-16、p7.5啟動(dòng)子、p7.5啟動(dòng)子的改良型啟動(dòng)子(7.5E)、PllK啟動(dòng)子、T7.10啟動(dòng)子、CPX啟動(dòng)子、HF啟動(dòng)子、H6啟動(dòng)子、T7雜合啟動(dòng)子等。
在痘苗病毒載體中導(dǎo)入編碼具有免疫原性的多肽的基因的方法，能夠按照構(gòu)建重組痘苗病毒載體的公知方法進(jìn)行，例如能夠按照“《補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，方法系列，基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法》(Supplement Experimental Medicine, The Protocol Series,Experimental Protocols for Gene Transfer&Expression Analysis)(齋藤泉等編，羊土社，1997年9月I日發(fā)行)”或者“《DNA克隆4-哺乳動(dòng)物系統(tǒng)，第2版》(D.M.Glover等編，加藤郁之進(jìn)監(jiān)譯，寶生物)”、“The EMBO Journal，第6卷，第3379-3384頁(yè)，1987年”等的記載進(jìn)行。然后，本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體包含可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體。這里，“上述免疫原性”是指本發(fā)明涉及的痘苗病毒載體可表達(dá)地?cái)y帶的多肽所具有的免疫原性。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及的仙臺(tái)病毒載體可表達(dá)地?cái)y帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因可以與本發(fā)明涉及的痘苗病毒載體攜帶的、編碼具有免疫原性的多肽的基因相同，只要具有同樣的免疫原性，也可以是不同的基因。仙臺(tái)病毒不與宿主的基因組相互作用地復(fù)制，并且沒(méi)有對(duì)人類的病原性，因此作為載體而被利用，可以認(rèn)為它是應(yīng)用于人類時(shí)安全性高的病毒。在本發(fā)明中，仙臺(tái)病毒載體可以具有與野生型同樣的復(fù)制能力，也可以是沒(méi)有復(fù)制能力的缺陷型載體。另外，本發(fā)明中涉及的仙臺(tái)病毒載體，也可以是野生型仙臺(tái)病毒的基因配置、基因組的堿基序列被改變了的載體。進(jìn)而，使用源自包膜蛋白質(zhì)、外殼蛋白質(zhì)中含有減毒突變、溫度敏感性突變的仙臺(tái)病毒突變株的仙臺(tái)病毒載體也沒(méi)有關(guān)系。在本發(fā)明中，可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體，除了能夠通過(guò)在與上述可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的制備方法相同的方法 中，按照專利文獻(xiàn)3的記載，用仙臺(tái)病毒代替痘苗病毒，作為感染病毒載體的細(xì)胞用LLC-MK2細(xì)胞、CVl細(xì)胞、BHK細(xì)胞、來(lái)自人類的細(xì)胞等仙臺(tái)病毒能夠感染的細(xì)胞進(jìn)行，從而制備以外，作為其他方法，還可以通過(guò)將適于導(dǎo)入的編碼具有免疫原性的多肽的基因片段用適當(dāng)?shù)南拗泼赶?，直接連接入添加了相同的酶識(shí)別位點(diǎn)的仙臺(tái)病毒基因組中，將該重組仙臺(tái)病毒基因組與適當(dāng)?shù)妮o助質(zhì)粒一起導(dǎo)入仙臺(tái)病毒能夠感染的細(xì)胞中而制備。另外，F(xiàn)蛋白質(zhì)缺失的仙臺(tái)病毒載體的制備能夠按照已有報(bào)道(國(guó)際公開(kāi)第2000/70055號(hào)、國(guó)際公開(kāi)第2000/70070號(hào))進(jìn)行。然后，本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體的不同形態(tài)為包含(a)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體、(b)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體以及(C)可表達(dá)地?cái)y帶編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體。在本發(fā)明中，可表達(dá)地?cái)y帶編碼⑶40Lm的基因的痘苗病毒載體能夠通過(guò)在與上述可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體的制備方法相同的方法中，將編碼具有免疫原性的多肽的基因用CD40Lm基因代替進(jìn)行而制備。這里，在本發(fā)明涉及的可表達(dá)地?cái)y帶編碼CD40Lm的基因的痘苗病毒載體中，誘導(dǎo)CD40Lm的表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)選使用P7.5啟動(dòng)子等賦予比較中等表達(dá)量的啟動(dòng)子。在本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體中，可以用任一個(gè)病毒載體進(jìn)行初免，用任一個(gè)病毒載體加強(qiáng)而使用，但優(yōu)選將(i )可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體、(ii)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40Lm的基因的痘苗病毒載體、或者(iii)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體和可表達(dá)地?cái)y帶編碼⑶40Lm的基因的痘苗病毒載體的(i)至(iii)中任一個(gè)作為初免用，將可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有上述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體作為加強(qiáng)用。這里，當(dāng)然地，只要是屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員就能夠理解:作為用本發(fā)明涉及的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體使哺乳動(dòng)物、特別是使人類免疫的方法、免疫激活方法，將上述載體作為疫苗使用的方法(包括作為疫苗的使用)，將上述載體用于醫(yī)藥的制造的方法，含有上述載體與藥學(xué)上允許的賦形劑的醫(yī)藥組合物等而表示的發(fā)明也被本說(shuō)明書(shū)的記載、特別是下述實(shí)施例的記載公開(kāi)。以下基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明涉及的包含痘苗病毒載體和仙臺(tái)病毒載體的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體進(jìn)行說(shuō)明。這里，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受通過(guò)這些實(shí)施例顯示的特征的限制。實(shí)施例<實(shí)施例1>(I)攜帶編碼人類免疫缺陷病毒包膜蛋白質(zhì)的基因的痘苗病毒載體的制備[1-1]m8 A -〈高 pro〉-env 的制備〈1-1-1〉env 基因的制備通過(guò)將編碼人類免疫缺陷病毒HIV-1JR-CSF株的包膜蛋白質(zhì)gpl60和gpl20(env)的基因(登錄號(hào)M38429 )插入p JW322的Avr 11/Xho I位點(diǎn)，得到p JW322_env。然后，為了使env高效表達(dá)，在env基因中使存在于第6751位至第6757位、第7367位至第7373位、以及第8305位至第8311位的痘苗病毒的轉(zhuǎn)錄終止序列通過(guò)體外誘變(in vitro mutagenesis)方法，發(fā)生如下所述突變，將其作為pJW322-env2。這里，通過(guò)該突變env的氨基酸序列沒(méi)有變化。第6751位至第6757位突變前:TTTTTAT (序列編號(hào)I)突變后:TTTCTAT (序列編號(hào)2)第7367位至第7373位突變前:TTTTTCT (序列編號(hào)3)突變后:TTCTTCT (序列編號(hào)4)第8305位至第8311位突變前:TTTTTCT (序列編號(hào)5)突變后:TTTCTCT (序列編號(hào)6)接著，以pJW322_env2為模板,用下述引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增并分離env基因。正向引物:5’-TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGG-3’(序列編號(hào) 7)，反向引物:5’-ATAGGCCGGCCTTATAGCA AAGCCCTTTCCAAGC-3’(序列編號(hào) 8)。將得到的PC R產(chǎn)物純化后，用限制酶Fse I和Rsr II消化?！?-1-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入將攜帶插入有ATl啟動(dòng)子、10個(gè)連續(xù)的改良型p7.5啟動(dòng)子(7.5E)以及多克隆位點(diǎn)(MCS)的基因組的痘苗病毒LC16m8 A株(m8A-〈高pro〉)(Suzuki H.等，Vaccine,第27卷，第966-971頁(yè)，2009年)，通過(guò)使用20-40%蔗糖梯度的超速離心純化。ATl啟動(dòng)子以及10個(gè)重復(fù)的7.5E為使存在于其下游的基因高效表達(dá)的啟動(dòng)子(高表達(dá)啟動(dòng)子)。接著，通過(guò)苯酹/氯仿/異戍醇法從純化的m8 A-〈高pro〉抽提基因組DNA,通過(guò)乙醇沉淀而濃縮。在該基因組DNA的Fse I/Rsr II位點(diǎn)，插入本實(shí)施例(I) [1_1]〈 1_1_1〉的env基因，得到攜帶插入有高表達(dá)啟動(dòng)子和env基因的基因組的痘苗病毒載體m8 A-〈高pro) -env的基因組?！?-1-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化在IOOmm培養(yǎng)皿中，用2.4X IO5個(gè)地鼠幼鼠腎臟細(xì)胞(BHK細(xì)胞)鋪板，過(guò)夜培養(yǎng)后,加入培養(yǎng)基以使金絲雀痘病毒的感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI) =10的量，在33°C培養(yǎng)I小時(shí)。接著，將未吸附的金絲雀痘病毒洗凈后，添加按照所附說(shuō)明書(shū)將IipofectamineLTX plus (Invitrogen 公司)與本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-2〉的 m8 A-〈高 pro〉-env 的基因組混合的混合物，過(guò)夜培養(yǎng)。隨后，將使培養(yǎng)的BHK細(xì)胞凍融而得的溶解液稀釋，加入在24孔板上培養(yǎng)的源自兔腎的細(xì)胞(RK13細(xì)胞)中，在33°C培養(yǎng)，形成單個(gè)噬斑。得到的單個(gè)噬斑再次凍融而得到溶解液后，將其稀釋，加入在24孔板上培養(yǎng)的RK13細(xì)胞中，在33°C培養(yǎng)，形成單個(gè)噬斑?；厥諉蝹€(gè)噬斑，將其作為攜帶插入有高表達(dá)啟動(dòng)子和env基因的基因組的痘苗病毒載體m8 A -〈高pro〉-env?！?-1-4〉env表達(dá)的確認(rèn):噬斑酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Plaque ELISA)將本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-3〉中回收的m8 A -〈高pro〉-env的卩遼斑用2% (w/v)多聚甲醛/PBS溶液固定后，用PBS洗滌，進(jìn)一步用5% (w/w)脫脂奶粉/PBS溶液封閉后，用PBS洗滌。接著，用人類抗env抗體作為一抗、用偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗人類IgG抗體作為二抗，按照常規(guī)方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，確認(rèn)到噬斑中env的表達(dá)?！?-1-5〉env表達(dá)的確認(rèn):蛋白質(zhì)免疫印記將本實(shí)施例(I)[1-1]〈1-1-3〉的 m8 A -(高 pro)-env 以 MOI=IO 加入 RK13 細(xì)胞中，在33°C吸附I小時(shí)。接著，將未吸附的病毒洗凈后，加入培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。接著，將約I ii g該RK13細(xì)胞用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用HIV-1感染者血清，按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記，確認(rèn)到env的表達(dá)。其結(jié)果示于圖2?！?-1-6〉痘苗病毒載體的大量培養(yǎng)將本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-3〉的m8 A-〈高pro〉-env在RK13細(xì)胞中大量培養(yǎng)后，通過(guò)使用36% (w/v)蔗糖墊層的超速離心純化濃縮，測(cè)定RK13細(xì)胞中的病毒效價(jià)。[l-2]m8 A -〈低 pro〉_hCD40Lm 的制備〈1-2-1〉質(zhì)粒的制備以插入有人類⑶40配體非切斷型突變體(h⑶40Lm)基因的pCA_h⑶40Lm3為模板，用下述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增并分離p7.5啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因。p7.5啟動(dòng)子是一般經(jīng)常使用的來(lái)自痘苗病毒的啟動(dòng)子，使存在于其下游的基因表達(dá)，但與上述高表達(dá)啟動(dòng)子相比較，是下游基因的表達(dá)量小的啟動(dòng)子。正向引物:5’-AGTGGATCCGCCAGCATGATCGAAACATACAACCAA-3’(序列編號(hào) 9)，

反向引物:5，-AGACCCGAGTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGGA-3，(序列編號(hào)10)。
將得到的PCR產(chǎn)物純化后，用限制酶Bam HI和Ava I消化，插入質(zhì)粒pVRl(ShidaH.等，EMB0.J.，第 6 卷，第 3379-3384 頁(yè)，1987 年)的血凝素(Hemagglutinin，HA)基因中的 Bam HI/Ava I 位點(diǎn)，從而得到 pVRl_hCD40Lm?！?-2-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%匯合(confluence)的BHK細(xì)胞中，加入痘苗病毒LC16m8 A株以使MOl=0.05，在33°C培養(yǎng)I小時(shí)。接著，加入按照所附說(shuō)明書(shū)將lipofectamine LTX plus (Invitrogen公司)和本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-1〉的pVRl-hCD40Lm混合的混合物，通過(guò)在33°C培養(yǎng)24小時(shí)，使痘苗病毒LC16m8 A株攜帶的基因組的血凝素(HA)基因與pVRl_hCD40Lm的p7.5啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因的插入位點(diǎn)之間發(fā)生同源重組?！?-2-3〉插入有基因的痘苗病毒的粗純化將使本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-2〉的BHK細(xì)胞凍融而得到的溶解液加入RK13細(xì)胞中，在33 °C培養(yǎng)3天形成噬斑。接著，在含有鈣離子和鎂離子的PBS (Ca2+-Mg2+-PBS)中以0.5-2.0% (w/v)的量懸浮雞紅細(xì)胞，制備紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD Test)溶液。用HAD Test溶液替換形成噬斑的RK13細(xì)胞的培養(yǎng)基，室溫下靜置I小時(shí)后，用Ca2+-Mg2+-PBS洗漆，刮取回收未見(jiàn)紅細(xì)胞的凝集的無(wú)色噬斑?！?-2-4〉插入有基因的痘苗病毒的純化對(duì)于在本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-3〉中回收的噬斑，通過(guò)進(jìn)一步進(jìn)行2次本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-3〉的操作，純化攜帶在HA基因部位插入有p7.5啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因的基因組的痘苗病毒，將其作為m8 A -〈低pro〉-hCD40Lm。〈1-2-5〉CD40Lm表達(dá)的確認(rèn):蛋白質(zhì)免疫印記對(duì)于本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-4〉的m8A-〈低pro〉_hCD40Lm，通過(guò)本實(shí)施例(I)[1-1]〈1-1-5〉中記載的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記，確認(rèn)到hCD40Lm的表達(dá)。只是用于電泳的細(xì)胞是用10 y g代替I y g，在h⑶40Lm的檢測(cè)中，代替HIV-1感染者血清，使用抗⑶40L小鼠單克隆抗體。其結(jié)果示于圖2?！?-2-6〉痘苗病毒載體的大量培養(yǎng)通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法，大量培養(yǎng)本實(shí)施例(I)〈1-2-4〉的m8 A -〈低pro〉-hOMOLm并純化濃縮,測(cè)定病毒效價(jià)。[l-3]m8 A -〈高 pro〉-env_hCD40Lm 的制備〈1-3-1〉質(zhì)粒的制備以本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-1〉的pJW322_env2為模板，用下述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增并分離env基因。`正向引物:5’ -CTAGAAITCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG-3’(序列編號(hào) 11)，反向引物:5’-CGTGAGCTCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC-3’(序列編號(hào) 12)。將得到的PCR產(chǎn)物純化后，用限制酶Eco RI和Sac I消化。另外，以本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-1〉的pVRl_hCD40Lm為模板，用下述引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增并分離p7.5啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因。
正向引物: 5’ -CTAGAGCTCGCCACCATATACTATATAGTAATACCAATA-3’(序列編號(hào) 13)，反向引物:5’-GTACCCGGGTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGG-3’(序列編號(hào) 14)。將得到的PCR產(chǎn)物純化后，用限制酶Sac I和Xma I消化。接著，將該env基因的PCR產(chǎn)物以及p7.5啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因的PCR產(chǎn)物插入PJW322 的 Eco RI/Xma I 位點(diǎn)，得到 pJW322-env_hCD40Lm。然后，以pJW322-env-hQ)40Lm為模板,用下述引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增并分離env基因、p7.5啟動(dòng)子以及h⑶40Lm基因的區(qū)域。正向引物:5’ -TTTCGGACCGCCACCATGAGAGTGAAGGGGATCAGGAAG-3’(序列編號(hào) 15)，反向引物:5，-AGAGGCCGGCCTCAGAGITTGAGTAAGCCAAAGGA-3，(序列編號(hào)16)。將得到的PCR產(chǎn)物純化后，用限制酶Fse I和Rsr II消化?！?-3-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-2〉中記載的方法，在m8A-〈高pro〉攜帶的基因組DNA的Fse I/Rsr II位點(diǎn)，插入本實(shí)施例(I) [1-3]〈1-3-1〉的env基因、ρ7.5啟動(dòng)子以及hCD40Lm基因的區(qū)域，得到攜帶插入有高表達(dá)啟動(dòng)子、env基因以及hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8 Λ -〈高pro〉-env-hCD40Lm的基因組?！?-3-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-3〉中記載的方法，純化攜帶插入有高表達(dá)啟動(dòng)子、env基因以及hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8A-〈高pro〉-env_hCD40Lm?！?-3-4〉env表達(dá)的確認(rèn):噬斑酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和蛋白質(zhì)免疫印記對(duì)于本實(shí)施例(I)[1-3]〈1-3-3〉的 ηι8Δ-〈高 pro〉-env-hOMOLm,通過(guò)本實(shí)施例
(I)[1-1]〈1-1-4〉中記載的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，在噬斑中確認(rèn)到env的表達(dá)。另夕卜，對(duì)于本實(shí)施例(I) [1-3]〈1-3-3〉的ηι8Δ-〈高pro〉-env-hOMOLm,通過(guò)本實(shí)施例(I)[1-1]〈1-1-5〉和本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-5〉中記載的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記，確認(rèn)到env和h⑶40Lm的表達(dá)。其結(jié)果示于圖2?！?-3-5〉痘苗病毒載體的大量培養(yǎng)通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法，大量培養(yǎng)本實(shí)施例(I) [1-3]〈1-3-3〉的ηι8Δ-〈高pro〉-env-hOMOLm并純化濃縮,測(cè)定病毒效價(jià)。[l-4]m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm 的制作〈1-4-1〉質(zhì)粒的制備以插入有hOMOLm基因的pCA_hO)40Lm3為模板,用下述引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增并分離hCD40Lm 基因。正向引物:5’-AAACCCGGGCATGATCGAAACATACAACCAAA-3’(序列編號(hào) 17)，反向引物:5’-CCATCTAGATCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCA-3’(序列編號(hào) 18)。將得到的PCR產(chǎn)物純化并用限制酶Xma I和Not I消化后，插入具有AT1啟動(dòng)子和
10個(gè)連續(xù) 7.5E(高表達(dá)啟動(dòng)子)的 pBHAR(Jin N-Y.等，Arch.Virol.，第 138 卷，第 315-330頁(yè)，1994 年)的 Xma I/Not I 位點(diǎn)，得到 pBHAR_hCD40Lm?！?-4-2〉基因向痘苗病毒基因組的插入
通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-2〉中記載的方法，在痘苗病毒LC16m8 Λ株攜帶的基因組中，插入本實(shí)施例(I) [1-4]〈1-4-1〉的高表達(dá)啟動(dòng)子和h⑶40Lm基因的區(qū)域。〈1-4-3〉插入有基因的痘苗病毒的純化通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-2]〈1-2-3〉和〈1_2_4〉中記載的方法，純化攜帶插入有高表達(dá)啟動(dòng)子和hCD40Lm基因的基因組的痘苗病毒載體m8 Λ -〈高pro〉_hCD40Lm?！?-4-4〉hOMOLm表達(dá)的確認(rèn):蛋白質(zhì)免疫印記對(duì)于本實(shí)施例(I) [1-4]〈1-4-3〉的m8A-〈高pro〉_hCD40Lm，通過(guò)本實(shí)施例(I)[1-2]〈1-2-5〉中記載的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記，確認(rèn)到h⑶40Lm的表達(dá)。其結(jié)果示于圖
Δι O如圖2所示，確認(rèn)到感染m8 Λ -〈高pro〉_hCD40Lm的細(xì)胞的hCD40Lm的表達(dá)量，比感染m8A-〈高pro〉-enV-hCD40Lm的細(xì)胞的hCD40Lm的表達(dá)量以及感染m8A-〈低pro) -hOMOLm的細(xì)胞的 hOMOLm的表達(dá)量大?！?-4-5〉痘苗病毒載體的大量培養(yǎng)通過(guò)本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-6〉中記載的方法,大量培養(yǎng)本實(shí)施例(I) [1-4]〈1-4-3〉的m8A-〈高pro〉_hCD40Lm并純化濃縮，測(cè)定病毒效價(jià)。以上本實(shí)施例(I)的m8 Δ -〈高 pro〉-env、m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm、m8 Δ -〈高pro〉-env-hQ)40Lm以及m8 Δ -〈高pro〉-hQ)40Lm中插入的基因和啟動(dòng)子的構(gòu)成示于圖1。(2)攜帶env的 仙臺(tái)病毒載體(SeV_env)的制作[2-1]質(zhì)粒的制備將兩端添加了 Not I識(shí)別序列的env基因插入pBluescript的Not I位點(diǎn),得到pBluescript—env。接著，由于在env基因中存在3處在仙臺(tái)病毒的基因表達(dá)中作為轉(zhuǎn)錄終止序列的A和T的連續(xù)序列，通過(guò)用下述引物進(jìn)行PCR，在該序列中導(dǎo)入突變，從而得到插入有導(dǎo)入了突變的 env 基因(env-mut 基因)的 pBluescript-env-mut。用于突變導(dǎo)入的引物突變1:正向引物:5’ -CCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAGGGGATCCAGAAATTG-3’(序列編號(hào) 19)反向引物:5’ -GAATAACACTTTAAAACAGATAGTTGAGAAGCTCCGCGAGCAGTTCA ACAACA AGACCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAG-3’(序列編號(hào) 20)突變2:正向引物:5’ -GTGAAGATCGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAG-3’(序列編號(hào) 21)反向引物:5’ -GAGACATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAGCTCTACAAGTACAAGGTCGTGAAGATCGAACCATTAGGAGTA-3 ’(序列編號(hào) 22 )突變3:正向引物:
5，-CGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGG-3’(序列編號(hào) 23)反向引物:5’-GTTTGACATAACAAAATGGCTGTGGTACATCAAGATCTTCATCATGATC GTGGGAGGCCTGATCGGTCTCCGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAG-3’(序列編號(hào) 24)[2-2]基因向仙臺(tái)病毒基因組的插入將本實(shí)施例(2) [2_1]的 pBluescript-env-mut 用 Not I 消化，切出 env_mut 基因片段，將其插入具有在仙臺(tái)病毒基因組的3’末端添加了 Not I識(shí)別序列的序列、并且不具有編碼仙臺(tái)病毒的表面蛋白質(zhì)fusion的基因(F)的質(zhì)粒pSeV/AF的Not I位點(diǎn)，從而得到 pSeV-env-mut/Δ F0[2-3]插入有基因的仙臺(tái)病毒的純化將本實(shí)施例(2 ) [2-2]的pSeV-env-mut/ Λ F與作為輔助質(zhì)粒的pCAGGS_NP、pCAGGS-P, pCAGGS-L以及pCAGGS_T7混合，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并培養(yǎng)。接著，將培養(yǎng)的293T細(xì)胞的上清加入作為F表達(dá)細(xì)胞的LLC_MK2/F/Ad細(xì)胞中并培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清。然后，將回收的培養(yǎng)上清進(jìn)行有限稀釋，用96孔板感染LLC_MK2/F/Ad細(xì)胞，克隆具有 pSeV-env-mut/ Δ F 的病毒。將克隆化的病毒作為攜帶插入有env基因的基因組的仙臺(tái)病毒載體SeV-env。這里，確認(rèn)SeV-env具有的env基因的堿基序列時(shí)，第450位的A突變?yōu)镚，在氨基酸序列中天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?。SeV-env感染LLC_MK2/F/Ad細(xì)胞而增殖。[2-4]仙臺(tái)病毒載體的大量培養(yǎng)在培養(yǎng)了 LLC-MK2/F/Ad細(xì)胞的、36個(gè)培養(yǎng)面積225cm2的培養(yǎng)瓶中加入實(shí)施例(2)[2-3]的SeV-env并培養(yǎng)24小時(shí)，更換培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)。隨后，回收培養(yǎng)上清并過(guò)濾，用超濾濾器濃縮。(3)攜帶env基因的質(zhì)粒(DNA-env)的制作[3-1]基因向質(zhì)粒中的插入以本實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-1〉的pJW322_env2為模板，用下述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增并分離env基因。正向引物:5’-CTAGAATTCGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3’(序列編號(hào) 25)，反向引物:5’-CGTGAATTCACCCATCTTATAGCAAAGCCCTT-3’(序列編號(hào) 26)。將得到的PCR產(chǎn)物純化后，用限制酶Eco RI消化后，插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒pCAGGS的Eco RI位點(diǎn)，得到攜帶env基因的pCAGGS質(zhì)粒(DNA-env)。[3-2] env表達(dá)的確認(rèn)將本實(shí)施例(3) [3-1]的DNA-env與聚乙烯亞胺(PEI, Polyscience公司)混合，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，將該細(xì)胞培養(yǎng)2天。接著，通過(guò)實(shí)施例(I) [1-1]〈1-1-5〉中記載的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記，確認(rèn)到env的表達(dá)。[3-3] DNA-env 的大量培養(yǎng)用本實(shí)施例(3) [3-1]的DNA-env轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue并大量培養(yǎng)后，用EndoFree Plasmid Purification (Qiagen 公司)純化。<實(shí)施例2>細(xì)胞免疫激活效果的確認(rèn):初免，DNA-env/加強(qiáng)，痘苗病毒載體的共表達(dá)痘苗病毒載體接種(I)初次免疫(初免)將實(shí)施例1(3) [3-3]的DNA-env溶解于PBS中使得成為I μ g/ml，制備DNA-env溶液。按照常規(guī)方法對(duì)9只C57BL/6小鼠各自肌肉注射50 yL(50y g)上述溶液(初免)后，飼養(yǎng)2周。接著，再次按照常規(guī)方法各自肌肉注射50 μ L (SOyg)DNA-env溶液(初免)后，飼養(yǎng)8周。(2)追加免疫(加強(qiáng))將實(shí)施例1 (I) [1-1]〈1-1-2〉的 m8A-〈高 pro〉、實(shí)施例1 (I) [1-1]〈1+6〉的 m8 Δ -〈高 pro〉_env 以及實(shí)施例1 (I) [1-3]〈1-3-5〉的ηι8Δ-〈高 pro〉-env_hCD40Lm，分別以I X 108PFU/mL的量溶解于PBS，制備m8 Λ -〈高pro〉溶液、m8 Λ -〈高pro〉-env溶液以及 πι8Δ-〈高 pro〉-env_hCD40Lm 溶液。接著，將本實(shí)施例(I)的小鼠分為3組，每組3只，作為對(duì)照組、A組和B組。分別按照常規(guī)方法各自皮內(nèi)注射IOOy·L (IX IO7PFU)如下溶液(加強(qiáng))，對(duì)照組的小鼠為m8A -〈高pro〉溶液，A組小鼠為m8 Δ -〈高pro)-env溶液,B組小鼠為m8 Δ -〈高pro〉_env_hOMOLm溶液，然后詞養(yǎng)2周。(3) T細(xì)胞的采集按照常規(guī)方法，從本實(shí)施例(2)的各組小鼠摘出脾臟而采集脾臟細(xì)胞。將采集的脾臟細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基后，在200 X g、室溫條件下進(jìn)行10分鐘離心分離，除去上清，添加0.8% (w/v)氯化銨水溶液而溶血，從而將紅細(xì)胞除去。將留下的脾臟細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基，通過(guò)尼龍網(wǎng)使T細(xì)胞濃縮后，按照常規(guī)方法對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。(4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色使用HlV-lConsensus Subtype B Env (15-mer) Peptides (艾滋病研究與參照試劑計(jì)劃，AIDS Research and Reference Reagent Program),根據(jù)所附說(shuō)明書(shū)刺激本實(shí)施例(3)的T細(xì)胞。接著，作為標(biāo)記抗體，使用APC標(biāo)記的抗小鼠IFN-Y (APC-1abeledant1-mouse IFN-Y , eBioscience 公司)和 PE 標(biāo)記的抗小鼠 CD8 (PE-labeled ant1-mouseCD8, eBioscience 公司)、以及 Fixation and Permeabilization Solution Kit with BDGolgiStop (日本BD公司)，根據(jù)所附說(shuō)明書(shū)將T細(xì)胞中的⑶8陽(yáng)性IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞染色。(5)使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定用FACS CantoII (日本BD公司)測(cè)定在本實(shí)施例(4)中染色的⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)。對(duì)于測(cè)定的結(jié)果，求各組的平均值，用圖形表示。其結(jié)果示于圖3。如圖3所示，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞在對(duì)照組中未檢出，另一方面，在A組中作為平均值約為1.25%、在B組中作為平均值約為1%。從這些結(jié)果可知，通過(guò)用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體加強(qiáng)，細(xì)胞免疫被激活。另外表明，使此時(shí)的痘苗病毒載體除了抗原蛋白質(zhì)以外，還共表達(dá)CD40Lm時(shí)，幾乎沒(méi)有見(jiàn)到細(xì)胞免疫激活的增強(qiáng)效果。<實(shí)施例3>細(xì)胞免疫激活效果的確認(rèn):初免:DNA-env/加強(qiáng):痘苗病毒載體的共表達(dá)痘苗病毒載體的刺種接種(I)初免與加強(qiáng)將2只C57BL/6小鼠分別作為小鼠A和小鼠B，對(duì)于這些小鼠，通過(guò)實(shí)施例2(1)和(2)中記載的方法，進(jìn)行初免和加強(qiáng)。只是在加強(qiáng)時(shí)，制備使實(shí)施例1 (1)[1_3]〈1-3-5〉的 m8 Λ -〈高 pro〉-env_hCD40Lm 在 PBS 中以成為 I X 109PFU/mL 的量溶解的 m8 Λ -〈高pro) -enV-hCD40Lm溶液，在小鼠A中，將10 μ L (IX IO7PFU)該溶液通過(guò)雙叉針刺種接種，在小鼠 B 中將實(shí)施例 2 (2)的 I X 108PFU/mL 的 m8 Λ -〈高 pro) -envhCD40Lm 溶液 100 μ L(I X IO7PFU)通過(guò)皮內(nèi)注射接種。(2) T細(xì)胞的采集、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以及使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定對(duì)于本實(shí)施例(1的小鼠A和小鼠B，通過(guò)實(shí)施例2 (3)至(5)中記載的方法進(jìn)行T細(xì)胞的采集、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以及使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。其結(jié)果示于圖4。如圖4所示，⑶8陽(yáng)性IFN- Y產(chǎn)生細(xì)胞在小鼠B中約為1.25%，與此相對(duì)，在小鼠A中約為3.25%。從該結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒進(jìn)行初免后用共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和hCD40Lm的痘苗病毒載體加強(qiáng)而激活細(xì)胞免疫的情況下，通過(guò)將加強(qiáng)的接種方法用雙叉針刺種代替皮內(nèi)注射，可增強(qiáng)細(xì)胞免疫激活效果。<實(shí)施例4>體液免疫激活效果的確認(rèn):初免:DNA-env/加強(qiáng):痘苗病毒載體與初免:痘苗病毒載體/加強(qiáng):與仙臺(tái)病毒載體的比較( 1)初免

將2只C57BL/6小鼠作為小鼠A和小鼠B。在小鼠A中通過(guò)實(shí)施例2 (I)中記載的方法接種，在小鼠B中，制備使實(shí)施例1 (I) [1-1]〈1-1-6〉的m8A-〈高pro〉_env在PBS 中以成為 1 X 109PFU/mL 的量溶解的 m8 Λ -〈高 pro〉-env 溶液，將 10 μ L (IX IO7PFU)該溶液用雙叉針刺種(初免)，然后飼養(yǎng)8周。(2)加強(qiáng)在本實(shí)施例(I)的小鼠A中，將本實(shí)施例(I)的m8 Λ -〈高pro) -env溶液10 μ L(I X IO7PFU)用雙叉針刺種(加強(qiáng))后，飼養(yǎng)2周。另一方面，在本實(shí)施例(I)的小鼠B中，將使實(shí)施例1(2) [2-4]的SeV-env在PBS中以成為4X 109CFU/mL的量溶解而得到的SeV-env溶液IOyL (4X IO7CFU)經(jīng)鼻注射(加強(qiáng))后，飼養(yǎng)2周。(3)血清的采集根據(jù)常規(guī)方法，從本實(shí)施例(2)的小鼠A和小鼠B采血，從而分離血清。(4)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[4-1] env固定平板的制備制備含有Tris-HCl (pH7.4) 10mmol/L、MgCl23mmol/L、NP400.5% (v/v)的 TMN緩沖液。在100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%匯合的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染實(shí)施例1 (3) [3_3]的DNA-env并培養(yǎng)2天。將該293T細(xì)胞在TMN緩沖液中溶解后，用于超濾，制備除去了分子量小于IOOkDa的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液。通過(guò)將其加入酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)用96孔板并溫育，得到固定有含env的抗原蛋白質(zhì)的env固定平板。[4-2]使用env固定平板的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)作為一抗，使用將本實(shí)施例(3)的血清分別稀釋100倍(1/100)、300倍(1/300)、900倍(1/900)、2700倍(1/2700)的稀釋液以及HIV-1感染者血清(陽(yáng)性對(duì)照)，作為二抗，使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗小鼠IgG抗體或者偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗人類IgG抗體，以及作為顯色試劑，使用TMB ELISA Substrate Solution (eBioscience公司)，按照常規(guī)方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光度。其結(jié)果示于圖5。如圖5左圖所示，小鼠A的吸光度在1/100、1/300、1/900以及1/2700的任一個(gè)中均為0，未確認(rèn)到抗env抗體的結(jié)合活性。與此相對(duì)，如圖5右圖所示，小鼠B的吸光度在1/100和1/300約為2.4、在1/900約為2.25、在1/2700約為1.5，由此確認(rèn)到抗env抗體
的結(jié)合活性。從這些結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體加強(qiáng)的情況下，體液免疫未被激活，與此相對(duì)，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)的情況下，體液免疫被激活。<實(shí)施例5>免疫激活效果的確認(rèn):初免:DNA-env/加強(qiáng):痘苗病毒載體的共表達(dá)載體接種( )初免將15只C57BL/6小鼠分為3組，每組各5只，分別作為對(duì)照組、A組和B組。在A組小鼠中用實(shí)施例4 (I)的m8A-〈高pro〉_env溶液、在B組小鼠中用實(shí)施例3 (I)的m8 Λ -〈高pro) -env-hCD40Lm溶液各10 μ L (IX IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)后，飼養(yǎng)8周。這里，在對(duì)照組小鼠中未接種任何物質(zhì)。(2)加強(qiáng)在本實(shí)施例(I)的A組和B組小鼠中，分別將實(shí)施例4(2)的SeV-env溶液各10 μ L(4X IO7CFU)經(jīng)鼻注射(加強(qiáng))后，飼養(yǎng)2周。(3) T細(xì)胞和血清的采集從本實(shí)施例(2)的各組小鼠采集血清，通過(guò)實(shí)施例2 (3)中記載的方法采集T細(xì)胞。(4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的T細(xì)胞，通過(guò)實(shí)施例2 (4)和(5)中記載的方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以及使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。另外，對(duì)于測(cè)定的結(jié)果，在A組和B組之間進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果示于圖6。如圖6所示，⑶8陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞在對(duì)照組中未檢出，在A組中作為平均值約為7.2%，在B組中作為平均值約為6%。另外，A組的測(cè)定值與B組的測(cè)定值之間沒(méi)有顯
著差異。從這些結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體或者共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和hCD40Lm的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)的情況下，細(xì)胞免疫被激活。另外，使此時(shí)的痘苗病毒載體為共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和CD40Lm的病毒載體時(shí)，未見(jiàn)細(xì)胞免疫激活的增強(qiáng)效果。(5)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例(3)采集的血清中，對(duì)于A組和B組的血清通過(guò)實(shí)施例4 (4)中記載的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。另外，對(duì)于得到的結(jié)果，求得各組的平均值。其結(jié)果示于圖7左圖。如圖7左圖所示，A組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.2，在1/2700約為1.4。另一方面，B組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.3，在1/2700約為1.95。因此，在A組和B組的任一個(gè)中，均確認(rèn)到抗env抗體的結(jié)合活性。另外，確認(rèn)到與A組相比較，B組的抗env抗體的結(jié)合活性大。(6)TZM_bI 實(shí)驗(yàn)對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的各組血清，按照已有報(bào)道(J.Vrol.，第79卷，第10108-10125頁(yè)，2005年)進(jìn)行TZM-bl實(shí)驗(yàn)，測(cè)定血清中含有的抗env抗體的中和活性。具體的，首先，在IOOmm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%匯合的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pCAGGS_SF162env3.3 μ g以及攜帶env基因缺失的HIV-1基因組的質(zhì)粒pSG3_ Λ Env6.6 μ g并培養(yǎng)48小時(shí)后，回收上清，從而得到含有被env的包膜覆蓋的假型病毒的假型病毒液。使該病毒液通過(guò)0.45 μ m濾器，在？80°C保存。接著，在96孔板上培養(yǎng)的TZM-bl細(xì)胞中，加入將假型病毒液5倍系列稀釋的液體，培養(yǎng)48小時(shí)后,通過(guò)用BrightGlo reagent (普洛麥格公司)測(cè)定突光素酶的發(fā)光,求得假型病毒液的TCID5tl。然后，制備在本實(shí)施例(3)中采集的血清的稀釋系列，分別加入200TCID5(i的假型病毒液，從而各制備100 μ I混合液，在37°C溫育I小時(shí)。隨后，在96孔板上培養(yǎng)至80%匯合的TZM-bl細(xì)胞中加入制備的混合液，培養(yǎng)72小時(shí)后，通過(guò)用BrightGlo reagent (普洛麥格公司)測(cè)定熒光素酶的發(fā)光，求得假型病毒對(duì)TZM-bl細(xì)胞的感染被50%阻斷的血清的稀釋倍數(shù)(ID5tlX其結(jié)果示于圖7右圖。如圖7右圖所示，ID5tl在A組平均值為300，與此相對(duì)，在B組平均值為8022，確認(rèn)到B組的抗env抗體的中和活性明顯比A組大。

從這些結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體或者共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和hCD40Lm的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)的情況下，體液免疫被激活。另外可知，使此時(shí)的痘苗病毒載體共表達(dá)抗原蛋白質(zhì)和CD40Lm時(shí)，可增強(qiáng)體液免疫的激活。<實(shí)施例6>免疫激活效果的確認(rèn):初免:DNA-env/加強(qiáng):痘苗病毒載體的病毒載體混合接種( I)初免對(duì)于9只C57BL/6小鼠，通過(guò)實(shí)施例2(1)中記載的方法進(jìn)行初免。(2)加強(qiáng)將本實(shí)施例(I)的小鼠分為3組，每組各3只，作為A組、B組以及對(duì)照組。另外，將實(shí)施例1 Cl) [1-2]〈1-2-6〉的 m8A-〈低 pro〉_hCD40Lm、實(shí)施例1 (I) [1-4]〈1-4-5〉的m8 Δ -〈高 pro〉-h OMOLm 以及實(shí)施例1 (I) [1-1]〈1-1-2〉的 ηι8Δ-〈高 pro〉，分別在 PBS中溶解以成為 I X 109PFU/mL,制備 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液、m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm溶液以及m8A-〈高pro〉溶液。在A組、B組以及對(duì)照組小鼠中，將本實(shí)施例(2)中制備的m8 Δ -〈低pro〉-hCD40Lm溶液、m8A-〈高pro〉-hCD40Lm溶液和m8A-〈高pro〉溶液、以及實(shí)施例4 (1)的1118厶-〈高pro)-env溶液按照如下組合而混合的混合物、各10 μ L (I X IO7PFU)分別用雙叉針刺種(力口強(qiáng))后，詞養(yǎng)2周。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液B 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉_hCD40Lm 溶液對(duì)照組:m8 Δ -〈高pro〉-env溶液和m8 Δ -〈高pro〉溶液
(3) T細(xì)胞和血清的采集根據(jù)常規(guī)方法從本實(shí)施例(2)的各組小鼠采集血清，通過(guò)實(shí)施例2 (3)中記載的方法采集T細(xì)胞。(4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以及使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的T細(xì)胞，通過(guò)實(shí)施例2 (4)和(5)中記載的方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色以及使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。其結(jié)果示于圖8。如圖8所示，⑶8陽(yáng)性IFN- Y產(chǎn)生細(xì)胞在A組中作為平均值約為7%、B組中作為平均值約為3.5%、對(duì)照組中作為平均值約為3.2%。從這些結(jié)果可知，在通過(guò)用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體加強(qiáng)而使細(xì)胞免疫激活的情況下，如果在加強(qiáng)中混合表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體和表達(dá)CD40Lm的痘苗病毒載體而接種，則細(xì)胞免疫的激活增強(qiáng)。進(jìn)一步可知，該細(xì)胞免疫激活的增強(qiáng)效果，在CD40Lm表達(dá)量較高時(shí)不能獲得，在CD40Lm表達(dá)量較低時(shí)能夠獲得。(5)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的血清，通過(guò)實(shí)施例4 (4)中記載的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。A組血清的結(jié)果中代表性的結(jié)果示于圖9。如圖9的代表性的結(jié)果所示，A組的吸光度在任一個(gè)稀釋倍率均為0，未確認(rèn)到抗env抗體的結(jié)合活性。另外,在B組以及對(duì)照組也未確認(rèn)到抗env抗體的結(jié)合活性(未圖示)。(6) TZM-bl 實(shí)驗(yàn) 對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的血清，通過(guò)實(shí)施例5 (6)中記載的方法進(jìn)行TZM-bl實(shí)驗(yàn)時(shí)，在A組、B組以及對(duì)照組的任一個(gè)的血清中，均未確認(rèn)到抗env抗體的中和活性(未圖示)。從這些結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)粒初免后，將表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體和表達(dá)⑶40Lm的痘苗病毒載體混合而加強(qiáng)的情況下，體液免疫未被激活。<實(shí)施例7>免疫激活效果的確認(rèn):初免:痘苗病毒載體/加強(qiáng):仙臺(tái)病毒載體的病毒載體混合接種( I)初免將15只C57BL/6小鼠分為3組，每組各5只，分別作為對(duì)照組、A組和B組。在A組和B組小鼠中，將實(shí)施例4 (1)的1118八-〈高pro〉-env溶液、實(shí)施例6 (2)的m8A-〈高pro)溶液以及實(shí)施例6 (2)的ηι8Δ-〈低pro〉_h⑶40Lm溶液按照如下組合而混合的混合物各10 μ L (IX IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)后，飼養(yǎng)8周。這里，對(duì)照組小鼠沒(méi)有接種任何物質(zhì)。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40Lm 溶液B 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉溶液(2)加強(qiáng)在本實(shí)施例(I)的A組和B組小鼠中，將實(shí)施例4 (2)的SeV-env溶液各10 μ L(4Χ IO7CFU)分別經(jīng)鼻注射(加強(qiáng))后，飼養(yǎng)2周。(3) T細(xì)胞以及血清的采集從本實(shí)施例(I)的各組小鼠采集血清，通過(guò)實(shí)施例2 (3)中記載的方法采集T細(xì)胞。(4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定對(duì)于在本實(shí)施例(3)中采集的T細(xì)胞，通過(guò)實(shí)施例2 (4)和(5)中記載的方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。另外，對(duì)于測(cè)定的結(jié)果，在A組和B組之間進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果示于圖10。如圖10所示，⑶8陽(yáng)性IFN- Y產(chǎn)生細(xì)胞在A組中作為平均值約為12%，在B組中作為平均值約為6%，另一方面，對(duì)照組中未檢出。另外，確認(rèn)到A組的測(cè)定值與B組的測(cè)定值相比明顯大。從這些結(jié)果可知，在通過(guò)用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)而使細(xì)胞免疫激活的情況下，如果在初免中將表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體和表達(dá)CD40Lm的痘苗病毒載體混合而接種，則細(xì)胞免疫的激活增強(qiáng)。(5)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例(3)采集的血清中，對(duì)于A組和B組的血清，通過(guò)實(shí)施例4 (4)中記載的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。另外，對(duì)于得到的結(jié)果，求得各組的平均值。其結(jié)果示于圖11左圖。如圖11左圖所示，A組的吸光度在1/100和1/300約為2.4，在1/900約為2.25，在1/2700約為1.6。另一方面，B組的吸光度在1/100約為2.3，在1/300約為2.1，在1/900約為1.6，在1/2700約為0.75。因此，確認(rèn)到A組比B組的抗env抗體的結(jié)合活性大。(6) TZM-bl 實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例(3)采集的血清中，對(duì)于A組和B組的血清，通過(guò)實(shí)施例5 (6)中記載的方法進(jìn)行TZM-bl實(shí)驗(yàn)。另外，對(duì)于得到的結(jié)果，求得各組的平均值。其結(jié)果示于圖11右圖。如圖11右圖所示，ID5tl在A組中作為平均值為1542.6，與此相對(duì)，在B組中作為平均值為1581.6，確認(rèn)到A組和B組的抗env抗體的中和活性大致相同。從這些結(jié)果可知，在通過(guò)用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)而使體液免疫激活的情況下，如果在初免中將表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體和表達(dá)CD40Lm的痘苗病毒載體混合而接種，則體液免疫的激活增強(qiáng)。<實(shí)施例8>免疫激活效果的確認(rèn):初免:痘苗病毒載體/加強(qiáng):仙臺(tái)病毒載體的共表達(dá)載體接種以及病毒載體混合接種( I)初免將25只C57BL/6小鼠分為5組，每組各5只，分別作為對(duì)照組、A組、B組、C組以及D組。在A組、B組、C組以及D組小鼠中，將實(shí)施例4 (1)的1118八-〈高pro〉-env溶液、實(shí)施例6 (2)的ηι8Δ-〈高pro〉溶液、實(shí)施例3 (1)的1118厶-〈高pro〉-env-hOMOLm溶液以及實(shí)施例6 (2)的m8 Δ -〈低pro〉_h⑶40Lm溶液按照如下組合混合的混合物各10 μ L(I X IO7PFU)分別用雙叉針刺種(初免)后，飼養(yǎng)8周。這里，對(duì)照組小鼠沒(méi)有接種任何物質(zhì)。A 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈低 pro〉_hCD40LmB 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液和 m8 Δ -〈高 pro〉C 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env_hCD4 0Lm 溶液D 組:m8 Δ -〈高 pro〉-env 溶液
(2)加強(qiáng)在本實(shí)施例(I) [1-1]的A組、B組、C組以及D組小鼠中，將實(shí)施例4(2)的SeV-env溶液各10 μ L (4X IO7CFU)分別經(jīng)鼻注射(加強(qiáng))后，飼養(yǎng)2周。(3) T細(xì)胞和血清的采集從本實(shí)施例(1)[1_1]的各組小鼠采集血清，通過(guò)實(shí)施例2 (3)中記載的方法采集T細(xì)胞。(4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和使用FACS對(duì)染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定將本實(shí)施例[1-3]采集的各組的T細(xì)胞各自分為2組。對(duì)于其中一組，用作為標(biāo)記抗體的 APC 標(biāo)記的抗小鼠 IFN-Y (APC-labeled ant1-mouse IFN-Y , eBioscience 公司)以及V450大鼠抗小鼠CD4 (V450Rat ant1-mouse CD4，日本BD公司)通過(guò)實(shí)施例2 (4)中記載的方法將⑶4陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞染色，對(duì)于另一組，用作為標(biāo)記抗體的PE-Cy7大鼠抗小鼠IL-4 (PE-Cy7Rat ant1-mouse IL-4，日本BD公司)以及V450大鼠抗小鼠CD4(V450Rat ant1-mouse CD4，日本BD公司)通過(guò)實(shí)施例2 (4)中記載的方法將CD4陽(yáng)性IL-4產(chǎn)生細(xì)胞染色。接著，通過(guò)實(shí)施例2 (5)中記載的方法，用FACS進(jìn)行染色細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。這里，對(duì)于⑶4陽(yáng)性IFN- Y產(chǎn)生細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果在A組和B組、以及C組和D組之間，對(duì)于⑶4陽(yáng)性IL-4產(chǎn)生細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果在各組與對(duì)照組之間，分別進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果示于圖12。如圖12左圖所示，⑶4陽(yáng)性IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)在對(duì)照組中未檢出，另一方面，檢出在A組中作為平均值約 0.2%，在B組中作為平均值約0.4%，在C組中作為平均值約0.22%，在D組中作為平均值約0.35%。另外，如圖12右圖所示，⑶4陽(yáng)性IL-4產(chǎn)生細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在A組中作為平均值約為23，在B組中作為平均值約為19，在C組中作為平均值約為29，在D組中作為平均值約為17，在對(duì)照組中作為平均值約為10。從這些結(jié)果可知，在用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的痘苗病毒載體初免后用表達(dá)抗原蛋白質(zhì)的仙臺(tái)病毒載體加強(qiáng)的情況下，如果在初免中通過(guò)混合接種或者共表達(dá)而表達(dá)CD40Lm時(shí)，與不表達(dá)⑶40Lm時(shí)相比，⑶4陽(yáng)性IFN- Y產(chǎn)生細(xì)胞減少，而⑶4陽(yáng)性IL-4產(chǎn)生細(xì)胞有所增加。
權(quán)利要求
1.初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，其包含下述(a)和(b)， (a)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體， (b)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有所述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，含有下述(C)， (C)可表達(dá)地?cái)y帶編碼⑶40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體為可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因和編碼CD40配體非切斷型突變體的基因的痘苗病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，初免用病毒載體為(a)或者(a)和(C)，并且加強(qiáng)用病毒載體為(b)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，痘苗病毒載體為痘苗病毒LC16株、LC16m8株或者Lcl6mO株，并且為在B5R基因中I個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、添加、插入和/或缺失而不產(chǎn)生具有正常功能的B5R基因產(chǎn)物的痘苗病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，具有免疫原性的多肽為針對(duì)人類的病原微生物的抗原蛋白質(zhì)或其部分肽、或者人類腫瘤抗原蛋白質(zhì)或其部分肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，病原微生物為從由人類免疫缺陷病毒、流感病毒、人類肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒、黃病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、腮腺炎病毒、黃熱病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、圣路易斯型腦炎病毒、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒沙門(mén)氏菌、百日咳菌、腦膜炎菌、破傷風(fēng)菌、分支桿菌以及瘧原蟲(chóng)組成的組中選擇的病原微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種病毒載體，所述病毒載體能夠使細(xì)胞免疫和體液免疫兩方激活，能夠用于對(duì)通常難以使用疫苗療法的由病原微生物引起的傳染病、惡性腫瘤有效的初免-加強(qiáng)疫苗的制造。所述病毒載體為包含下述(a)和(b)的初免-加強(qiáng)疫苗用病毒載體，(a)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有免疫原性的多肽的基因的痘苗病毒載體，(b)可表達(dá)地?cái)y帶編碼具有所述免疫原性的多肽的基因的仙臺(tái)病毒載體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK103189506SQ20118005084
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者志田壽利, 祖父江友好, 加藤和則, 井上誠(chéng), 長(zhǎng)谷川護(hù) 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人北海道大學(xué), 北海道公立大學(xué)法人札幌醫(yī)科大學(xué), 生物載體株式會(huì)社