專利名稱：分泌產(chǎn)生蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種產(chǎn)生蛋白質的方法，更具體地說，本發(fā)明涉及到一種用大腸桿菌轉化菌株分泌產(chǎn)生蛋白質的方法，所述大腸桿菌能在其周質中有效地分泌和積累所述蛋白質。
近年來，重組DNA技術已能用微生物為宿主產(chǎn)生有用的蛋白質。這一技術主要的例子包括胞內(nèi)產(chǎn)生方法和分泌產(chǎn)生方法。
已知胞內(nèi)產(chǎn)生方法是一種以高產(chǎn)率在胞質中產(chǎn)生和積累所需蛋白質的方法。然而，在胞質中產(chǎn)生和積累的蛋白質是非天然型的，其中蛋氨酸添加到天然型氨基酸序列的N-末端，并且，大量產(chǎn)生的重組蛋白質通常變?yōu)榉Q作包含體的不溶形式，以致在提取操作后易于形成與真正的結構不同的不正確的高級結構。因此，在胞內(nèi)產(chǎn)生方法中，需要一個將具有高級結構的蛋白質轉化成其真正結構的重折疊步驟，這意味著在制造過程中必須加上這一復雜的步驟。
另一方面，在以上提到的分泌產(chǎn)生方法中，所需重組蛋白質以一種融合蛋白質形式(一種前體，其中一種分泌信號肽加到N-末端上)被表達。因為這一分泌信號肽在透過細胞膜的轉移期間被酶促缺失，所以，可以分泌出真正的蛋白質。結果是分泌出天然型蛋白質。在分泌產(chǎn)生方法的情況下，產(chǎn)生的蛋白質可以具有真正的一級和高級結構。因此，這一方法比胞內(nèi)產(chǎn)生方法更好。然而，在分泌產(chǎn)生方法中，額外地需要一個透過細胞膜的轉移步驟和一個前體加工步驟，這樣，其產(chǎn)率通常是低的。特別是，已知在用無核生物產(chǎn)生和必泌源于哺乳動物的蛋白質時，其產(chǎn)率較用其產(chǎn)生和分泌源于原核生物的蛋白質的產(chǎn)率低得多。因此，人們期望有一種更好的分泌產(chǎn)生方法。
現(xiàn)在，已報道了與微生物蛋白質分泌有關的各種因子，并已進行了使用這些報道的因子改進分泌產(chǎn)率的幾種研究。其中之一是分泌信號肽的研究。已知分泌信號肽在分泌步驟的早期階段起重要作用[J.Biol.Chem.，Vol.263.p.8164-8169(1990)]就從宿主微生物分泌蛋白質來說，在胞質中合成的融合蛋白質必需被轉移透過細胞膜并被正確地加工已形成真正的結構。USP4,680,260已公開了一種用于分泌一種堿性磷酸酶或一種腸毒素分泌信號肽可作為分泌分子量約為22,000的人生長激素(此后將人生長激素稱為＂hGH＂，將具有所述分子量的人生長激素稱為＂22KhGH＂)的優(yōu)選的分泌信號肽。此外，該專利同時報道，使用得自原核生物的分泌信號肽試驗了幾種真核生物蛋白質的分泌，但在一些實施例中，不合成任何蛋白質，在另一些實施例中，即使蛋白質在胞質中表達，它也不能分泌。這一事實表明，對每一種待分泌的蛋白質來說，需要選擇一種合適的分泌信號肽。迄今還沒有發(fā)現(xiàn)一種能用于每一種蛋白質分泌的全能分泌信號肽。而且，關于分泌信號肽的序列，最近已闡明在N-端正電荷區(qū)的正電荷和中心疏水區(qū)的疏水性是重要的[J.Biol.Chem.，Vol.267.p.4882-4888(1992)]。已知一些基于這一認識的成功的例子。例如，Udaka等已報道，在使用短芽孢桿菌為宿主的分泌產(chǎn)生中，將兩個堿性氨基酸(Arg)和三個疏水氨基酸Leu加入到短芽孢桿菌MWP(中間壁蛋白質)分泌信號肽的堿性疏水區(qū)引起hGH的有效表達。在這種情況下，累積的hGH達到200mg/L(專利申請WO 94/9474)。然而，對于這種分泌信號肽的修飾，不存在任何一般性的指導原則，仍需一個接一個地反復試驗來發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的序列。此外，該分泌信號肽對將前體融合蛋白質轉運到胞質膜起作用，但它不直接涉及下一個步驟，在該步驟中，前體蛋白質被轉運穿過胞質膜以從胞質轉移到周質或培養(yǎng)基中。因此，分泌信號肽的修飾對改進前體蛋白質向膜的轉移(定位)是有效的，但是，它對待分泌蛋白質從胞質通過胞質膜到達周質或培養(yǎng)基的接下來的步驟幾乎是無效的，即，在膜通過步驟是速度控制步驟的情況下，改進分泌信號肽的效能是有限的?？偟膩碚f，為改進分泌效力起見而進行的分泌信號肽的修飾對前體蛋白質向胞質膜的轉移是重要的，這一點是公知的。然而，在接下來的膜通過步驟中存在麻煩的情況下，這種修飾沒有任何改進的效果。
這樣，在蛋白質的分泌產(chǎn)生中，低的分泌效力的原因存在于分泌蛋白質(待從胞質轉移到周質或培養(yǎng)基中)通過胞質膜的步驟中的情況下，也需要一種改進的技術，而不是修飾分泌信號肽?，F(xiàn)在，已報道涉及大腸桿菌蛋白質分泌的幾種蛋白質因子(SecA、SecB、SecD、SecE、secF、SecY、SecG等)，并已在體外測試了各個因子對分泌的作用。然而，幾乎沒有有關其體內(nèi)應用的報道。僅有的一個例子是，最近報道了通過增強大腸桿菌SecY/E基因的表達可以改進白細胞介素6(IL-6)的分泌產(chǎn)生[Bio/Technology，Vol.12，p.178-180(1994)]。使用涉及分泌的蛋白質因子的研究迄今還沒有投入實際應用。為了有效地產(chǎn)生和分泌不同種類的蛋白質(特別是得自哺乳動物的蛋白質)，可以考慮待研究的各種課題，但具體地就較少分泌蛋白質來說，不存在任何改善其分泌產(chǎn)率的普通技術，因此，仍然需要許多試驗，且對這些試驗的結果會是成功的無任何保證。
本發(fā)明發(fā)明人試驗了哺乳動物蛋白質在大腸桿菌中的分泌。在這種情況下，22KhGH能相對較好地被分泌，但就分子量約為20,000的人生長激素(此后稱為＂20KhGH＂)來說，其分泌產(chǎn)率卻非常低。由此，為了改進20KhGH的分泌產(chǎn)率，采用上述公知方法(分泌信號肽氨基酸序列的修飾和蛋白質分泌基因的表達)進行了各種研究。然而，在任何研究中，未能發(fā)現(xiàn)有效的分泌產(chǎn)生方法。
本發(fā)明的目的是提供一種有效的分泌產(chǎn)生方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將一種重組蛋白質(特別是得自哺乳動物的蛋白質)分泌到微生物周質中，所述蛋白質用現(xiàn)有技術的方法在微生物中難以產(chǎn)生和分泌。
為了發(fā)現(xiàn)非常新的分泌促進因子(它背離了上述公知的觀念)這一目的，本發(fā)明發(fā)明人進行了廣泛的研究，結果發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽還原酶(此后簡稱為＂GR＂)可以在大腸桿菌中與靶重組蛋白質同時表達，即共表達，從而分泌到周質中的蛋白質的量可以顯著改善。基于這一新的認識，相應地完成了本發(fā)明。
(1)本發(fā)明的第一方面針對一種分泌產(chǎn)生重組蛋白質的方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將重組蛋白質分泌到宿主大腸桿菌周質中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時表達谷胱甘肽還原酶與靶重組蛋白質。
(2)本發(fā)明的第二方面針對一種分泌產(chǎn)生分子量約為20,000的人生長激素的方法，所說的分泌產(chǎn)生包括將分子量約為20,000的人生長激素分泌到宿主大腸桿菌周質中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時表達谷胱甘肽還原酶與所述人生長激素。
(3)本發(fā)明的第三方面針對一種能將重組蛋白質分泌到周質中的重組大腸桿菌，所述的重組大腸桿菌能夠人工同時表達谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質。
(4)本發(fā)明的第四方面針對一種能將分子量約為20,000的人生長激素分泌到周質中的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌能夠人工同時表達谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長激素。
按照本發(fā)明的方法，過去在微生物中難以產(chǎn)生和分泌的重組蛋白質(特別是得自哺乳動物的蛋白質)可被分泌到微生物周質中，從而能有效地產(chǎn)生該重組蛋白質。
而且，按照本發(fā)明的方法，20KhGH的產(chǎn)率可由采用大腸桿菌為宿主的遺傳重組技術改進。
本發(fā)明的方法也被認為甚至可以改進胞內(nèi)產(chǎn)生重組蛋白質的產(chǎn)率。


圖1是說明GR表達質粒pKKGR1制備方法的示意圖。
圖2是說明分泌的22KhGH質粒pGHW300制備方法的示意圖。
圖3是部分說明用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號肽的分泌20KhGH質粒pGHV1制備方法的示意圖。
圖4是部分說明用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號肽的分泌20KhGH質粒pGHV2制備方法的示意圖。
圖5是部分說明具有修飾過的得自中性蛋白酶的分泌信號肽的20KhGH分泌質粒制備方法的示意圖。
圖6是部分說明具有藥物抗性標記的20KhGH分泌質粒制備方法的示意圖。
圖7是部分說明具有藥物抗性標記的20KhGH分泌質粒制備方法的示意圖。
圖8是部分說明具有藥物抗性標記的20KhGH分泌質粒制備方法的示意圖。
圖9是部分說明具有藥物抗性標記的20KhGH分泌質粒制備方法的示意圖。
圖10是說明在相同的質粒中包含GR基因和20KhGH基因(具有修飾過的分泌信號肽)的分泌質粒pGHV45GR制備方法的示意圖。
圖11是說明在相同的質粒中包含GR基因和20KhGH基因(具有修飾過的分泌信號肽)并且能恰好用于無lacIq基因的宿主菌株的分泌質粒pGR10制備方法的示意圖。
Ptac……tac啟動子區(qū)SD……核糖體結合區(qū)TrrnB……rrnB轉錄終止子區(qū)Ampr……氨芐青霉素抗性基因區(qū)pBR322ori……pBR322復制起點區(qū)
GR……谷胱甘肽還原酶基因PNP……解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因啟動子區(qū)SS……解淀粉芽胞桿菌的中性蛋白酶分泌信號肽或修飾過的分泌信號肽的編碼區(qū)22KhGH……22KhGH基因pUB110ori……pUB110的復制起點區(qū)TNP……解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因的轉錄終止子區(qū)20KhGH……20KhGH基因Tetr……四環(huán)素抗性基因區(qū)lacZ……β-半乳糖苷酶基因區(qū)ColE1ori……ColE1復制起點區(qū)Ttrp……trpA基因轉錄終止子區(qū)lacIq……lacIq基因現(xiàn)在詳細描述本發(fā)明。
GR是一種黃素(FAD)酶，它需要NAD(P)H為輔酶，能將氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽，廣泛存在于動物、植物和微生物組織中。已知GR產(chǎn)生可與存在于胞質中的蛋白質的二硫鍵反應的還原型谷胱甘肽，這樣保留了其SH的還原態(tài)，或者GR具有將過氧化氫交換到水中的解毒功能。此外，已報道在其葉綠體中表達得自大腸桿菌的GR的一種植物(煙草)中，對由光引起的氧化應力的抗性增加[＂Plant Cell Physiol.＂，Vol.34，p.129-135(1993)]。然而，本發(fā)明中的GR增加的表達與分泌效率有關這一認識迄今還不存在。
GR基因和重組蛋白質基因的共表達可以由使所述兩種基因存在于一個復制子中的方式或使它們分別存在于不同的復制子中的方式完成。所述復制子指DNA復制的一個自主單位?！笆顾鰞煞N基因存在于一個復制子中”指所述兩種基因一起存在于一個染色體或一個質粒中?！笆顾鼈兎謩e存在于不同的復制子中”指GR基因和重組蛋白質基因存在于染色體和一個質?；驈椭谱硬煌膬蓚€質粒的每一組合中。
在本發(fā)明中，可以使用得自任何生物的有效的GR基因。而且也可以使用任何已知的GR基因，例如從GR的mRNA獲得的cDNA和由化學合成裝配的基因。源于大腸桿菌的GR基因可容易地獲得并適于使用。在本發(fā)明中，當使用源于大腸桿菌的GR基因時，可允許所獲得的GR基因與染色體或質粒共存，并且GR基因可與重組蛋白質同時表達，因為得自大腸桿菌的GR原始存在于大腸桿菌染色體中。
只要其能在大腸桿菌中表達，本發(fā)明中對分泌的重組蛋白質沒有特別的限制。所述重組蛋白質的例子包括22KhGH、20KhGH和β-內(nèi)酰胺酶，本發(fā)明對產(chǎn)生20KhGH特別有效。本發(fā)明已提出了一種使用大腸桿菌分泌產(chǎn)生20KhGH的方法，其中使用了得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因的啟動子，即一種分泌信號肽(USP5,496,713)。按照所提出的方法，分泌產(chǎn)生20KhGH可以提高到30mg/升培養(yǎng)基。但仍期望培養(yǎng)一種能獲得更高產(chǎn)量的菌株。
20KhGH具有一個176個氨基酸的序列，在構成22KhGH的191個氨基酸序列中缺失了其第23到46位氨基酸(15個殘基)。近年來，盡管22KhGH已用于醫(yī)療，但人們更多得注意到作為一種具有較低的葡萄糖耐受畸變性和較低的白血病起因的hGH的20KhGH的生物學性質。同以，20KhGH是一種作為新的藥用hGH被表達的蛋白質。而且，就20KhGH的N-端14位氨基酸來說，已有兩種報道，即，一種報道它為絲氨酸，另一種報道它為蛋氨酸。這就是說，在Masuda，N.et al.，＂Biophysica Acta＂，Vol.949，p.125(1988)中，一段cDNA堿基序列是AGT(它編碼絲氨酸)，在Martial，J.A.et al.，＂Science＂，Vol.205，p.602(1979)中，包含為20KhGH的從N-末端起的第14位氨基酸編碼的序列的一段mRNA是AUG(它編碼蛋氨酸)。本發(fā)明的20KhGH指第14位氨基酸為蛋氨酸的氨基酸序列和第14位氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列兩者。此外，其1或2位氨基酸被取代、丟失、插入或缺失的氨基酸序列也包含在本發(fā)明的20KhGH類別的范圍內(nèi)。
對分泌信號肽的類別沒有特別的限制，源于任何分泌蛋白質的分泌信號肽均是可用的。然而，優(yōu)選的分泌信號肽應考慮待分泌蛋白質的種類來選擇。就分泌產(chǎn)生20KhGH而言，得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號肽是優(yōu)選的，如USP5,496,713所述。為了發(fā)現(xiàn)一種對分泌20KhGH比得自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶更有利的氨基酸序列這一目的，本發(fā)明發(fā)明人進行了一種實驗。即，將一個堿性氨基酸(Lys)加入到分泌信號肽N-末端氨基酸序列的正電荷區(qū)，將5個疏水氨基酸(Leu)加入到分泌信號肽N-末端氨基酸序列的中心疏水區(qū)，有秩序地組裝攜帶各種修飾分泌信號肽的20KhGH分泌質粒。如比較實施例1所述。然后，培養(yǎng)用所述質粒轉化的宿主大腸桿菌，結果某些修飾的分泌信號肽提高了分泌蛋白質的產(chǎn)量。而如實施例4所示，如果GR基因和20KhGH基因在大腸桿菌中同時表達時，在所有轉化的大腸桿菌中觀察到具有修飾分泌信號肽的20KhGH的分泌改善效果。修飾分泌信號肽pGHV45的序列示于序列表的SEQ ID NO1中，利用這一序列可以獲得最高的分泌水平。
GR基因與編碼待分泌的靶蛋白質基因同時人工表達，因此，如果GR基因表達非常強烈，這種情況下就會影響大腸桿菌的生長和靶蛋白的分泌。這一問題可以基于已知信息通過控制GR基因的表達來解決。例如，當使用可誘導的啟動子(tac啟動子、lac啟動子等)表達GR基因時，可以適當?shù)夭捎靡环N方法，如降低加入的誘導劑的濃度、不加誘導劑或使用啟動子的抑制基因(如tac啟動子的LacIq)。GR基因的過度強烈地表達可很容易地通過對由超聲波處理培養(yǎng)細胞的溶液進行電泳分析來證實。
為了制備本發(fā)明的重組大腸桿菌，將(a)包含上述的GR基因和與此連接的啟動子的一段DNA和/或(b)包含編碼重組蛋白質的基因的一段DNA和編碼啟動子和在上游側向與重組蛋白基因連接的分泌信號肽序列的一段DNA摻入到一個可復制的載體中或分別摻入到不同的可復制的載體中，以產(chǎn)生一種質粒，然后用轉化的方法將這一質粒引入到宿主大腸桿菌中。換種方法，以上DNA(a)和(b)可以一起摻入到染色體DNA中，或者可以各自分別摻入到一種染色體DNA和一種質粒中。
就在本發(fā)明中能用作宿主的大腸桿菌菌株來說，任何菌株都是可接受的。但無致病性的且實際已經(jīng)常應用的大腸桿菌菌株是優(yōu)選的。這種合適的可用的菌株的例子包括JM109、HB101和W3110(ATCC27325)。這里，ATCC編號是美國典型培養(yǎng)物保藏中心收藏的微生物的編號，ATCC27325可以售賣給任何一個需要它的人。
這樣，可以獲得轉化的大腸桿菌菌株，在該菌株中，蛋白質可以通過GR基因的表達得到有效的分泌。特別是20KhGH的分泌作用可以得到明顯改善?？梢苑置诤彤a(chǎn)生20KhGH的菌株的例子是MT-10765，這一菌株以保藏號BP-5020保藏在1-1-3，Higasi，Tsukuba City，Ibaraki Prefecture，Japan的工業(yè)科學技術局國家生物科學和人類技術研究所。因MT-10765菌株可在30℃的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，所以可以縮短培養(yǎng)時間，且20KhGH的產(chǎn)率可高達每升培養(yǎng)基70mg或更高。
涉及靶蛋白質產(chǎn)生的改進的GR以增加的量在宿主細胞中產(chǎn)生的機制不清楚。可能是GR與有關胞質膜中質子梯度的形成的現(xiàn)象和在待分泌蛋白質通過胞子膜的轉運步驟中需要的氧化還原電位有關。
轉化的大腸桿菌菌株按已知的培養(yǎng)技術在包含可被同化的碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。就培養(yǎng)方法來說，可優(yōu)選地使用液體培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)基是包含0.2到1.0％甘油的加倍濃縮的LB培養(yǎng)基(20g/l聚蛋白胨和10g/l酵母膏)。
經(jīng)培養(yǎng)本發(fā)明的轉化的大腸桿菌菌株，分泌的蛋白質在轉化菌株的周質中積累。從轉化的大腸桿菌菌株的周質中收集分泌的蛋白質可以用從周質中收集純化蛋白質的常用方法進行。例如，滲透休克方法[Nossal G.N.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.241(13)，p.3055-3062(1996)]或類似的方法。
因此，按照本發(fā)明的產(chǎn)生方法，所需蛋白質可以有效地分泌到轉化大腸桿菌菌株的周質中，并在該周質中積累。
下面將結合實施例更詳細地描述本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍絲毫不受這些實施例的限制。
在下列實施例中具有“FERM BP-”編號的菌株保藏在以上所述的“國家生物科學和人類技術研究所”。實施例1GR基因和hGH基因共表達對hGH分泌效率的影響(1)大腸桿菌GR基因表達質粒pKKGR1的制備制備這一質粒的一種方法示于圖1中。制備大腸桿菌K-12菌株(ATCC23716)的染色體DNA。使用化學合成的寡核苷酸引物SEQ IDNO2和SEQ ID NO3，以上述染色體為模板用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增GR基因[Mullis，K.B.et al.，＂MethodsEnzymol.＂，Vol.155，P.335-350(1987)]。結果獲得了一個包含編碼大腸桿菌GR基因的序列的DNA區(qū)段。接著，用限制酶EcoRI和PstI消化這一DNA區(qū)段，以分離1352bp的DNA片段。接著用限制酶EcoRI和PstI消化從Pharmacia Co.Ltd獲得的載體質粒pKK223-3，分離4.6kb的DNA片段(2)，將這一DNA片段(2)與上述DNA片段(1)連接，制備表達大腸桿菌GR基因的質粒pKKGR1的。此后，按InoueH.et al.[＂Gene 96＂，p.23-28(1990)]的方法用以上提到的質粒轉化大腸桿菌JM109菌株(從Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)，獲得一個轉化大腸桿菌菌株(MT-10771)。(2)22KhGH分泌質粒pGHW300的制備制備這一質粒的一種方法示于圖2中。用限制酶StuI和BglII消化用于枯草桿菌宿主的22KhGH分泌質粒phGH526[Nakayama A.et al.，J.Biotech，Vol.8，p.123-134(1988)]，分離一個包含C-末端截短的22KhGH基因的DNA比段(3)。另一方面，用限制酶StuI和BglII消化從MT-10712(FERM BP-4361)抽提出的人20KhGH分泌質粒pGHW3(USP5,496,713)獲得一個載體片段(4)。該這一載體片段(4)與以上提到的DNA片段(3)連接，獲得一個22KhGH分泌質料pGHW300。此后，用以上提到的質粒轉化大腸桿菌HB101菌株(從Takara Shuzo Co.Ltd.獲得)，獲得MT-10773。如此獲得的MT-10773以FERM BP-5019的保藏號保藏。(3)hGH基因和GR基因的共表達上述質粒pGHW3具有編碼作為從20KhGH N-末端起的第14位氨基酸的絲氨酸的DNA堿基序列。另一方面，本發(fā)明人制備了一種攜帶包括為從N-末端起的14位氨基酸的蛋氨酸編碼的密碼子在內(nèi)的核苷酸序列的20KhGH分泌質粒pGHW30。具體來說，以質粒pGHW3為模板，用化學合成的寡核苷酸SEQ ID NO17和市售的M4引物進行PCR擴增，獲得約0.6kbp的DNA片段。用限制酶StuI和BglII消化這一擴增的DNA片段，然后用質粒pGHW3相應的部分取代所形成的StuI-BglII片段，制備出具有為20KhGH編碼的核苷酸序列的20KhGH分泌質粒pGHW30，所述序列具有為作為從N-末端起的14位氨基酸的蛋氨酸編碼的密碼子。此外，用上述質粒pGHW30轉化大腸桿菌W3110菌株(ATCC27325)，獲得轉化大腸桿菌菌株(MT-10772)。接著，用常用的方法從這一轉化菌株抽提和純化質粒pGHW30。此后，按照Inoue H.et al.，[＂Gene96＂，p.23-28(1990)]的方法，分別用pGHW30與pKKGR1的組合和pGHW300和pKKGR1的組合來轉化宿主大腸桿菌JM109菌株。將如此獲得的每一種轉化體于30℃下在含有10μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其形成菌落。接下來將分離的轉化體在30℃的培養(yǎng)溫度下在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml四環(huán)素的雙倍濃縮的LB培養(yǎng)基(20g/l聚蛋白胨和10g/l酵母膏)中培養(yǎng)24小時。因質粒pKK223-3和pKKGR1具有tac啟動子，所以要監(jiān)測在培養(yǎng)具有這類質粒的轉化菌株的培養(yǎng)開始時加入1mM IPTG的影響。在培養(yǎng)之后，用滲透沖擊方法[Nossal G.N.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.241(13)，p.3055-3062(1996)]收集分泌到周質部分中的hGH。以酶疫免測定法[Kato K.et al.，＂J Immunol.＂，Vol.116，p.1554(1967)]用hGH的抗體測定hGH在周質部分中的濃度。按以下方法制備周質部分溶液。這就是說，采用離心培養(yǎng)基的方法，以沉淀組分的狀態(tài)收集培養(yǎng)的大腸桿菌的細胞沉淀，然后懸浮在原始培養(yǎng)基1/10量的等滲溶液(含有20％蔗糖和1mM EDTA的10mM tris-鹽酸緩沖液(ph7.0))中。此后，使懸液靜置30分鐘，接著進行離心分離并收集細胞沉淀。接下來，將如此收集的細胞沉淀懸浮在4℃的冷水中，抽提存在于細胞沉淀周質中的蛋白質。將該懸液離心分離，從其中除去細胞沉淀。收集作為周質組分的所形成的上清液(提取的組分)。用酶免疫測定法測定在周質組分中的收集的hGH的濃度。根據(jù)測定值，計算每升培養(yǎng)基中分泌的hGH的量。結果示于表1和表2中。
表1由GR基因同時表達引起的20KhGH分泌量的提高(以mg/升培養(yǎng)基)
表2由GR基因同時表達引起的22KhGH分泌量的提高(以mg/升培養(yǎng)基表示)
當GR基因與hGH基因共表達時，20khGH和22khGH兩者均比在單獨使用hGH分泌質粒時得到更大量的分泌。當使載體質粒pKK223-3和hGH分泌質粒存在于同一細胞中的情況下，分泌的20khGH和22khGH兩者的量都降低。而使GR表達質粒pKKGR1和hGH分泌質粒存在于同一細胞中時，分泌的20khGH和22khGH兩者的量均明顯增加。這一事實表明，GR基因的共表達可以提高分泌的靶產(chǎn)物的產(chǎn)量。為什么在載體質粒pKK223-3和hGH分泌質粒的共存在時，分泌的hGH的量比hGH分泌質粒單個存在時的量要小的原因還不確定。但是，與hGH分泌質粒類似，pKK223-3有源于pBR322的復制起點，因此可以假定會出現(xiàn)復制和相容性致劣的競爭。也可以假定，pKK223-3的藥物抗性標記β-內(nèi)酰胺酶是一種分泌蛋白質，該蛋白質在膜通過步驟中與hGH前體競爭。
在用GR表達質粒pKKGR1和hGH分泌質粒兩種質粒轉化菌株JM109中，需要加入GR表達的誘導劑(IPTG)。實施例2GR基因和β-內(nèi)酰胺酶基因的共表達對β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響在從Pharmacia Labs.，Inc.獲得的載體質粒pKK223-3上，β-內(nèi)酰胺酶基因以一種藥物抗性標記存在。β-內(nèi)酰胺酶在大腸桿菌胞質中表達，然后分泌到周質空間并在那里積累。將GR基因滲入到pKK223-3中形成質粒pKKGR1，因而該質粒僅在這一點上與pKK223-3不同，質粒pKKGR1的剩下的部分與pKK223-3中的完全相同(包括β-內(nèi)酰胺酶的表達區(qū)在內(nèi))。因此，通過將由質粒pKKGR1表達的β-內(nèi)酰胺酶的分泌量與由質粒pKK223-3表達的β-內(nèi)酰胺酶的分泌量進行比較，可以看出GR同時表達對β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響。以與上述hGH產(chǎn)生菌株的培養(yǎng)相同的方法培養(yǎng)用各個質粒轉化的JM109菌株。收集周質部分溶液，進行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍R250染色。此后，用光密度計測定β-內(nèi)酰胺酶帶(32.0kDa)，以檢測β-內(nèi)酰胺酶相對于總的周質蛋白質的含量比率(％)。結果示于表3中。
表3GR基因的共表達對β-內(nèi)酰胺酶分泌效率的影響[A660(32.0kDa)/A660(周質組分中總蛋白量)％]
大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶向周質中的分泌也能被GR基因的共表達加強得到了證實。實施例3使用源于大腸桿菌OmpA的分泌信號肽分泌和產(chǎn)生20KhGH
(1)嘆基因和具有得自大腸桿菌OmpA基因的分泌信號肽編碼區(qū)的20KhGH基因的共表達按與實施例1相同的方式將20KhGH分泌質粒pGHW40與GR表達質粒pKKGR1一起轉化進大腸桿菌JM109菌株中，所述質粒pGHW40攜帶有源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的轉錄啟動子和源于大腸桿菌外膜蛋白OmpA基因的分泌信號肽。用與實施例1相同的方法培養(yǎng)如此轉化的菌株，然后抽提周質組分。接著用酶免疫測定法測定分泌的20KhGH的量，結果示于表4中。
表4由使用源于大腸桿菌OmpA的信號肽共表達GR基因產(chǎn)生的分泌促進作用(以mg/升培養(yǎng)基表示)
對20KhGH的分泌來說，源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號肽是優(yōu)選的(表1)，分泌的20KhGH的量可以經(jīng)共表達GR基因明顯增加。然而，即使通過使用用具有源于大腸桿菌OmpA的分泌信號肽的分泌質粒轉化的菌株，由于GR基因的共表達，其分泌效率能明顯提高，但分泌的20KhGH的量比使用源于中性蛋白酶的分泌信號肽時的量相對小一些。
而且，如實施例2所示，在具有β-內(nèi)酰胺酶的分泌信號肽的β-內(nèi)酰胺酶分泌中也可以觀察到GR基因的同時表達產(chǎn)生的分泌促進作用。就這一事實來看，GR基因同時表達的作用并不被特定種類的分泌信號肽所限制，這一點是明顯的。比較實施例1使用源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的修飾分泌信號肽產(chǎn)生20KhGH(1)用于修飾源于中性蛋白酶的分泌信號肽的20KhGH分泌質粒pGHV2的裝配為了將一個可有可無的氨基酸殘基插入到源于解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶的分泌信號肽中，向分泌信號肽序列中引入一個限制酶識別位點，并同時組成一個完整的質粒，以產(chǎn)生用于修飾分泌信號肽的質粒pGHV2。方法示于圖3和圖4中。在用限制酶消化pGHV2后，用克列諾酶處理使pGHW30末端變成平端，使限制酶BamHI作用在pGHW30上，從而制備約0.85kbp的DNA片段(5)，該片段含有一個啟動子和一個分泌信號肽編碼區(qū)，兩個中性蛋白酶基因和20KhGH基因。將這一DNA片段(5)與載體部分(6)連接，所述載體部分是由為了產(chǎn)生pGHV1(圖3)用限制酶SmaI和BamHI處理市售的克隆載體pUCll9獲得的。接著，以所述pGHVl為模板，用化學合成的寡核苷酸SEQ ID NO4和市售M4引物進行PCR擴增，獲得約100bp的包含中性蛋白酶基因啟動子的DNA片段(7)。此外，也用化學合成的寡核苷酸SEQ ID NO5和市售RV引物進行PCR擴增，獲得約700bp的含有中性蛋白酶分泌信號肽編碼區(qū)基因和20KhGH基因的DNA片段(8)。接著，為了用這一PCR擴增將可有可無的氨基酸殘基插入到分泌信號肽中這一目的，設計一種引物SEQ ID NO5，以使其中可包含識別限制酶NdeI和SpeT的位點。如圖4所示，分別用限制酶EcoRI和NdeI、NdeI和HindIII消化擴增的DNA片段(7)和(8)，然后連接到用EcoRI和HindIII消化市售的克隆載體pUC118獲得的載體部分(9)上，從而產(chǎn)生pGHV2(圖4)。在由這一質粒編碼的源于中性蛋白酶的信號肽中，由于限制酶NdeI和SpeI識別位點的插入，其從N-末端起的第8位絲氨酸(Ser)殘基被蘇氨酸(Thr)殘基取代。(2)具有修飾分泌信號肽序列的20K hGH分泌質粒的產(chǎn)生為了在分泌信號肽序列中增加一個正電荷區(qū)和一個疏水區(qū)，分別插入正電荷氨基酸(Lys)和疏水氨基酸(Leu)。Mizusima等已報道，從分泌效率考慮，有許多構成疏水區(qū)的疏水氨基酸殘基(Hikita C.and Mizushima S.，＂J.Biol.Chem.＂，Vol.267，p.4882-4888(1992)]，因此合成了SEQ ID NO 6-10所示的接頭DNA，其中改變了被插入的亮氨酸殘基的數(shù)量。用夾在pGHV2的限制酶NdeI和SpeI之間的區(qū)取代每一合成接頭，產(chǎn)生20KhGH分泌質粒(pGHV3、pGHV4、pGHV5、pGHV6和pGHV)，所述質粒在分泌信號肽序列中具有不同的亮氨酸殘基(圖5顯示了使用SEQ ID NO8為代表性例子的方法)。經(jīng)使用熒光探針DNA序列試劑盒(ABI Co.，Ltd.制造)翻譯在分泌信號肽序列中編碼氨基酸殘基的DNA序列來證實修飾分泌信號肽序列中的氨基酸序列。在引入了額外的亮氨酸殘基后，用上述pGHV2的絲氨酸(Ser)殘基再次取代蘇氨酸(Thr)殘基，除了插入的殘基外，原始序列被保持。(3)使用具有修飾分泌信號肽的20KhGH分泌質粒產(chǎn)生20KhGH用與實施例1相同的方式培養(yǎng)用以上獲得的具有修飾分泌信號肽的每一20KhGH質粒轉化的大腸桿菌JM109菌株，然后提取周質組分。此后，測量20KhGH的含量，再計算每升培養(yǎng)其中20KhGH的產(chǎn)量。結果示于表5中。在表5中，符號K代表Lys殘基，L代表leu殘基。各符號前面的數(shù)字分別代表插入后在正電荷區(qū)和疏水區(qū)存在的賴氨酸殘基的亮氨酸殘基的數(shù)目。
表5分泌信號肽序列的修飾對分泌的20KhGH的量的影響(以mg/升培養(yǎng)基表示)
實施例4GR基因的共表達和分泌信號肽序列的修飾對分泌20KhGH的影響(1)通過分泌信號肽的修飾改變20KhGH分泌質粒的藥物抗性標記將GR表達質粒和用修飾分泌信號肽分泌20KhGH的質粒滲入到相同的宿主細菌中，且為了測定GR基因的同時表達對分泌20KhGH的影響，有必要將具有帶修飾信號肽的20KhGH分泌質粒的藥物抗性標記從氨芐青霉素改變成四環(huán)素。對攜帶有修飾分泌信號肽編碼區(qū)的質粒(pGHW30、pGHV2、pGHV3、pGHV4、pGHV5、pGHV6和pGHV7)進行所有相同的操作，因此僅以pGHV5為代表例在以下進行描述。
簡單地說，用pGHV5和EcoRI-HindIII部分(含有中性蛋白酶基因的啟動子和編碼由修飾信號肽與20KhGH組成的前體的區(qū))取代pBR322的EcoRi-HindIII部分。克隆載體pBR322是可以購買到的。
在這種情況下，為了阻止中性蛋白酶啟動子的引入，將trpA終止子序列直接加在編碼20KhGH的DNA序列的下游側向。
具體地說，將SEQ ID NO11所示的含有trpA終止子的合成接頭插入到夾在pGHV5的限制酶Bamhi和XbaI之間的位點，以獲得pGHV15(圖6)。接著，用限制酶EcoRI和HindIII切割pGHV15，獲得約0.85kbp的DNA片段(10)。另一方面，用限制酶EcoRI和HindIII切割pBR322，以取得載體部分(11)。將所述DNA片段(10)與載體部分(11)連接制備pGHV25(圖7)。然而，該質粒缺失四環(huán)素抗性基因，HindIII上游的-35序列，因而它僅表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性，而不表現(xiàn)出四環(huán)素抗性功能。為了將-35序列插入到四環(huán)素基因的上游側向這一目的，化學合成SEQ ID NO12所示的DNA接頭，然后插入到夾在pGHV25的限制酶XbaI和HindIII之間的位點上，以制備pGHV35(圖8)。此外，為了消除pGHV35具有的氨芐青霉素抗性基因，使約0.8kbp的區(qū)缺失產(chǎn)生pGHV45(圖9)，所述約0.8kbp的區(qū)位于限制酶EcoRI和VspI之間以固定啟動子區(qū)的氨芐青霉素抗性基因。對具有其它修飾信號肽的20KhGH分泌質粒進行類似的操作，產(chǎn)生pGHV42、pGHV43、pGHV44、pGHV46和PGHV47。
(2)用具有修飾分泌信號肽編碼區(qū)的20KhGH分泌質粒的GR表達質粒分泌20KhGH將同時用20KhGH分泌質粒(具有修飾分泌信號肽編碼區(qū)，該區(qū)帶有獲得的四環(huán)素抗性標記)和GR表達質粒pKKGR1轉化的大腸桿菌JM109菌株加入到含有IPTG(1mM)的培養(yǎng)基中。然而用與實施例1相同的方法培養(yǎng)，然后提取周質組分。此后，測定20KhGH的含量，再計算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量。結果示于表6中。在表6中，符號K代表Lys殘基、符合L代表Leu殘基。這些符號前面的數(shù)字分別代表插入后在正電荷區(qū)和疏水區(qū)存在的賴氨酸殘基和亮氨酸殘基的數(shù)目。
表6在GR基因共表達下分泌信號肽序列的修飾作用(對分泌的20KhGH的量的影響)(以mg/升培養(yǎng)基表示)
在這些具有修飾分泌信號肽的20KhGH質粒中，pGHV45給出最大的分泌產(chǎn)量。實施例5用在同一質粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號肽編碼區(qū))和GR基因的質粒產(chǎn)生20KhGH(1)在同一質粒中包含帶有分泌信號肽編碼區(qū)的20KhGH基因和GR基因的分泌質粒pGHV45GR的產(chǎn)生用示于SEQ ID NO 13和14中的合成寡核苷酸為引物，將包含tac啟動子、GR基因和TrrnB終止子的pKKGR1的一個區(qū)進行PCR擴增，以獲得約2.0kbp的DNA片段(12)。在這種情況下，設計各引物，以使限制酶AvaI和AccIII的識別序列可以存在于DNA片段的兩端。接著將包含GR基因表達區(qū)的DNA片段(12)插入到用限制酶AvaI和AccIII消化的pGHV45的位點上，產(chǎn)生pGHV45GR(圖10)。
(2)使用在同一質粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號肽編碼區(qū))和GR基因的分泌質粒pGHV45GR產(chǎn)生20KhGH用與實施例1相同的方法培養(yǎng)由pGHV45GR轉化的各種大腸桿菌菌株，提取各周質組分。接著測定20KhGH的含量，并計算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量(mg)，結果示于表7中表7經(jīng)使用pGHV45GR的20KhGH的產(chǎn)率(以mg/升培養(yǎng)基表示)
在以JM109為宿主并且向培養(yǎng)基中加入IPTG的情況下，分泌的20KhGH的量與使用兩種不同質粒的實施例1、2和3的實驗結果比較相反地要低。當將超聲波處理制備的全細胞提取溶液進行SDS-PAGE分析時，可證實GR非常高的產(chǎn)量。相反地，在不向培養(yǎng)基中加入IPTG的非誘導條件下，獲得了大量的分泌產(chǎn)物。用SDS-PAGE將這些培養(yǎng)細胞進行類似的分析，結果證實產(chǎn)生的GR的量比在誘導培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的GR的量小。從這些結果可明顯看出，對轉化的JM109(其中20KhGH基因和GR基因存在于同一質粒中)，向培養(yǎng)基中加入IPTG的條件是優(yōu)選的。GR基因被tac啟動子表達，但宿主是JM109的情況下，可以認為加入IPTG的誘導作用導致GR基因的過度表達，這引起分泌作用的降低。
在轉化的W3110中，在IPTG誘導和無IPTG誘導兩種情況下都獲得了小量的分泌，如表7所示。當由超聲波處理制備的全細胞提取溶液用于SDS-PAGE分析時，可證實GR非常高的產(chǎn)量。在以HB101為宿主的情況下也獲得了類似的結果。
可以假定由于不同宿主JM109和W3110引起的上述不同與每一宿主染色體上的lacIq的存在/不存在有關。這就是說，JM109具有起到tac啟動子的抑制劑作用的tacIq基因，而W3110沒有任何lacIq基因。用以RB791為宿主的以下實驗證實了這一假設是正確的。RB791(ATCC53622)是由將lacIq基因整合到W3110中制備的菌株，RB791的其它特征與W3110的相同。在使用RB791的情況下，在IPTG誘導的培養(yǎng)條件下分泌的20KhGH的量降低，與在JM109的情況下一樣，電泳證實了GR的高產(chǎn)量。另一方面，在無IPTG誘導的情況下，可以獲得大量分泌的20KhGH。電泳證實了不存在GR的過度產(chǎn)生。實施例6無lacIq基因的宿主菌株的使用為了使在實施例5中令人不滿意的大腸桿菌宿主的W3110和HB101能夠使用，進行了以下所述的研究(1)在相同的質粒中包含20KhGH基因(帶有修飾分泌信號肽編碼區(qū))和GR基因并且即使在無lacIq基因的宿主中也是有效的分泌質粒pGHR10的產(chǎn)生為了將lacIq基因整合到作為20KhGH基因表達區(qū)的相同的復制子中，以化學合成的示于SEQ ID NO 15和16為引物，將市售表達載體pTrc99A(Pharmacia Labs.，Inc.)的lacIq基因進行PCR擴增。在這種情況下，設計各引物使限制酶EcoT141和AvaI識別位點可以加入到DNA片段(13)的兩端。接著，用限制酶EcoT141和AvaI消化pGHV56GR，以得到載體片段(14)。將這一載體片段(14)與含有l(wèi)acIq基因的DNA片段(13)連接，產(chǎn)生pGHR10(圖11)。所插入的lacIq基因僅含有RBS序列(一個核糖體鍵合區(qū))，但不含有任何啟動子區(qū)，因此它可以經(jīng)引入上游四環(huán)素抗性基因被轉錄和表達。
(2)使用在同一質粒中含有20KhGH基因(帶有修飾的分泌信號肽編碼區(qū))和GR基因且其中GR的表達由lacIq基因控制的分泌質粒pGHR10產(chǎn)生20KhGH。
用與實施例1相同的方式培養(yǎng)用pGHR10轉化的各種轉化大腸桿菌菌株，然后提取各周質組分。接著測定20KhGH的含量，并計算每升培養(yǎng)基中20KhGH的產(chǎn)量(mg)。結果示于表8中。在所有轉化的大腸桿菌菌株中，大腸桿菌W3110菌株(MT-10765)(攜帶pGHR10)以保藏號FERM BP-5020保藏。HB101菌株從Takara Shuzo Co.，Ltd.獲得，LE392菌株(ATCC 33572)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。
表8用pGHR10產(chǎn)生20K/hGH(以mg/升培養(yǎng)基表示)
通過采用pGHR10(其中20KhGH基因表達區(qū)和GR基因存在于相同的復制子上)和使lacIq基因(控制由啟動子(tac)定向的GR基因的表達)存在于相同的質粒中，使用不具有l(wèi)acIq基因的宿主菌株也是可能的。
權利要求
1.一種分泌產(chǎn)生重組蛋白質的方法，所述的包括分泌產(chǎn)生將重組蛋白質分泌到宿主大腸桿菌的周質中，所述方法包括在相同的宿主大腸桿菌中人工同時表達谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質這一步驟。
2.按照權利要求1的分泌產(chǎn)生方法，其中的人工表達的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
3.按照權利要求1或2的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼靶重組蛋白質的基因位于同一復制子中。
4.按照權利要求1或2的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼靶重組蛋白質的基因分別位于不同的復制子中。
5.一種分泌產(chǎn)生分子量約為20,000的人生長激素的方法，所述的分泌產(chǎn)生包括將分子量約為20,000的人生長激素分泌到宿主大腸桿菌的周質中，該方法包括在同一宿主大腸桿菌中人工同時表達谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長激素。
6.按照權利要求5的分泌產(chǎn)生方法，其中的人工表達的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
7.按照權利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長激素的基因位于同一復制子中。
8.按照權利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長激素的基因分別位于不同的復制子中。
9.按照權利要求5或6的分泌產(chǎn)生方法，其中的有關分子量約為20,000的人生長激素的分泌的信號肽是SEQ ID NO1所描述的氨基酸序列。
10.一種在其中靶重組蛋白質能被分泌到周質中的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌能人工同時表達谷胱甘肽和靶重組蛋白質。
11.按照權利要求10的重組大腸桿菌，其中的被人工表達的谷胱甘肽還原酶源于大腸桿菌。
12.按照權利要求10或11的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因與編碼靶重組蛋白質的基因位于同一復制子中。
13.按照權利要求10或11的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因與編碼靶重組蛋白質的基因分別位于不同的復制子中。
14.一種在其中分子量約為20,000的人生長激素能被分泌到周質中的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌能人工同時表達谷胱甘肽還原酶和分子量約為20,000的人生長激素。
15.按照權利要求14的重組大腸桿菌，其中的人工表達的谷胱甘肽還原酶得自大腸桿菌。
16.按照權利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長激素的基因位于同一復制子中。
17.按照權利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的谷胱甘肽還原酶基因和編碼分子量約為20,000的人生長激素的基因分別位于不同的復制子中。
18.按照權利要求14或15的重組大腸桿菌，其中的有關分子量約為20,000的人生長激素的分泌的分泌信號肽是SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列。
19.按照權利要求18的重組大腸桿菌，其中的重組大腸桿菌是FERM BP-5020。
全文摘要
在從大腸桿菌周質中產(chǎn)生重組蛋白質的方法中，通過人工共表達谷胱甘肽還原酶和靶重組蛋白質，可以提高靶重組蛋白質的產(chǎn)率。
文檔編號C12N15/70GK1148626SQ9610805
公開日1997年4月30日 申請日期1996年3月29日 優(yōu)先權日1995年3月29日
發(fā)明者本城勝, 內(nèi)藤直和, 內(nèi)田博司 申請人:三井東壓化學株式會社