專利名稱：一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及一種能夠有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶，又稱甘油三酯水解酶，是一類能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解的酶，也可以催化該反應(yīng)的逆反應(yīng)，許多微生物分泌的脂肪酶還可以催化酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、酸解反應(yīng)以及氨解反應(yīng)等。家禽胰腺中脂肪酶的活性在出生時很低，出生后隨著日齡的升高而逐漸增加，肉雞出生時對動物脂肪的消化率很差，在1-8周齡逐漸增加，肉雞對植物油的消化率較動物油高，但在仔雞出生后兩周內(nèi)的消化率較低。家禽在剛出生時胰腺分泌的脂肪酶不足成為限制脂肪消化利用的一個因素，因此，在玉米-豆粕型日糧中添加脂肪酶可以提高脂肪的消化率，從而影響動物的生長。在飼料中添加脂肪酶，能夠提高日糧的脂肪消化率和能量利用率，從而改善畜禽生產(chǎn)性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明申請即是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種能夠有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應(yīng)用。具體來說，本發(fā)明申請所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶， 其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法獲得1、獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；2、分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達(dá)盒；3、將該PEL基因表達(dá)盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達(dá)載體；4、將含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的青霉基因工程菌；5、將所述的青霉基因工程菌以菌絲體或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在25-35°C、 200-300rpm條件下培養(yǎng)對小時后，以5% -20 %接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35 °C、 150-300rpm條件下發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。其中，獲得潮霉素抗性表達(dá)盒的方法包括PCR技術(shù)或限制性酶切技術(shù)。獲得青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子 (PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)的方法包括PCR擴增或限制酶克隆或化學(xué)合成技術(shù)克隆。
其中所述的被轉(zhuǎn)化的青霉菌為擴展青霉菌。所述的目標(biāo)質(zhì)粒為下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。其中，所以培養(yǎng)基的成分如下1、種子培養(yǎng)基(% )黃豆餅粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，F(xiàn)eSO4 0. 003 ；2、發(fā)酵培養(yǎng)基(% )黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，F(xiàn)eSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本發(fā)明申請還要求包括該脂肪酶在降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平中的應(yīng)用。例如可以將該脂肪酶作為動物飼料添加劑添加到動物的日常飼料中，改善動物的肉質(zhì)。


圖1為PV2+載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為pCAMBIA2300載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為pCAMBIA2302載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4 為 PMD18-T: :gpdA-Lip-TtrpC 載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5 為 pCHAMBIA2302: PgpdA-Lip-TtrpC 最終載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為超表達(dá)載體pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的構(gòu)建路線圖；圖7為構(gòu)建的超表達(dá)載體pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鑒定圖譜；其中，1-6 獨立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子、+ 陽性對照、-陰性對照、M :DL-2000Marker ；圖8為青霉轉(zhuǎn)基因菌株的PCR鑒定圖譜；其中，1-5 獨立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子、+ 陽性對照、-陰性對照、M :DL-2000Markero
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明申請所述的本發(fā)明申請所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶進(jìn)行進(jìn)一步描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，而不是對所述技術(shù)內(nèi)容的限制，事實上，在本發(fā)明精神實質(zhì)內(nèi)，對本發(fā)明申請所述方法的改進(jìn)，目標(biāo)質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶的替換都是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員無需創(chuàng)造性的勞動即可獲得的，因此都在本發(fā)明申請所要求保護(hù)的技術(shù)方案之內(nèi)。實施例一、超表達(dá)載體的構(gòu)建采用如下的步驟(1)利用限制性內(nèi)切酶Mc I, Kpn I將潮霉素抗性表達(dá)盒從質(zhì)粒PV2+上酶切出來(如圖1所示)，片段經(jīng)凝膠回收，克隆到PCAMBIA2300質(zhì)粒(如圖2所示)的相應(yīng)酶切位點上，獲得具有潮霉素抗性的重組質(zhì)粒pCHAMBIA2302(如圖3所示)；潮霉素表達(dá)盒也可來自其它含該序列的任何DNA或者直接合成，用于構(gòu)建PEL基因超表達(dá)載體的質(zhì)粒除PCAMBIA2300外，還可用能在絲狀真菌中表達(dá)的質(zhì)粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等 pCAMBIA系列載體和pHB載體；(2)根據(jù)擴展青霉菌P. expansium的脂肪酶基因PEL (AF330635)的序列設(shè)計引物 (正向引物:TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下劃線的序列為限制性酶Spe I切點；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下劃線的序列為限制件酶Not I切點)，利用 PCR 技術(shù)擴增全基因序列，PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s, 35 個循環(huán)；72 °C IOmin ；(3)根據(jù)質(zhì)粒pPAN7_l(Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124)的序列設(shè)計引物(正向引物GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA,下劃線的序列為限制性酶Not I 切點；反向引物:GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC,下劃線的序列為限制件酶PmeI切點)，利用PCR技術(shù)擴增出色氨酸合成酶終止子TtrpC，PCR反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，35 個循環(huán)；72°C IOmin ；(4)取(2)禾Π (3)的反應(yīng)液各 1 μ L 作為模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCA ATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，進(jìn)行 PCR 擴增，PCR 的反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s，72°C 150s，；35 個循環(huán)；72°C IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠柱回收，并克隆到PMD-18-T 載體，獲得中間載體 PMD-18-T: PEL-TtrpC ；(5)根據(jù)質(zhì)粒 pPAN7-l (Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124 的序列設(shè)計引物(正向引物:GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下劃線的序列為限制性酶Not I切點；反向引物:GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下劃線的序列為限制性酶PmeI切點)利用PCR技術(shù)擴增強啟動子PgpdA。PCR反應(yīng)條件為95°C 5min ;95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150s, 35個循環(huán)；72°C IOmin0利用限制性內(nèi)切酶Ml I和Spe I將PgpdA克隆到載體 PMD-18-T: PEL-TtrpC 的相應(yīng)位點，獲得中間載體 PMD-18-T: :PgpdA-PEL_TtrpC(如圖 4 所示)；(6)利用限制內(nèi)切酶I和Rne I對載體PMD-18-T: PgpdA-PEL-TtrpC進(jìn)行消化，回收表達(dá)盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相應(yīng)位點，獲得最終載體 PCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL_TtrpC(如圖5所示)，整個的構(gòu)建過程如圖6所示；(7)對含有最終載體pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的菌進(jìn)行擴大培養(yǎng)， 并抽提質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌EHA105，隨機挑選6株轉(zhuǎn)化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作為反向引物，以載體 PMD-18-T: PEL-TtrpC為陽性對照，空EHA105為陰性對照，對這6株菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示這6株菌均為陽性，見圖7。實施例二、青霉基因工程菌的獲得所述青霉基因工程菌的活動包括如下的步驟(1)挑取分離純化后的野生型青霉接種于PDA平板上，于培養(yǎng)20天左右，用無菌水洗下成熟孢子；(2)將實例一中含終載體 pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC 的工程農(nóng)桿菌 EHA105 接種于含有鏈霉素、卡那霉素(均為100μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中^°C，200rpm過夜培養(yǎng)，用含有鏈霉素和卡那霉素(均為100 μ g/ml)的MM培養(yǎng)基重新活化，28°C，220rpm培養(yǎng) 48小時。吸取適量的培養(yǎng)物5000rpm離心去上清，并用IM液體培養(yǎng)基洗滌，最后用IM液體培養(yǎng)基稀釋至0D600 = 0. 15，然后在^°C，220rpm的條件下培養(yǎng)6-8小時，至0D600 = 0. 5-0. 6 ；
(3)將第(1)步得到的新鮮孢子配制成IX IO7個/mL濃度的懸浮液，隨后取上述孢子懸液與步驟O)中的工程農(nóng)桿菌等體積混合，取200 μ L均勻涂布到鋪有玻璃紙的IM 固體培養(yǎng)基(含AS 200yg/mL)之上二8°C共培養(yǎng)60h，然后將玻璃紙反鋪到含有潮霉素 (100 μ g/mL轉(zhuǎn)化選擇抗生素)、頭孢菌素(500 μ g/mL，抑制農(nóng)桿菌生長抗生素)的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，揭下玻璃紙，在條件下培養(yǎng)1-3天，將抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子挑出接種到二篩培養(yǎng)基上，如穩(wěn)定傳代，即是所述的青霉基因工程菌，如此獲得了 30株青霉基因工程菌。隨機挑選5株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴大培養(yǎng)，并分別抽提基因組DNA，以(TGACTAGTATGTTG TTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，以載體PMD-18-T: =PEL-TtrpC為陽性對照，野生型青霉基因組DNA為陰性對照，對這 5株菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示這5株菌均為陽性，見圖8。MM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO 3100mg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，無菌水 941. 5mL。IM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO 32. 5mL，50%甘油 10mL，IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmM AS(乙酰丁香酮)2mL，無菌 7jC 898. 7mLCM培養(yǎng)基加一半IM培養(yǎng)基的葡萄糖量，外加1. 5%瓊脂，其它成份同IM培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20 ；瓊脂，15 ；PH自然。實施例三、產(chǎn)脂肪酶能力對比實驗隨機挑選實例2所得的青霉基因工程菌接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10天后分別接入種子培養(yǎng)基50mL中，在，210rpm搖床培養(yǎng)Mh，然后以10%的接種量分別轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基Q50mL三角瓶裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基)，在，210rpm條件下發(fā)酵48h ；然后將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行脂肪酶活力檢測。利用酸堿滴定法對脂肪酶活力進(jìn)行檢測。步驟取IOOmL三角瓶20只，分別加入4. OmL pH9. 4的Gly-NaOH緩沖液和5. OmL橄欖油乳化液；放入震蕩恒溫水浴鍋36°C水浴鍋預(yù)熱5分鐘.酶液過濾后，用0.05mol/L pH9. 4 的Gly-NaOH緩沖液稀釋使酶活為4_5u/mL后測定。往其中兩個各加入ImL稀釋好的酶液，緩慢振蕩(60次/min) 10分鐘(精確計時).另外兩瓶做空白對照.立即加入95%酒精20mL(空白對照加入ImL稀釋好的酶液)，搖勻，加入10mL30 %的氯化鈉溶液，搖勻；用 0. Olmol/LNaOH溶液滴定樣品使其與空白對照的pH相同，記下0. Olmol/LNaOH用量。計算X = AXBXl/TXn式中
X—樣品的酶活力(u/g或u/mL)；A——滴定樣品時消耗標(biāo)準(zhǔn)0. Olmol/LNaOH的體積(mL)；B——滴定用NaOH的濃度(μ mol/mL) T——酶促反應(yīng)時間(min)，η—稀釋倍數(shù)；同時做兩份平行，結(jié)果取平均值，所得結(jié)果表示至整數(shù)。平行試驗相對誤差不得超過 5.0%。PDA培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20 ；瓊脂，15 ；PH自然種子培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉 4，玉米淀粉 0. 8，NaNO3 0. 3，Na 2HP04 0. 2, K2SO4O. 25， MgSO4 0. 03，F(xiàn)eSO4 0. 003發(fā)酵培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，F(xiàn)eSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02橄欖油乳化液的制取4% PVA溶液和橄欖油為2 1 (ν/ν)，放到小三角瓶里(外包冰塊)，調(diào)整為轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，一次乳化3分鐘，間隔3分鐘，共乳化3次。轉(zhuǎn)基因青霉和非轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力測定結(jié)果見下表
菌林編號WTTlT2T3T4T5酶活力 (IU/mL)3100 + 155320 + 305210 + 256130 + 405460 + 455750 + 50其中，WT為青霉野生型菌株，Tl，Τ2，Τ3，Τ4，Τ5 為獨立的青霉轉(zhuǎn)化子，由圖可知， 轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力顯著高于非轉(zhuǎn)基因青霉的酶活力。實施例四、在動物飼料中添加上述脂肪酶的動物實驗本試驗選用240只1日齡健康的愛維因肉仔雞，按照隨機分配原則分為4個處理組，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。試驗期為8周。整個飼養(yǎng)期分為三個階段0-3wk 為生長前期，4-6wk為生長中期，7-8wk為生長后期，試驗設(shè)計見表1。表1試驗設(shè)計
組別正對照負(fù)對照試驗I試驗11處理常規(guī)曰糧低能量曰糧常規(guī)曰糧低能量曰糧+0. 02%脂肪酶+0. 02%脂肪酶一、試驗日糧—次性購入所需北方常規(guī)使用原料，粉碎后按日糧組成用攪拌機混合均勻。依據(jù)國家肉雞標(biāo)準(zhǔn)O004)的營養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)日糧作為正對照組日糧，負(fù)對照組、試驗I、試驗I I日糧組成與營養(yǎng)水平見表2、表3與表4。所有日糧均為粉料，嚴(yán)格按試驗設(shè)計飼喂相應(yīng)日糧。表2 0-3周日糧組成及營養(yǎng)水平(％ )
權(quán)利要求
1.一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法獲得(1)獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；(2)分別擴增青霉的脂肪酶基因PEL、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子PgpdA和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子TtrpC，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達(dá)盒；(3)將該PEL基因表達(dá)盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達(dá)載體；(4)將含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的青霉基因工程菌；(5)將所述的青霉基因工程菌以菌絲體或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基，在25-35°C、 200-300rpm條件下培養(yǎng)對小時后，以5 % -20 %接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35 °C、 150-300rpm條件下發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于在步驟(1)中獲得潮霉素抗性表達(dá)盒的方法包括PCR技術(shù)或限制性酶切技術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于在步驟O)中獲得青霉的脂肪酶基因PEL、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子PgpdA和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子TtrpC的方法包括PCR擴增或限制酶克隆或化學(xué)合成技術(shù)克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于步驟(4)中所述的青霉菌為擴展青霉菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的目標(biāo)質(zhì)粒為下列之一PCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于步驟(5)中所述培養(yǎng)基的成分如下(1)種子培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉4，玉米淀粉0. 8，Na N03 0. 3，Na2HP040. 2，K2S04 0. 25，MgS04 0. 03，F(xiàn)eS04 0.003 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(%)黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaN03 0. 4，Na2HP04 0. 2，K2S04 0. 3， MgS04 0. 035, FeS04 0. 02，CaC03 0. 5，Na2C03 0.02。
7.權(quán)利要求1所述的脂肪酶在降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂肪酶作為添加劑在動物飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明申請?zhí)峁┮环N能夠有效降低動物體內(nèi)膽固醇、血脂水平的脂肪酶及其應(yīng)用，通過在日糧中添加脂肪酶對商品肉仔雞的生長性能的影響、對表觀代謝能的影響、對血液生化指標(biāo)的影響和對腹脂率等的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，添加脂肪酶能提高肉雞的生長性能和表觀代謝能，降低血液中甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量，降低腹脂率，并且在試驗中期生長性能和表觀代謝能提高最大，甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量和腹脂率降低最大。
文檔編號A61K38/46GK102154237SQ20111000053
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者張清輝, 王劍英, 陳健 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司