專利名稱：水解多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富含多不飽和脂肪酸的油的完全酶催化水解。
n-6和n-3系列脂肪酸具有營養(yǎng)價值，尤其是在前列腺素生物合成中作為前體的該類脂肪酸。在各種營養(yǎng)品和化妝品中使用具有可以得到的富集有這些脂肪酸的部分是有利的。這些脂肪酸在自然界中主要以甘油三酯的形式被發(fā)現(xiàn)。
工業(yè)上通過在高溫和高壓下水解甘油三酯得到游離脂肪酸。游離的脂肪酸也可以用化學(xué)的方法通過將甘油三酯與強(qiáng)堿皂化，然后用強(qiáng)堿與皂中和釋放脂肪酸，最后用非極性溶劑，例如己烷從介質(zhì)中提取脂肪酸得到。
應(yīng)用這些方法在多不飽和脂肪酸的情況下會引起降解。
酶催化方法代表著前述方法的一種替代方法，因為其能夠使得反應(yīng)在溫和條件下使用非常少的能量和更小的壓力系統(tǒng)下進(jìn)行。
水解通常在兩相介質(zhì)中進(jìn)行，同時保持有效地攪拌以確保水相和有機(jī)相之間最大可能地接觸。
我們發(fā)現(xiàn)一種簡單的油狀的甘油三酯完全水解的酶催化方法，該方法能夠以預(yù)想不到的方式使水解得到改善，同時得到的轉(zhuǎn)化成脂肪酸的轉(zhuǎn)化率大于在兩相介質(zhì)中通過酶催化方法得到的轉(zhuǎn)化率，與化學(xué)方法比較，該水解在該條件下幾乎不會引起降解，并且能夠使得到的多不飽和脂肪酸具有改善的質(zhì)量和穩(wěn)定性。
本發(fā)明涉及從富集多脂肪酸的油中制備多不飽和脂肪酸的酶催化方法，其特征在于在作為乳化劑的卵磷脂存在下在乳化的介質(zhì)中通過來自Candida cylindracea的非立體專一的脂酶水解該油。
本發(fā)明的方法尤其可用于水解富含n-3和n-6系列脂肪酸，尤其是γ-亞麻酸的油，尤其是來自黑紅醋栗、琉璃苣和晚櫻種子的油。
當(dāng)具體使用該方法時，富含多不飽和脂肪酸的油狀甘油三酯在乳化介質(zhì)中的完全酶催化水解在20℃至45℃，優(yōu)選在室溫下，在大氣壓下和pH6至8下進(jìn)行。這些控制條件從質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)上看都是有利的。
酶催化反應(yīng)在有機(jī)相和含有酶和緩沖水溶液的水相之間的交界面上，在pH6-8，接近中性條件下進(jìn)行。水包油型乳液通過在水相和乳化劑存在下劇烈攪拌生成。這樣得到的油的乳液是以細(xì)小的液滴形式，例如平均直徑為約450nm的液滴形式分散在水相中并被乳化劑，卵磷酯穩(wěn)定化。
用于本發(fā)明的卵磷酯優(yōu)選地可以是選自下列的磷脂—含有大于60％(重量)的丙酮不溶物(下文AIM)的卵磷脂，—不含油的卵磷脂，含有大于90％的AIM，—溶于醇的卵磷脂部分，含有大于60％(重量)的AIM，富含磷脂酰膽堿(PC)，—醇溶的無油的卵磷脂，含大于90％(重量)的AIM，—含大于50％(重量)的PC的卵磷脂部分和一經(jīng)胰或微生物源的磷脂酶A2(Phospholipidase)改良的卵磷脂或它們的前述部分，其中10％至90％(重量)的PC被轉(zhuǎn)化成溶原-PC(LPC)。
乳化液可以預(yù)先制備以便隨后使用，例如將乳化液放入消毒容器中。
乳化液的組成被規(guī)定以便得到持續(xù)的穩(wěn)定性。如果油的比例增加至超過某些限制，例如超過約20％(重量)，乳化液就不再是均相的，并且得到的水解程度被降低。卵磷脂含量小于約1％(重量)也導(dǎo)致水解程度降低。優(yōu)選地，卵磷脂含量是總組成的0.1％至5％(重量)，有利的是0.3％至0.8％(重量)，優(yōu)選0.5％(重量)。優(yōu)選地，卵磷脂的含量是固定的以便使得基于乳化液的油含量的純PC的相應(yīng)含量是1.5％至4％(重量)，優(yōu)選約2.5％(重量)。
非立體專一的脂酶來自Candida gylindracea。理想的反應(yīng)條件取決于被水解的基質(zhì)的性質(zhì)和各種脂酶的內(nèi)在性質(zhì)。
反應(yīng)在20℃至45℃之間，優(yōu)選在最低溫度，例如約20℃下進(jìn)行以便水解盡可能完全，這樣能夠處理多不飽和脂肪酸，因為其對氧化降解特別敏感，而氧化降解隨著升溫而增加。
pH值在6至8之間不影響水解反應(yīng)程度。優(yōu)選使用鹽的中性緩沖溶液，例如，pH6.88的磷酸鹽的緩沖溶液，以便確保反應(yīng)條件得到穩(wěn)定的和可重復(fù)的結(jié)果。在上述理想的條件下在2至20小時內(nèi)可以達(dá)到完全水解。
在前述的操作條件下，水解程度取決于所用酶的濃度，但該濃度超出一定限制，該參數(shù)就不再起作用，因為酶催化反應(yīng)在油和含水介質(zhì)之間的交界面上發(fā)生，酶的需要量超過了由可以得到的交界面的表面積決定的最大值。優(yōu)選使用10至100mg/g油的濃度。
一旦反應(yīng)完成，脂酶優(yōu)選可以被循環(huán)重新使用。為了這樣做，將乳化液以高速度離心破壞，然后用溶劑提取回收類脂相，用水洗滌，硫酸鈉干燥并蒸發(fā)溶劑。脂肪酸優(yōu)選在避光、在惰性氣氛下和在零下溫度(攝氏度)優(yōu)選在約-25℃下保存。在水相中的脂酶溶液和水解中生成的甘油通過濃縮，例如超濾作用回收。然后可以將脂酶再循環(huán)。
得到的脂肪酸混合物可以用作富集特殊不飽和脂肪酸的方法或制備其中脂肪酸以及其位置在甘油分子中是特定的甘油三酯結(jié)構(gòu)的方法中的原料。得到的產(chǎn)物可以依次用于營養(yǎng)品，化妝品和藥物組合物中。
下面的實(shí)施例說明本發(fā)明。其中，除非另有說明，百分比和份數(shù)按重量計。
實(shí)施例1-7將20％的黑紅醋栗的種子油和1.2％的豆油卵磷脂(Asol 100(R)，Lucas Meyer)溶于78.8％的pH6.88的0.025M磷酸鹽緩沖劑水溶液中制備水包油乳液，并將其5次通過微流化器(110T，MicrofluidicsCorporation，Newton)導(dǎo)致平均油液滴直徑為約450nm。
脂酶在磷酸鹽緩沖劑中被溶液化，然后將其以4000g離心20分鐘以除去不溶殘余物。用上清液作實(shí)驗。將10ml前面的乳化液(含2g黑紅醋栗的種子油)置于蓋住的25ml錐形燒瓶中，放入恒溫浴中以保持在所選擇的溫度，并且以250rpm電磁攪拌，加入相當(dāng)于0.2g脂酶的酶溶液。
反應(yīng)后，將介質(zhì)以4000g離心以破壞乳化液，類脂相用乙醚提取回收。用水洗滌，硫酸鈉干燥，然后通過蒸發(fā)除去溶劑。得到的脂肪酸在氮?dú)庀略?25℃貯于避光處。
在水相中的溶液中的脂酶以及生成的甘油通過超濾作用(YM10module，cut-off threshold 10000，Amicon，Denver，USA)回收，由此得到脂酶的濃縮溶液，該脂酶可以重新使用。
相應(yīng)于反應(yīng)時釋放出的游離脂肪酸的百分?jǐn)?shù)的水解率通過使用Metrohm692滴定計進(jìn)行酸堿滴定確定。將所分析的樣品溶于25ml乙醇和乙醚等體積混合物中用濃度為0.1N的KOH醇溶液滴定。
水解條件列于下面表I中表I實(shí)施例 Candida cylindracea溫度時間 ％脂酶 ℃ h 水解1 Type B，Biocatalysts Ltd 37 4 99.9Cardiff，England2 Type VII，Sigma Chemical 20 20 91.6Co.St Louis，USA3 Lot189，Biogenzia Lemania 37 20 96SA，Lausanne，Switzerland4 Type OF，Meito Sangyo Co. 20 8 99.2Ltd.Tokyo，Japan5 Type OF，Meito Sangyo Co. 30 8 96.3Ltd.Tokyo，Japan6 Type MY，Meito Sangyo Co. 37 20 91.1Ltd.Tokyo，Japan7 Type F5，Enzymatix，37 20 97.6Cambridge，England作為比較，在兩相系統(tǒng)中使用實(shí)施例1至4中的酶，溫度條件和時間進(jìn)行水解，結(jié)果如下實(shí)施例脂酶在兩相系統(tǒng)中水解的百分率1 794 81.1實(shí)施例8-13通過改變酶的濃度、油和卵磷脂的比例和與再循環(huán)脂酶連續(xù)循環(huán)的次數(shù)，同時使用與實(shí)施例4中相同的其他條件，得到列于表II中所示的水解率表II實(shí)施例 乳化液組成酶濃度 20小時水 ％水解(％) mg/g油解循環(huán)次數(shù)8油，30- - 78卵磷脂，1.2緩沖劑，68.89 油，20 - - 89卵磷脂，1緩沖劑，7910 - 20- 88.611 - 50- 92.712 - - 2 9613 - - 3 94.6-與實(shí)施例4相同的條件。
實(shí)施例14將用酶方法得到的脂肪酸的質(zhì)量和穩(wěn)定性與在下列條件下通過黑紅醋栗的種子油化學(xué)皂化得到的脂肪酸的相應(yīng)性質(zhì)進(jìn)行比較判斷將100g黑紅醋栗的種子油與213g由47.7％水、14.3％氫氧化鈉、37.8％乙醇和0.15％乙二胺四乙酸二鈉鹽組成的堿性溶液混合，混合物在80-85℃回流120分鐘。在加入40g水，然后再加入80ml發(fā)煙鹽酸之后，將反應(yīng)混合物劇烈攪拌60分鐘。生成的脂肪酸用己烷提取，有機(jī)相用水洗，硫酸鈉干燥并經(jīng)蒸發(fā)除去溶劑。
通過氣相色譜分析以它們甲酯形式的兩種水解產(chǎn)物表明它們的組成完全一致，這能夠證明大豆卵磷脂不被水解。
通過脂肪酸在異辛烷溶液中的UV色譜分析表明酶水解得到的脂肪酸的最大吸收值低于用化學(xué)方法得到的脂肪酸的相應(yīng)值。而且，通過計算兩種脂肪酸在某些波長上的摩爾消光系數(shù)值發(fā)現(xiàn)，用化學(xué)方法得到的脂肪酸的該值高于用酶方法得到的脂肪酸的相應(yīng)值。
最后，脂肪酸過氧化指數(shù)的確定能夠比較兩種水解方法和得到的脂肪酸的質(zhì)量。通過將鐵離子轉(zhuǎn)化成硫氰酸鐵用紅顏色在510nm波長在Hewlett Packard 845A分光光度計上測量得到的值，能夠確定用meq of O2/kg表示的過氧化指數(shù)。其結(jié)果如下皂化方法得到的脂肪酸 7.9酶方法得到的脂肪酸1.4上述分析結(jié)果證實(shí)，生物催化的水解反應(yīng)得到的脂肪酸混合物比化學(xué)水解得到的脂肪酸具有更好的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.從富含多不飽和脂肪酸的油中制備多不飽和脂肪酸的酶催化方法，其特征在于該油用來自Candida cylindracea的非立體專一的脂酶在作為乳化劑的卵磷脂存在下在乳化的介質(zhì)中水解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于乳化液是水包油型，含有高達(dá)30％(重量)的油和0.1％至5％，優(yōu)選0.3％至0.8％(重量)的卵磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于水相含有保持pH值約為中性的緩沖劑鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于酶的使用量相當(dāng)于10至100mg/g油。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于反應(yīng)需要2至20小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，一旦反應(yīng)完全，將乳化液高速離心將其破壞，然后將類脂相用溶劑提取回收，用水洗滌，干燥并蒸發(fā)溶劑，得到的脂肪酸在惰性氣氛下在零下溫度避光保存以備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于將在水相中的脂酶溶液與水解中生成的甘油通過超濾作用濃縮回收，并循環(huán)到新的水解中重新使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用的油是富含n-3和n-6系列的脂肪酸，尤其是富含γ-亞麻酸的油，優(yōu)選選自黑紅醋栗子、琉璃苣和晚櫻種子的油。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9的方法處理得到的脂肪酸混合物。
全文摘要
為了制造具有理想質(zhì)量的多不飽和脂肪酸混合物，將富含多不飽和脂肪酸的油用來自Candidacylindracea的非立體專一的脂酶在作為乳化劑的卵磷脂存在下在水包油的被乳化的介質(zhì)中水解，水解優(yōu)選在室溫下在pH值接近中性的含水緩沖介質(zhì)中進(jìn)行。
文檔編號C12R1/72GK1131697SQ9512174
公開日1996年9月25日 申請日期1995年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月28日
發(fā)明者H·-J·維勒 申請人:雀巢制品公司