專利名稱：低密度脂蛋白中或極低密度脂蛋白中的膽甾醇的定量法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在臨床診斷領域中在脂質代謝方面具有重要意義的低密度脂蛋白(LDL)或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇(以下稱為LDL膽甾醇和VLDL膽甾醇)的定量法。
LDL具有向末稍細胞供應膽甾醇的作用，是引起以冠狀動脈硬化癥為首的各種動脈硬化癥的直接因素，LDL在血中的含量已知可作為動脈硬化性疾病的指標。另外，富含甘油三酸酯(TG)的VLDL也與動脈硬化有關，這一點正引起人們注意。作為現有的LDL膽甾醇的定量法，有超離心法、電泳法、換算法等，而作為VLDL膽甾醇的定量法，有超離心法、電泳法等。超離心法可作為基本的定量法使用，它是使用一種分離用超離心機，根據比重的差別來分離LDL或VLDL，進而測定其中膽甾醇的含量(Adr.Lipid Res.，第6卷，第1頁，1968年)。然而該方法在定量性、簡便性、經濟性等方面存在缺點。在使用電泳法的情況下，以乙酸纖維素膜或瓊脂膠等作為支持體進行分離，通過酶反應來定量膽甾醇(臨床檢查，第29卷，1344頁，1985年)。該方法在簡便性、經濟性等方面存在問題。在換算法的情況下是根據以下的計算式來算出LDL膽甾醇含量(Clin.Chem.，第18卷，499頁，1972年)。
(LDL膽甾醇量)＝(總膽甾醇量)－(HDL膽甾醇量)－(甘油三酸酯)/5然而，該方法由于受到血清中的TG含量和高脂血癥的類型等的限制，因此在簡便性、正確性、多個試樣處理等方面存在問題。如上所述，現有的LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法不適合于進行多個試樣處理、迅速測定以及在臨床檢查領域中廣泛地使用的自動分析裝置中使用。而且，按照現有的定量法容易產生諸如用定量移液管量取分離出來的LDL時那樣的人為誤差。然而，即使不將血清試樣分離成LDL或VLDL而是將其直接地添加到一種含有膽甾醇酯酶和膽甾醇氧化酶的試劑中，與用于定量總膽甾醇的體系也沒有差別，不能特異地定量LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇。
本發(fā)明者們發(fā)現，使用存在糖化合物和/或蛋白增溶劑的膽甾醇測定試劑體系，對以超離心法分離出的高密度脂蛋白(HDL)、LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)的各種脂蛋白進行測定時，由于糖化合物和/或蛋白增溶劑的組合，可使得與各種脂蛋白的反應性產生差異，其結果是使HDL中的膽甾醇、LDL膽甾醇、VLDL膽甾醇、CM中的膽甾醇的反應性產生差異，至此便完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測定試樣中的LDL膽甾醇量或VLDL膽甾醇量。在進行上述測定時，為了進一步提高其特異性，還可以同時添加二價的金屬原子鹽。
另外，根據本發(fā)明，提供了一種以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分的用于LDL或VLDL中膽甾醇的定量試劑，或者由糖化合物與蛋白增溶劑組合而成的用于LDL或VLDL中膽甾醇的定量試劑。
作為糖化合物，優(yōu)選使用葡萄糖衍生物，作為葡萄糖衍生物，例如可以舉出通式(I)和通式(II)表示的化合物，其中，通式(I)為 〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氫原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷?；O3M2(式中，M2表示氫原子或金屬原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麥芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氫原子、金屬原子或SO3M3(式中，M3表示氫原子或金屬原子)；m表示6-8〕通式(II)為 〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氫或SO3M4(式中，M4表示氫原子或金屬原子)；R9表示氫原子、OM5(式中，M5表示氫原子或金屬原子)或OSO3M6(式中，M6表示氫原子或金屬原子)；R10表示氫原子、金屬原子或SO3M7(式中，M7表示氫原子或金屬原子)；n表示4-8000的整數〕。
作為蛋白增溶劑，優(yōu)選使用由通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，通式(III)為R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12(III)〔式中，a和b表示0-200的整數；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或鏈烯基；X表示單鍵或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整數；R21表示烷基或鍵烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氫原子、金屬原子、烷基或鏈烯基)但是a和b不能同時為0，不過兩種成分可以任意的比例存在〕通式(IV)為 (式中，R13、R14、R15、R16、R17和R18相同或不同，表示烷?；?通式V為R19-Y-SO3M1(V)〔式中，R19表示烷基、鏈烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示單鍵、 -O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或鏈烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整數)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整數)、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或鏈烯基)或者它們的混合物；M1表示氫或金屬原子〕。
以下對通式(I)-通式(V)表示的化合物分別稱為化合物(I)-化合物(V)。
在通式(I)-通式(V)中的各基團的定義中，作為烷基和烷?；耐榛糠质侵辨溁蛑ф湢詈?-22個碳原子的烷基，例如可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、癸基、十五烷基、二十烷基、二十二烷基等；作為鏈烯基，指直鏈或支鏈含碳原子2-22的鏈烯基，例如可以舉出乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、癸烯基、十五碳烯基、二十碳烯基、二十二碳烯基等。所說芳基表示苯基或萘基；作為金屬原子，可以舉出鋰、鈉、鉀等。
作為取代烷基和取代烷?；娜〈?，例如可以舉出羥基、羧基、磺基等。作為取代芳基的取代基，例如可以舉出烷基等，所說烷基表示與上述烷基具有同樣的定義。
作為糖化合物，優(yōu)選使用化合物(I)或化合物(II)中的環(huán)糊精衍生物，特別優(yōu)選甲基化的環(huán)糊精。例如可以舉出α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、二甲基-β-環(huán)糊精、三甲基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-α-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、糖基-β-環(huán)糊精、麥芽糖基-α-環(huán)糊精、麥芽糖基-β-環(huán)糊精、部分(パ-シヤリ)-甲基-β-環(huán)糊精、α-環(huán)糊精硫酸酯、β-環(huán)糊精硫酸酯等。
作為蛋白增溶劑，優(yōu)選使用化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)等表面活性劑，特別優(yōu)選非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑。作為非離子型表面活性劑，例如可以舉出聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯十八碳烯基醚、聚氧乙烯二十二烷基醚、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯單油酸酯、聚氧乙烯月桂酰胺、聚氧乙烯硬脂酰胺、蔗糖脂肪酸酯等；作為陰離子型表面活性劑，例如可以舉出十十烷基苯磺酸鈉、正十二烷基苯磺酸鈉、月桂基硫酸鈉、高級醇硫酸酯鈉等。
作為二價金屬原子鹽，可以舉出0.01-20mM的鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽、鈷鹽等，優(yōu)選使用0.01-20mM的鎂鹽。
本發(fā)明的特征在于使糖化合物和/或蛋白增溶劑與膽甾醇測定試劑體系共存，而膽甾醇測定試劑體系本身可根據下述的反應原理，按照一般方法配制。其中，作為色素源和測定波長沒有限定。
色素＋5H2O(λmax＝555nm)EMSEN-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺
NAD(P)H＋H+(λmax＝340nm)例如，作為色素源，一般使用4-氨基安替比林與苯酚、4-氯苯酚、間甲酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等苯酚類的組合，除此之外，還可以使用4-氨基安替比林與已知可作為Trinder’s試劑(同仁化學研究所第19版總合目錄，1994年)使用的下列化合物組合使用，所說化合物有N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基間甲苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基間甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基茉胺、N-乙基-N-磺丙基間甲苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺等苯胺類或者N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙?；叶返?。另外，作為高靈敏度的色素源，也可以使用特公昭60-33479中所示的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、在特公開4-27839中所示的雙〔3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特開昭62-296中所示的色素源等，另外，4-氨基安替比林或者上述的Trinder’s試劑也可以組合使用。作為色素源的濃度，優(yōu)選為0.01-10mg/ml，這要受溶解度關系的限制。
作為膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶，可以舉出通常市售的，由一些對膽甾醇酯具有水解能力的微生物或動物得來的膽甾醇酯酶或脂蛋白脂肪酶、由一些能將膽甾醇氧化而生成過氧化氫的微生物得來的膽甾醇氧化酶、由微生物或動物得來的膽甾醇脫氫酶等，但是，為了進一步提高這些酶的特異性和穩(wěn)定性，可以使用通過以聚乙二醇為主成分的基團、水溶性的低聚糖殘基、磺丙基等對上述的酶進行化學修飾而獲得的酶。另外，按照基因工程的操作從這些酶中提取基因并將其導入別的微生物中而產生的酶或對這些酶進行化學修飾而獲得的修飾體，或者將這些基因改變而產生的酶，或對這些酶進行化學修飾而獲得的修飾體等也適合使用。
作為用于修飾所說酶的試劑(化學修飾劑)，例如可以舉出在聚乙二醇上鍵合一種能夠與氨基鍵合的基團而生成的化合物{例如在聚乙二醇上鍵合一種能夠與N-羥基琥珀酰亞氨基等氨基鍵合的基團而生成的Sunbright VFM 4101〔日本油脂(株)制〕等}、具有聚乙二醇結構和酸酐結構的Sunbright AKM系列、同樣的ADM系列、同樣的ACM系列〔每一種皆為日本油脂(株)制化學工學論文集，第20卷，第3號，459頁，1994年〕、在聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物上鍵合一種能夠與氨基鍵合的基團而生成的化合物、聚乙二醇單甲基丙烯基單甲醚與馬來酸酐的共聚物等。另外，作為聚氨酯化學修飾劑的聚氨酯P4000activated.(ベ-リニガ-マンハイム社制Enzyme modification set能書)、作為葡聚糖化學修飾劑的葡聚糖T40，TCT-activated(同)、1，3-丙烷磺內酯等也可以使用。
下面例示出使上述化學修飾劑與酶反應的方法，但本發(fā)明不受這些例子的制約。首先，將所說的酶溶解于pH8以上的磷酸緩沖液等緩沖液中，在0-50℃下添加例如0.01-500倍摩爾量的Sunbright，攪拌5分鐘-24小時。可以將該反應液直接使用或者根據需要通過限外過濾膜除去低分子物質后使用。膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶和膽甾醇脫氫酶的用量優(yōu)選為0.1-100μ/ml。
本發(fā)明的方法可以適用于血液、尿等含有LDL或VLDL的體液。
下面舉例說明本發(fā)明的定量法。
方法1在實施本發(fā)明時，首先配制糖化合物溶液和/或蛋白增溶劑溶液。糖化合物溶液的配制是將糖化合物溶解于適當的緩沖液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應時的濃度例如為100mM以下，優(yōu)選為3-80mM。可以預先使糖化合物共存于膽甾醇測定試劑中。蛋白增溶劑溶液的配制是將蛋白增溶劑溶解于適當的緩沖液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其與膽甾醇測定試劑共存，使其在反應時的濃度例如在50g/l以下，優(yōu)選在0.1-20g/l以下。所說試劑由與糖化合物溶液和/或膽甾醇測定試劑共存的蛋白增溶劑溶液來調制(在不使用蛋白增溶劑溶液的情況下，使糖化合物預先共存于膽甾醇測定試劑中)，在20-50℃，優(yōu)選在30-40℃保溫約5分鐘。然后將試樣直接地加入，或者根據需要用水或食鹽水稀釋后再加入上述的試劑中，使其反應5-30分鐘。反應結束后，以340-900nm，例如，在單波長的情況下，以555nm；在雙波長的情況下，以主波長600nm，副波長700nm來測定該反應液的吸光度，據此算出膽甾醇含量(在雙波長的情況下，由按該兩波長所獲吸光度的差值算出)。
使用按超離心法由血清分離出的HDL、LDL、VLDL和CM的各部分為樣品，用上述試劑測定其中的膽甾醇含量。其結果，通過糖化合物與蛋白增溶劑的組合，使得HDL膽甾醇、LDL膽甾醇、VLDL膽甾醇、CM膽甾醇的反應性發(fā)生差異，由此可以確認，通過糖化合物與蛋白增溶劑的組合，可使其與各種脂蛋白的反應性產生差異。
當使糖化合物50mM與蛋白增溶劑聚氧乙烯單月桂酸酯5g/l組合并共存于膽甾醇測定試劑(未修飾)中時，各種脂蛋白反應性的差異示于表1中。
表1
-、+、++、+++分別表示反應性強度，其順序為-＜+＜++＜+++。
當使糖化合物三甲基-β-環(huán)糊精5mM與蛋白增溶劑5g/l組合并共存于膽甾醇測定試劑(未修飾)中時，各種脂蛋白反應性的差異示于表2中。
表2
-、+、++、+++分別表示反應強度，其順序為-＜+＜++＜+++。
方法2糖化合物溶液的配制是將糖化合物溶解于適當的緩沖液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應時的濃度例如在100mM以下，優(yōu)選為3-80mM。蛋白增溶劑溶液的配制是將蛋白增溶劑溶解于適當的緩沖液中，例如溶解于50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中，使其在反應時的濃度例如在50g/l以下，優(yōu)選為0.1-20g/l。將試樣直接地加入，或者根據需要用水或生理食鹽水稀釋后的試樣加入預先加熱至20-50℃，優(yōu)選30-40℃，例如37℃的糖化合物溶液和/或蛋白增溶劑溶液中，例如在37℃下加熱5分鐘，5分鐘后測定所獲得溶液在555nm處的吸光度(E1)。然后添加入預先加熱至20-50℃，優(yōu)選30-40℃，例如37℃的膽甾醇測定試劑，攪拌，5分鐘后在相同波長處測這吸光度〔E2(濃度補正后的值)〕。使用含有已知濃度膽甾醇的標準液進行同樣的操作，根據對(E2-E1)值的比較算出膽甾醇的含量。
下面根據實施例說明本發(fā)明的方案。
用于實施本發(fā)明的最佳方案實施例1用于直接定量LDL膽甾醇的本方法與瓊脂糖電泳法(臨床檢查，第29卷，1344頁，1985年)的比較。
本方法的試劑組成第一試劑三甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM第二試劑膽甾醇酯酶(未修飾) 1.0U/ml
膽甾醇氧化酶(未修飾) 5.0U/ml過氧化物酶25U/ml4-氯基安替比林2.2mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM按照本方法，首先將血清樣品50μl添加到預先加熱至37℃的第一試劑2.25ml中，在37℃下加熱5分鐘，5分鐘后測定所獲溶液在555nm處的吸光度(E1)。然后加入預先加熱至37℃的第二試劑0.75ml，5分鐘后測定在相同波長處的吸光度〔E2(濃度補正后的值)〕。使用一種膽甾醇濃度為200mg/dl的標準液進行同樣的操作，通過比較(E2-E1)的數值算出LDL膽甾醇的含量。
按照瓊脂糖電泳法，對電泳后在支持體上的脂蛋白部分進行膽甾醇的酶染色，用光密度計(クリニスキヤン株式會社研究所)定量測定LDL膽甾醇的含量。
所獲結果示于表3中。
表3
如表3所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結果與按電泳法獲得的結果具有良好的相關性。
實施例2
除了將第一試劑中所用的糖化合物與蛋白增溶劑組合改變之外，其余按與實施例1的本發(fā)明方法同樣的步驟進行，對血清樣品的20個試樣進行測定，獲得了與瓊脂糖電泳法相關的相關系數。
第一試劑的組成A.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMB.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMC.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯單月桂酸酯 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMD.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mM按照本方法，使用日立7070自動分析裝置分別進行測定。測定條件如下所示。
樣品量 4μl第一試劑300μl第二試劑100μl測定波長 主波長600nm；副波長700nm所獲結果示于表4中。表4
如表4所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結果與按電泳法獲得的結果有良好的相關性。
實施例3除了向實施例2的B和D中添加金屬原子鹽之外，其余按照與實施例2同樣的步驟進行，對血清樣品的20個試樣進行測定，獲得了與瓊脂糖電泳法相關的相關系數。
第一試劑的組成E.三甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lMgCl2·6H2O6mg/mlEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0)30mMF.二甲基-β-環(huán)糊精 5mM十二烷基苯磺酸鈉 5g/lMgCl2·6H2O6mg/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(PH7.0)30mM結果示于表5中。
表5
如表5所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結果與按電泳法所獲結果具有良好的相關性。
實施例4對用于直接定量VLDL膽甾醇的本方法與瓊脂糖電泳法(臨床檢查，第29卷，1344頁，1985年)，通過進行與實施例1同樣的操作來作比較。
本方法的試劑組成第一試劑2-羥丙基-β-環(huán)糊精 5mM聚氧乙烯十二烷基醚 5g/lEMSE 1.1mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM第二試劑修飾的膽甾醇酯酶 1.0U/ml修飾的膽甾醇氧化酶 5.0U/ml過氧化物酶 25U/ml4-氨基安替比林 2.2mMTris緩沖液(pH7.0) 30mM應說明，所說修飾的膽甾醇酯酶和修飾的膽甾醇氧化酶的制備是將膽甾醇酯酶或膽甾醇氧化酶溶解于20mM的磷酸緩沖液(pH8)中(10mg/ml)，在5℃下冷卻后，向其中加20倍摩爾量的Sunbright4001(日本油脂)，使其溶解，在5℃下反應4小時，用聚乙二醇進行修飾，所獲反應液即可直接使用(聚乙二醇部分的分子量6000)。
結果示于表6中。
表6
如表6所示，顯示出按本發(fā)明方法獲得的結果與按電泳法獲得的結果具有良好的相關性。
產業(yè)上利用的可能性按照本發(fā)明，可以提供一種不需要煩雜的分級分離操作的簡便而且適用于自動分析裝置的LDL膽甾醇或VLDL膽甾醇的定量法。
權利要求
1.低密度脂蛋白(LDL)或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測定試樣中的LDL或VLDL中的膽甾醇含量。
2.LDL中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測定試樣中的LDL中的膽甾醇含量。
3.VLDL中的膽甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測定試樣中的VLDL中的膽甾醇含量。
4.如權利要求1-3所述的定量法，其中所說的糖化合物是葡萄糖衍生物。
5.如權利要求4所述的定量法，其中所說的糖化合物是由下列通式(I)或通式(II)表示的化合物，所說通式(I)為 〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氫原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷酰基、SO3M2(式中，M2表示氫原子或金屬原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麥芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氫原子、金屬原子或SO3M3(式中，M3表示氫原子或金屬原子)；m表示6-8〕〔以下稱為化合物(I)，對于其他通式編號的化合物同樣類推〕；所說通式(II)為 〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氫或SO3M4(式中，M4表示氫原子或金屬原子)；R9表示氫原子、OM5(式中，M5表示氫原子或金屬原子)或OSO3M6(式中，M6表示氫原子或金屬原子)；R10表示氫原子、金屬原子或SO3M7(式中，M7表示氫原子或金屬原子)；n表示4-8000的整數〕。
6.如權利要求5所述的定量法，其中所說的糖化合物是環(huán)糊精衍生物。
7.如權利要求1-6所述的定量法，其中所說的蛋白增溶劑為通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，通式(III)為R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12(III)〔式中，a和b表0-200的整數；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或鏈烯基；X表示單鍵或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整數；R21表示烷基或鍵烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氫原子、金屬原子、烷基或鏈烯基)但是a和b不能同時為0，不過兩種成分可以任意的比例存在〕通式(IV)為 (式中，R13、R14、R15、R16和R18相同或不同，表示烷?；?通式V為R19-Y-SO3M1(V)〔式中，R19表示烷基、鏈烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示單鍵、 -O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或鏈烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整數)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整數)、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或鏈烯基)或者它們的混合物；M1表示氫原子或金屬原子〕。
8.如權利要求7所述的定量法，其中所說的蛋白增溶劑為非離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑。
9.如權利要求1-8中任一項所述的定量法，其中，在測定膽甾醇含量時存在二價金屬原子鹽。
10.如權利要求1-9中任一項所述的定量法，其中，使膽甾醇酯水解酶和膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶在試樣中發(fā)生反應，通過定量分析由于這種反應而生成的過氧化氫或還原型輔酶來測定膽甾醇的含量，在該測定方法中所用的膽甾醇酯水解酶、膽甾醇氧化酶或膽甾醇脫氫酶是經化學修飾或未修飾的膽甾醇酯酶、經化學修飾或未修飾的膽甾醇氧化酶或經化學修飾或未修飾的膽甾醇脫氫酶。
11.一種用于LDL或VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
12.一種用于LDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
13.一種用于VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑以糖化合物和/或蛋白增溶劑作為成分。
14.一種用于LDL或VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
15.一種用于LDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
16.一種用于VLDL中的膽甾醇的定量試劑，該試劑由糖化合物與蛋白增溶劑組成。
17.如權利要求11-16中任一項所述的定量試劑，其中所說的糖化合物是葡萄糖衍生物。
18.如權利要求17所述的定量試劑，其中所說的糖化合物是化合物(I)或化合物(II)。
19.如權利要求18所述的定量試劑，其中所說的糖化合物是環(huán)糊精衍生物。
20.如權利要求11-19中任一項所述的定量試劑，其中所說的蛋白增溶劑是化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)。
21.如權利要求20所述的定量試劑，其中所說的蛋白增溶劑是非離子型表面活性劑或陰離子型表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及低密度脂蛋白(LDL)中的膽甾醇或極低密度脂蛋白(VLDL)中的膽甾醇的定量法，其特征在于在糖化合物和/或蛋白增溶劑的存在下測定試樣中LDL中的膽甾醇含量或VLDL中的膽甾醇含量。
文檔編號C12Q1/32GK1148891SQ96190206
公開日1997年4月30日 申請日期1996年3月15日 優(yōu)先權日1995年3月20日
發(fā)明者柏原典彥, 多多納俊雄, 首藤榮子, 杉內博幸, 入江徹美, 上釜兼人 申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社