專利名稱：使用拉曼散射測(cè)量酶反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)酶反應(yīng)中特異酶之靶底物的定性測(cè)量和定量測(cè)量，以及測(cè)量酶活性的方法。
已實(shí)施了一些方法以作為測(cè)量酶反應(yīng)的方法，如果酶反應(yīng)是可產(chǎn)生過(guò)氧化氫的反應(yīng)系統(tǒng)，則下列方法是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的，例如(1)使用過(guò)氧化氫電極的方法此方法適于測(cè)量電流的變化，電流變化的起因是當(dāng)過(guò)氧化氫被電氧化時(shí)，因此通過(guò)還原共存于樣品溶液中的物質(zhì)產(chǎn)生電感應(yīng)。
(2)Leuco或氧化縮合型分光光度測(cè)定法(參見日本專利公開公報(bào)No.59-182361(1984)，典型地，此儀器適于過(guò)氧化氫與4-氨基安替比林和酚反應(yīng)以產(chǎn)生顏色，并在505nm下測(cè)量顯色反應(yīng)溶液的光吸收值。在Leuco型分光光度計(jì)中，由于色素原的自然氧化導(dǎo)致空白試劑顯色容易引起錯(cuò)誤。另一方面，在氧化縮合型分光光度測(cè)定法中，還原性物質(zhì)易導(dǎo)致假陰性。另外，需要2mol過(guò)氧化氫才能產(chǎn)生1mol色素，因此該方法不適于測(cè)定量少的成分。
(3)熒光法，它適于過(guò)氧化氫與高香草酸反應(yīng)以產(chǎn)生熒光并測(cè)量熒光。在熒光法中，敏感性顯著依賴于儀器的性能。因此該方法受溫度和共存物質(zhì)的影響極大。
(4)化學(xué)發(fā)光法，適于在催化劑，如POD(過(guò)氧化物酶)存在的條件下通過(guò)氧化過(guò)氧化氫的能量激發(fā)魯米諾或光澤精的底物，并檢測(cè)底物由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)時(shí)所發(fā)出的光。在化學(xué)發(fā)光法中，僅在堿性條件下可得到足夠量的光發(fā)射，反應(yīng)速度緩慢且可重復(fù)性差。另外，當(dāng)有蛋白質(zhì)共存時(shí)，光發(fā)射的強(qiáng)度有所降低。
另一方面，被稱為拉曼散射分析的方法，屬于光學(xué)分析法。這種拉曼散射分析法利用下列現(xiàn)象當(dāng)特定的分子被電磁波形式的輻射能量照射時(shí)，小部分?jǐn)y有光子的分子不返回到原始振動(dòng)水平，而是在釋放了所攜光子之后，下降到具有不同電子基態(tài)的水平。因此，由這些分子釋放的能量水平也是特異性的，通過(guò)檢測(cè)以電磁波形式釋放的能量水平可鑒定該特異性分子。
盡管由拉曼散射釋放的能量射線可以處于低于(Stokes拉曼散射)或高于(antistokes拉曼散射)所吸收的能量的狀態(tài)，但由于處于激發(fā)態(tài)的電子數(shù)目比處于基態(tài)的電子數(shù)目要少得多，因此antistokes擔(dān)曼散射的強(qiáng)度非常微弱。因此，鑒定特異性分子的方法通常使用stoke拉曼散射進(jìn)行測(cè)量。
通過(guò)拉曼散射測(cè)量酶反應(yīng)的例子尚未見有報(bào)道。
本發(fā)明的目的是能夠定性測(cè)量或定量測(cè)量酶反應(yīng)的底物，或測(cè)量酶的活性。
在由發(fā)明人完成的鐵氰離子拉曼散射測(cè)量中，當(dāng)含有某種酶的靶底物和鐵氰離子的樣品溶液被單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射時(shí)，僅能觀察到極其微弱的拉曼散射。然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了這樣一種現(xiàn)象，即加入酶之前的樣品溶液，其拉曼散射光譜的一些峰當(dāng)樣品溶液中加入酶以導(dǎo)致酶反應(yīng)時(shí)，隨著酶反應(yīng)的展開此峰會(huì)增強(qiáng)，通過(guò)增強(qiáng)的拉曼散射峰即可進(jìn)行酶反應(yīng)的定性測(cè)量、定量測(cè)量或酶活性的測(cè)量。
在根據(jù)本發(fā)明的測(cè)量酶靶底物存在與否的定性測(cè)量法中，向已加入鐵氰離子的樣品溶液中加入酶，在加入酶之前和之后用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射樣品溶液，以使樣品溶液的散射光能被接收并按其光譜成分分開，酶靶底物存在與否的測(cè)量取決于加入酶之后樣品溶液的拉曼散射光譜是否包括加入酶之前樣品溶液的拉曼散射光譜的增強(qiáng)峰。
在根據(jù)本發(fā)明的為得到底物濃度的定量測(cè)量法中，向含有已知濃度靶底物的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中加入恒定濃度的鐵氰離子和恒定單位的酶以導(dǎo)致酶反應(yīng)，用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液以接收來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的散射光并將散射光按光譜成分分開，對(duì)多種靶底物濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液由標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液拉曼散射光譜增強(qiáng)峰的峰強(qiáng)度值隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，以形成可顯示靶底物濃度和反應(yīng)速度之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線。在含有未知濃度靶底物的測(cè)量樣品溶液中加入與形成校準(zhǔn)曲線的測(cè)量中所用的那些濃度相同、單位相同的鐵氰離子和酶，用與上述類似的激發(fā)射線照射待測(cè)樣品溶液，以由拉曼散射峰(與形成校準(zhǔn)曲線所用的那些相同)的峰強(qiáng)度值隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，根據(jù)校準(zhǔn)曲線即可得到測(cè)量樣品溶液的底物濃度。
在根據(jù)本發(fā)明的為得到酶活性的酶活性測(cè)量法中，在含有已知濃度靶底物的樣品溶液中加入恒定濃度的鐵氰離子和恒定單位的酶以導(dǎo)致酶反應(yīng)，用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射樣品溶液以使標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的散射光能被接收并按其光譜成分分開，由酶反應(yīng)前樣品溶液拉曼散射光譜增強(qiáng)峰的峰強(qiáng)度隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，根據(jù)反應(yīng)速度即可得到酶活性。


圖1A和圖1B顯示了底物為葡萄糖，酶為葡萄糖氧化酶的酶反應(yīng)系統(tǒng)中鐵氰離子拉曼散射光譜的變化。圖1A顯示了通過(guò)在含有葡萄糖的反應(yīng)溶液中加入鐵氰離子測(cè)量的鐵氰離子拉曼光譜。在此反應(yīng)系統(tǒng)中，僅觀察到鐵氰離子極其微弱的拉曼散射。
另一方面，圖1B顯示了向含有葡萄糖和鐵氰離子的圖1A反應(yīng)溶液中加入用作酶的葡萄糖氧化酶(GOD)幾分鐘后測(cè)量的拉曼散射光譜。此光譜包括一些峰，其中從加入酶之前的反應(yīng)溶液的拉曼散射光譜中觀察到的一些峰得到增強(qiáng)。
圖2A和圖2B顯示了其它酶反應(yīng)系統(tǒng)中鐵氰離子拉曼散射光譜的變化。圖2A顯示了在含有乳酸作為底物的反應(yīng)溶液中加入鐵氰離子并測(cè)量其拉曼散射光譜的結(jié)果，與圖1A類似，僅觀察到鐵氰離子微弱的拉曼散射峰。
另一方面，圖2B顯示了通過(guò)在含有乳酸和鐵氰離子的圖2A反應(yīng)溶液中加入作為酶的乳酸氧化酶(LOD)并在間隔幾分鐘后進(jìn)行測(cè)量所得的拉曼散射光譜。此拉曼散射光譜也包括峰，其中從加入酶之前的反應(yīng)溶液的拉曼散射光譜中觀察到的一些峰得到增強(qiáng)。
將圖1B和圖2B的光譜互相比較，增強(qiáng)的拉曼散射峰出現(xiàn)于相同的轉(zhuǎn)變波數(shù)處，這表明這些光譜的峰是相同物質(zhì)的拉曼散射光譜，盡管酶反應(yīng)系統(tǒng)彼此不同。應(yīng)理解盡管仍未闡明酶反應(yīng)的進(jìn)行是如何影響鐵氰離子的，但不論酶反應(yīng)的類型如何都會(huì)產(chǎn)生同樣的影響，其鐵氰離子受酶反應(yīng)影響且峰強(qiáng)度水平有所增強(qiáng)的拉曼散射峰存在于與激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)的轉(zhuǎn)變波數(shù)的1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1和2450至2580cm-1處。峰位置的具體例子是1574cm-1，1658cm-1，1872cm-1，2012cm-1，2081cm-1，2142cm-1，2374cm-1，2464cm-1，2562cm-1等等。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)行定性測(cè)量所根據(jù)的事實(shí)是酶反應(yīng)由這些拉曼散射峰的增強(qiáng)引起，即酶的靶底物存在于樣品溶液中，通過(guò)這些拉曼散射峰中的任何一個(gè)可進(jìn)行定量測(cè)量。另外，通過(guò)測(cè)量增強(qiáng)這些峰中任何一個(gè)的速度即可測(cè)量酶活性。
酶具有底物特異性和僅導(dǎo)致與特異性物質(zhì)(靶底物)有關(guān)的某個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)特異性。當(dāng)導(dǎo)致酶反應(yīng)時(shí)，在反應(yīng)的起始階段，其反應(yīng)產(chǎn)物以恒定的速度產(chǎn)生，然后在下文作為實(shí)施例描述的圖4所具體闡明的階段中反應(yīng)速度逐漸降低。下面等式(1)(稱為Michaelis-Nenten等式)，確立了酶反應(yīng)的起始階段反應(yīng)速度VO(反應(yīng)速度的最大值)和底物濃度[S]之間的關(guān)系VO＝(Vmax·[S])/([S]＋Km)(1)其中Vmax表示最大反應(yīng)速度，Km被稱作Michaelis常數(shù)，圖3(A)顯示了此等式。Michmelis常數(shù)Km為相應(yīng)于底物濃度[S]的值，[S]是當(dāng)反應(yīng)速度VO為Vmax/2時(shí)得到的，最大反應(yīng)速度Vmax和Michaelis常數(shù)Km提供了酶活性。
可以畫出圖3(A)所示的圖象，經(jīng)過(guò)改變底物濃度[S]而保持酶濃度不變并測(cè)量反應(yīng)速度VO，可估算最大反應(yīng)速度Vmax并得到Michaelis常數(shù)Km。
最大反應(yīng)速度Vmax是一漸近值，從圖3A的圖中不能正確地得到此值。已知使用Lineweaver-Burk作圖的方法可作為實(shí)驗(yàn)得到Michaelis常數(shù)Km的方法。如下所述將等式(1)的兩邊取倒數(shù)
1/VO＝(Km/Vmax)(1/[S])＋(1/Vmax)(2)等式(2)可表示為圖3B所示的橫坐標(biāo)軸為1/[S]，縱坐標(biāo)軸為1/VO的線性表示形式，而通過(guò)顯示在與底物濃度[S]有關(guān)的圖3B圖中實(shí)驗(yàn)得到的VO可實(shí)驗(yàn)得到Km和Vmax。
根據(jù)本發(fā)明，如上文所述，在酶反應(yīng)系統(tǒng)中加入鐵氰離子以得到拉曼散射峰增加速度的最大值VO，此峰增強(qiáng)的原因是鐵氰離子受酶反應(yīng)的影響，根據(jù)最大值VO和底物濃度[S]之間的等式(1)或(2)可得到酶活性。
本發(fā)明并不局限于上文所闡述的酶反應(yīng)。本發(fā)明也適用于氧化還原酶的酶反應(yīng)，如吡喃糖氧化酶、膽紅素氧化酶、膽甾醇氧化酶和多酚氧化酶以及其它類型的那些酶。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)測(cè)量拉曼散射光即可進(jìn)行底物的定性測(cè)量或定量測(cè)量，或進(jìn)行酶活性的測(cè)量，此散射光通過(guò)受酶反應(yīng)影響的鐵氯離子而增強(qiáng)，而經(jīng)簡(jiǎn)單的光學(xué)測(cè)量法即可測(cè)量酶反應(yīng)。
聯(lián)系附圖從下文對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述中可更明顯地看出本發(fā)明的上述和其它目的、特征、方面和優(yōu)點(diǎn)。
圖1A和圖1B分別闡明了在葡萄糖/葡萄糖氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中酶反應(yīng)之前和之后來(lái)自鐵氰離子的拉曼散射光譜；圖2A和圖2B分別闡明了在乳酸/乳酸氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中酶反應(yīng)之前和之后來(lái)自鐵氰離子的拉曼散射光譜；圖3A和圖3B分別顯示與酶反應(yīng)速度相關(guān)的Michaelis-Menten等式和Lineweaver-Burk作圖法；
圖4闡明了在2081cm-1的轉(zhuǎn)變波數(shù)處，被酶反應(yīng)增強(qiáng)的峰隨時(shí)間的變化；圖5闡明了在2081cm-1的轉(zhuǎn)變波數(shù)處，具有不同葡萄糖濃度的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的峰隨時(shí)間的變化；圖6顯示了根據(jù)圖5所示的測(cè)量結(jié)果形成的葡萄糖濃度校準(zhǔn)曲線；圖7是顯示進(jìn)行本發(fā)明的典型測(cè)量裝置的方塊圖；和圖8A和圖8B分別是顯示吸取180°增強(qiáng)散射和90°增強(qiáng)散射的元件部分的剖面圖。
在石英散射光元件中引入250μl用作底物的葡萄糖溶液(100mg/d1)，14.5μ用作酶的葡萄糖氧化酶以及250μl鐵氰化鉀溶液(0.5M)，用磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)PH至7.4以制備樣品溶液，依次將它們維持在25℃并使之反應(yīng)。He-Ne激光束作為激發(fā)射線被投射到反應(yīng)溶液上，其散射光按光譜成分分開以每隔10秒鐘測(cè)量一次在激發(fā)射線波長(zhǎng)的2081cm-1波數(shù)周圍轉(zhuǎn)變位置處峰的增長(zhǎng)，結(jié)果以符號(hào)＂a＂示于圖4。
當(dāng)反應(yīng)開始時(shí)，起始階段的峰強(qiáng)度基本上呈線性增長(zhǎng)，然后增長(zhǎng)速度有所降低。測(cè)量峰強(qiáng)度在起始階段呈線性增長(zhǎng)的反應(yīng)速度VO。
類似地，圖4顯示了在底物為乳酸，酶為乳酸氧化酶的反應(yīng)系統(tǒng)中加入鐵氰化鉀以導(dǎo)致反應(yīng)并測(cè)量2081cm-1轉(zhuǎn)變波數(shù)處相同峰的改變所得的結(jié)果，此結(jié)果以符號(hào)＂b＂表示。
至于反應(yīng)溶液，其中每份鐵氰化鉀溶液(0.5M)的量定為恒定值250μl，每份葡萄糖氧化酶的濃度定為恒定值14.5μ，每份葡萄糖底物的量定為恒定值250μl，而葡萄糖濃度可在250mg/dl，125mg/dl、100mg/dl、80mg/dl和50mg/dl中變化，圖5顯示了每隔10秒鐘測(cè)量在光散射光譜的2081cm-1轉(zhuǎn)變波數(shù)處的峰的強(qiáng)度變化所獲得的結(jié)果。
圖6表示在從圖5的結(jié)果所獲得的各葡萄糖濃度下的反應(yīng)速度最大值和葡萄糖濃度之間的相關(guān)性結(jié)果。圖6用作為獲得測(cè)量樣品溶液的未知葡萄糖濃度的校準(zhǔn)曲線。
為了對(duì)具有未知葡萄糖濃度的測(cè)量樣品進(jìn)行定量測(cè)量，類似于形成校準(zhǔn)曲線的情況，向250μl的測(cè)量樣品溶液中加入250ml鐵氰化鉀溶液(0.5M)和14.5U葡萄糖氧化酶，混和物調(diào)節(jié)至pH7.4，樣品溫度保持在25℃，以便例如能根據(jù)諸如2081cm-1的轉(zhuǎn)變波數(shù)處的峰等的規(guī)定峰的強(qiáng)度變化測(cè)量反應(yīng)速度的最大值。通過(guò)將測(cè)出的反應(yīng)速度最大值用于圖6的校準(zhǔn)曲線即可得到底物的葡萄糖濃度。
圖7闡明了測(cè)量本發(fā)明拉曼散射光的典型裝置，數(shù)1表示激發(fā)光源，例如它可由激光裝置形成以測(cè)量拉曼散射光?？捎蛇M(jìn)行連續(xù)振動(dòng)的Ar離子激光，Kr離子激光、He-Ne激光、He-Cd激光或NdYAG激光，或者脈沖激光制備的激光裝置可選自越過(guò)紫外區(qū)附近和紅外區(qū)附近的寬波長(zhǎng)范圍的激光。除激光裝置外也可使用鹵素?zé)艋蚱漕愃莆镒鳛楣庠矗@里假定將He-Ne激光用作光源1。數(shù)2表示控制光源1輸出的能源裝置。
數(shù)4表示帶通濾光器，它適用于從激光束12上切割邊帶，激光束12是從光源1振蕩出的。激光束12被分成樣品側(cè)面的激發(fā)射線12s和參照側(cè)面的參照射線12r，以致穿過(guò)波段通過(guò)的濾光器7以切割由半鏡5產(chǎn)生的波長(zhǎng)射線，再通過(guò)透鏡9即可使激發(fā)射線12s集中并投射到元件3上。
元件3是石英管狀散射光元件，它含有反應(yīng)溶液，例如可將它維持在恒定溫度25℃。鏡11a被放置于激發(fā)射線12s的投射方向以便能增強(qiáng)由元件3所含反應(yīng)溶液產(chǎn)生的散射光，從而使激發(fā)射線12s穿過(guò)元件3被傳送，然后被鏡11a反射又重新投射到元件3上，因此增強(qiáng)了拉曼散射。另一個(gè)鏡11b被放置于上激發(fā)射線12s的投射方向呈90°的方向以將激發(fā)射線反射到分光鏡22上，由元件3發(fā)出的散射光與激發(fā)射線以及被鏡11b反射的激發(fā)射線一起被集中透鏡16和20集中，并穿過(guò)濾光器21被分光鏡22集中。濾光器21適于切割激發(fā)光成分以僅將散射光成分引入分光鏡22中。分光鏡22和檢測(cè)器23由多波道檢測(cè)系統(tǒng)形成，此系統(tǒng)中有多色器，其中沿著分光鏡22的色散方向放置了多個(gè)檢測(cè)元件。數(shù)24表示檢測(cè)器控制部分以將各個(gè)波長(zhǎng)的輸出信號(hào)與多波道檢測(cè)器23分開。
分光鏡22可任選地由校驗(yàn)分光鏡制備，而檢測(cè)器23可由含有單個(gè)檢測(cè)元件的檢測(cè)器制備。在這種情況下就需要分光鏡控制部分25以校驗(yàn)分光鏡22的波長(zhǎng)。
另一方面，穿過(guò)半鏡5從激發(fā)射線12s分離的參照射線12r穿過(guò)鏡6彎向檢測(cè)器30，12r先穿過(guò)波段通過(guò)的濾光器8以切割由鏡6產(chǎn)生的波長(zhǎng)射線再投射到檢測(cè)器30上，以檢測(cè)光源強(qiáng)度。處理數(shù)據(jù)的運(yùn)算/輸出部處理數(shù)據(jù)的運(yùn)算/輸出部分31用顯示光源強(qiáng)度的參照射線側(cè)面檢測(cè)器30的檢測(cè)值校正了由分光鏡22和檢測(cè)器23發(fā)出的拉曼散射光的檢測(cè)值以得到拉曼散射光譜，因此從特異峰的強(qiáng)度變化可計(jì)算出反應(yīng)速度的最大值并將此值輸出。當(dāng)進(jìn)行定量測(cè)量時(shí)，處理數(shù)據(jù)的運(yùn)算/輸出部分31含有以前測(cè)量所形成的校準(zhǔn)曲線資料，由根據(jù)校準(zhǔn)曲線測(cè)量未知樣品所得的反應(yīng)速度最大值計(jì)算出底物濃度以輸出之。當(dāng)分光鏡22進(jìn)行波長(zhǎng)校驗(yàn)時(shí)，處理數(shù)據(jù)的計(jì)算/輸出部分31穿過(guò)分光鏡控制部分25進(jìn)行波長(zhǎng)校驗(yàn)。
圖8A和8B顯示了通過(guò)激發(fā)射線進(jìn)一步有效增強(qiáng)拉曼散射的典型元件。
參見圖8A，元件3a為圓底燒瓶的形狀，它是由如玻璃、石英或聚乙烯對(duì)苯二酸鹽的透明材料制成以用于貯存樣品溶液。元件3a被束縛于接合球狀元件支撐物10a中，元件支撐物10a具有反射性內(nèi)表面，元件支持物10a留有窗口以接收由激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)射線12s并以與投射方向呈180°的角度的方向吸收散射光。激發(fā)射線12s由鏡14彎曲并穿過(guò)元件支撐物10a的窗口被引入元件3a。
數(shù)16表示聚光透鏡，可用于聚集由元件支撐物10a的窗口發(fā)出的散射光。當(dāng)鏡14被設(shè)置于聚光透鏡16的光軸時(shí)，其孔徑與聚光透鏡16的孔徑相比足夠小，不會(huì)阻止聚光透鏡16聚集散射光。元件3a所貯存的樣品溶液使用的激發(fā)射線被元件支持物10a的內(nèi)表面重復(fù)反射，利用拉曼散射可將此射線從元件支撐物10a的窗口中取出并引向光譜檢測(cè)器。
參見圖8B，在另一方面，其元件支撐物10b留有窗口以吸取散射光，此散射光的方向與激發(fā)射線12s的投射方向呈90°。元件3a被束縛于具有反射內(nèi)表面的接合球狀元件支撐物10b中，而元件支撐物10b留有窗口以從Y方向引入激發(fā)射線12s，并在與Y方向呈90°角的x方向吸取散射光18。
拉曼散射可識(shí)別多個(gè)峰，其中鐵氰離子受酶反應(yīng)影響，而峰被增強(qiáng)，不僅可通過(guò)實(shí)施例中所用的轉(zhuǎn)變波數(shù)2081cm-1處的峰，通過(guò)任何其它峰都可進(jìn)行底物的定性測(cè)量或定量測(cè)量，或進(jìn)行酶活性的測(cè)量。
盡管已詳細(xì)描述和闡明了本發(fā)明，但仍應(yīng)清楚地理解這些描述和闡明僅僅是為了說(shuō)明和舉例的目的，而并不為了限制本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由附加的權(quán)利要求的詞語(yǔ)來(lái)限定。
權(quán)利要求
1.一種定性測(cè)量的方法，它包括下列步驟在已加入鐵氰離子的樣品溶液中加入酶；在加入所說(shuō)酶之前和之后用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射所說(shuō)樣品溶液，以接收來(lái)自所說(shuō)樣品溶液的散射光并按其光譜成分將所說(shuō)散射光分開；和根據(jù)所說(shuō)樣品溶液在加入所說(shuō)酶之后的拉曼散射光譜是否包括所說(shuō)樣品溶液在加入所說(shuō)酶之前的拉曼散射光譜的峰的增強(qiáng)峰即可測(cè)量所說(shuō)酶的靶底物存在與否。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)量方法，其特征在于用作拉曼散射峰的峰存在于與激發(fā)波長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)變波數(shù)1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1處。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)量方法，其特征在于所說(shuō)酶是氧化還原酶。
4.一種定量測(cè)量的方法，它包括下列步驟向含有已知濃度靶底物的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中加入恒定濃度的鐵氰離子和恒定單位的酶以導(dǎo)致酶反應(yīng)，用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射所說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液以接收來(lái)自所說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的散射光并將所說(shuō)散射光按光譜成分分開，在酶反應(yīng)前對(duì)多種靶底物濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液由所說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液拉曼散射光譜增強(qiáng)峰的峰強(qiáng)度值隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，以形成可顯示所說(shuō)靶底物濃度和所說(shuō)反應(yīng)速度之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線；和在含有未知濃度靶底物的待測(cè)樣品溶液中加入與形成所說(shuō)校準(zhǔn)曲線的測(cè)量中所用的那些濃度相同，單位相同的鐵氰離子和酶，用與上述類似的激發(fā)射線照射所說(shuō)待測(cè)樣品溶液，以由與形成所說(shuō)校準(zhǔn)曲線所用的那些相同的拉曼散射峰峰強(qiáng)度值隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，根據(jù)所說(shuō)的校準(zhǔn)曲線即可得到所說(shuō)測(cè)量樣品溶液的底物濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的測(cè)量方法，其中，用作拉曼散射峰的峰存在于與激發(fā)波長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)變波數(shù)1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1處。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的測(cè)量方法，其特征在于所說(shuō)酶是氧化還原酶。
7.測(cè)量酶活性的方法，它包括以下步驟在含有已知濃度靶底物的樣品溶液中加入恒定濃度的鐵氰離子和恒定單位的酶以導(dǎo)致酶反應(yīng)；用單一波長(zhǎng)的激發(fā)射線照射所說(shuō)樣品溶液以使所說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的散射光能被接收并按其光譜成分將所說(shuō)散射光分開；和在所說(shuō)酶反應(yīng)前，由所說(shuō)樣品溶液拉曼散射光譜增強(qiáng)峰的峰強(qiáng)度隨時(shí)間的改變測(cè)量反應(yīng)速度，根據(jù)所說(shuō)反應(yīng)速度即可得到酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的測(cè)量方法，其特征在于用作拉曼散射峰的峰存在于與激發(fā)波長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)變波數(shù)1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1處。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的測(cè)量方法，其特征在于所說(shuō)酶是氧化還原酶。
全文摘要
有關(guān)反應(yīng)溶液，其中每份鐵氰化鉀、葡萄糖氧化酶和葡萄糖底物的量規(guī)定為恒定值，而葡萄糖濃度可以改變，每隔10秒鐘測(cè)量光散射光譜轉(zhuǎn)變波數(shù)2081cm
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1159576SQ96107318
公開日1997年9月17日 申請(qǐng)日期1996年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月11日
發(fā)明者竇曉鳴, 山崎豐, 上野山晴三, 山口佳則 申請(qǐng)人:株式會(huì)社京都第一科學(xué)