專利名稱：化學(xué)合成的HBV 1.2x基因組、表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及是關(guān)于一種化學(xué)合成的HBV1. 2x基因組、表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
合成生物學(xué)是新生交叉學(xué)科，對生命過程或生物體進(jìn)行有目標(biāo)的設(shè)計(jì)、改造、重新合成改造乃至重新合成，有助于解決生物醫(yī)藥、環(huán)境能源、生物材料等問題，對于解決國計(jì)民生相關(guān)的重大生物技術(shù)問題有著長遠(yuǎn)的戰(zhàn)略意義和現(xiàn)實(shí)意義。一般的合成過程是把目標(biāo)DNA序列分成大小不同的DNA的片段,化學(xué)合成每段寡核苷酸，寡核苷酸包含與其它寡核苷酸的重疊片段，經(jīng)過PCR和連接酶鏈反應(yīng)，得到全長的DNA，由測序驗(yàn)證保證序列100%準(zhǔn)確。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不依賴天然模板、可以根據(jù)需要改造的化學(xué)合成的HBV1. 2x基因組、表達(dá)系統(tǒng)及構(gòu)建方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種化學(xué)合成的HBV1. 2x基因組， 所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列。
進(jìn)一步的，所述第一序列由SEQ ID NO :2所示的第二序列改造而成，所述第二序列的1501-3215片段和1-2150片段構(gòu)成改造序列，改造序列對應(yīng)第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變?yōu)镃、第1912個核苷酸由C突變?yōu)門、第2248個核苷酸由T突變?yōu)镃，在改造序列(對應(yīng)第二序列的1501-3215， 1-2150，其中包含上述三個突變點(diǎn))的兩端均加入序列GATATC(即EcoRV酶切位點(diǎn))得到所述第一序列。
一種HBV基因型/基因亞型表達(dá)系統(tǒng)，包括表達(dá)載體及克隆到所述表達(dá)載體的所述的HBV 1.2x基因組。
所述表達(dá)載體是pcDNA3.1。
一種所述的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟
a)獲得HBV1. 2x基因組，所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列；
b)將所述HBV1. 2x基因組克隆到真核表達(dá)載體；
c)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株H印G2細(xì)胞，得到所述表達(dá)系統(tǒng)。
一種HBV基因型/基因壓型快速診斷試劑盒，包括重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包括真核表達(dá)載體及插入所述真核表達(dá)載體的所述的HBV1. 2x基因組，所述重組質(zhì)粒的HBV基因型/基因亞型特異性片段用作陽性對照模板。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明不用依賴天然模板，而且可以根據(jù)需要進(jìn)行改造； 本發(fā)明HBV1. 2x基因組構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)/HBV，然后轉(zhuǎn)入肝腫瘤細(xì)胞系!fepG2細(xì)胞，培養(yǎng)上清中檢測到HBV特異性抗原HBe Ag和HBs Ag，從而能夠?qū)崿F(xiàn)HBV特異性抗原的表達(dá)。


圖1是本發(fā)明重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /HBV結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明HBV1. 2x基因組是由現(xiàn)有HBV基因組改造，本發(fā)明HBV1. 2x基因組的序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列，現(xiàn)有HBV基因組的序列為SEQ ID NO 2所示的第二序列?，F(xiàn)有HBV基因組的相關(guān)信息如下HBV subtype C2, genotype C ;GenBank :FJ899789.1。 改造序列對應(yīng)第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909 個核苷酸由T突變?yōu)镃、第1912個核苷酸由C突變?yōu)門 (該位點(diǎn)可以作為Clal酶切位點(diǎn))、 第2248個核苷酸由T突變?yōu)镃(該位點(diǎn)可以作為Xhol酶切位點(diǎn))，然后在突變后的改造序列的兩端均加入序列GATATC (該兩端可以作為EcoRV酶切位點(diǎn))，得到第一序列。
如圖1所示，把合成得到的第一序列插入到PCDNA3.1 (+)的EcoRV位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /HBV,然后轉(zhuǎn)入肝腫瘤細(xì)胞系IfepG2細(xì)胞，培養(yǎng)上清中檢測到HBV特異性抗原HBeAg和HBsAg，其檢測結(jié)果如表I所示
表I ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液特異性分泌蛋白
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)合成的HBV1. 2x基因組，其特征在于所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列。
2.如權(quán)利要求1所述的HBV1. 2x基因組，其特征在于所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的第一序列，所述第一序列由SEQ ID NO 2所示的第二序列改造而成，改造序列對應(yīng)所述第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，所述1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變?yōu)镃、第1912個核苷酸由C突變?yōu)門、第2248個核苷酸由T突變?yōu)镃，在所述改造序列的兩端均加入序列GATATC得到所述第一序列。
3.一種HBV基因型/基因亞型表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于包括表達(dá)載體及克隆到所述表達(dá)載體的如權(quán)利要求1或2所述的HBV1. 2x基因組。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述表達(dá)載體是pcDNA3.1。
5.一種如權(quán)利要求3所述的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 a)獲得HBV1. 2x基因組，所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列； b)將所述HBV1. 2x基因組克隆到真核表達(dá)載體； c)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株H印G2細(xì)胞，得到所述表達(dá)系統(tǒng)。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于所述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1。
7.一種HBV基因型/基因亞型快速診斷試劑盒，其特征在于包括重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包括真核表達(dá)載體及插入所述真核表達(dá)載體的如權(quán)利要求1或2所述的HBV1. 2x基因組，所述重組質(zhì)粒的HBV基因型/基因亞型特異性片段用作陽性對照模板。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化學(xué)合成的HBV 1.2x基因組、表達(dá)系統(tǒng)及構(gòu)建方法，所述HBV 1.2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO1所示的第一序列。所述第一序列由SEQ ID NO2所示的第二序列改造而成，所述改造序列(對應(yīng)第二序列的1501-3215，1-2150)，其中1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變?yōu)镃、第1912個核苷酸由C突變?yōu)門、第2248個核苷酸由T突變?yōu)镃，在改造序列的兩端均加入序列GATATC得到所述第一序列。根據(jù)本發(fā)明HBV1.2x基因組構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HBV，然后轉(zhuǎn)入肝腫瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)上清中檢測到HBV特異性抗原HBe Ag和HBs Ag，從而能夠?qū)崿F(xiàn)HBV特異性抗原的表達(dá)。
文檔編號C12Q1/70GK102994519SQ20111027375
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者蔡志明, 韓永華, 唐愛發(fā), 劉宇辰, 段永剛, 楊銳林, 葉藝旺 申請人:蔡志明, 韓永華, 唐愛發(fā), 劉宇辰, 段永剛, 楊銳林, 葉藝旺