專利名稱：大黃魚甘油三酯脂酶atgl基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及一種大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因。
背景技術(shù)：
哺乳動物多余的能量主要以甘油三酯(Triglyceride，TG)的形式儲存在脂肪組織中，動物饑餓時這些貯存的脂質(zhì)由甘油三酯分解成非酯化的脂肪酸，釋放入血液參與能量代謝。能量供求平衡受到眾多神經(jīng)信號和激素調(diào)控，建立于脂肪儲存和脂肪動員的動態(tài)平衡過程中(Flier, 2004 ；Bell et al.，2005)。如果脂解作用出現(xiàn)障礙或者病變，就會影響機體能量平衡，進而引發(fā)肥胖和胰島素抵抗等疾病(Arner，2002 ;Boden and Shulman, 2002 ；Blaak，200;3)。脂肪組織的甘油三酯的分解需要脂肪分解酶的參與，激素敏感脂酶 (Hormone-sensitive lipase, HSL)是第一個被發(fā)現(xiàn)和克隆得到的脂肪分解酶(Holm et al.，1988)，并相繼對該酶底物的選擇性以及調(diào)控機制開展了廣泛的研究(Greenberg et al. ,2001 ；Kraemer et al. ,2002 ；Yeaman, 2004) HSL—直被認(rèn)為是脂肪細胞脂動員過程中唯一的脂肪水解限速酶。近年來對HSL基因敲除鼠的研究發(fā)現(xiàn)，HSL敲除鼠體重正常， 所表現(xiàn)的生理特性暗示著在脂肪動員過程中存在著HSL以外的分解酶，HSL的限速作用受到 了質(zhì)疑(Haemmerle et al. ,2002 ；Mulder et al. ,2003) 另外研究還發(fā)現(xiàn)，HSL 基因敲除伴有脂肪細胞中甘油二酯的堆積，表明HSL在脂肪組織脂解作用中可能主要針對甘油二酯，而不是甘油三酯(Haemmerle et al.，2002)，同時暗示著存在著另外的未知的甘油三酯水解酶(Haemmerle et al. ,2002 ；OkazakiH et al. ,2002) 2004 年，三個不同的實驗室相繼在人和鼠上發(fā)現(xiàn)了一種新的具有脂解TG能力的脂肪酶，即甘油三酯酶(adipose triglyceride lipase, ATGL),又口L] patatin-like phospholipase domain containing 2 (PNPLA2)、calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2)、desnutrin (Jenkins et al. ,2004 ；Villena et al.，2004)。ATGL的發(fā)現(xiàn)也成為了脂動員研究領(lǐng)域新的熱點之一， 該酶對甘油三脂具有較高的底物特異性，并且受營養(yǎng)及激素調(diào)控，是啟動脂動員又一新的脂肪分解酶，ATGL的發(fā)現(xiàn)進一步完善了對脂肪分解過程的認(rèn)識，已成為脂肪動員研究的新執(zhí)占。大黃魚[Pseudosciaena crocea (Richardson)]是我國重要的經(jīng)濟魚類，由于過量捕撈，產(chǎn)量急劇下降。1987年我國大黃魚人工育苗獲得成功并在1994年開始人工養(yǎng)殖。但養(yǎng)殖大黃魚體型差，魚肉口感、營養(yǎng)價值遠不及野生大黃魚(段青源等，2000)，因此無法滿足市場“質(zhì)”的需求，大量研究表明，脂肪的過度沉積是影響體型、口感的重要因素之一(繆伏榮等2008 ；徐繼林等，200 。而且養(yǎng)殖過程中因為脂肪大量沉積，脂肪肝的高發(fā)生率嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益(劉振勇等，2007 ；曾端等，2008)，影響了大黃魚養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。因此如何改善大黃魚肉質(zhì)，降低脂肪的過多沉積是當(dāng)前最具有現(xiàn)實經(jīng)濟意義的重大課題。通過對ATGL基因表達的調(diào)控可以改善大黃魚體內(nèi)脂肪代謝過程，促進脂肪動員，減少脂肪過度沉積，對提高大黃魚肉質(zhì)具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大黃魚甘油三酯脂酶ATGL的基因，該基因?qū)τ谶M一步深入了解大黃魚的脂肪代謝過程，并通過營養(yǎng)手段調(diào)控大黃魚脂肪代謝，從而減少大黃魚脂肪沉積起到重要作用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因，為SEQ IDNO 1所示或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時提供了編碼上述大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的蛋白質(zhì)，為SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時提供了上述大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的用途，用于大黃魚的脂肪分解。本發(fā)明的ATGL基因全長1820bp，其中包括141bp 5，非編碼區(qū)、1485bp編碼區(qū)和 194個bp的3，非編碼區(qū)。編碼區(qū)翻譯495個氨基酸。氨基酸序列BLAST結(jié)果表明，yATGL氨基酸序列與牛(bATGL)、山羊(cATGL)，雞 (gaATGL)、人(hATGL)、鰕虎魚(giATGL)、豬(sATGL)同源性分別達到 94 %，94 %，95 %， 94%，98%和93%。與其他動物的ATGL—樣，也含有一個“GXSXG(Gly-X-Ser-X-Gly) ”保守序列，如圖3。大黃魚ATGL基因也具有I^tatin蛋白家族的保守核心結(jié)構(gòu)域，如圖4。通過對大黃魚不同組織表達情況的熒光定量分析，表明肝臟組織中表達量最高， 鰓組織中表達量最低，但是都有基因的表達。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了大黃魚甘油三酯脂酶ATGL的基因克隆及其熒光定量方法，為探討大黃魚脂肪代謝的分子作用機制提供了理論基礎(chǔ)，并對其他石首魚科魚類ATGL基因的克隆和表達提供了借鑒作用。本發(fā)明通過對ATGL基因表達的調(diào)控可以改善大黃魚體內(nèi)脂肪代謝過程，促進脂肪動員，減少脂肪過度沉積，對提高大黃魚肉質(zhì)具有重大意義。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是5，RACE PCR電泳結(jié)果圖(600bp左右)；圖2是3，RACE PCR電泳結(jié)果圖(1200bp左右)；圖3是大黃魚ATGL氨基酸序列比對結(jié)果圖；由于幅面的原因，將圖3分成(1)和 O)兩部分；圖4是大黃魚ATGL基因保守結(jié)構(gòu)域分析圖；圖5是大黃魚ATGL基因進化樹分析圖；圖6是大黃魚ATGL基因溶解曲線圖；圖7是大黃魚不同組織ATGL基因表達差異圖；圖8是不同脂肪源對ATGL表達的影響圖；圖9是不同脂肪水平對ATGL表達的影響圖。
具體實施例方式實施例1 兼并引物進行PCR擴增篩選新基因
根據(jù)GeneBank上已有的ATGL的基因序列，根據(jù)同源性設(shè)計兩對簡并引物ATGL-Fl :5-TTYCCWHTGGACTCCSCDTGGA_3ATGL-Rl 5-ATCCAYCBAATATCCTCAGG-3ATGL-F2 5-CYTTCAACHTGGTRAAGAYCAT-3ATGL-R2 5-GAACTGGATGSWKGTRTTGGTGA-3根據(jù)此簡并引物拉出666bp長度基因片段(SEQ ID NO :1，即序列表中第一序列)， 經(jīng)過與GeneBank上相應(yīng)核酸序列進行比對，確認(rèn)此序列是ATGL基因的部分序列。實施例2 =ATGL基因全長cDNA的克隆和測序采用FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion)進行ATGL基因5擴增反應(yīng)，具體方案見說明書(為FirstChoice RLM-RACE Kit所提供的使用說明)。(1)5，RACE 擴增引物ATGL-R2 5-CATTTCATACTGAGGGAGGTTGT-3ATGL-Rl 5-CGGGGACACGGTGATGGTATTT-3第一輪PCR擴增反應(yīng)
滅菌去離子水 IOxLABufFer MgCl2 ( 25mM) dNTPs (2.5mM)
權(quán)利要求
1.大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因，其特征是為SEQID NO :1所示或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
2.編碼如權(quán)利要求1所述大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的蛋白質(zhì)，其特征是為SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的用途，其特征是用于大黃魚的脂肪分解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因，為SEQ ID NO1所示或SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時公開了編碼上述大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的蛋白質(zhì)，為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。該大黃魚甘油三酯脂酶ATGL基因的用途是能用于大黃魚的脂肪分解。該基因?qū)τ谶M一步深入了解大黃魚的脂肪代謝過程，并通過營養(yǎng)手段調(diào)控大黃魚脂肪代謝，從而減少大黃魚脂肪沉積起到重要作用。
文檔編號C12N15/55GK102296080SQ20111027422
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者汪以真, 王新霞 申請人:浙江大學(xué)