專利名稱：具有酶活性的dna分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能裂解其它核酸分子，特別是RNA的核酸酶或催化性(具有酶活性的)DNA分子。本發(fā)明還涉及含有所公開的具有酶活性的DNA分子的組合物以及制備和使用該酶和組合物的方法。
背景對在其天然環(huán)境外部發(fā)揮作用或催化不代表天然條件的反應的催化劑的需要導致了“酶工程”技術的形成。在酶工程中采用的常規(guī)途徑是“理性設計”研究，依靠對天然酶的了解來幫助構建新的酶。不幸的是，在蛋白質結構和化學領域的熟練狀態(tài)不足以產(chǎn)生新的生物催化劑途徑。
最近，對形成新催化劑進行了不同的探討。該方法涉及構建大分子的異源庫并應用體外選擇程序從庫中分離催化所需反應的分子。從大分子庫中選擇催化劑不依賴于對其結構和化學特性的深入了解。因此，該方法稱為“非理性設計”(Brenner和Lerner，美國國家科學院院報895381-5383(1992))。
到目前為止涉及具有酶活性的DNA分子或核酶的理性設計的大多數(shù)努力未產(chǎn)生具有基本上新的或改進的催化功能的分子。然而，經(jīng)過模仿自然界生物的達爾文進化的，我們描述為“定向分子進化”或“體外進化”的過程應用非理性設計方法具有導致產(chǎn)生具有所需功能特征的DNA分子的潛力。
應用該技術對溶液中的RNA分子(例如，見Mills，等，美國國家科學院院報58217(1967)；Green，等，自然347406(1990)；Chowrira等，自然354320(1991)；Joyce，基因8283(1989)；Beaudry and Joyce，科學257635-641(1992)；Robertson andJoyce，自然344467(1990))以及對結合于附著在固相支持物上的配體上的RNA(Tuerk等，科學249505(1990)；Ellington，等，自然346818(1990))取得了不同程度的成功。它還應用于直接附著于固相支持物的肽(Lam，等，自然35482(1991))和在病毒衣殼蛋白內表達的肽抗原決定簇(Scott等，科學249386(1990)；Devlin，等，科學249249(1990)；Cwirla等，美國國家科學院院報876378(1990))。
催化性RNA的發(fā)現(xiàn)已超過十年(Kruger，等，細胞31147-157(1982)；Guerrier-Takada等，細胞35849-857(1983))。已知的天然存在的核酶數(shù)目不斷增長(見Cech，RNA世界，Gesteland和Atkins(編輯)，pp239-269，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約(1993)；Pyle，科學261709-716(1993)；Symons，當今結構生物學評論4322-330(1994))且最近幾年經(jīng)過體外進化獲得的合成核酶得到擴大。(例如，見Joyce，當今結構生物學評論4331-336(1994)；Breaker和Joyce，生物工程動向12268-275(1994)；Chapman和Szostak，當今結構生物學評論4618-622(1994))。
考慮到DNA含有大多數(shù)與RNA相同的官能基，似乎有理由假定DNA也具有催化活性。然而，除了某些病毒基因組和復制中間體外，在生物體中幾乎所有的DNA均以完整的雙螺旋存在，這妨礙了它形成復雜的二級和三級結構。因此不奇怪在自然界中未發(fā)現(xiàn)DNA酶。
在本發(fā)明出現(xiàn)前，具有核苷酸裂解能力的催化性DNA分子的設計，合成和應用尚未公開或證實。因此，本文公開的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明特別有意義的是它們突出了體外進化作為設計越來越多的有效催化性分子，包括裂解其它核酸，特別是RNA的具有酶活性的DNA分子的方法的潛力。
發(fā)明概述本發(fā)明因而包含能在限定的裂解位點裂解底物核酸(NA)序列的合成的或工程化的(即，非天然存在的)催化性DNA分子。本發(fā)明還包含具有核酸內切酶活性的具有酶活性的DNA分子。
在一個優(yōu)選的變化中，核酸內切酶活性對底物核酸序列中包含單鏈核酸的限定的裂解位點的核酸序列具有特異性。在另一個優(yōu)選的變化中，裂解位點是雙鏈核酸。同樣地，底物核酸序列可以是單鏈的，雙鏈的，部分單鏈或雙鏈的，環(huán)狀的或其任意組合。
在另一個包含的實施方案中，底物核酸序列包括一個或多個核酸類似物。在一個變化中，底物核酸序列是較大分子的一部分或附著于其上。
在各種實施方案中，較大的分子選自RNA，修飾的RNA，DNA，修飾的DNA，核苷酸類似物或其組合。在另一實施例中，較大分子包含核酸序列和非核酸序列的組合。
在另一實施方案中，本發(fā)明包含的底物核酸序列包括一個或多個核苷酸類似物。進一步的變化包含單鏈核酸包括RNA，DNA，修飾的RNA，修飾的DNA，一個或多個核酸類似物，或其任意組合。在公開的發(fā)明的一個實施方案中，核酸內切酶活性包括在裂解位點水解磷酯鍵。
在各種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的催化性DNA分子全部或部分是單鏈。這些催化性DNA分子可優(yōu)選采取與其催化活性一致的各種形狀。因此，在一個變化中，本發(fā)明的催化性DNA分子包括一個或多個發(fā)夾環(huán)結構。在另一個變化中，催化性DNA分子可呈與“錘頭”核酶相似的形狀。在其它實施方案中，催化性DNA分子可以呈與嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)核酶，例如來自I組內含子的核酶相似的構象。
同樣地，本發(fā)明優(yōu)選的催化性DNA分子能不管底物分子的原始取向而表現(xiàn)出位點特異性核酸內切酶活性。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子能裂解與具有酶活性的DNA分子分離的，即不聯(lián)接到DNA酶(DNAzyme)上的底物核酸序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，具有酶活性的DNA分子能裂解附著的底物核酸序列，即，它能進行與自我裂解相似的反應。
本發(fā)明還包含具有核酸內切酶活性的具有酶活性的DNA分子(催化性DNA分子，脫氧核酸或DNAzymes)，其中核酸內切酶活性需要存在二價陽離子。在各種優(yōu)選的，任選的實施方案中，二價陽離子選自Pb2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，和Ca2+。另一變化中包含的核酸內切酶活性需要存在單價陽離子。在這類任選的實施方案中，單價陽離子優(yōu)選選自Na+和K+。
在本發(fā)明的各種優(yōu)選的實施方案中，具有酶活性的DNA分子包含選自SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 14；SEQ ID NO 16；SEQ IDNO 17，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20；SEQ ID NO 21；和SEQ ID NO 22的核苷酸序列。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的催化性DNA分子包含選自SEQ ID NO 23；SEQ ID NO 24；SEQ ID NO 25；SEQ ID NO 26；SEQ IDNO 27；SEQ ID NO 28；SEQ ID NO 29；SEQ ID NO 30；SEQ ID NO 31；SEQ ID NO 32；SEQ ID NO 33；SEQ IDNO 34；SEQ ID NO 35；SEQ ID NO 36；SEQ ID NO 37；SEQ ID NO 38；和SEQ ID NO 39的核酸序列。
另一優(yōu)選的實施方案涉及本發(fā)明的催化性DNA分子包括選自SEQID NO 50和SEQ ID NO 51的核酸序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的催化性DNA分子包括選自SEQ ID NOS 52至101的核苷酸序列。正如本文所公開的，還包含具有基本上與本文公開的序列相似的序列的催化性DNA分子。因此可對本文描述的分子進行各種取代，缺失，插入，重復和其它突變以產(chǎn)生各種其它有用的具有酶活性的DNA分子，以及所說的分子表現(xiàn)出本文所公開的位點特異性裂解活性，它們在本說明書的范圍內。
在本發(fā)明的另一變化中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子優(yōu)選具有大約1μM或更少的底物結合親和力。在另一實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子結合具有KD小于大約0.1μM的底物。
本發(fā)明還公開了具有有用的轉換率的具有酶活性的DNA分子。在一個實施方案中，轉換率小于5hr-1；在一個優(yōu)選的實施方案中，轉換率小于大約2hr-1；在一個更優(yōu)選的實施方案中，轉換率小于1hr-1；在甚至更優(yōu)選的實施方案中，轉換率是大約0.6hr-1或更少。
在另一實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子表現(xiàn)出有用的轉換率，其中kobs少于1min-1，優(yōu)選少于0.1min-1，更優(yōu)選少于0.01min-1，甚至更優(yōu)選少于0.005min-1。在一個變化中，kobs的值是大約0.002min-1或更少。
本發(fā)明還包含所公開的DNA酶的催化率完全合適的實施方案。因此，在各種優(yōu)選的實施方案中，由于存在Mg2+而提高的反應Km大約是0.5-20mM，優(yōu)選大約1-10mM，更優(yōu)選大約2-5mM。
本發(fā)明還包含其中核苷酸序列限定的裂解位點包含至少一個核苷酸的實施方案。在各種其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的催化DNA分子能識別和裂解2個或更多個核苷酸的核苷酸序列限定的裂解位點。
在各種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子包含兩側有一個或多個底物結合區(qū)的保守核心。在一個實施方案中，具有酶活性的DNA分子包括第一和第二底物結合區(qū)。在另一實施方案中，具有酶活性的DNA分子包括2個或多個底物結合區(qū)。
正如前面所提到的，本發(fā)明優(yōu)選的催化性DNA分子也可包括一個保守核心。在一個優(yōu)選的實施方案中，保守的核心包括一個或多個保守的區(qū)域。在其它優(yōu)選的變化中，一個或更多個保守的區(qū)域包括選自CG；CGA；AGCG、AGCCG；CAGCGAT；CTTGTTT和CTTATTT的核苷酸序列(例如，見圖3)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子進一步包括在保守核心中的保守區(qū)域間的一個或多個可變的或間隔子核苷酸。在另一實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子進一步包括在保守核心和底物結合區(qū)之間的一個或多個可變的或間隔子核苷酸。
在一個變化中，第一底物結合區(qū)優(yōu)選包括選自CATCTCT；GCTCT；TTGCTTTTT；TGTCTTCTC；TTGCTGCT；GCCATGCTTT(SEQ ID NO 40)；CTCTATTTCT(SEQ ID NO41)；GTCGGCA；CATCTCTTC和ACTTCT的核苷酸序列。在另一優(yōu)選的變化中，第二底物結合區(qū)包括選自TATGTGACGCTA(SEQ IDNO 42)；TATAGTCGTA(SEQ ID NO 43)；ATAGCGTATTA(SEQ ID NO 44)；ATAGTTACGTCAT(SEQ ID NO 45)；AATAGTGAAGTGTT(SEQ ID NO 46)；TATAGTGTA；ATAGCGGT；ATAGGCCCGGT(SEQ ID NO 47)；AATAGTGAGGCTTG(SEQ ID NO 48)和ATGNTG的核苷酸序列。
在本發(fā)明的各種實施方案中，底物結合區(qū)長度可改變。因此，例如底物結合區(qū)可包括單個核苷酸到幾十個核苷酸。然而，據(jù)了解底物結合區(qū)大約3-25個核苷酸長，優(yōu)選大約3-15個核苷酸長，更優(yōu)選大約3-10個核苷酸長。在各種實施方案中，底物結合區(qū)中的單個核苷酸能與底物分子中的核苷酸形成互補堿基對；在其它實施方案中，形成非互補堿基對。還包含的互補及非互補堿基配對的混合物也在本發(fā)明公開的實施方案的范圍內。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的催化性DNA分子可進一步包括第三底物結合區(qū)域。在一些優(yōu)選的實施方案中，第三區(qū)域包括選自TGTT；TGTTA和TGTTAG的核苷酸序列。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案公開的具有酶活性的DNA分子進一步包含位于底物結合區(qū)之間的一個或多個可變的或“間隔子”區(qū)。
在另一公開的實施方案中，本發(fā)明包含從其它DNA分子和寡核苷酸中分離出的純化的合成具有酶活性的DNA分子，該具有酶活性的DNA分子具有核酸內切酶活性，其中核酸內切酶活性對底物核酸序列中包含單鏈或雙鏈核酸的核苷酸序列限定的裂解位點具有特異性。在一個變化中，公開了具有核酸內切酶活性的合成(或改造的)具有酶活性的DNA分子，其中，核酸內切酶活性對基本上由底物核酸序列的單鏈或雙鏈區(qū)組成的核苷酸序列限定的裂解位點具有特異性。
在另一實施方案中，本發(fā)明包含的具有酶活性的DNA分子包含具有催化活性的脫氧核糖核苷酸多聚體以水解含核酸的底物以產(chǎn)生底物裂解產(chǎn)物。在一個變化中，水解以點特異性方式發(fā)生。如前面所述，多聚體可以是單鏈，雙鏈或兩者的某種組合。
本發(fā)明進一步涉及包含核酸序列的底物。在各種實施方案中，核酸序列底物包含RNA，修飾的RNA，DNA，修飾的DNA，一個或多個核苷酸類似物或前述的任意組合。一種實施方案涉及的底物包括單鏈片段；還有另一實施方案包含的底物是雙鏈的。
本發(fā)明還涉及包含具有催化活性的脫氧核糖核苷酸多聚體的具有酶活性的DNA分子，它水解含核酸的底物以產(chǎn)生裂解產(chǎn)物。在一個變化中，具有酶活性的DNA分子具有對底物的有效結合親和力并缺乏對裂解產(chǎn)物的有效結合親和力。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明公開了一種非天然存在的具有酶活性的DNA分子，包含限定了保守核心的核苷酸序列及兩側的識別區(qū)，可變區(qū)和間隔區(qū)。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸序列限定了一個與分子5′端連續(xù)或相鄰的第一可變區(qū)，位于第一可變區(qū)3′端的第一識別區(qū)，位于第一識別區(qū)3′端的第一間隔區(qū)，位于第一間隔區(qū)3′端的第一保守區(qū)，位于第一保守區(qū)3′端的第二間隔區(qū)；位于第二間隔區(qū)3′端的第二保守區(qū)，位于第二保守區(qū)3′端的第二識別區(qū)，位于第二識別區(qū)3′端的第二可變區(qū)。
在另一實施方案中，核苷酸序列優(yōu)選限定與分子5′端連續(xù)或相鄰的第一可變區(qū)，位于第一可變區(qū)3′端的第一識別區(qū)，位于第一識別區(qū)3′端的第一間隔區(qū)，位于第一間隔區(qū)3′端的第一保守區(qū)，位于第一保守區(qū)3′端的第二間隔子區(qū)，位于第二間隔子區(qū)3′端的第二保守區(qū)，位于第二保守區(qū)3′端的第二識別區(qū)；位于第二識別區(qū)3′端的第二可變區(qū)；位于第二可變區(qū)3′端的第三識別區(qū)。
在上述的一個變化中，該分子包括一個保守的核心區(qū)及側翼的2個底物結合區(qū)；在另一變化中，保守核心區(qū)包含一個或多個保守區(qū)。在另一優(yōu)選的實施方案中，保守核心區(qū)進一步包含一個或多個可變的或間隔子核苷酸。在另一實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子進一步包含一個或多個間隔子區(qū)域。
本發(fā)明進一步包含許多種組合物。例如，公開了包括上文所述的具有酶活性的DNA分子的組合物并在本文中涉及。在一個任選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括如上面所述的具有酶活性的DNA分子的2種或多種群體，其中各群體中的具有酶活性的DNA分子能識別不同的底物。在各種實施方案中，還優(yōu)選包括單價或多價陽離子的組合物。
本發(fā)明進一步包含產(chǎn)生，選擇和分離本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的方法。在一個變化中，選擇在特異性位點裂解核酸序列(例如RNA)的具有酶活性的DNA分子的方法包括下列步驟(a)獲得推定的具有酶活性的DNA分子的群體，不管該序列是天然存在的還是合成的，且優(yōu)選的是，它們是單鏈DNA分子；(b)將含核苷酸的底物序列與上述DNA分子的群體混合以形成混合物；(c)在預定反應條件下維持混合物足夠長的時間使群體中推定的具有酶活性的DNA分子引起底物序列的裂解，從而產(chǎn)生底物裂解產(chǎn)物；(d)從底物序列和底物裂解產(chǎn)物中分離DNA分子群體；(e)從群體中分離在特異性位點裂解底物核酸序列(例如RNA)的DNA分子。
在上述方法的進一步變化中，在特異性位點裂解底物核酸序列的DNA分子用固定化試劑標記。在一個實施例中，該試劑包含生物素。
在上述方法的另一變化中，經(jīng)過使用為這一目的構建的具有酶活性的DNA分子選擇希望裂解的序列(例如，預定的“靶”核苷酸序列)開始。因此，在一個實施方案中，預選(或預定)的“靶”序列經(jīng)過將它附著或標記到含一個或多個任選序列或片段的脫氧核糖核酸序列上用于產(chǎn)生能在特異性位點裂解底物核酸序列的DNA分子的群體。在一個變化中，任選的序列大約40個核苷酸長；在另一個變化中，任選的序列大約50個核苷酸長。本發(fā)明還包含任選的序列長1-40，40-50和50-100個核苷酸。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用于產(chǎn)生具有酶活性的DNA分子的群體的核苷酸序列選自SEQ ID NO 4，23，50和51。在另一實施方案中，“靶”或“底物”核苷酸序列包含1或多個核苷酸的序列，例如，見SEQ ID NOS 4和23及SEQ ID NO 49的相關部分。本發(fā)明還包含的有用的“靶”或“底物”核苷酸序列還包括DNA，RNA或其組合物。
本發(fā)明還包含如上文所述的方法，其中分離步驟進一步包含將標記的DNA分子與具有抗生物素蛋白連接于其上的固相表面接觸，從而標記的DNA分子附著到固相表面。如上所述，底物可以是RNA，DNA，兩者的組合物或包括核苷酸序列的分子。
本發(fā)明還包含在特異性裂解位點專一性地裂解底物核酸序列的方法，包含的步驟是(a)提供能在特異性裂解位點裂解底物核酸序列的具有酶活性的DNA分子；(b)將具有酶活性的DNA分子與底物核酸序列接觸以引起在裂解位點特異性地裂解核酸序列。在一個變化中，具有酶活性的DNA分子是非天然存在的(或合成的)DNA分子。在另一變化中，具有酶活性的DNA分子是單鏈的。
在上述方法的另一變化中，底物包含核酸。在各種實施方案中，底物核酸包含RNA，修飾的RNA，DNA，修飾的DNA，一個或多個核苷酸類似物，或上述的任意組合物。在另一實施方案中，特異性裂解由具有酶活性的DNA分子的核酸內切酶活性引起。本文還包含反應條件的改變，如pH，溫度，陽離子百分數(shù)，酶百分數(shù)，底物百分數(shù)和產(chǎn)物百分數(shù)的調整。
本發(fā)明還包含裂解磷酯鍵的方法，包括(a)將能在限定的裂解位點裂解底物核酸序列的催化性DNA分子與含磷酯鍵的底物混合以形成反應混合物；(b)在預定反應條件下維持混合物以使具有酶活性的DNA分子裂解磷酯鍵，從而產(chǎn)生底物產(chǎn)物的群體。在一個實施方案中，具有酶活性的DNA分子能以位點特異性方式裂解磷酯鍵。在另一實施方案中，該方法進一步包括步驟(c)從催化性DNA分子中分離出產(chǎn)物和(d)將另外的底物加入具有酶活性的DNA分子中以形成新反應混合物。
本發(fā)明還包含構建裂解磷酯鍵的具有酶活性的DNA分子的方法。一個舉例性的方法包括下列步驟(a)獲得單鏈DNA分子的群體；(b)將遺傳變化導入群體以產(chǎn)生變化的群體；(c)從變化的群體中選擇符合預定選擇標準的個體；(d)從變化群體的殘留物中分離選擇的個體及(e)擴增選擇的個體。
附圖簡述

圖1說明了用于分離裂解靶RNA磷酯的DNA的選擇性擴增程序。如圖所示，含一段50個隨機核苷酸的雙鍵DNA(上面以具有“N50”的分子表示它)采用在3′端以腺嘌呤核糖核苷酸(rA)終止的5′生物素標記的DNA引物經(jīng)PCR擴增。(生物素標記以帶圈的字母“B”表示)。該引物經(jīng)Taq聚合酶延伸以產(chǎn)生含單個包埋的核糖核苷酸的DNA產(chǎn)物。所得的雙鏈DNA固定在鏈霉抗生物素蛋白基質上，經(jīng)過用0.2N NaOH洗滌去掉未標記上生物素的DNA鏈。用緩沖液重新平衡柱后，用加有1mM PbOAc的相同溶液洗柱。進行Pb2+依賴性自我裂解的DNA從柱上釋放出來，收集于洗脫液中并經(jīng)PCR擴增。然后PCR產(chǎn)物用于開始下一輪的選擇性擴增。
圖2顯示了在鉛離子(Pb2+)存在的條件下，開始的DNA(GO)庫和第一至第5輪選擇(G1-G5)后獲得的群體的自我裂解活性。標記Pre代表108個核苷酸前體DNA(SEQ ID NO 4)；Clv，28核苷酸5′裂解產(chǎn)物(SEQ ID NO 5)；M，引物3a(SEQ ID NO 6)相應于5′裂解產(chǎn)物的長度。
圖3顯示從五輪選擇后的群體分離的單個變異體的序列對比。固定的底物區(qū)在頂部顯示，帶有用倒三角指定的靶核糖腺苷酸(adenylate)通常在推定的堿基配對相互作用中涉及的底物核苷酸用垂直棒表示。相應于50個最初任選的核苷酸的序列與底物區(qū)進行反向平行序列對比。所有的變異體以固定的序列5′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′(未顯示；SEQ ID NO 1)作3′末端。推測與底物區(qū)形成堿基對的開始任選的區(qū)域內的核苷酸在圖的右和左側表示；具有酶活性的DNA分子推測的堿基對形成區(qū)分別位于各序列所示的盒中。保守區(qū)以兩個大的，位于中央的盒表示。
圖4A和4B顯示隨催化轉換進行的分子間反應中RNA磷酯的DNA催化裂解。圖4A是代表在19聚體底物(3′-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5′，SEQ ID NO 2)和38聚體DNA酶(5′-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA-3′，SEQ ID NO 3)之間形成的復合物的示意圖。該底物含單個腺苷核糖核苷酸(“rA”，與箭頭相鄰)，側翼為脫氧核苷酸。合成的DNA酶是圖3所示的最頻繁出現(xiàn)的變異體的38核苷酸部分。位于推測的催化區(qū)內的高度保守的核苷酸位于盒內。如圖所示，一個保守的序列是“AGCG”，另一個是“CG”(按5′→3′方向閱讀)。
圖4B顯示用于測定在與體外選擇采用的相同的條件下DNA催化裂解[5′-32P]標記的底物的Km(負斜率)和Vmax(y-截距)的Eadie-Hofstee標繪圖。對于含有5nM DNA酶和0.125，0.5，1，2，或4μM底物的反應測定裂解的起始速率。
圖5是顯示聚丙烯酰胺凝膠的照片，顯示了選擇的催化性DNA4個家族的特異性核酸內切酶活性。以平行的方式重復Pb2+依賴性分子家族的選擇作為對照(第一組)。在第二組中，Zn2+用作陽離子；在第三組中，陽離子是Mn2+；在第四組中，陽離子是Mg2+。凝膠上的第5個位點僅由裂解產(chǎn)物組成，作為標記。
如上所述，在上述四組的每個內有3條泳道。在每組的3條泳道中，第一條泳道顯示在缺乏金屬陽離子的條件下選定的群體缺乏活性，第二條泳道顯示在存在金屬陽離子的條件下觀察到的活性，第三條泳道顯示起始庫(GO)缺乏活性。
圖6A和6B分別提供了“祖先”催化性DNA分子和本文公開的選擇性擴增方法獲得的一些催化性DNA分子之一的二維示意圖。圖6A顯示了起始庫的舉例性分子，顯示了由SEQ ID NO 23代表的分子的總的構象。如圖所示，在隨機(N40)區(qū)的兩側是各種互補核苷酸。圖6B代表一個經(jīng)本文描述的方法產(chǎn)生的Mg2+依賴性催化性DNA分子(或“DNA酶”)的示意圖。底物核酸中的核糖核苷酸位置在圖6A和6B中以箭頭表示。
圖7顯示了基本上按下文實施例5所述進行的10輪體外選擇性擴增的一些結果。如圖所示，出現(xiàn)的催化劑的兩個位點和2個家族表現(xiàn)出最有效地裂解靶序列。裂解條件基本上如圖7所示，即10mM Mg2+，pH7.5和37℃；反應進行2小時后得到的資料如圖所示。裂解率(％)以對代數(shù)(0至10)的點表示。能在底物所示位點裂解靶序列的催化性DNA分子的數(shù)目/總數(shù)以垂直棒表示，在G↓UAACUAGAGAU位裂解以條紋棒表示，在GUAACUA↓GAGAU位裂解以空心棒(略帶陰影)。
圖8顯示了本發(fā)明的2個催化性DNA分子，克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位點和轉換率。反應條件如圖所示，即，10mMMg2+，pH 7.5和37℃。以克隆8-17限定的DNA酶在左側顯示，RNA底物的裂解位點以箭頭表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-與DNA酶分離(即，顯示分子間裂解)-如此標記。同樣，本文以10-23表示的DNA酶在右側表示，RNA底物的裂解位點以箭頭表示。還顯示了底物序列。對于8-17酶，轉換率大約為0.6hr-1；對于10-23酶，轉換率大約為1hr-1。非互補性配對以實心環(huán)(·)表示，而互補性配對以垂直線(|)表示。
圖9進一步顯示了本發(fā)明的2個催化性DNA分子，克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位點和轉換率。反應條件如圖所示，即10mMMg2+，pH 7.5和37℃。與圖8一樣，鑒定為克隆8-17的DNA酶在左側表示，RNA底物的裂解位點以箭頭表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-與DNA酶分離(即，顯示分子內裂解)-如此標記。同樣，本文鑒定為10-23的DNA酶在右側顯示，RNA底物的裂解位點以箭頭表示。還顯示了底物序列。對于8-17酶，kobs大約為0.002min-1；對于10-23酶，kobs值大約為0.01min-1。非互補性配對用實心環(huán)(·)表示，而互補配對以垂直線(|)表示。
詳細描述A.定義本文使用的術語“脫氧核糖酶”用于描述能發(fā)揮酶的功能的含DNA的核酸。在本說明書中，術語“脫氧核糖酶”(deoxyribozymes)包括核糖核酸內切酶和脫氧核糖核酸內切酶，盡管特別優(yōu)選具有核糖核酸內切酶活性的脫氧核糖酶。本文用于可與脫氧核糖酶互換的其它術語是“具有酶活性的DNA分子”，“DNA酶”或“催化性DNA分子”，這些術語應全部理解為包括其酶活性的部分，不管它們是經(jīng)合成生產(chǎn)還是來自生物體或其它來源。
術語“具有酶活性的DNA分子”還包括在底物結合區(qū)與特異性寡核苷酸靶或底物具有互補性的DNA分子，該分子還具有對特異性地裂解寡核苷酸底物具活性的酶活性。換句話說，具有酶活性的DNA分子能裂解分子間的寡核苷酸底物。這一互補功能允許具有酶活性的DNA分子與底物寡核苷酸的充分雜交，使底物發(fā)生分子間裂解。盡管優(yōu)選百分之百(100％)的互補性，但75-100％范圍內的互補性也是有用的并在本發(fā)明中涉及。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可任選描述為具有核酸酶或核糖核酸酶活性。這些術語在本文中可互換使用。
本文所用的術語“具有酶活性的核酸”包含酶RNA或DNA分子、酶RNA-DNA多聚體，及其酶活性部分或衍生物，盡管具有酶活性的DNA分子是根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的酶活性分子類型。
本文使用的術語“脫氧核糖核酸內切酶”是能裂解主要包含DNA的底物的酶。本文使用的術語“核糖核酸內切酶”是能裂解主要包含RNA的底物的酶。
本文使用的術語“堿基對”(bp)一般用于描述腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)間的配對關系，盡管可預料到堿基A，T，C和G(以及U)的罕見類似物可能偶爾摻入堿基對中，當DNA或RNA采用雙鏈構象時正常配對的核苷酸在本文也稱為“互補堿基”。
“互補核苷酸序列”一般指與另一單鏈寡核苷酸足夠互補并因此以形成的氫鍵與其進行特異性雜交的DNA或RNA的單鏈分子或片段中的核苷酸序列。
“核苷酸”一般指由糖部分(戊糖)，磷酸基和含氮雜環(huán)堿基組成的DNA或RNA單體單位。堿基經(jīng)糖苷碳(戊糖上的1′碳)連接到糖基上，堿基和糖的組合是“核苷”。當核苷含有一個結合到戊糖3′或5′位的磷酸基時，將它稱為核苷酸。有效連接的核苷酸的序列本文典型地稱為“堿基序列”或“核苷酸序列”和其語法上的相當物，本文以其從左到右方向是5′端至3′端的常規(guī)方向的通式代表，除非另有限定。
“核苷酸類似物”一般指結構上不同于A，T，G，C或U，但足以相似地取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。本文所用的術語“核苷酸類似物”包含改變的堿基，不同或不常見的糖類(即，不同于“通用”戊糖的糖類)，或兩者的組合。在下文C部分中提供了堿基已改變的舉例性的類似物目錄。
“寡核苷酸或多核苷酸”一般指單鏈或雙鏈核苷酸多聚體。本文使用的“寡核苷酸”和其語法上的相當物包括全部范圍的核酸。寡核苷酸典型地指由核糖核苷酸的線型鏈組成的核酸分子。精確的大小取決于許多因素，而這些因素又取決于所用的最終條件，正如本領域所熟知的。
本文所用的術語“生理條件”指模仿在哺乳動物、尤其是人類中發(fā)現(xiàn)的建議的反應條件。盡管諸如溫度，陽離子的可獲得性和pH范圍的變化可如下文的更詳細的描述而變化，但“生理條件”一般包括大約35-40℃的溫度，特別優(yōu)選37℃，以及大約7.0-8.0的pH，特別優(yōu)選7.5，進一步包含陽離子的可獲得性，優(yōu)選二價和/或單價陽離子，特別優(yōu)選大約2-15mM濃度的Mg2+和0-1.0M Na+。本文所用的“生理條件”可任選包括存在自由核苷輔因子。如上文所述，優(yōu)選的條件在下面作更詳細的描述。
R.具有酶活性的DNA分子在各種實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可組合一個或多個修飾或突變，包括添加，缺失和取代。在任選的實施方案中，可使用產(chǎn)生隨機或特定突變或修飾的方法產(chǎn)生該突變或修飾。例如，這些突變可一個環(huán)，間隔子區(qū)域或識別序列(或結構域)的長度或改變其核苷酸。在一個催化活性具有酶活性的DNA分子內的一個或多個突變可與第二個催化活性具有酶活性的DNA分子內的突變組合以產(chǎn)生含兩個分子都有突變的新具有酶活性的DNA分子。
在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可使用本領域的技術人員熟知的各種方法將隨機突變導入其中。例如，Cadwell和Joyce所述的方法(PCR方法和應用228-33(1992))對于本文所公開的用途特別優(yōu)選，其中一些修飾將在下面實施例中描述。(也見Cadwell和Joyce，PCR方法和應用3(增刊)S136-S140(1994))。根據(jù)這一修飾的PCR方法，可將隨機點突變導入克隆的基因。
例如，上述方法已用于誘變編碼核酶的基因，經(jīng)序列分析測定每位點突變率為0.66％±0.13％(95％置信區(qū)間)，關于堿基取代的類型觀察不到較強的偏好性。這允許將隨機突變導入本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的任意位點。
在導入限定或隨機突變中有用的另一方法在Joyce和Inoue，核酸研究17711-722(1989)中公開。隨后的方法涉及切除雙鏈DNA的模板(編碼)鏈，用包含誘變寡核苷酸的模板鏈重建，及部分誤配模板的隨后轉錄。這允許在該分子的任意位置導入限定的或隨機突變，包括在選定位置含已知或隨機核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可根據(jù)分子的類型和功能合適地改變長度和折疊方式。例如，具有酶活性的DNA分子可以是大約15到大約400或更多核苷酸的長度，盡管為了避免因使其太大或笨重而限制分子的治療用途，優(yōu)選長度不超過大約250個核苷酸。在各種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子至少是大約20個核苷酸長，盡管有用的分子可能超過100個核苷酸長，但優(yōu)選的分子一般不超過大約100個核苷酸長。
在各種治療應用中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子包含脫氧核糖酶的酶活性部分。在各種實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子優(yōu)選包含不超過大約200個核苷酸。在其它實施方案中，本發(fā)明的脫氧核糖酶包含不超過大約100個核苷酸。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的脫氧核酶大約20-75個核苷酸長，更優(yōu)選大約20-65個核苷酸長。其它優(yōu)選的具有酶活性的DNA分子大約10-50個核苷酸長。
在其它應用中，具有酶活性的DNA分子可具有相似于“錘頭”核酶的構象。該具有酶活性的DNA分子優(yōu)選不超過大約75-100個核苷酸長，特別優(yōu)選大約20-50個核苷酸長。
一般來說，如果試圖合成按本文所公開的用途的分子，具有酶活性的核酸分子越大，合成越困難。本領域的技術人員顯然可預料這些設計難度。盡管如此，這類較大的分子也在本發(fā)明的范圍內。
還應明白本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可包含脫氧核糖酶的酶活性部分，或可包含具有一個或多個突變，例如，具有一個或多個堿基對形成序列或間隔子缺乏或修飾的脫氧核酶，只要該缺失，增加或修飾對該分子作為酶的能力無有害影響。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的識別區(qū)典型地包含在催化區(qū)兩側的2個核苷酸序列，典型地含有至少大約3到大約30個堿基的序列，優(yōu)選大約6到大約15個堿基，由于具有酶活性的DNA分子的高度序列特異性，它能與底物核酸內的堿基互補序列雜交。以熟知的方法對識別位點進行的修飾或突變允許改變具有酶活性的核酸分子的序列特異性(例如，見Joyce等，核酸研究17711-712(1989))。
本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子還包括改變的識別位點或區(qū)域。在各種實施方案中，這些改變的識別區(qū)賦予包括該識別區(qū)的具有酶活性的核酸分子單一的序列特異性。存在于識別區(qū)的精確的堿基確定了發(fā)生裂解的堿基序列。底物核酸的裂解在識別區(qū)發(fā)生。該裂解在底物裂解序列上產(chǎn)生2′，3′，或2′，3′-環(huán)磷酸基及在開始位于原始底物的底物裂解序列3′的核苷酸上產(chǎn)生5′羥基。經(jīng)過改變存在于識別序列(內部指導序列)的堿基可將裂解改向到選定的堿基。見Murphy et al.，美國國家科學院院報869218-9222(1989)。
而且，為了利于在具有酶活性的DNA分子和其底物間的識別和結合，加入多胺可能有用。有用的多胺的例子包括亞精胺，腐胺或精胺。大約1mM的亞精胺濃度在具體實施方案中有效，而從大約0.1mM到大約10mM的濃度范圍也可能有用。
在各種任選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子已增強或優(yōu)化了裂解核酸底物，優(yōu)選RNA底物的能力。正如本領域的技術人員可預料到的，酶催化的反應的速率隨底物和酶濃度而變化，一般來說，在高底物或酶濃度時達到平衡。考慮到這些影響，在下面限定反應的術語中描述酶催化的反應的動力學。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子增強的或優(yōu)化的裂解RNA底物的能力可在存在具有酶活性的DNA分子的條件下隨標記的RNA底物量的改變在裂解反應中測定。裂解底物的能力一般以催化速率(kcat)除以米氏(Michaelis)常數(shù)(KM)來限定。符號kcat代表當?shù)孜锝咏柡椭禃r的酶反應的最大速率。KM代表反應速率是最大值的一半時的底物濃度。
例如，KM和kcat的值可在本發(fā)明中以底物濃度[S]超過具有酶活性的DNA分子濃度[E]的實驗來確定。從起始線性期估測在一個底物濃度范圍內的反應起始速率(vo)，一般是在反應的前5％或更少的時期。以最小二乘方法使數(shù)據(jù)點回歸到等式v＝-KM(vo/[S]+Vmax給出的理論直線上。因此，以反應起始速率vo和底物濃度[S]測定kcat和KM。
在各種任選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子增強或優(yōu)化了裂解核酸底物，優(yōu)選RNA底物的能力。在優(yōu)選的實施方案中，增強的或優(yōu)化的具有酶活性的DNA分子裂解RNA底物的能力顯示出比未催化的速率提高大約10-109倍。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子能以比“祖先”種類提高大約103-107倍的速率裂解RNA底物。在更優(yōu)選的實施方案中，增強的或優(yōu)化的裂解RNA底物的能力以相對祖先種類提高104-106倍來表達。本領域的技術人員可預料到增強的或優(yōu)化的具有酶活性的DNA分子裂解核酸底物的能力可根據(jù)在本發(fā)明的體外進化程序期間所用的選擇條件而改變。
本發(fā)明修飾脫氧核酶和其它具有酶活性的DNA分子和核酸酶的各種優(yōu)選的方法在下文實施例1-3中進一步描述。
C.核苷酸類似物如上所述，本文使用的術語“核苷酸類似物”一般指結構上不同于A，T，G，C或U但足以對核酸分子中的該“正?！焙塑账徇M行相似取代的嘌呤或嘧啶核苷酸。本文使用的術語“核苷酸類似物”包含改變的堿基，不同(或不常見)糖類，改變的磷酸主鏈或這些改變的任意組合。根據(jù)本發(fā)明有用的核苷酸類似物的例子包括下表中所列的那些，其中大多數(shù)在37 CFR§1.822的批準的修飾堿基表中發(fā)現(xiàn)(本文引用以供參考)。
表1核苷酸類似物縮寫描述ac4c4-乙酰胞苷chm5u 5-(羧羥基甲基)尿苷cm 2′-O-甲基胞苷cmnm5s2u5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷d 二氫尿苷fm 2′-O-甲基假尿苷galqβ，D-半乳糖苷gm 2′-O-甲基鳥苷I 肌苷i6a N6-異戊烯基腺苷m1a 1-甲基腺苷m1f 1-甲基假尿苷m1g 1-甲基鳥苷m11 1-甲基肌苷m22g2，2-二甲基鳥苷m2a 2-甲基腺苷m2g 2-甲基鳥苷m3c 3-甲基胞苷m5c 5-甲基胞苷m6a N6-甲基腺苷m7g 7-甲基鳥苷mam5u 5-甲基氨基甲基尿苷mam5s2u 5-甲氧氨甲基-2-硫尿苷manqβ，D-甘露糖基甲基尿苷mcm5s2u 5-甲氧羰基甲基尿苷mo5u5-甲氧尿苷ms2i6a 2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷表1，續(xù)縮寫描述ms2t6a N-((9-β-D-呋喃核糖苷-2-甲硫嘌呤-6-基)氨基甲?；?蘇氨酸mt6aN-((9-β-D-呋喃核糖苷嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)蘇氨酸mv 尿苷-5-草酸甲酯o5u 尿苷-5-草酸(v)osywwybutoxosinep 假尿苷q queosines2c 2-硫胞苷s2t 5-甲基-2-硫尿苷s2u 2-硫尿苷s4u 4-硫尿苷t 5-甲基尿苷t6a N-((9-β-D-呋喃核糖苷嘌呤-6-基)氨甲?；?蘇氨酸2′-O-甲基-5-甲基尿苷um 2′-O-甲基尿苷yw wybutosinex 3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷，(acp3)uaraUβ，D-阿拉伯糖基araTβ，D-阿拉伯糖基其它有用的類似物包括在公開的國際申請?zhí)朩O 92/20823(本文引用其說明書以供參考)中描述的那些或根據(jù)其公開的方法制備的類似物。根據(jù)本發(fā)明公開的內容在DeMesmaeker等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33226-229(1994)；DeMesmaeker等，Synlett733-736(Oct.1993)；Nielsen，等，科學2541497-1500(1991)和Idziak等，四面體通訊(Tetrahedron Letters)345417-5420(1993)中描述的類似物也有用且所述的文獻在本文引用以供參考。
D.構建具有酶活性的DNA分子的方法本發(fā)明還包含產(chǎn)生具有預定活性的核酸分子的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸分子是具有酶活性的DNA分子。在另一變化中，所需活性是催化活性。
在一個實施方案中，本發(fā)明包含合成可隨后構建成對預定反應具有催化特異性的具有酶活性的DNA分子的方法。制備具有酶活性的DNA分子的方法在本文描述，例如，見下面實施例1-3。在另一實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可構建成可結合小分子或配體，如腺苷三磷酸(ATP)。(例如，見Sassanfar，等，自然364550-553(1993))。
在另一實施方案中，本發(fā)明包含使用具有酶活性的DNA分子的群體在誘變條件下產(chǎn)生突變具有酶活性的DNA分子的各種各樣的群體(可任選稱為“脫氧核酶”或“DNA酶”)。此后，從群體中選擇和/或分離具有所需特征的具有酶活性的DNA分子或隨后擴增。
另外，可經(jīng)過改變具有酶活性的DNA分子識別區(qū)的長度將突變導入具有酶活性的DNA分子中。具有酶活性的DNA分子識別區(qū)與底物核酸序列內的堿基互補序列相關。改變識別區(qū)長度的方法是本領域已知的，例如，包括PCR，有用的技術在下面實施例中進一步描述。
具有酶活性的DNA分子識別區(qū)的長度的改變對具有酶活性的DNA分子的結合特異性具有合適的影響。例如，識別區(qū)長度的增加可增加具有酶活性的DNA分子與底物寡核苷酸的互補堿基序列間的結合特異性，或可在雜交底物中增強對特定序列的識別。另外，識別區(qū)長度的增加也可增加其結合底物的親和力。在各種實施方案中，具有酶活性的DNA分子改變的識別區(qū)提供了具有酶活性的DNA和其底物間增加的結合特異性和親和力。
最近已注意到某些寡核苷酸能識別和結合不同于具互補序列的寡核苷酸的分子。這些寡核苷酸常稱為“aptamers”。例如，Ellington和Szostak描述了能結合許多有機染料的RNA分子(自然346818-822(1990))，而Bock等描述了結合人凝血酶的ssDNA分子(自然355564-566(1992))。同樣，Jellinek等描述了堿性成纖維細胞生長因子的RNA配體(美國國家科學院院報9011227-11231(1993))。因此，本文進一步包含可根據(jù)本文描述的方法加工成表現(xiàn)出與aptamers典型相關的各種能力的本發(fā)明的催化活性DNA酶。
因此，本領域的技術人員應預料到本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可用本文公開的各種方法，包括PCR和3SR(自我持久序列復制-見下面實施例1)在任意核苷酸序列，如識別區(qū)進行改變。例如，經(jīng)過在引物中包含增加的核苷酸可將增加的核苷酸加到具有酶活性的DNA分子的5′端。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子經(jīng)過使用諸如定點誘變的方法也可以更非隨機的方式進行制備或改造。例如，可基本上按Morinaga等，生物工程2636(1984)所述并按本文所述改良進行應用于脫氧核酶的定點誘變。構建具有酶活性的DNA分子的有用的方法在下面實施例中進一步描述。
在一個公開的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子包含一個保守的核心和側翼的通過堿基對相互作用與底物相互作用的2個底物結合(或識別)區(qū)或序列。在各種實施方案中，保守的核心包含一個或多個保守的區(qū)域或序列。在另一變化中，具有酶活性的DNA分子進一步包含涉及堿基配對的區(qū)域(或序列)之間的“間隔子”區(qū)(或序列)。在另一個變化中，保守核心被一個或更多保守性較小的可變的或“間隔子”核苷酸以各種間隔“打斷”。
在各種實施方案中，具有酶活性的DNA分子的群體由至少2種不同類型的脫氧核酶分子組成。例如，在一個變化中，該分子具有不同的序列。在另一變化中，脫氧核酶是具有與核酸序列5′端相連續(xù)或相鄰的核酸序列限定的識別區(qū)的核酸分子。在各種任選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可進一步包含位于識別區(qū)3′端的一個或多個間隔子區(qū)，位于識別區(qū)和/或間隔子區(qū)3′端的一個或多個環(huán)。在其它變化中，本發(fā)明的脫氧核酶包含能與相同分子其它區(qū)雜交的一個或多個區(qū)域。根據(jù)這里公開的方法產(chǎn)生的具有酶活性的DNA分子的其它特征在本文的其它部分描述。
在其它實施方案中，誘變條件包括在具有酶活性的DNA分子內誘導限定的或隨機的核苷酸取代的條件。典型的誘導條件的實施例包括在本說明書的其它部分公開的條件和Joyce等，核酸研究17711-722(1989)；Joyce，基因8283-87(1989)；和Beaudry and Joyce，科學257635-41(1992)描述的方法。
在還有一個實施方案中，本發(fā)明的突變的具有酶活性的核酸分子的不同群體是含至少2種不具有完全相同的核酸序列的核酸分子。在其它變化中，根據(jù)其實現(xiàn)預定活性的能力從這些不同的群體中選擇具有預定活性的具有酶活性的DNA分子或其它具有酶活性的核酸。在各種實施方案中，預定的活性包含但并不局限于增強的催化活性，減少的KM，增強的底物結合能力，改變的底物特異性等。
可認為是酶效能特征的其它參數(shù)包括催化活性或能力，底物結合能力，酶轉換率，酶對反饋機制的敏感性等。在某些情況下，底物特異性可認為是酶效能的一個方面，特別是在酶能識別和結合2個或多個競爭性底物，每一個均影響酶對其它底物的效能的情況下。
本文使用的底物特異性指本文描述的具有酶活性的核酸分子對特定底物，如僅包含核糖核苷酸，僅包含脫氧核糖核苷酸或兩者的組合物的分子的特異性。底物分子也可含有核苷酸類似物。在各種實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子可優(yōu)選與雜交或非雜交的底物的特定區(qū)域結合。
本文以“底物特異性”鑒定的術語或參數(shù)也可包括序列特異性；即，本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子可“識別”和結合具有特定核酸序列的核酸底物。例如，如果本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子的底物識別區(qū)僅結合具有在一排中的一系列的一個或兩個核糖核苷酸(例如，rA)的底物分子，那么，具有酶活性的核酸分子將不會識別或結合缺乏該序列的核酸底物分子。
關于選擇方法，在各種實施方案中，選擇包括從突變具有酶活性的核酸的不同群體中物理分離具有預定活性的突變具有酶活性的核酸的各種方法。通常，選擇包括以大小，催化活性的有無，或將突變核酸與存在于溶液中或附著于固相基質的另一核酸，多肽或某些其它分子雜交來分離。
在各種實施方案中，預定活性是使具有該預定活性的突變具有酶活性的核酸經(jīng)其活性特征以其中方式被標記。例如，預定活性可以是具有酶活性的DNA分子活性，其中對其底物的突變具有酶活性的核酸活性使突變具有酶活性的核酸共價結合于其上。然后以共價連接特征選擇突變的具有酶活性的核酸。
在其它實施方案中，選擇具有預定活性的突變具有酶活性的核酸包括突變具有酶活性的核酸的擴增(例如，見Joyce，基因8283-87(1989)；Beaudry和Joyce，科學257635-41(1992))。選擇具有預定特征或活性的具有酶活性的核酸分子的其它方法在實施例部分描述。
E.組合物本發(fā)明還包含含有本發(fā)明的一種或多種類型或群體的具有酶活性的DNA分子的組合物；例如，不同類型或群體可識別和裂解不同的核苷酸序列。組合物可進一步包括含核糖核酸的底物。根據(jù)本發(fā)明的組合物可進一步包含鉛離子，鎂離子或其它二價或單價陽離子，如本文所述。
優(yōu)選的是，具有酶活性的DNA分子以大約0.05μM到大約2μM的濃度存在。典型的是，具有酶活性的DNA分子以具有酶活性的DNA分子與底物的濃度比從大約1∶5到大約1∶50的濃度存在。更優(yōu)選的是，具有酶活性的DNA分子以大約0.1μM到大約1μM的濃度存在于組合物中。還有更優(yōu)選的是，組合物含大約0.1μM到大約0.5μM濃度的具有酶活性的DNA分子。優(yōu)選的是，底物以大約0.5μM到大約1000μM的濃度存在于組合物中。
本領域的技術人員將明白含核酸的底物有許多來源，包括天然來源和合成來源。合適的底物來源包括但不限于各種病毒和逆轉錄病毒試劑，包括HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HTLV-II。
其它合適的底物包括，但不限于病毒和逆轉錄病毒試劑，包括由小RNA病毒，嗜肝DNA病毒科(例如，HBV，HCV)，乳頭瘤病毒(例如，HPV)，γ-皰疹病毒(例如，EBV)，淋巴隱病毒，白血病病毒(例如，HTLV-1和-II)，黃病毒，披膜病毒，皰疹病毒(包括α-皰疹病毒和β-皰疹病毒)，巨細胞病毒(CMV)，流感病毒和引起免疫缺陷疾病和綜合癥(例如，HIV-1和-2)的病毒和逆轉錄病毒所產(chǎn)生或包含的試劑。另外，合適的底物包括感染非人類靈長動物和其它動物的病毒和逆轉錄病毒試劑，包括但不限于猿猴和貓免疫缺陷病毒和牛白血病病毒。
如前所述的鎂離子，鉛離子，或其它合適的單價或雙價離子可以大約1-100mM的濃度范圍存在于組合物中。更優(yōu)選的是，預選的離子以大約2mM到大約50mM的濃度存在于組合物中，特別優(yōu)選是大約5mM的濃度。本領域的技術人員將明白離子濃度僅受水溶液中其來源的可溶性極限(例如鎂)和使具有酶活性的DNA分子在相同組合物中以活性構象存在的需要的約束。
本發(fā)明還包含含有本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子，雜交的脫氧核糖核苷酸-核糖核苷酸分子，及上文所述濃度的鎂或鉛離子的組合物。如前面所述，其它單價或雙價離子(例如，Ca2+)可用于代替鎂。
本發(fā)明還包含含有本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子，含核酸的底物(例如，RNA)和濃度大于大約1毫摩爾的預選離子的組合物，其中所說的底物長度大于存在于具有酶活性的DNA分子中的識別區(qū)。
在一個變化中，組合物包含具有酶活性的DNA分子底物復合物，其中具有酶活性的DNA分子和其底物間的堿基對是連續(xù)的。在另一實施例中，具有酶活性的DNA分子和其底物間的堿基對被一個或多個非互補對打斷。在各種任選的實施例中，本發(fā)明的組合物可進一步包含單價陽離子，雙價陽離子或兩者都含。
在另一變化中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子在存在或缺乏二價陽離子時能有效地發(fā)揮功能。在一個變化中，存在二價陽離子且包含Pb2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，或Ca2+。另外，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子在存在或缺乏單價陽離子時能有效發(fā)揮功能。可預料到與本文對Pb2+或Mg2+所述相似的單價或二價陽離子濃度按本文所公開的將會有用。
任選的是，單價陽離子也可以額外地或作為二價陽離子的替代存在。例如，諸如鈉(Na+)或鉀(K+)的單價陽離子可作為解離離子或以諸如NaCl或KCl的可解離的化合物的形式存在。
在一個實施方案中，單價陽離子濃度以0-1.0M的范圍存在于組合物中。在另一實施方案中，單價陽離子以大約0-200mM的濃度范圍存在。在其它實施方案中，單價陽離子以大約1-100mM的濃度范圍存在。另外，單價陽離子的濃度范圍從大約2mM-50mM。在其它實施方案中，濃度范圍從大約2mM-25mM。
F.使用具有酶活性的DNA分子的方法使用本文所公開的具有酶活性的DNA分子的方法有很多。如前面所討論的，能裂解連接相鄰核酸的鍵(例如磷酯鍵)的分子有許多包含廣泛應用的用途。例如，具有本文公開的能力，結構和/或功能的具有酶活性的DNA分子在藥用和醫(yī)用產(chǎn)品(例如，傷口清除，血塊溶解，等)，以及在家庭用品(例如，去污劑，牙衛(wèi)生產(chǎn)品，肉變嫩劑)中有用。也包含本文公開的化合物，組合物和方法的工業(yè)用途并且在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明還描述了裂解任何單鏈，環(huán)狀，部分或全部雙鏈的核酸的有用方法；這些方法的大多數(shù)采用了本發(fā)明的新的酶活性核酸分子。在各種實施方案中，底物的單鏈核酸片段或部分(或其全部底物)包含DNA，修飾的DNA，RNA，修飾的RNA或其組合物。優(yōu)選的是，核酸底物僅僅需要在或靠近底物裂解序列處是單鏈的，以便本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子由于酶識別序列的特征能與底物裂解序列雜交。
以本發(fā)明的方法可裂解的核酸底物可以是化學合成的或酶促生產(chǎn)的，或它可從各種來源，如噬菌體，病毒，原核細胞或真核細胞，包括動物細胞，植物細胞，酵母細胞和細菌細胞中分離?；瘜W合成的單鏈和雙鏈核酸可從許多途徑以商品的形式買到，包括但不限于ResearchGenetics(Huntsville，AL)。
RNA底物也可使用應用生物系統(tǒng)(Applied Biosystem)(FosterCity，CA)寡核苷酸合成儀根據(jù)廠家說明書來合成。單鏈噬菌體也是核酸底物的來源(例如，見Messing等，美國國家科學院院報743642-3646(1977)，和Yanisch-Perron等，基因33103-119(1985))。含單鏈噬菌體的細菌細胞也是合適的單鏈核酸底物的簡便來源。
也可以用諸如小RNA病毒，披膜病毒，正粘病毒，副粘病毒，桿狀病毒，冠形病毒，沙粒病毒或逆轉錄病毒的任意RNA病毒提供以本發(fā)明的方法可裂解的單鏈RNA。如上文所述，許多原核和真核細胞也是合適的核酸底物的極好的來源。
本發(fā)明的方法可用于存在于細胞內的單鏈核酸或具環(huán)的或雙鏈核酸的單鏈部分，包括真核，原核，植物，動物，酵母或細菌細胞。在這些條件下本發(fā)明的具有酶活性的核酸分子(例如，具有酶活性的DNA分子或脫氧核酶)可充當抗病毒劑或基因表達的調節(jié)劑。本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的這類用途的實施例在下文進一步描述。
在本發(fā)明的大部分方法中，單鏈核酸的裂解發(fā)生在預定堿基序列的3′-端。該預定的堿基序列或底物裂解序列典型地含1到10個核苷酸。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子能識別裂解位點上游或上游及下游的核苷酸。在各種實施方案中，具有酶活性的DNA分子能識別裂解位點上游大約2-10個核苷酸，在其它實施方案中，具有酶活性的DNA分子能識別裂解位點上游大約2-10個核苷酸和下游大約2-10個核苷酸。其它優(yōu)選的實施例包含的具有酶活性的DNA分子能識別高達大約30個核苷酸長的核苷酸序列，更優(yōu)選長達大約20個核苷酸。
本文公開的方法允許經(jīng)過改變具有酶活性的DNA分子識別區(qū)的核苷酸序列在任意核苷酸序列上裂解。這允許在缺乏限制性核酸內切酶位點的條件下在選定的位置裂解單鏈核酸。
本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子可從經(jīng)過在合適的裂解位點進行點特異性雜交而附著到具有酶活性的DNA分子上的單鏈核酸底物的任意部分上分離。具有酶活性的DNA分子從底物(或“裂解產(chǎn)物”)上的分離允許具有酶活性的DNA分子進行另一裂解反應。
一般來說，在合適的核酸裂解條件下，優(yōu)選在生理條件下用有效量的本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子處理核酸底物。如果核酸底物包含DNA，裂解條件可包括存在大約2-10mM濃度的二價陽離子。
具有酶活性的DNA分子的有效量指需要裂解單鏈核酸內預定堿基序列的量。優(yōu)選的是，具有酶活性的DNA分子以DNA分子與底物裂解位點摩爾比為1比20存在。該比率可根據(jù)在采用的具體核酸裂解條件下特定具有酶活性的DNA分子的處理長度和效率而變化。
因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，處理典型地包含在水溶液中混合含RNA的底物和酶以形成裂解混合物，然后在RNA裂解條件下維持由此形成的混合物一段足以使具有酶活性的DNA分子在RNA中任意預定的核苷酸序列上裂解RNA底物的時間。在各種實施方案中，還提供了離子來源，即單價或雙價陽離子，或二者都有。
在本發(fā)明的一個實施方案中，預測了具有酶活性的DNA分子裂解單鏈核酸所必須的時間量。時間量從大約1分鐘到大約24小時，并根據(jù)反應物的濃度和反應溫度而變化。通常，該時間期限是從大約10分鐘到大約2小時，具有酶活性的DNA分子在任意預測的核酸序列上裂解單鏈核酸。
本發(fā)明進一步包含的核酸裂解條件包括存在大約2-100mM濃度的二價陽離子(例如，PbOAc)來源。典型的是，核酸裂解條件包括大約2mM至大約10mM濃度的二價陽離子，特別優(yōu)選大約5mM的濃度。
核酸裂解條件中包括的最佳陽離子濃度可經(jīng)過測定在給定陽離子濃度下裂解的單鏈核酸的量來較容易的測定。本領域的技術人員將明白最佳濃度可根據(jù)采用的具體具有酶活性的DNA分子而變化。
本發(fā)明進一步包含的核酸裂解條件包括大約pH6.0到大約pH9.0的pH。在一個優(yōu)選的實施方案中，pH范圍從大約pH6.5到pH8.0。在另一優(yōu)選的實施方案中，pH模仿生理條件，即，pH為大約7.0-7.8，特別優(yōu)選大約7.5的pH。
本領域的技術人員將預料到本發(fā)明的方法可在廣泛的pH范圍內進行，只要用于核酸裂解的pH使該具有酶活性的DNA分子保持活性構象?；钚詷嬒蟮木哂忻富钚缘腄NA分子以其裂解預定核酸序列上的單鏈核酸的能力而易于被檢測。
在各種實施方案中，核酸裂解條件還包括許多溫度范圍。如上所述，特別優(yōu)選與生理條件一致的溫度范圍，盡管本文也包含與工業(yè)應用一致的溫度范圍。在一個實施方案中，溫度范圍從大約15℃到大約60℃。在其它變化中，核酸裂解條件包括大約30℃到大約56℃的溫度范圍。在另一變化中，核酸裂解條件包括從大約35℃到大約50℃的溫度。在優(yōu)選的實施方案中，核酸裂解條件包含大約37℃到大約42℃的溫度范圍。與核酸裂解條件一致的溫度范圍僅受所需裂解率和特定具有酶活性的DNA分子在該特定溫度下的穩(wěn)定性限制。
在各種方法中，本發(fā)明包含包括存在多胺的核酸裂解條件。實施本發(fā)明有用的多胺包括精亞胺，腐胺，精胺等。在一個變化中，多胺以大約.01mM到大約10mM的濃度存在。在另一個變化中，多胺以大約1mM到大約10mM的濃度存在。核酸裂解條件也可包括存在大約2mM到大約5mM濃度的多胺。在各種優(yōu)選的實施方案中，多胺是精亞胺。
G.載體本發(fā)明的特征還有包含位于載體內的編碼本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的核酸片段的表達載體，優(yōu)選以允許該具有酶活性的DNA分子在靶細胞(例如，植物或動物細胞)內表達的方式存在。
因此，一般來說，根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選包括質粒，粘粒，噬菌粒，病毒或噬菌體載體。優(yōu)選的是，合適的載體包含單鏈DNA(ssDNA)-例如，環(huán)形噬菌粒ssDNA。也可預料到根據(jù)本發(fā)明的有用的載體不必是環(huán)形。
在一個變化中，優(yōu)選提供在每個增加的具有酶活性的DNA分子編碼序列側翼的核苷酸序列，該序列可被第一具有酶活性的DNA分子識別。插入或側翼序列優(yōu)選包含至少一個核苷酸，更優(yōu)選的是，插入或側翼序列大約2-20個核苷酸長，特別優(yōu)選長大約為5-10個核苷酸的序列。
多核苷酸尾巴的增加對于保護根據(jù)本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的3′端也是有用的。這些可經(jīng)過采用末端轉移酶附著一個多聚體序列來提供。
根據(jù)本發(fā)明的載體包括2個或多個具有酶活性的DNA分子。在另一實施方案中，第一具有酶活性的DNA分子具有分子內裂解活性，并能夠識別和裂解核苷酸序列以釋放其它具有酶活性的DNA序列；即，它能發(fā)揮從載體中“釋放”其它具有酶活性的DNA分子的功能。例如，載體優(yōu)選構建成當?shù)谝痪哂忻富钚缘腄NA分子表達時，第一分子能裂解編碼第二具有酶活性的DNA分子，第三具有酶活性的DNA分子等的其它核苷酸序列側翼的核苷酸序列。假定所說的第一具有酶活性的DNA分子(即，“釋放”分子)能裂解分子內的寡核苷酸序列，其它的(例如，第二，第三等)具有酶活性的DNA分子(即，“被釋放”的分子)不必具有與“釋放”分子相同的特征。例如，在一個實施方案中，“被釋放”的(即，第二，第三等)具有酶活性的DNA分子能裂解特定的RNA序列，而第一(“釋放性”)具有酶活性的DNA分子具有使其裂解為“被釋放的”分子的核酸酶活性。在另一實施方案中，“被釋放的”具有酶活性的DNA分子具有酰胺鍵裂解活性，而第一(“釋放性”)具有酶活性的DNA分子具有核酸酶活性。
作為選擇，第一具有酶活性的DNA分子可被與第二(和第三，第四，等)具有酶活性的DNA分子獨立的載體編碼，并且可具有分子內裂解活性。如本文所述，第一具有酶活性的DNA分子可以是自我裂解性具有酶活性的DNA分子(例如，脫氧核酶)，第二具有酶活性的DNA分子可以是任意所需的具有酶活性的DNA分子類型。當載體引起從這些核酸序列表達DNA時，該DNA具有在合適條件下裂解各側翼區(qū)的能力，從而釋放第二具有酶活性的DNA分子的一個或多個拷貝。如果需要，一些不同的第二具有酶活性的DNA分子可放入相同細胞或載體以產(chǎn)生不同的脫氧核酶。還包含的任意一個或多個載體可包括以“釋放性”和“被釋放”的具有酶活性的核酸分子的任意組合的一個或多個核酶或脫氧核酶，只要該組合能達到所需的結果釋放能裂解預定核酸序列的具有酶活性的核酸分子。
還包含分離和純化本發(fā)明的具有酶活性的DNA分子的方法。除了本文所述的方法外，各種純化方法(例如，使用HPLC的方法)和色譜分離技術是本領域可獲得的。例如，見公開的國際申請?zhí)朩O 93/23569中所述的方法，其公開內容編入本文以供參考。
還應明白本文描述的實施例的各種組合包括在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從上文說明書，下面的實施例和權利要求書來看將是顯而易見的。
實施例下面的實施例用來說明但不限制本發(fā)明。
實施例I具有酶活性的DNA分子的體外進化綜述體外選擇和體外進化技術允許分離對其組成或結構無背景技術的新催化劑。該方法用于獲得具有新催化特征的RNA酶。例如，已從隨機tRNAphe分子庫中產(chǎn)生了與鉛離子一起進行自體裂解的核酶(Pan和Uhlenbeck，生物化學313887-3895(1992))。已分離的I型核酶能裂解DNA(Beaudry和Joyce，科學257635-641(1992))或改變金屬依賴性(Lehman和Joyce，自然361182-185(1993))。以一組隨機RNA序列開始，已獲得了催化聚合酶樣反應的分子(Bartel和Szostak，科學2611411-1418(1993))。在本實施例中，描述了在體外進化過程中經(jīng)過改變選擇條件精制進化酶的特定催化特征。
達爾文進化需要三個過程的重復操作(a)遺傳變異的誘導；(b)根據(jù)某種適應性標準選擇個體；和(c)選定個體的擴增。每一過程可在體外實現(xiàn)(Joyce，基因8283(1989))。基因可經(jīng)過化學修飾，隨機誘變的寡脫氧核苷酸的摻入或以聚合酶進行不準確的拷貝來誘變(例如，見Cadwell and Joyce，RCR方法和應用228-33(1992)；Cadwell和Joyce，RCR方法和應用3(增刊)S136-S140(1994)；Chu，等，病毒學98168(1979)；Shortle等，酶學方法100457(1983)；Myers，等，科學229242(1985)；Matteucci等，核酸研究113113(1983)；Wells，等，基因34315(1985)；McNeil，等，分子細胞生物學53545(1985)；Hutchison，等，美國國家科學院院報83710(1986)；Derbyshire，等，基因46145(1986)；Zvkour，等，自然295708(1982)；Lehtovaara等，蛋白質工程263(1988)；Leung等，技術111(1989)；Zhou等，核酸研究196052(1991))。
例如，可用其結合配體或進行化學反應的能力選擇基因產(chǎn)物(例如，見Joyce，同前(1989)；Robertson和Joyce，自然344467(1990)；Tuerk等，科學249505(1990))。與選定基因產(chǎn)物相應的基因可用交互引物方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，(例如，見Saiki，等，科學2301350-54(1985)；Saiki等，科學239487-491(1988))。
作為選擇，核酸擴增可使用自我持續(xù)序列復制(3SR)進行。(例如，見Guatelli等，美國國家科學院院報871874(1990)，其公開內容引入本文以供參考)。根據(jù)3SR方法，靶核酸序列可經(jīng)過使用對逆轉錄病毒復制所必須的三種酶活性(1)逆轉錄酶，(2)RNase H，和(3)DNA-依賴性RNA聚合酶在體外等溫條件下典型地擴增(復制)。借助于cDNA介質經(jīng)過模仿RNA復制的逆轉錄方法，該反應積累原始靶的cDNA和RNA拷貝。
總的來說，如果期望具有酶活性的DNA分子的群體進化，一個連續(xù)的逆轉錄和轉錄反應系列可借助于cDNA中間體復制RNA靶序列。該設計的關鍵性成份為(a)寡核苷酸引物限定該靶并含有編碼T7RNA聚合酶結合位點的5′延伸部分，使所得的cDNA是活性轉錄模板；(b)可進行cDNA合成以完成由于RNase H對中間體RNA-DNA雜交體中模板RNA的降解而產(chǎn)生的兩條鏈；(c)反應產(chǎn)物(cDNA和RNA)可作為隨后步驟的模板發(fā)揮功能，使能進行指數(shù)復制。
如果進化具有酶活性的DNA分子，本設計的各種關鍵成份有些不同，正如在這些實施例中所公開的。例如，(1)寡核苷酸引物限定靶并且優(yōu)選以某種方式標記-例如，以生物素標記-，因此所得的活性模板鏈易于鑒定；(2)使用的體外選擇方法優(yōu)選取決于最有利的釋放機制的鑒定。
實現(xiàn)體外達爾文進化的主要障礙是需要整合突變和擴增，兩者都與基因型相關，選擇時，它是表型相關的。對于核酸酶，基因型和表現(xiàn)型體現(xiàn)在相同的分子中，因此工作得到簡化。
A.具有酶活性的DNA分子的設計已知單鏈DNA可呈有趣的三級結構。例如“tDNA”的結構與相應tRNA非常相似。(見Paquette等，歐洲生物化學雜志189259-265(1990))。而且，在錘頭狀核酶內取代35個核糖核苷酸中的31個，而至少保留某些催化活性是可能的。(見Perreault等，自然344565-567(1990)；Williams等，美國國家科學院院報89918-921(1992)；Yang等，生物化學315005-5009(1992)。)。
體外選擇技術已應用于隨機序列DNA的大量群體中，導致回收以高親和力結合靶配體的特定DNA“aptamers”。(Bock，等，自然355564-566(1992)；Ellington & Szostak，自然355850-852(1992)；Wyatt和Ecker，美國國家科學院院報911356-1360(1994))。最近，兩個小組進行了一個aptamer的一級NMR結構測定，它是一個形成G-四重峰(G-quartet)結構和以高親和力結合蛋白質凝血酶的15聚體DNA(Wang等，生物化學321899-1904(1993)；Macaya等，美國國家科學院院報903745-3749(1993))。這些發(fā)現(xiàn)以X-射線晶體照片分析來證實(Padmanabhan等，生物化學雜志26817651-17654(1993))。
具有高親和力和特異性結合底物分子的能力是好酶的前提。而且，酶必須利用自身或輔因子內的定位好的功能基團以啟動特定的化學轉化。而且，酶必須在反應過程中保持不發(fā)生變化并且能以催化轉換進行操作。一些額外的要求是它是由亞基組成的信息大分子，亞基的特定順序決定催化活性。盡管這些標準對語義的和化學的基礎的思考是開放的，它們用于區(qū)分從簡單的溶解效應到在底物擴散極限時生物學酶操作變化中化學速率增強的表型(Albery和Knowles，生物化學155631-5640(1976))。
正如在下面所進行的更詳細的描述，我們試圖從隨機序列開始，形成快速獲得DNA催化劑和DNA酶的一般方法。作為起始靶，我們選擇了我們認為完全在DNA能力范圍內的反應以二價金屬輔因子的幫助水解RNA磷酸二酯。這是由各種天然存在的RNA酶，包括錘頭和發(fā)夾部分所進行的相同反應(例如，見Forster A.C.和Symons R.H，細胞49211-220(1987)；Uhlenbeck，自然328596-600(1987)；Hampel和Tritz，生物化學284929-4933(1989))。
最近表明，以tRNA分子隨機文庫開始，可獲得在中性pH下具有Pb2+依賴性，位點特異性RNA磷酸酯酶活性的核酶(Pan和Uhlenbeck，生物化學313887-3895(1992)；Pan和Uhlenbeck，自然358560-563(1992))。這與酵母tRNAphe的偶然自我裂解反應類似(Dirheimer和Werner，Biochimie 54127-144(1972))。它依賴于Pb2+離子在tRNA內限定位點的特異性協(xié)作。(見Rubin和Sundaralingam，生物分子結構和動力學雜志(J.Biomol.Struct.Dyri.)1639-646(1983)；Brown等，生物化學244785-4801(1985))。
正如本文所公開的，我們的目的包括形成能對特定RNA磷酯進行Pb2+依賴性裂解的DNA，該RNA磷酯開始位于附著于該DNA分子5′端的一段短先導序列內，最終位于以分子間方式用快速催化轉換能裂解的分離分子內。如下面所進行的進一步的描述，已成功地達到了這些目標。
對于該DNA如何與靶磷酯和周圍的核苷酸相互作用沒有給出假設。以一組大約1014隨機50聚體序列開始，體外選擇允許進行該過程。進行5輪選擇4天后，該群體作為一個整體達到了在1mM Pb2+存在的條件下以大約0.2min-1的速率裂解靶磷酯的能力。這與在相同反應條件下的自發(fā)裂解速率相比大約增加105倍。
從群體中分離個體，測序并測定催化活性。根據(jù)這些信息，反應轉變成分子間形式，然后在1mM PbOAc存在的條件下，在23℃和pH7.0中以1min-1的轉換率進行的反應中簡化成允許38聚體DNA酶點特異性裂解19聚體底物。
B.體外選擇方法產(chǎn)生大約1014單鏈DNA分子的起始庫，均含有5′生物素部分，接著相連續(xù)的是包括單個核糖核苷酸的固定區(qū)，由50個隨機脫氧核糖核苷酸組成的有效催化區(qū)和位于3′端的第二固定區(qū)(圖1)。
由嵌套PCR(聚合酶鏈式反應)技術構建該群體，以含50個隨機核苷酸，兩側為引物結合位點的合成DNA開始。嵌套PCR引物是具有3′端腺嘌呤核糖核苷酸的5′-生物素標記的合成寡脫氧核苷酸。核糖核苷酸終止的寡核苷酸在PCR環(huán)境中有效地引發(fā)模板指導的延長(L.E.Orgel.私人交流)，在這種情況下產(chǎn)生含單個包埋的核糖核苷酸的延伸產(chǎn)物。
圖1顯示了分離裂解靶RNA磷酯的DNA的選擇性擴增方案。含50個隨機核苷酸鏈的雙鏈DNA經(jīng)PCR，采用在3′端以腺嘌呤核糖核苷酸(由符號“N”或“rA”代表，其中N和rA均代表腺嘌呤核糖核苷酸)終止的5′生物素標記的DNA引物(例如，引物3-3a或3b)進行擴增。該引物以Taq聚合酶延伸以產(chǎn)生含單個包埋的核糖核苷酸的DNA產(chǎn)物。所得的雙鏈DNA固定于鏈霉抗生物素蛋白質基質上，經(jīng)過用0.2NNaOH洗滌去掉未標記生物素的DNA。用緩沖液重新平衡柱后，用加有1mM PbOAc的相同溶液洗柱。進行Pb2+依賴性自我裂解的DNA從柱上釋放，收集于洗脫液中，以PCR擴增。然后PCR產(chǎn)物用于起動下一輪選擇性擴增。
PCR產(chǎn)物經(jīng)過鏈霉抗生物素蛋白親和基質，導致雙螺旋DNA 5′-生物素標記的鏈非共價附著。經(jīng)過用0.2N NaOH簡單洗滌去掉未標記生物素的鏈。結合鏈在含0.5M NaCl，0.5M KCl，50mM MgCl2和50mM HEPES(pH7.0)的緩沖液中23℃平衡。接著，在相同緩沖液中提供1mM PbOAc，使在靶磷酯上發(fā)生Pb2+依賴性裂解，從而從鏈霉抗生物素蛋白基質中釋放DNA亞基。原則上，個體DNA以各種方式幫助其自身的釋放，如破壞生物素與鏈霉抗生物素蛋白間的相互作用或裂解一個脫氧核糖核苷酸鍵。根據(jù)鍵的相對不穩(wěn)定性認為核糖核苷酸3′-O-P鍵的裂解是釋放的最可能的機制，且Pb2+依賴性水解允許發(fā)生最迅速的釋放。然而，原則上體外選擇程序應鑒定最有利的釋放機制以及那些能最佳完成該機制的個體。
加入Pb2+時從基質中釋放的DNA分子收集在洗脫液中，用乙醇沉淀濃縮并進行嵌套式PCR擴增。與構建開始的分子群體一樣，第一次PCR擴增所利用的引物(引物1和2)在隨機區(qū)的兩側，第二次利用具有3′端核糖腺苷酸的5′生物素標記的引物(引物3b)，從而再次導入靶RNA磷酯。完整的選擇擴增程序需要3-4小時進行。
在該程序的每一輪中以3種方式純化分子第一PCR擴增后，用酚提取2次并用氯仿/異戊醇提取一次，然后用乙醇沉淀；第二，將DNA附著到鏈霉抗生物素蛋白上后，在強變性條件下洗去全部未標記生物素的分子；第三，用Pb2+洗脫后，用乙醇沉淀。沒有凝膠電泳純化步驟，因此沒有限制分子到特定長度的選擇壓力。
C.催化性DNA的選擇我們進行了5輪連續(xù)的體外選擇，在加入Pb2+后逐步減少反應時間以逐步增強選擇的嚴格性。在1輪到3輪中，反應時間為1小時，在第4輪中，反應時間為20分鐘，在第5輪中，反應時間為1分鐘。單鏈DNA的起始庫與每輪選擇后獲得的分子群體一起在與體外選擇中所用的相同的條件下測定自我裂解活性(見圖2)。
對該測定，用不同于5′-生物素部分的5′-32P制備分子，允許檢測起始物質和5′裂解產(chǎn)物。培養(yǎng)5分鐘后，在起始庫(GO)或第一和第2輪選擇后獲得的群體中無可檢測的活性。第三輪(G3)后獲得的DNA表現(xiàn)出穩(wěn)定的活性水平，該活性穩(wěn)定增加，在第5輪選擇(G5)后獲得的DNA中達到大約50％的自我裂解。即使在延長培養(yǎng)時間后，僅在靶磷酯上檢測到裂解。如果在反應混合物中省去Pb2+則活性喪失。
圖2顯示了DNA開始庫(GO)和第一至第五輪選擇(G1-G5)后獲得的群體的自我裂解活性。反應混合物含50mM MgCl2，0.5MNaCl，0.5M KCl，50mM HEPES(pH7.0，23℃)和3nM[5′-32P]標記的DNA，在存在或缺乏1mM PbOAc的條件下23℃保溫5分鐘。符號Pre代表108核苷酸前體DNA(SEQ ID NO 4)；Clv代表28核苷酸5′裂解產(chǎn)物(SEQ ID NO 5)；M代表引物3a(SEQ IDNO 6)，相應于5′裂解產(chǎn)物的長度。
28核苷酸5′裂解產(chǎn)物(Clv)顯示優(yōu)選具有序列5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3′，其中“N”代表在3′端具有額外2′，3′-環(huán)形磷酸的腺嘌呤核糖核苷酸(SEQ ID NO5)。在另外的實施方案中，“N”代表在分子3′端具有額外2′或3′磷酸的腺嘌呤核糖核苷酸。
在圖2中，“GO”泳道“Pre”帶包含各包括50個隨機核苷酸的108核苷酸前體DNA樣品。因此，任一給定的“Pre”樣品含許多前體DNA，各樣品很可能不同于以前的和隨后的樣品?！癎1”到“G5”泳道含為催化性DNA分子不斷富集的“Pre”帶，但還含有大量不同DNA序列(即，在50核苷酸隨機區(qū)有區(qū)別)。這些與“G5 Pre”DNA不同的序列樣品在圖3中提供。
鳥槍法克隆技術用于從G5群體中分離個體然后測定了20個這類亞克隆的完整核苷酸序列(見圖3)。(例如，也見Cadwell和Joyce在PCR方法和應用228-33(1992)；Cadwell和Joyce，PCR方法和應用3(增刊)S136-S140(1994))。在20個序列中，5個是單一的，2個出現(xiàn)2次，1個出現(xiàn)3次，1個出現(xiàn)8次。所有這些獨立的變異體在DNA起始庫的隨機的50核苷酸區(qū)域內具有共同的序列成份。它們都含有2個推測的模板區(qū)，一個與剛好位于裂解位點上游的核苷酸鏈具有互補性，另一個與位于至少四個核苷酸下游的核苷酸具有互補性。在這兩個假定的模板區(qū)之間有一個1-11核苷酸的可變區(qū)，接著是固定序列5′-AGCG-3′，然后是3-8個核苷酸的第二可變區(qū)，最后是固定序列5′-CG-3′或5′-CGA-3′。位于兩個假定模板區(qū)外側的核苷酸在序列和長度上高度可變。在所有測序的亞克隆中，與50個起始隨機化核苷酸相應的區(qū)域保持總共50核苷酸的長度。
圖3顯示了5輪選擇后從群體中分離的個體變異體的序列對比。固定的底物區(qū)(5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC-3′或5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3′，其是N代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ IDNO 13)在頂部顯示，靶核糖腺苷酸用倒三角限定。在推定的堿基配對相互作用中通常涉及的底物核苷酸以垂直棒表示。與50個起始的隨機核苷酸相應的序列與底物區(qū)進行反向序列對比。所有變異體3′端均為固定序列5′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′(SEQ ID NO 1)(“引物位點”；未顯示)。推測與底物區(qū)形成堿基對的起始隨機區(qū)域內的核苷酸在圖右側和左側表示；具有酶活性的DNA分子推測的堿基對形成(或底物結合)區(qū)分別位于顯示的各序列的盒內。推定的催化性區(qū)域內的高度保守核苷酸在2個盒形柱中表示。
盡管預期其它資料可能對構建催化區(qū)的有意義的二級結構模型有用，但我們注意到，與錘頭和發(fā)夾核酶一樣，具有酶活性的DNA分子的催化區(qū)似乎含一個保守核心，兩側為2個通過堿基對相互作用與底物作用的底物結合區(qū)(或識別區(qū))。與錘頭和發(fā)夾核酶相似，催化性DNA似乎也需要堿基配對的兩個區(qū)域之間的未配對底物核苷酸短鏈(在本例中是5′-GGA-3′)。
有趣的是還注意到9個不同變異體中每個都表現(xiàn)出與底物區(qū)有不同方式的推定互補性。在某些例子中，堿基配對是連續(xù)的，而在其它例子中被一個或多個非互補性配對打斷。一般的傾向似乎是與裂解位點上游的核苷酸形成的相互作用比下游更牢固。結合研究和定點誘變分析使我們獲得了進一步的見解并進一步證實了該推測。
為了對催化功能所需的序列獲得進一步的了解，在本文描述的選擇條件下試驗并評估了9個變異體中6個的自我裂解活性(見圖3)。意料之中的是，在20個亞克隆中的8個中出現(xiàn)的序列證明反應性最強，第一級速率常數(shù)為1.4min-1。所有研究的變異體在自我裂解試驗中具有活性且產(chǎn)生相應于靶RNA磷酸酯裂解的單個5′-標記的產(chǎn)物。
在各種反應條件下進一步分析顯性亞克隆。其自我裂解活性取決于Pb2+，但如果從反應混合物中省去Mg2+卻不受影響。也需要單價陽離子，可用Na+或K+來滿足。在0-1.0M的范圍內隨單價陽離子濃度的增加反應速率呈線性增加(r＝0.998)?？捎绊懛磻钠渌勺円蛩厝鏿H，溫度和其它二價金屬的存在在進一步評價中。
實施例2材料和方法A.寡核苷酸和寡核苷酸類似物從Operon Technologies購買了合成的DNA和DNA類似物。使用模板5′-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA-3′(SEQ IDNO 9)，按以前所述(Breaker，Banerji，和Joyce，生物化學3311980-11986(1994))，經(jīng)逆轉錄酶催化延伸5′-pTCACTATrA-3′(或5′-pTCACTATN-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ ID NO 8)制備19核苷酸底物，5′-pTCACTATrAGGAAGAGATGG-3′(或5′-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)。引物3，5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA-3′(或5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3′，其中“N”代表腺嘌呤核苷酸)(SEQ ID NO 6)，用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶進行5′標記(引物3a)或用[γ-S]ATP和T4多核苷酸激酶使5′端硫磷酸化并隨后用N-碘乙酰-N′-生物素己二胺進行生物素標記(引物3b)。B.DNA庫制備使用合成寡聚體5′-GTGCCAAGCTTACCG-N50-GTCGCCATCTCTTCC-3′(SEQ ID NO 4)，其中N是G，A，T和C的等摩爾混合物，經(jīng)PCR制備DNA起始庫。一個2ml的PCR，含500pmole的隨機寡聚體，1000pmole引物1(5′-GTGCCAAGCTTACCG-3′，SEQ ID NO 10)，500pmole引物2(5′-CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3′，SEQ ID NO 11)，500pmole引物3b，10μCi[α-32P]dATP和0.2Uμl-1Taq DNA聚合酶，在50mM KCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl(pH8.3，23℃)，0.01％明膠，各0.2mM的dNTP存在的條件下92℃保溫1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘，然后92℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1分鐘進行5個循環(huán)。所得的混合物用酚提取2次，用氯仿/異戊醇提取1次，經(jīng)過用乙醇沉淀分離DNA。C.體外選擇DNA起始庫重懸于500μl緩沖液A(1M NaCl和50mM HEPES(pH7.0，23℃))中并重復通過鏈霉抗生物素蛋白柱(AffiniTip Strep20，Genosys，The Woodlands，TX)。用5個100μl體積的緩沖液A洗柱，接著用5個100μl體積的0.2N NaOH洗柱，然后用5個100μl體積的緩沖液B(0.5M NaCl，0.5M KCl，50mM MgCl2，50mMHEPES(pH7.0，23℃))平衡。在1小時內用3個20μl體積的加有1mM PbOAc的緩沖液B洗脫固定的單鏈DNA。全部固定和洗脫過程在23℃進行。在等體積的緩沖液C(50mM HEPES(pH7.0，23℃)，80mM EDTA)中收集洗脫液并用乙醇沉淀DNA。
所得的DNA在含20pmole引物1，20pmole引物2，0.05Uμl-1Taq聚合酶，50mM KCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl(pH8.3，23℃)，0.01％凝膠和各0.2mM的dNTP的100μl PCR以92℃10秒，50℃30秒，72℃30秒循環(huán)30次進行擴增。反應產(chǎn)物用酚提取2次并用氯仿/異戊醇提取一次，經(jīng)過用乙醇沉淀回收DNA。大約4pmole的擴增的DNA加入含100pmole引物1，100pmole引物3b，20μCi[α-32P]dATP，0.1Uμl-1Taq聚合酶，總體積為200μl的第二個嵌套PCR中，在92℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1分鐘擴增10個循環(huán)。PCR產(chǎn)物再次提取和沉淀，所得的DNA重懸于50μl緩沖液A中，然后用于開始下一輪選擇。
按上面所述進行第二和第三輪，除了在第三輪嵌套式PCR在100-μl體積中進行。在第4輪中，加入Pb2+后洗脫時間減少到20分鐘(2個20-μl洗脫體積)，回收DNA的一半用于僅含15個溫度循環(huán)的第一PCR。在第4輪中，洗脫時間減少到1分鐘(2個20-μl洗脫體積)，僅僅1/4的回收DNA用于包含15次溫度循環(huán)的第一PCR。亞克隆和測序第5輪后獲得的DNA，如以前所述(Tsang和Joyce，生物化學335966-5973(1994))。
D.催化性DNA的動力學分析在如上所述的條件下，在含10pmole引物3a，0.5pmole輸入DNA和0.1Uμl-1Taq聚合酶的25μl反應混合物中以92℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分鐘循環(huán)10次進行不對稱PCR，用5′-32P標記制備DNA群體和各種亞克隆個體。所得的[5′-32P]標記的擴增產(chǎn)物在10％聚丙烯酰胺/8M凝膠中經(jīng)電泳純化。
DNA在緩沖液B中預保溫10分鐘后進行自我裂解試驗。經(jīng)過加入終濃度1mM的PbOAc開始反應，經(jīng)過加入等體積的緩沖液C終止反應。經(jīng)過在10％聚丙烯酰胺/8M凝膠中電泳分離反應產(chǎn)物。在包含50μgml-1BSA以防止物質吸附到管壁上的緩沖液B中進行多個轉換條件下的動力學試驗。底物和酶分子分別在缺乏Pb2+的反應緩沖液中預保溫5分鐘，然后混合，并經(jīng)過加入PbOAc至終濃度為1mM起動反應。
實施例3進行分子間裂解的脫氧核酶的進化A.轉變成分子間形式根據(jù)所研究的變異體催化區(qū)和底物區(qū)之間預測的堿基對相互作用的可變方式，有理由認為直接將DNA催化的反應轉變?yōu)榉肿娱g方式。在該轉變中，我們希望簡化催化劑的2個底物結合區(qū)以便能與底物各形成7-8個堿基對的不間斷鏈。另外，我們希望提供最小的底物，限制到2個堿基對區(qū)和間隔序列5′-GGA-3′(圖4A)。
圖4A和4B顯示了在進行催化轉換的分子間反應中DNA催化的RNA磷酯裂解。圖4A是在19聚體底物和38聚體DNA酶之間形成的復合物的圖示。該底物含單個腺嘌呤核糖核苷酸(“rA”或“N”，靠近箭頭)，兩側是脫氧核糖核苷酸。合成的DNA酶是在圖3中所示的最常出現(xiàn)的變異體的38核苷酸部分。位于推斷的催化區(qū)內的高度保守的核苷酸是“盒內”。如圖所示，一個保守序列是“AGCG”，另一個是“CG”(按5′→3′方向閱讀)。
圖4B顯示了用于測定在與體外選擇中所用的相同的條件下DNA催化裂解[5′-32P]-標記的底物的Km(負斜率)和Vmax(y-截距)的Eadie-Hofstee布點圖。測定了在含5mM DNA酶和0.125，0.5，1，2，或4μM底物的反應中裂解的起始速率。
在設計催化區(qū)時，我們主要依賴于大多數(shù)反應變異體的組合物，其5′端的2個核苷酸和在3′端的11個核苷酸被截斷。位于2個模板區(qū)之間的15個核苷酸未變化，且單個核苷酸插入3′模板區(qū)形成能與底物形成堿基對的核苷酸的連續(xù)鏈。底物簡化成序列5′-TCACTATrA·GGAAGAGATGG-3′(或5′-TCACTATN·GGAAGAGATGG-3′，其中“N”代表腺嘌呤核糖核苷酸)(SEQ ID NO 12)，劃線核苷酸相應于涉及與催化性DNA分子進行堿基配對的2個區(qū)。
采用38聚體催化性DNA分子(催化劑)，完全由脫氧核糖核苷酸和含包埋于其它全部為DNA序列中的單個核糖核苷酸的19聚體底物組成的簡化的反應系統(tǒng)允許以快速轉換有效地由DNA催化磷酯裂解。在存在0.01μM催化劑和1μM底物時保溫90分鐘后，46％的底物裂解，相應于催化劑的46次轉換。進行了該反應的初步動力學分析，在多個轉換條件下進行評價。DNA催化劑表現(xiàn)出Michaelis-Menten動力學，kcat和Km的值分別為1min-1和2μM(見圖4B)。Km的值比根據(jù)Watson-Crick相互作用預期的催化劑和底物間的解離常數(shù)大得多。在相同反應條件(但缺乏催化劑)下保溫底物，獲得4×10-6min-1的kuncat值。這與在0.5mM Pb2+存在下更易變的1-硝基苯基-1，2-丙二醇在pH7.0和37℃下的水解的報道值5×10-3分-1一致(Breslow和Huang，美國國家科學院院報884080-4083(1991))。
現(xiàn)在推測磷酸酯裂解反應經(jīng)過包括鄰位磷酸上的核糖核苷酸2′-羥基攻擊，產(chǎn)生具有末端2′(3′)-環(huán)磷酸的5′產(chǎn)物和具有末端5′羥基的3′產(chǎn)物的水解機制進行。在該機制的證據(jù)中，3′-裂解產(chǎn)物用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP有效磷酸化，與游離5′-羥基的可用率一致(資料未顯示)。B.討論5輪體外選擇后，獲得催化靶RNA磷酯有效進行Pb2+-依賴性裂解的單鏈DNA分子的群體。根據(jù)從這一群體中分離的代表性個體的共同特征，構建了催化區(qū)和底物區(qū)的簡化形式，用于證實在分子間環(huán)境中的快速催化的轉化。因此，38聚體催化區(qū)提供了DNA酶(或可稱為“脫氧核酶”)的一個例子。
至于該分子作為一種酶，根據(jù)它是一種能加速在以快速轉換并遵守Michaelis-Menten動力學的反應中的化學轉化的信息大分子的事實，不可能滿足構成一種酶的普遍接受的概念。有人可能堅持認為酶從定義上講必須是一種多肽。然而，如果接受了RNA酶的概念，那么似乎有理由采納關于DNA酶的相似觀點。考慮到不論我們能多快地從隨機序列DNA組中產(chǎn)生該分子，我們仍會漏過在不久的將來會出現(xiàn)的合成DNA酶的許多其它例子。
選擇RNA磷酸酯的Pb2+依賴性裂解作為DNA催化的起始靶是因為它是一種簡單地需要協(xié)同的Pb2+-羥基的合適位置以利于與裂解位點相鄰的2′羥基脫質子的直接反應。(例如，見Pan等，The RNA World，Gesteland和Atkins(編輯)，pp 271-302，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993))。已知Pb2+與嘌呤的N7位，鳥嘌呤的O6位，尿嘧啶的O4位，胞嘧啶的N3位配價(Brown等，自然303543-546(1993))。因此，與RNA相比DNA在糖組成和構象上的區(qū)別似乎不可能防止DNA形成完全限定的Pb2+結合袋。
選擇含有在其它均為DNA序列內的一個單一的核糖核苷酸的底物，因為它提供了唯一有用的裂解位點并保證任何所得的催化活性僅對DNA有用。底物識別似乎取決于催化劑和底物之間的堿基配對相互作用的2個區(qū)。然而，位于這兩個區(qū)域之間的未配對的底物核苷酸5′-GGA-3′可能在底物識別，金屬配價或催化功能的其它方面中起重要作用。
進一步預期全部RNA分子，其它RNA-DNA組合物，含一個或多個核苷酸類似物的分子是可接受的底物。如本文所公開的，本文描述的體外進化方法可成功地用于產(chǎn)生具有所需特異性的具有酶活性的DNA分子，對這些系統(tǒng)的進一步分析在下文提供。
另外，使用本文描述的方法測定酶和底物之間推定堿基配對相互作用是否對序列是可概括的研究取得了進展。本文公開的Pb2+依賴性脫氧核酶也可認為是具有DNA結構和酶特征的模型化合物。
本說明書用于迅速形成DNA催化劑的方法具有相當大的普遍性，允許我們利用其它輔助因子觸發(fā)附著到有效催化區(qū)的靶連接的裂解。關于這點，在生理條件下特異性裂解靶RNA的Mg2+-依賴性DNA酶的形成是所感興趣的，正如形成在其它陽離子存在的條件下發(fā)揮功能的DNA酶(見實施例4)。該分子提供了用于特異性滅活靶mRNA的傳統(tǒng)反義和核酶研究的另一選擇。
因此，DNA與RNA和蛋白質一起加入了能表現(xiàn)出酶活性的生物學大分子的行列。DNA催化能力的完全程度有待于開發(fā)，但這些開發(fā)應根據(jù)諸如本研究所用的體外選擇方法迅速進行。
與其它大分子催化劑相比，DNA酶具有一些重要的優(yōu)勢。首先，在大多數(shù)實驗室擁有自動DNA合成儀且DNA磷酰亞胺的價格十分便宜的時代，它們易于制備。第二，它們是非常穩(wěn)定的化合物，尤其是與RNA相比，從而利于其在生物物理研究中的應用。第三，我們預期它們可適應于在目前利用無RNA裂解活性的反義DNA的治療應用。體外選擇應使用DNA類似物進行，包括具有核酸酶抗性的化合物，如含硫代磷酸酯的DNA，只要這些類似物可以脫氧核苷酸5′-三磷酸的形式制備且作為DNA依賴性DNA聚合酶的底物可接受。最后，DNA酶為我們了解大分子催化功能的基礎提供了一個新的窗口。例如，有趣的是對催化相同化學轉化的以蛋白質，RNA和DNA為基礎的酶進行比較分析。
實施例4催化性DNA的其它家族基本上按上面實施例2.B所述經(jīng)PCR制備DNA的起始庫，除了DNA的起始庫包含含有40個隨機核苷酸的分子。因此，本文描述的DNA起始庫使用合成寡聚體5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TATrA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N40GT GAC GGT AAG CTT GGCAC 3′(SEQ ID NO 23)，其中N是G，A，T和C的等摩爾混合物，經(jīng)PCR制備，并選擇具有裂解靶rA后磷酯之能力的DNA分子(也見圖6A)。
在Pb2+，Zn2+，Mn2+，或Mg2+存在的條件下進行選擇性擴增，從而產(chǎn)生催化性DNA分子的至少4個“家族”。如圖5所示，在各種陽離子存在的條件下產(chǎn)生顯示特異性活性的催化性DNA分子。
圖5是顯示聚丙烯酰胺凝膠的照片，證實了四個家族的選定催化性DNA的特異性核酸內切酶活性。以并列的方式重復Pb2+-依賴性家族的分子的選擇作為對照。在各組的3個泳道中，第一泳道顯示在缺乏金屬陽離子的條件下選定群體缺乏活性，第二泳道顯示在金屬陽離子存在的條件下觀察到的活性，第三泳道顯示起始庫(GO)缺乏活性。目前觀察到的反應活性順序是Pb2+＞Zn2+＞Mn2+＞Mg2+，反應了相應金屬氫氧化物的pKa。
在預選的二價陽離子存在的條件下，經(jīng)過5(G5)或6(G6)輪選擇性擴增后，獲得所需核酸內切酶活性。在Mg2+存在的條件下，下面描述的選擇性擴增試圖作為一個例子。
按照上文實施例2描述的方法進行6輪體外選擇性擴增，除了使用的二價金屬是1mM Mg2+而不是1mM Pb2+(也見Breaker和Joyce，Chem & Biol.1223-229(1994)，本文引用以供參考，它描述了基本上相同的方法)。
第6輪后分離單個克隆，測定24個這些克隆的核苷酸序列，全部序列以5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGATGG CGA CA(SEQ ID NO 23，從位置1至44)開始并以CGG TAAGCT TGG CAC 3′(SEQ ID NO 23，從位置93到107)結尾。
在起始庫中部相應于TCTC N40GTGA(SEQ ID NO 23，從位置45至92)的片段變化如下(13)CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TTGTTA GTA T (SEQ ID NO 24)(5) TCT CTT CAG CGA TGC ACG CTT GTT TTA ATG TTG CAC CCA TGTTAG TGA(SEQ ID NO 25)(2) TCT CAT CAG CGA TTG AAC CAC TTG GTG GAC AGA CCC ATG TTAGTG A(SEQ ID NO 26)(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG TTC TTGTTA GTA T(SEQ ID NO 27)(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTG CTC TCGTTA GTA T(SEQ ID NO 28)(1) TCT CAG ACT TAG TCC ATC ACA CTC TGT GCA TAT GCC TGC TTGATG TGA(SEQ ID NO 29)(1) -CT CTC ATC TGC TAG CAC GCT CGA ATA GTG TCA GTC GAT GTG A(SEQ ID NO 30).
圓括號內的起始數(shù)表示具有特定序列的克隆號。注意一些突變(以粗體字標明)出現(xiàn)在不同于開始任選的那些核苷酸位置。
上面列出的第二個序列(即SEQ ID NO 25)在24個克隆的5個中出現(xiàn)，選擇它作為用于進一步研究的先導(即，原始)化合物。在1mM濃度的各種二價金屬和1M NaCl存在的條件下在pH7.0和23℃下測量其裂解活性
金屬 kobs(min-1)無未作Mg2+2.3×10-3Mn2+6.8×10-3Zn2+4.2×10-2Pb2+1.1×10-2因此，在所有4種二價金屬存在的條件下，該先導化合物具有活性，即使在Mg2+存在的條件下選擇活性。相反，在Mn2+，Zn2+或Pb2+存在的條件下選擇活性的DNA分子不顯示出在存在Mg2+時的任何活性。
另外，在Mg2+存在下，經(jīng)過6輪體外選擇后獲得的DNA群體，當作為全部含硫代磷酸DNA類似物制備時，顯示出觀察速率為～10-3min-1的Mg2+依賴性裂解活性。以酶法制備含硫代磷酸酯的類似物以便在各立體中心具有RP構象。與未修飾的DNA相比該化合物對細胞核酸酶降解具有相對的抗性。
先導化合物在40個核苷酸位置(下面劃線)再次任選，以15％的頻率(每3個可能的堿基取代有5％的概率)導入突變。對再次任選的群體再進行7輪體外選擇。在最后四輪中，在1mM Pb2+存在下有反應性的分子從群體中取出，然后剩余物在1mM Mg2+存在下進行競爭性反應。7輪后分離出單個克隆，測定14個這些克隆的核苷酸序列。所有這些序列以5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAGAGA TGG CGA CAT CTC(SEQ ID NO 23，從位置1到48)開始并以GTG ACG GTA AGC TTG GCA C 3′(SEQ ID NO 23，從位置89至107)結束。
在中部，相應于40個部分任選的位置(N40，SEQ ID NO 23，從位置49到88)的片段變化如下(4)TAC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG GGT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 31)(2)ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT CAA TGT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 32)(2)TTC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 33)
(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TGC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 34)(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG CGT TAC ACC CAT GTT G(SEQ ID NO 35)(1)ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 36)(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 37)(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT TAG TGT TGC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 38)(1)ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CAT TAC ACC CAT GTT A(SEQ ID NO 39).
在圓括號中的數(shù)字表示具有特定序列的克隆號。以黑體字表示的核苷酸是與先導序列相比有區(qū)別的核苷酸。
對這些克隆的裂解活性進行了正式的分析。該群體作為一個整體表現(xiàn)出觀察到的速率為～10-2min-1的Mg2+依賴性裂解活性，與在Pb2+存在下的水平相當。
圖6A和6B分別提供了“祖先”催化性DNA分子和經(jīng)本文所公開的方法進行選擇性擴增獲得的7個催化性DNA分子之一的2維圖示。圖6A顯示了起始庫的一個舉例性分子，顯示以SEQ ID NO23代表的分子的總構象。如圖所示，各種互補性核苷酸位于隨機(N40)區(qū)的兩側。
圖6B是經(jīng)本文描述的方法產(chǎn)生的一個Mg2+依賴性催化性DNA分子(或DNA酶)的圖示。底物核酸中核糖核苷酸的位置以箭頭表示。(所示的分子包括本文以SEQ ID NO 25鑒定的序列，以及SEQ ID NO23的“開始”和“結尾”的序列)。
經(jīng)過本文所公開的體外進化后每個上述“家族”的核酸內切酶活性繼續(xù)增強，因此預期使用本文所公開的指導思想可成功地產(chǎn)生所需特異性不斷增強的具有酶活性的DNA分子。
實施例5較大RNA序列的裂解作為上述內容的延伸，我們形成了裂解全部RNA底物而不是如上所示的包埋于其它全部為DNA中的單個核糖核苷酸的底物的DNA酶(也見R.R.Breaker & G.F.Joyce，Chem.& Biol.1223-229(1994)；R.R.Breaker和G.F.Joyce，Chem.& Biol.2655-660(1995))。作為靶序列，我們選擇了HIV-1 RNA U5 LTR區(qū)內12個高度保守的核苷酸鏈，具有序列5′GUAACUAGAGAU 3′(SEQ ID NO 49)。
按照上面實施例所述的方法，我們產(chǎn)生了具有下列組成的1014個DNA分子的一組5′-GGAAAAr(GUAACUAGAGAU)GGAAGAGATGGCGAC N50CGGTAAGCTTGGCAC-3′(SEQ ID NO 50)，其中N是脫氧核糖核苷酸G，A，T和C的等摩爾混合物，鑒定為“r(GUAACUAGAGAU)”的序列由核糖核苷酸組成。(可任選的是，可改變起始5′核苷酸序列，例如，在5′端核糖核苷酸位置前的序列中加入一個額外的dA殘基，從而導致起始序列閱讀“GGAAAAA”并使SEQID NO 50為99個核苷酸長。很清楚，這并不是為了按本文詳細所述改造特定具有酶活性的DNA分子可做出的修飾的唯一的例子。)選擇由此產(chǎn)生的具有酶活性的DNA分子裂解位于包埋的RNA靶序列內的磷酯的能力。根據(jù)在10mM Mg2+存在時pH7.5和37℃下具有酶活性的DNA分子的活性進行10輪體外選擇性擴增。在選擇過程中，對“優(yōu)選的”裂解位點以及對在各優(yōu)選的位點裂解的“最佳”催化劑存在競爭。2個位點和2個家族的催化劑表現(xiàn)出具有最有效的裂解能力(見圖7)。
圖7顯示了基本上按本文所述進行的10輪體外選擇性擴增的一些結果。如圖所示，2個位點和2個家族的催化劑表現(xiàn)出對靶序列的最有效的裂解。裂解條件基本上如圖7所示，即，10mM Mg2+，pH7.5和37℃；顯示了反應進行2小時后收集的資料。裂解率(％)以對代數(shù)(這里是0到10)的布點圖表示。能在底物所示位點裂解靶序列的催化性DNA分子的代數(shù)/能力(prevalence)以垂直棒表示，在G↓UAACUAGAGAU裂解以帶條紋的棒表示，在GUAACUA↓GAGAU位的裂解以空白(略帶陰影)棒表示。在本文圖7中，箭頭(↓)表示發(fā)生裂解的2個相鄰核苷酸之間的位點。
克隆第8和第10輪選擇性擴增后獲得的群體的各個體。然后測定第8輪的29個個體和第10輪的32個個體的核苷酸序列(分別見表2和3)。
在表2和3中開頭的“核苷酸序列”表示各鑒定的克隆相應于起始庫任選的50個核苷酸(即N50)的部分；因此，給定克隆的完整核苷酸序列一般包括“N50”片段之前，之后和包含它的核苷酸序列，假定底物序列已附著且未發(fā)生自我裂解。例如，一個(非自我裂解的)克隆的完整序列一般包括SEQ ID NO 50的1-33號殘基，隨后是代表任選的N50區(qū)的殘基，隨后是SEQ ID NO 50的84-98號殘基或SEQ IDNO 51的1-34號殘基，隨后是代表任選的N50區(qū)的殘基，隨后是SEQID NO 51的85-89號殘基。然而，據(jù)信各克隆N50(或N40)區(qū)(或其部分)在測定特定具有酶活性的DNA分子的特異性和/或活性中特別重要。在底物和DNA酶是分離的分子的反應中這是具體證據(jù)(例如，見圖8和9)。
第8或第10輪后獲得的個體的克隆號分別命名為8-x或10-x。SEQ ID NOS也被列出且相應于各克隆的“N50”區(qū)。
表2第8輪擴增后克隆的個體SEQ克隆號 核苷酸序列ID NO ″N50″ (5′-3′)8-2 52 CCA ATA GTG CTA CTG TGT ATC TCA ATG CTG GAA ACA CGG GTTATC TCC CG8-4 53 CCA AAA CAG TGG AGC ATT ATA TCT ACT CCA CAA AGA CCA CTTTTC TCC CG8-5154 ATC CGT ACT AGC ATG CAG ACA GTC TGT CTG CTT TTT CAT TACTCA CTC CC8-1455 CAA TTC ATG ATG ACC AAC TCT GTC AAC ACG CGA ACT TTT AACACT GGC A8-17256 CTT CCA CCT TCC GAG CCG GAC GAA GTT ACT TTT TAT CAC ACTACG TAT TG8-3 57 GGC AAG AGA TGG CAT ATA TTC AGG TAA CTG TGG AGA TAC CCTGTC TGC CA8-6 58 CTA GAC CAT TCA CGT TTA CCA AGC TAT GGT AAG AAC TAG AATCAC GCG TA8-8 59 CGT ACA CGT GGA AAA GCT ATA AGT CAA GTT CTC ATC ATG TACCTG ACC GC8-1060 CAG TGA TAG ATG AGT GCA CCG CTA CGA CTA AGT CTG TAA CTTATT CTA CC8-2261 ACC GAA TTA AAC TAC CGA ATA GTG TGG TTT CTA TGC TTC TTCTTC CCT GA8-1162 CAG GTA GAT ATA ATG CGT CAC CGT GCT TAC ACT CGT TTT ATTAGT ATG TC8-2163 CCC TAC AAC ACC ACT GGG CCC AAT TAG ATT AAC GCT ATT TTATAA CTC G8-1264 CCA AAC GGT TAT AAG ACT GAA AAC TCA ATC AAT AGC CCA ATCCTC GCC C8-1365 CAC ATG TAT ACC TAA GAA ATT GGT CCC GTA GAC GTC ACA GACTTA CGC CA8-2366 CAC AAC GAA AAC AAT CTT CCT TGG CAT ACT GGG GAG AAA GTCTGT TGT CC8-4067 CAC ACG AAC ATG TCC ATT AAA TGG CAT TCC GTT TTT CGT TCTACA TAT GC8-24 68CAG AAC GAG GGT CTT GTA AGA CTA CAC CTC CTC AGT GAC AATAAT CCT G8-26 69CAC TAC AGC CTG ATA TAT ATG AAG AAC AGG CAA CAA GCT TATGCA CTG G8-27 70GGG TAC ATT TAT GAT TCT CTT ATA AAG AGA ATA TCG TAC TCTTTT CCC CA8-28 71CCA AAG TAC ATT CCA ACC CCT TAT ACG TGA AAC TTC CAG TAGTTT CCT A8-29 72CTT GAA GAT CCT CAT AAG ACG ATT AAA CAA TCC ACT GGA TATAAT CCG GA8-34 73CGA ATA GTG TCC ATG ATT ACA CCA ATA ACT GCC TGC CTA TCATGT TTA TG8-35 74CCA AGA GAG TAT CGG ATA CAC TTG GAA CAT AGC TAA CTC GAACTG TAC CA8-36 75CCA CTG ATA AAT AGG TAA CTG TCT CAT ATC TGC CAA TCA TATGCC GTA8-37 76CCC AAA TTA TAA ACA ATT TAA CAC AAG CAA AAG GAG GTT CATTGC TCC GC8-39 77CAA TAA ACT GGT GCT AAA CCT AAT ACC TTG TAT CCA AGT TATCCT CCC CC1與10-4，10-40相同2與8-20，8-32，8-38，10-1，10-34相同，1突變成10-11；3突變成10-29表3第10輪擴增后克隆的個體SEQ克隆號 核苷酸序列ID NO ″N50″ (5′-3′)10-3378 CCG AAT GAC ATC CGT AGT GGA ACC TTG CTT TTG ACA CTA AGAAGC TAC AC10-1079 CCA TAA CAA ATA CCA TAG TAA AGA TCT GCA TTA TAT TAT ATCGGT CCA CC10-1280 CAG AAC AAA GAT CAG TAG CTA AAC ATA TGG TAC AAA CAT ACCATC TCG CA10-1481 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTT CCC TGC TTG GCAACG ACA C10-15 82 CTC CCT ACG TTA CAC CAG CGG TAC GAA TTT TCC ACG AGA GGTAAT CCG CA10-19 83 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTT TTC CCC10-39 84 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTT TAG CCT ACC ATAGTC CGG T10-23 85 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTT TCC CTG CTT GAATTG TA10-27486 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTT TCC CTG CTT GACCTG TTA CGA10-31 87 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTT CCC TGC TTG GAACGA CAC10-18 88 CAT GGC TTA ATC ATC CTC AAT AGA AGA CTA CAA GTC GAA TATGTC CCC CC10-20 89 CAA CAG AGC GAG TAT CAC CCC CTG TCA ATA GTC GTA TGA AACATT GGG CC10-6 90 TAC CGA CAA GGG GAA TTA AAA GCT AGC TGG TTA TGC AAC CCTTTT CGC A10-7 91 CTC GAA ACA GTG ATA TTC TGA ACA AAC GGG TAC TAC GTG TTCAGC CCC C10-8 92 CCA ATA ACG TAA CCC GGT TAG ATA AGC ACT TAG CTA AGA TGTTTA TCC TG10-16 93 CAA TAC AAT CGG TAC GAA TCC AGA AAC ATA ACG TTG TTT CAGAAT GGT CC10-21 94 GCA ACA ACA AGA ACC AAG TTA CAT ACA CGT TCA TCT ATA CTGAAC CCC CA10-24 95 CCT TTG AGT TCC TAA ATG CCG CAC GGT AAG CTT GGC ACA CTTTGA CTG TA10-28 96 CAA AGA TCT CAC TTT GGA AAT GCG AAA TAT GTA TAT TCG CCCTGT CTG C10-33 97 CCA CGT AGA ATT ATC TGA TTT ATA ACA TAA CGC AGG ATA ACTCTC GCC CA10-35 98 CAC AAG AAA GTG TCG TCT CCA GAT ATT TGA GTA CAA GGA ACTACG CCC10-36 99 CAT GAA GAA ATA GGA CAT TCT ACA GGC TGG ACC GTT ACT ATGCCT GTA GG10-37 100 CAT AGG ATA ATC ATG GCG ATG CTT ATG ACG TGT ACA TCT ATACCT T10-38 101 CAG ATG ATC TTC CTT TAA AGA CTA CCC TTT AAA GAA ACA TAAGGT ACC CC31突變成10-541突變成10-30隨后測量了各克隆的自我裂解活性。發(fā)現(xiàn)克隆8-5，8-17和10-3在5′GUAACU↓AGAGAU 3′位點有效裂解，而發(fā)現(xiàn)克隆10-14，10-19和10-27在5′G↓UAACUAGAGAU 3′位有效裂解。當分子的RNA部分延長為序列5′GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3′(SEQID NO 51的殘基號1-24)時，克隆8-17，10-14和10-27達到全部活性，而克隆8-5，10-3和10-19顯示出活性減小。隨后，發(fā)現(xiàn)克隆10-23在包含延伸RNA區(qū)的自我裂解反應中表現(xiàn)出高水平的活性。
還應注意到，在該事件中，相關領域的技術人員不會預料到這種情況，即根據(jù)本發(fā)明說明書的教導構建的多核苷酸分子“N50”片段之前和之后的核苷酸序列可以各種方式改變以產(chǎn)生特定特異性的具有酶活性的DNA分子。例如，盡管SEQ ID NO 51的殘基號1-24在本文以RNA核苷酸描述，但它們可任選包含DNA，RNA或其組合。(因此，可較容易地改變SEQ ID NO 51，以便核苷酸殘基號1-7包含DNA，殘基號8-19包含RNA，殘基號20-99包含DNA，等)。同樣，“N50”區(qū)域之后的核苷酸可包含RNA，DNA或其組合。按本文所述，也可改變“N50”(或“N40”-見實施例4)之前和之后的區(qū)域長度。而且，N50或N40區(qū)域之前和/或之后的序列可在其全長上縮短，延伸或缺失。
而且，如上所述，我們選擇HIV-1 RNA的特定區(qū)域作為本實施例描述的方法中的靶序列；該序列不是可用作靶的唯一序列。很明顯，相關領域的技術人員可按照本文的教導構建和設計對其它靶序列具有特異性的具有酶活性的DNA分子。如本文所述，該靶序列可構建或插入包含DNA，RNA或其組合的較大序列中，如SEQ ID NO 50和51所示。
自我裂解反應經(jīng)過將酶和底物區(qū)分成分離的分子易于轉變成分子間裂解反應。選擇克隆8-17和10-23作為原型分子。兩者都在以多個轉換進行的反應中作為裂解分離的純RNA底物的DNA酶(圖8)。該底物結合臂在分開裂解位點的未配對核苷酸的每一側隨后減少到7個堿基對(圖9)。
圖8顯示了本發(fā)明的2個催化性DNA分子克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位點，和轉換率。反應條件如圖所示，即10mM Mg2+，pH7.5和37℃。鑒定為克隆8-17的DNA酶在左側顯示，RNA底物的裂解位點用箭頭表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-與DNA酶分離(即，顯示分子間裂解)-如此標記。同樣，本文以10-23鑒定的DNA酶在右側顯示，RNA底物的裂解位點用箭頭表示。另外，顯示了該底物序列。對于8-17酶，轉換率大約為0.6hr-1，對于10-23酶，轉換率大約為1hr-1。
如圖8所示，能裂解分離的底物分子的克隆8-17催化性DNA分子的核苷酸序列如下5′-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT-3′(SEQ ID NO 56的殘基號1-34)。在該圖中，能裂解分離的底物分子的克隆10-23催化性DNA分子的核苷酸序列如下5′-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′(SEQ IDNO 85的殘基號3-33)。
圖9進一步顯示了本發(fā)明的2個催化性DNA分子的克隆8-17和10-23的核苷酸序列，裂解位點，和轉換率。反應條件如圖所示，即10mM Mg2+，pH7.5和37℃。如圖8所示，以克隆8-17鑒定的DNA酶在左側顯示，RNA底物的裂解位點以箭頭表示。底物序列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3′)-與DNA酶分離(即，顯示分子間裂解)-如圖進行標記。同樣，本文以10-23鑒定的DNA酶在右側顯示，RNA底物裂解位點以箭頭表示。另外，顯示了底物序列。對于8-17酶，kobs為大約0.002min-1；對于10-23酶，kobs值大約為0.01min-1。
如圖9所示，能裂解分離的底物分子的克隆8-17催化性DNA分子的核苷酸序列如下5′-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3′(SEQ IDNO 56的殘基號4-30)。在相同圖中，能裂解分離的底物分子的克隆10-23催化性DNA分子的核苷酸序列如下5′-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′(SEQ ID NO 85的殘基號5-33。在5′端用“CTA”取代“TTG”)。
裂解RNA的DNA酶的催化速率還有待充分優(yōu)化。如上面所公開及如在前面研究中所報道的，我們已經(jīng)過部分任選原型分子并進行多輪選擇性擴增能增加催化速率。然而，我們發(fā)現(xiàn)，在pH7.5和37℃測量時，對于8-17和10-23 DNA酶，Mg2+的Km分別為大約5mM和2mM，這當然與細胞內條件相容。
上面說明書，包括具體實施方案和實施例是試圖說明本發(fā)明而不是用于限制。在不背離本發(fā)明的實質和范圍的條件下可產(chǎn)生許多其它的變化和修改。
序列表(1)一般信息(I)申請人The Scripps Research Institute(ii)發(fā)明題目具有酶活性的DNA分子(iii)序列數(shù)101(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人The Scripps Research Institute(B)街道10666 North Torrey Pines Road，TPC-8(C)城市La Jolla(D)州加利福利亞(E)國家美國(F)郵編92037(v)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)一般申請資料(A)申請?zhí)朠CT/US95/(B)申請日01-12-1995(C)分類(vii)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/472,194(B)申請日07-6-1995(vii)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/349,023(B)申請日02-12-1994(viii)委托/代理人資料(A)姓名Logan，April C.
(B)登記號33，950(C)參考/檔案號463.2 PC
(ix)電訊資料(A)電話(619)554-2937(B)電傳(619)554-6312(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGTAAGCTT GGCAC15(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(8，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO2TCACTATNAG GAAGAGATGG20(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3ACACATCTCT GAAGTAGCGC CGCCGTATAG TGACGCTA 38(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度80個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GTGCCAAGCT TACCGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNGTCGC CATCTCTTCC 80(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置28(D)其它信息/標準_名稱＝“2′3′環(huán)磷酸酯”(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(28，″″)
(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO5GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN 28(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(28，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO6GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN28(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(8，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO7TCACTATNGG AAGAGATGG 19(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度8個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(8，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO8TCACTATN 8(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CCATCTCTTC CTATAGTGAG TCCGGCTGCA 30(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO10GTGCCAAGCT TACCG15(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11CTGCAGAATT CTAATACGAC TCACTATAGG AAGAGATGGC GAC43(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(8，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO12TCACTATNGG AAGAGATGG 19(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(28，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO13GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GAC43(2)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14TCACACATCT CTGAAGTAGC GCCGCCGTAT GTGACGCTAG GGGTTCGCCT 50(2)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GGGGGGAACG CCGTAACAAG CTCTGAACTA GCGGTTGCGA TATAGTCGTA 50(2)SEQ ID NO16資料
(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16CGGGACTCCG TAGCCCATTG CTTTTTGCAG CGTCAACGAA TAGCGTATTA 50(2)SEQ ID NO17資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17CCACCATGTC TTCTCGAGCC GAACCGATAG TTACGTCATA CCTCCCGTAT 50(2)SEQ ID NO18資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18GCCAGATTGC TGCTACCAGC GGTACGAAAT AGTGAAGTGT TCGTGACTAT 50(2)SEQ ID NO19資料(i)序列特征
(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO19ATAGGCCATG CTTTGGCTAG CGGCACCGTA TAGTGTACCT GCCCTTATCG 50(2)SEQ ID NO20資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO20TCTGCTCTCC TCTATTCTAG CAGTGCAGCG AAATATGTCG AATAGTCGGT 50(2)SEQ ID NO21資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO21TTGCCCAGCA TAGTCGGCAG ACGTGGTGTT AGCGACACGA TAGGCCCGGT 50(2)SEQ ID NO22資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO22TTGCTAGCTC GGCTGAACTT CTGTAGCGCA ACCGAAATAG TGAGGCTTGA 50(2)SEQ ID NO23資料(i)序列特征(A)長度107個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc區(qū)別(B)位置取代(28，″″)(D)其它信息/標準_名稱＝“腺嘌呤核糖核苷酸”/標記＝rA(xi)序列描述SEQ ID NO23GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GACATCTCNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNGT GACGGTAAGC TTGGCAC 107(2)SEQ ID NO24資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO24CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT TGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO25資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO25TCTCTTCAGC GATGCACGCT TGTTTTAATG TTGCACCCAT GTTAGTGA 48(2)SEQ ID NO26資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO26TCTCATCAGC GATTGAACCA CTTGGTGGAC AGACCCATGT TAGTGA46(2)SEQ ID NO27資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO27CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGTTCT TGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO28資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO28CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT CGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO29資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO29TCTCAGACTT AGTCCATCAC ACTCTGTGCA TATGCCTGCT TGATGTGA 48(2)SEQ ID NO30資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO30CTCTCATCTG CTAGCACGCT CGAATAGTGT CAGTCGATGT GA 42(2)SEQ ID NO31資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO31TACAGCGATT CACCCTTGTT TAAGGGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO32資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO32ATCAGCGATT AACGCTTGTT TCAATGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO33資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO33TTCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA40(2)SEQ ID NO34資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO34ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTGC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO35資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO35ATCAGCGATT CACCCTTGTT TAAGCGTTAC ACCCATGTTG40(2)SEQ ID NO36資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO36ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO37資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO37ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO38資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO38ATCAGCGATT AACGCTTGTT TTAGTGTTGC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO39資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO39ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCATTAC ACCCATGTTA40(2)SEQ ID NO40資料(i)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO40GCCATGCTTT 10(2)SEQ ID NO41資料(i)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO41CTCTATTTCT 10(2)SEQ ID NO42資料(i)序列特征(A)長度12個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO42TATGTGACGC TA 12(2)SEQ ID NO43資料(i)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO43TATAGTCGTA10(2)SEQ ID NO44資料(i)序列特征(A)長度11個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO44ATAGCGTATT A 11(2)SEQ ID NO45資料(i)序列特征(A)長度13個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO45ATAGTTACGT CAT 13(2)SEQ ID NO46資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO46AATAGTGAAG TGTT 14(2)SEQ ID NO47資料(i)序列特征(A)長度11個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO47ATAGGCCCGG T 11(2)SEQ ID NO48資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO48AATAGTGAGG CTTG 14(2)SEQ ID NO49資料(i)序列特征(A)長度12個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO49GUAACUAGAG AU 12(2)SEQ ID NO50資料(i)序列特征(A)長度98個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置7..18(D)其它信息/注＝“位置7-18是RNA；殘余序列是DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO50GGAAAAGUAA CUAGAGAUGG AAGAGATGGC GACNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCGGTAAG CTTGGCAC 98(2)SEQ ID NO51資料(i)序列特征(A)長度99個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..24(D)其它信息/注＝“位置1-24是RNA；殘余序列是DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO51GGAAAAAGUA ACUAGAGAUG GAAGAGATGG CGACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNCGGTAA GCTTGGCAC 99(2)SEQ ID NO52資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO52CCAATAGTGC TACTGTGTAT CTCAATGCTG GAAACACGGG TTATCTCCCG 50(2)SEQ ID NO53資料
(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO53CCAAAACAGT GGAGCATTAT ATCTACTCCA CAAAGACCAC TTTTCTCCCG 50(2)SEQ ID NO54資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO54ATCCGTACTA GCATGCAGAC AGTCTGTCTG CTTTTTCATT ACTCACTCCC50(2)SEQ ID NO55資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無
(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO55CAATTCATGA TGACCAACTC TGTCAACACG CGAACTTTTA ACACTGGCA 49(2)SEQ ID NO56資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO56CTTCCACCTT CCGAGCCGGA CGAAGTTACT TTTTATCACA CTACGTATTG 50(2)SEQ ID NO57資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO57GGCAAGAGAT GGCATATATT CAGGTAACTG TGGAGATACC CTGTCTGCCA 50(2)SEQ ID NO58資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO58CTAGACCATT CACGTTTACC AAGCTATGGT AAGAACTAGA ATCACGCGTA 50(2)SEQ ID NO59資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO59CGTACACGTG GAAAAGCTAT AAGTCAAGTT CTCATCATGT ACCTGACCGC 50(2)SEQ ID NO60資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非
(xi)序列描述SEQ ID NO60CAGTGATACA TGAGTGCACC GCTACGACTA AGTCTGTAAC TTATTCTACC 50(2)SEQ ID NO61資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO61ACCGAATTAA ACTACCGAAT AGTGTGGTTT CTATGCTTCT TCTTCCCTGA 50(2)SEQ ID NO62資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO62CAGGTAGATA TAATGCGTCA CCGTGCTTAC ACTCGTTTTA TTAGTATGTC 50(2)SEQ ID NO63資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO63CCCTACAACA CCACTGGGCC CAATTAGATT AACGCTATTT TATAACTCG 49(2)SEQ ID NO64資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO64CCAAACGGTT ATAAGACTGA AAACTCAATC AATAGCCCAA TCCTCGCCC 49(2)SEQ ID NO65資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO65CACATGTATA CCTAAGAAAT TGGTCCCGTA GACGTCACAG ACTTACGCCA50(2)SEQ ID NO66資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO66CACAACGAAA ACAATCTTCC TTGGCATACT GGGGAGAAAG TCTGTTGTCC 50(2)SEQ ID NO67資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO67CACACGAACA TGTCCATTAA ATGGCATTCC GTTTTTCGTT CTACATATGC 50(2)SEQ ID NO68資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO68CAGAACGAGG GTCTTGTAAG ACTACACCTC CTCAGTGACA ATAATCCTG 49(2)SEQ ID NO69資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO69CACTACAGCC TGATATATAT GAAGAACAGG CAACAAGCTT ATGCACTGG 49(2)SEQ ID NO70資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO70GGGTACATTT ATGATTCTCT TATAAAGAGA ATATCGTACT CTTTTCCCCA50(2)SEQ ID NO71資料(i)序列特征
(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO71CCAAAGTACA TTCCAACCCC TTATACGTGA AACTTCCAGT AGTTTCCTA 49(2)SEQ ID NO72資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO72CTTGAAGATC CTCATAAGAC GATTAAACAA TCCACTGGAT ATAATCCGGA50(2)SEQ ID NO73資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非
(xi)序列描述SEQ ID NO73CGAATAGTGT CCATGATTAC ACCAATAACT GCCTGCCTAT CATGTTTATG 50(2)SEQ ID NO74資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO74CCAAGAGAGT ATCGGATACA CTTGGAACAT AGCTAACTCG AACTGTACCA50(2)SEQ ID NO75資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO75CCACTGATAA ATAGGTAACT GTCTCATATC TGCCAATCAT ATGCCGTA 48(2)SEQ ID NO76資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO76CCCAAATTAT AAACAATTTA ACACAAGCAA AAGGAGGTTC ATTGCTCCGC 50(2)SEQ ID NO77資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO77CAATAAACTG GTGCTAAACC TAATACCTTG TATCCAAGTT ATCCTCCCCC 50(2)SEQ ID NO78資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO78CCGAATGACA TCCGTAGTGG AACCTTGCTT TTGACACTAA GAAGCTACAC50(2)SEQ ID NO79資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO79CCATAACAAA TACCATAGTA AAGATCTGCA TTATATTATA TCGGTCCACC50(2)SEQ ID NO80資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO80CAGAACAAAG ATCAGTAGCT AAACATATGG TACAAACATA CCATCTCGCA 50(2)SEQ ID NO81資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO81CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG CAACGACAC 49(2)SEQ ID NO82資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO82CTCCCTACGT TACACCAGCG GTACGAATTT TCCACGAGAG GTAATCCGCA50(2)SEQ ID NO83資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO83CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TTCCCC 36(2)SEQ ID NO84資料(i)序列特征
(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO84CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TAGCCTACCA TAGTCCGGT 49(2)SEQ ID NO85資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO85CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG AATTGTA 47(2)SEQ ID NO86資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非
(xi)序列描述SEQ ID NO86CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG ACCTGTTACG A 51(2)SEQ ID NO87資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO87CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG AACGACAC 48(2)SEQ ID NO88資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO88CATGGCTTAA TCATCCTCAA TAGAAGACTA CAAGTCGAAT ATGTCCCCCC50(2)SEQ ID NO89資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO89CAACAGAGCG AGTATCACCC CCTGTCAATA GTCGTATGAA ACATTGGGCC50(2)SEQ ID NO90資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO90TACCGACAAG GGGAATTAAA AGCTAGCTGG TTATGCAACC CTTTTCGCA 49(2)SEQ ID NO91資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO91CTCGAAACAG TGATATTCTG AACAAACGGG TACTACGTGT TCAGCCCCC 49(2)SEQ ID NO92資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO92CCAATAACGT AACCCGGTTA GATAAGCACT TAGCTAAGAT GTTTATCCTG 50(2)SEQ ID NO93資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO93CAATACAATC GGTACGAATC CAGAAACATA ACGTTGTTTC AGAATGGTCC 50(2)SEQ ID NO94資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO94GCAACAACAA GAACCAAGTT ACATACACGT TCATCTATAC TGAACCCCCA50(2)SEQ ID NO95資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO95CCTTTGAGTT CCTAAATGCC GCACGGTAAG CTTGGCACAC TTTGACTGTA50(2)SEQ ID NO96資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO96CAAAGATCTC ACTTTGGAAA TGCGAAATAT GTATATTCGC CCTGTCTGC 49(2)SEQ ID NO97資料(i)序列特征
(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO97CCACGTAGAA TTATCTGATT TATAACATAA CGCAGGATAA CTCTCGCCCA50(2)SEQ ID NO98資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO98CACAAGAAAG TGTCGTCTCC AGATATTTGA GTACAAGGAA CTACGCCC 48(2)SEQ ID NO99資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非
(xi)序列描述SEQ ID NO99CATGAAGAAA TAGGACATTC TACAGGCTGG ACCGTTACTA TGCCTGTAGG 50(2)SEQ ID NO100資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO100CATAGGATAA TCATGGCGAT GCTTATGACG TGTACATCTA TACCTT46(2)SEQ ID NO101資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定無(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO101CAGATGATCT TCCTTTAAAG ACTACCCTTT AAAGAAACAT AAGGTACCCC50
權利要求
1.具有點特異性核酸內切酶活性的催化性DNA分子。
2.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的核酸內切酶活性對底物核酸序列中包含單鏈核酸的核苷酸序列限定的裂解位點具有特異性。
3.權利要求2的催化性DNA分子，其中所說的單鏈核酸包含RNA，DNA，修飾的RNA，修飾的DNA，核苷酸類似物或其組合。
4.權利要求2的催化性DNA分子，其中所說的底物核酸包含RNA，DNA，修飾的RNA，修飾的DNA，核苷酸類似物或其組合。
5.權利要求2的催化性DNA分子，其中所說的核酸內切酶活性包括在所說的裂解位點水解裂解磷酯鍵。
6.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的分子是單鏈。
7.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的分子包括一個或多個發(fā)夾環(huán)結構。
8.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的底物核酸序列附著于所說的催化性DNA分子上。
9.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的底物核酸序列未附著于所說的催化性DNA分子上。
10.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子包括選自DEQ ID NO 3和SEQ ID NOS 14到22的核苷酸序列。
11.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子包括選自SEQ ID NOS 23到30的核苷酸序列。
12.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子包括選自SEQ ID NOS 31到39的核苷酸序列。
13.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子包括選自SEQ ID NOS 52到101的核苷酸。
14.權利要求11，12或13的催化性DNA分子，其中所說的核酸內切酶活性在Mg2+存在下得到增強。
15.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子具有大約1μM或更少的底物結合親和性。
16.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子以少于大約0.1μM的KD結合底物。
17.權利要求2的催化性DNA分子，其中所說的核苷酸序列限定的所說的裂解位點包含至少一個核苷酸。
18.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的核酸內切酶活性由于存在二價陽離子而增強。
19.權利要求18的催化性DNA分子，其中所說的二價陽離子選自Pb2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，和Ca2+。
20.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的核酸內切酶活性由于存在單價陽離子而增強。
21.權利要求20的催化性DNA分子，其中所說的單價陽離子選自Na+和K+。
22.權利要求1的催化性DNA分子，其中所說的催化性DNA分子包含兩側有第一和第二底物結合區(qū)的一個保守核心。
23.權利要求22的催化性DNA分子，進一步包含位于所說的保守核心和所說的底物結合區(qū)之間的一個或多個間隔子核苷酸。
24.權利要求22的催化性DNA分子，其中所說的保守核心包含一個或多個保守區(qū)。
25.權利要求24的催化性DNA分子，其中所說的一個或多個保守區(qū)包括選自CG；CGA；AGCG；AGCCG；CAGCGAT；CTTGTTT；和CTTATTT.的核苷酸序列。
26.權利要求24的催化性DNA分子，進一步包含位于所說的保守核心的所說的保守區(qū)之間的一個或多個可變的或間隔子核苷酸。
27.權利要求22的催化性DNA分子，其中所說的第一底物結合區(qū)包括選自CATCTCT；GCTCT；TTGCTTTTT；TGTGTTCTC；TTGCTGCT；GCCATGCTTT；CTCTATTTCTGTCGGCA；CATCTCTTC；和ACTTCT.的核苷酸序列。
28.權利要求22的催化性DNA分子，其中所說的第二底物結合區(qū)包括選自TATGTGACGCTA；TATAGTCGTA；ATAGCGTATTA；ATAGTTACGTCAT；AATAGTGAAGTGTT；TATAGTGTA；ATAGTCGGT；ATAGGCCCGGT；AATAGTGAGGCTTG；和ATGNTG.的核苷酸序列。
29.權利要求22的催化性DNA分子進一步包含第三底物結合區(qū)，其中所說的第三區(qū)包括選自TGTT；TGTTA和TGTTAG的核苷酸序列。
30.權利要求29的催化性DNA分子，進一步包含位于所說的底物結合區(qū)之間的一個或多個間隔子區(qū)域。
31.包含根據(jù)權利要求1的2個或多個催化性DNA分子的群體的組合物，其中各催化性DNA分子的群體能裂解底物中的不同核苷酸序列。
32.包含根據(jù)權利要求1的催化性DNA分子的2個或多個群體的組合物，其中各催化性DNA分子的群體能識別不同的底物。
33.一種選擇在特異性位點裂解底物核酸序列的催化性DNA分子的方法，包括下列步驟a.獲得單鏈DNA分子的群體；b.將含核苷酸底物的分子與所說的單鏈DNA分子的群體混合以形成混合物；c.在預定的反應條件下維持所說的混合物足夠長的一段時間使所說的群體中的單鏈DNA分子裂解所說的底物序列，從而產(chǎn)生底物裂解產(chǎn)物；d.將所說的單鏈DNA分子從所說的底物序列和底物裂解產(chǎn)物中分離；和e.從所說的群體中分離在特定位點裂解含核苷酸的底物的單鏈DNA分子。
34.權利要求33的方法，其中所說的底物包含RNA。
35.權利要求33的方法，其中所說的在特定位點裂解所說的底物的DNA分子用固定化試劑標記。
36.權利要求35的方法，其中所說的試劑包含生物素。
37.權利要求35的方法，其中所說的分離步驟進一步包含將所說的標記的DNA分子與具有抗生物素蛋白連接其上的固相表面接觸，從而使所說的標記的DNA分子附著于所說的固相表面上。
38.一種裂解磷酯鍵的方法，包括a.將能在限定的裂解位點裂解底物核酸序列的催化性DNA分子與含磷酯鍵的底物混合以形成反應混合物；和b.在預定反應條件下維持所說的混合物使所說的催化性DNA分子裂解所說的磷酯鍵，從而產(chǎn)生底物產(chǎn)物的群體。
39.權利要求38的方法，進一步包括下列步驟a.從所說的催化性DNA分子中分離所說的產(chǎn)物；b.向所說的催化性DNA分子中加入額外的底物以形成新的反應混合物。
40.權利要求38的方法，其中所說的底物包含RNA。
41.權利要求38的方法，其中所說的預定的反應條件包括存在單價陽離子，二價陽離子或二者均有。
42.構建裂解磷酯鍵的催化性DNA分子的方法，包括下列步驟a.獲得單鏈DNA分子的群體；b.將遺傳變異導入所說的群體以產(chǎn)生變異群體；c.從符合預定選擇標準的所說變異群體中選擇個體；d.從所說變異群體的殘留物中分離所說的選定個體；和e.擴增所說的選定個體。
43.一種非天然存在的催化性DNA分子，包括限定保守核心及兩側的一個或多個識別區(qū)，可變區(qū)和間隔區(qū)的核苷酸序列。
44.權利要求43的催化性DNA分子，其中所說的核苷酸序列限定與該分子5′端連續(xù)或相鄰的第一可變區(qū)，位于第一可變區(qū)3′端的第一識別區(qū)，位于第一識別區(qū)3′端的第一間隔子區(qū)，位于第一間隔子區(qū)3′端的第一保守區(qū)，位于第一保守區(qū)3′端的第二間隔子區(qū)；位于第二間隔子區(qū)3′端的第二保守區(qū)，位于第二保守區(qū)3′端的第二識別區(qū)，位于第二識別區(qū)3′端的第二可變區(qū)。
45.權利要求43的催化性DNA分子，其中所說的核苷酸序列限定與該分子5′端連續(xù)或相鄰的第一可變區(qū)，位于第一可變區(qū)3′端的第一識別區(qū)，位于第一識別區(qū)3′端的第一間隔子區(qū)，位于第一間隔子區(qū)3′端的第一保守區(qū)，位于第一保守區(qū)3′端的第二間隔子區(qū)；位于第二間隔子區(qū)3′端的第二保守區(qū)，位于第二保守區(qū)3′端的第二識別區(qū)；位于第二識別區(qū)3′端的第二可變區(qū)；位于第二可變區(qū)3′端的第三識別區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明公開了能以位點特異性方式裂解核酸序列或分子,尤其是RNA的脫氧核糖核酸酶(催化性或具有酶活性的DNA分子)以及包括它的組合物。還公開了制備和使用所公開的酶和組合物的方法。
文檔編號C12N9/00GK1173207SQ95197440
公開日1998年2月11日 申請日期1995年12月1日 優(yōu)先權日1994年12月2日
發(fā)明者G·F·喬伊斯, R·R·布列克 申請人:斯克里普斯研究學院 被以下專利引用 (1),