專利名稱：截短的生物活性更高的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(“KGF”)。更具體地說，涉及一個截短的比在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的重組全長KGF具有更高的生物活性和較低細(xì)胞毒性的KGF片段及其類似物。該KGF片段在本文中稱為KGFdesl-23，它缺失了成熟全長KGF N-末端頭23個氨基酸殘基，該N-末端含有Finch，P.W.et a1.Science245752-755(1989)指明的在N-末端第14到16位氨基酸殘基上的一個糖基化位點(diǎn)，以前認(rèn)為該N-末端使KGF具有上皮細(xì)胞專一性。
背景技術(shù)：
KGF屬于成纖維細(xì)胞生長因子(“FGF”)族，本族的典型代表是堿性FGF(“bFGF”)。因此KGF也稱為FGF-6。與其它FGF一樣，KGF是一種肝素結(jié)合蛋白，但區(qū)別之處是它具有獨(dú)特的靶細(xì)胞特異性。特別是，F(xiàn)GF通常能刺激從原中胚層或后成中胚層以及神經(jīng)外胚層衍生而成的各種細(xì)胞的繁殖與分化。KGF類似于其它FGF，具有刺激上皮細(xì)胞繁殖的能力，但區(qū)別在于它不能刺激內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的繁殖，如Finch，P.W.等人所述(在上述引文中)。
已知包括酸生成纖維細(xì)胞生長因子(“aFGF”)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(“bFGF)在內(nèi)的成纖維細(xì)胞生長因子具有結(jié)合肝素特性，并具有誘導(dǎo)早期囊胚中腹中胚層和背中胚層繁殖和分化的能力，如同Gospodarowicz et al.，Cell Biol.Rev.25307-314(1991)和Basilico et al.，Adv.Cancer Res.59115-165(1992)所討論的。細(xì)胞對FGF的反應(yīng)是通過FGF與細(xì)胞表面受體(“FGFR”)的結(jié)合而介導(dǎo)的，存在著三種相互聯(lián)系類型的受體，參見Hou et al.，Science 251665-668(1991)。高親和力的FGFR是酪氨酸激酶類，包括flg受體(“FGFR-1”)、bek受體(“FGFR-2”)和K Sam受體(“FGFR-3”)，參見Lee et al.，Science24557-60(1989)；Dionne et al.，EMBO92685-2692(1990)；Miki etal.，Science 25172-75(1991)；Miki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89246-250(1992)；Dell et al.，J.Biol.Chem.26721225-21229(1992)。
FGFR-1和FGFR-2在中胚層和神經(jīng)內(nèi)胚層組織中廣泛表達(dá)，2者能以相似的親和力結(jié)合aFGF和bFGF。FGFR-3是上皮細(xì)胞特有的一種KGF受體。它是FGFR-2的另一種轉(zhuǎn)錄本。FGFR-2對aFGF和bFGF都有很高的親和力，但對KGF無親和力，與此相反，F(xiàn)GFR-3對KGF和aFGF的親和力約是對bFGF的20到1000倍，如同Miki等人和Dell等人(在上述引文中)所討論的。
KGF的嚴(yán)格限制于上皮細(xì)胞的活力分布是合乎需要的，例如，在許多類型的傷口愈合應(yīng)用中和在表皮過度增生疾病如牛皮癬和基細(xì)胞癌的治療中。目前，除KGF外，還沒有很合適的促細(xì)胞分裂因子能用于這些應(yīng)用。因此，從治療上考慮很有必要對KGF進(jìn)行修飾以提高其效力和降低其細(xì)胞毒性。
近來，Ron等人(J.Biol.Chem.2682984-2988(1993年2月))發(fā)現(xiàn)，當(dāng)KGF163在T7原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時，可獲得一個具有促細(xì)胞分裂活力的重組KGF(“rKGF”)多肽。當(dāng)rKGF分子從成熟KGF163多肽的N-末端分別缺失3、8、27、38和48個氨基酸殘基而被截短時，可獲得生物活性不同的分子。當(dāng)分別缺失3個和8個氨基酸殘基時，所得分子的促細(xì)胞分裂活力不受影響，與全長rKGF(“rKGF163”)一樣。然而，當(dāng)缺失27個氨基酸殘基時，促細(xì)胞分裂活性下降了10-20倍。當(dāng)分別缺失38和48個氨基酸殘基時，促細(xì)胞分裂活力和結(jié)合肝素的能力完全喪失。如此，Ron等人未得到任何具有比rKGF163分子更高的促細(xì)胞分裂活力的截短的KGF片段。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供一個含有成熟全長KGF(KGF163)氨基酸序列一部分的KGF片段，它具有比全長重組KGF(rKGF)增強(qiáng)了至少2倍的促細(xì)胞分裂活力。一個特別的目的是提供一個KGF片段，它缺少了包含rKGF163N-末端的頭23個氨基酸殘基的序列，這23個氨基酸殘基是C-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-N-C-S-S-P-E-R-H-T-R-。
本發(fā)明的另一目的是提供一個比rKGF163降低了細(xì)胞毒性的KGF片段。另一目的是提供一種含有上述KGF片段和一個毒素分子的結(jié)合物。毒素分子可以是蓖麻蛋白A、白喉毒素和皂草素中的至少一種。
本發(fā)明的另一目的是提供一種治療組合物，它含有上述的KGF片段和一種藥學(xué)上可接受的載體，例如適合人皮膚局部使用的載體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有編碼上述KGF片段的核苷酸序列的DNA分子。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有編碼上述KGF片段的DNA分子和該DNA分子表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。該表達(dá)載體可以是例如桿狀病毒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)液中分離KGF片段而生產(chǎn)KGF片段的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過對上皮細(xì)胞需要生長的部位施以上述的KGF片段并使該細(xì)胞生長而刺激上皮細(xì)胞生長的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過在需治療的傷口部位施以上述的治療組合物并使傷口愈合而治愈傷口的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種在需治療部位施以上述結(jié)合物而治療表皮過度增生疾病的方法。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的，這里就不一一列出。本發(fā)明也包括那些對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的上述內(nèi)容的變化和修改，而這些變化和修改沒有實(shí)質(zhì)性地改變該片段、結(jié)合物、治療組合物、載體、宿主的性質(zhì)和活力以及使用方法。
附圖概述

圖1示出成熟全長人KGF多肽的氨基酸序列，該序列從N-末端開始，含有163個氨基酸殘基，其中在14-16位氨基酸殘基處含有一單個N-連接的糖基化信號。
圖2示出插入了KGF的163個氨基酸序列的pAcC13表達(dá)載體。
圖3說明從SF9細(xì)胞條件培養(yǎng)基經(jīng)用1M NaCl在肝素瓊脂糖(“HS”)柱中洗脫后進(jìn)一步純化本發(fā)明的KGF片段。合并從HS柱洗脫的具有生物活性的部分，用10mM Tris，pH7.3緩沖液稀釋5倍，然后上Mono S HR5/5陽離子交換FPLC。
圖4比較長的(即rKGF163)和短的(即KGFdesl-23)KGF相對于aFGF對Balb/Mk細(xì)胞系的生物活性。
圖5比較長的(即rKGF163)和短的(即KGFdesl-23)KGF相對于bFGF對得自大血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞(AABAE細(xì)胞)或得自毛細(xì)血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述非常驚奇地發(fā)現(xiàn)，缺失了rKGF163N-末端的頭23個氨基酸殘基的截短的、未糖基化的KGF(在這里稱為KGF片段或KGFdesl-23)，具有比rKGF163對上皮細(xì)胞更高的生物活性和降低了的細(xì)胞毒性。一般來說，本發(fā)明的KGF片段保留了KGF163刺激上皮細(xì)胞增生的專一性。
因此，本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案是一種新的、截短的、未糖基化的KGF片段KGFdesl-23，該片段不伴有那些在體內(nèi)常伴隨天然分子一起產(chǎn)生的雜質(zhì)。根據(jù)該片段在Na Dod SO4/PAGE中作為單峰時的遷移，其表觀分子量為約18KDa。純化的KGFdesl-23對Balb/Mk細(xì)胞的比活力大約是2.5×107單位/mg(ED50為40pg/ml)，比以細(xì)胞增生法測定的rKGF163或aFGF活力約高7-10倍，比在化學(xué)組成確定的培養(yǎng)基中觀察Balb/Mk細(xì)胞DNA合成起始而進(jìn)行生物測定時rKGF163的活力高100倍，參見PCT專利申請WO90/08771。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，KGFdesl-23是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的，特別是大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的含有KGFdesl-23或其類似物的重組DNA分子和表達(dá)載體是按照標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)技術(shù)和本領(lǐng)域中熟知的方法制得的。
在另一實(shí)施方案中，含有編碼KGFdesl-23的DNA或含有該DNA的載體能在細(xì)菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌或酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)最適于生產(chǎn)KGFdesl-23片段。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA或載體是在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的。
本發(fā)明的KGF片段可用來鑒別受體識別位點(diǎn)以及設(shè)計(jì)肽激動劑和拮抗劑。再者，鑒于KGF對角質(zhì)形成細(xì)胞具有獨(dú)特的專一性，不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞增生且無細(xì)胞毒性，在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，KGFdesl-23被優(yōu)選地用于傷口愈合，特別是需要促進(jìn)皮膚上皮再生的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，KGFdesl-23被用于角膜上皮的修復(fù)?；贙GFdesl-23對胃腸道上皮細(xì)胞的專一性，可以設(shè)想出KGFdesl-23的其它用途。
在諸多生長因子如表皮生長因子(“EGF”)、血小板衍生生長因子(“PDGF”)和其它FGF中選擇KGF片段用于皮膚修復(fù)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)。其它生長因子除直接或間接刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增生外還誘導(dǎo)纖維增生和血管形成。在皮膚修復(fù)中，這種附帶的活性可導(dǎo)致如瘢痕等不良副作用。在受傷或手術(shù)后的角膜修復(fù)中，使用其它生長因子可引起血管侵入角膜，結(jié)果導(dǎo)致不期望的角膜混濁或水腫。另一方面，KGF對角質(zhì)形成細(xì)胞具有獨(dú)特的專一性，并且不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的增生，因此將是一種適合于上述特殊傷口愈合應(yīng)用的因子。
本發(fā)明的KGF片段也能以KGF片段/毒素結(jié)合物的形式在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中使用。這種偶聯(lián)物能減慢和終止因表皮基層角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生而引起的疾病如牛皮癬的病理過程。該結(jié)合物不影響該組織中另兩種主要的細(xì)胞類群如血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，KGF片段/毒素結(jié)合物可用于根除腫瘤細(xì)胞增生，例如基細(xì)胞癌。
除特別指明外，本發(fā)明的實(shí)施都應(yīng)用本領(lǐng)域中常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡描述，可參考Sambrook，et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；DNA克隆第I卷和第II卷，D.N.Glover ed.IRL Press(1985)；寡核苷酸的合成MJ.Gait ed.，IRL Press(1984)；核酸雜交，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.IRL Press(1984)；轉(zhuǎn)錄和翻譯，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.IRL Press(1984)；動物細(xì)胞培養(yǎng)，R.L.Freshney ed.，IRL Press(1986)；B.Perbal，分子克隆實(shí)用方法，[出版商](1984)；“酶學(xué)方法”系列，Academic Press，Inc.，哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；酶學(xué)方法，Vol.154和Vol.155，Wu and Grossman，and Wu，eds.[Mayer and Walker，eds.[出版商](1987)；細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法，Academic Press，London，Scopes[作者]，(1987)；蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐，2nd ed.(Springer-Verlag，N.Y.年度)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊Vols.I-IV，D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.，(出版商)(1986)；Kitts et al.，Biotechniques 14810-817(1993)；Munemitsu et al.，Mol.and Cell Biol.105977-5982(1990)；等等。
氨基酸標(biāo)準(zhǔn)縮寫將用于圖1和本說明書其它地方。這里所有引用的出版物、專利和專利申請?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?。為明確起見，本文所用的術(shù)語將更準(zhǔn)確地定義如下。
定義本文所用的術(shù)語“角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子”或“KGF”是指一種屬于結(jié)構(gòu)上獨(dú)特的蛋白族即成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的多肽，這些FGF顯示了不同程度的序列同源性，表明它們是由一族相關(guān)的基因編碼的。KGF具有在本說明書其它地方描述的特性，如它能結(jié)合FGFR-3并能夠刺激表皮細(xì)胞特別是角質(zhì)形成細(xì)胞的生長。全長KGF由163個氨基酸殘基組成。
如同本文所用，本發(fā)明的KGF片段是由成熟的全長KGF中的一部分氨基酸序列組成的多肽。如同本文所用，KGF片段的類似物包括那些因微小的插入、缺失或置換產(chǎn)生的基本不影響KGF片段特性的KGF片段。例如、一些氨基酸間的保守性置換是預(yù)料中的。這種置換是(例如)發(fā)生在在側(cè)鏈中相關(guān)的一族氨基酸中。這些氨基酸族包括(1)酸生氨基酸天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極生氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(4)不帶電極性氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時一起列為芳香族氨基酸。特別是，一般認(rèn)為由下列氨基酸間的孤立置換構(gòu)成的氨基酸保守性置換不會對多肽性質(zhì)有顯著影響由異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸；由谷氨酸置換天冬氨酸；由絲氨酸置換蘇氨酸；或者在多肽活性位點(diǎn)以外區(qū)域中結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸間的類似保守性置換。
KGF片段的特性包括(i)它的生物活性比成熟的全長天然KGF分子在刺激上皮細(xì)胞增生方面高2-10倍，優(yōu)選2倍，最優(yōu)選的是7-10倍；(ii)它能結(jié)合FGFR-3。
本文所用的術(shù)語“重組多核苷酸”意為一種半合成或全合成或由cDNA或基因組DNA(“gDNA”)編碼的多核苷酸，這樣，(1)它不與在天然情況下所結(jié)合的多核苷酸的全部或其部分結(jié)合(2)它連接在一個并非天然情況下所連接的多核苷酸上；或(3)它不是天然存在的。
“復(fù)制子”是指任何基因元件，諸如質(zhì)粒、病毒、粘粒等等，它們在細(xì)胞中表現(xiàn)為一個自主多核苷酸復(fù)制單位，即它能在自我控制下進(jìn)行復(fù)制。一個復(fù)制子可含有如選擇性標(biāo)記。
“重組載體”是一個復(fù)制子，其中連入了另一個多核苷酸片段，從而能復(fù)制和/或表達(dá)所連入的多核苷酸片段。
“調(diào)控序列”是指一個多核苷酸序列，它對與其并列連接的編碼序列表達(dá)的調(diào)控是必需的。這種調(diào)控序列的本質(zhì)因表達(dá)編碼序列的宿主細(xì)胞的不同而不同。在原核細(xì)胞內(nèi)，這種調(diào)控序列通常包括如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。在真核細(xì)胞內(nèi)，這種調(diào)控序列通常包括啟動子和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“調(diào)控序列”也可包括另外一些成份，而這些成份的存在是有好處的，例如一個分泌先導(dǎo)序列可編碼先導(dǎo)肽使被表達(dá)的多肽分泌。
“并列連接”是指一種并列連接狀態(tài)，在此狀態(tài)下各成份按一定的關(guān)系連接，使各成份按期望的方式起作用。例如，調(diào)控序列與編碼序列并列連接意味著編碼序列是以能在適合調(diào)控序列的條件下表達(dá)編碼序列的方式連接。
“編碼序列”是一個多核苷酸序列，在合適的調(diào)控序列控制下它能被翻譯成一個多肽。編碼序列的兩端通常由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括如cDNA和重組多核苷酸序列。
“ PCR”是指聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，參見Saiki et al.，Nature 324163(1986)；Scharf et al.，Science 2331076-1078(1986)；美國專利4,683,195；美國專利4,683,202。
本文所用的術(shù)語“多肽”是指一個氨基酸聚合物，并不特指特定長度的聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包含在這一術(shù)語中。該術(shù)語也包括多肽的翻譯修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?。此定義還包括那些如天然存在或非天然存在的帶有取代鍵的多肽以及本領(lǐng)域熟知的其他修飾。
本文所用的術(shù)語“終止子”是指一些調(diào)控序列，如位于編碼序列終止密碼子3’端或下游的聚腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。
“重組宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞培養(yǎng)”和其它類似的術(shù)語是指能夠或已被用作導(dǎo)入重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的微生物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等，這些術(shù)語也包括已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代。這些后代包括那些其形態(tài)或基因組DNA或總cDNA不一定與原始親代相同的細(xì)胞，這些細(xì)胞的產(chǎn)生可能是天然的、偶然的或人為突變的結(jié)果。哺乳動物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(“CHO”)和猴腎細(xì)胞(“COS”)。
本文所用的術(shù)語“微生物”包括原核和真核微生物種群，例如細(xì)菌和真菌，后者包括酵母和絲狀真菌。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指外源多核苷酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的過程而與所使用的轉(zhuǎn)移方法無關(guān)，這些方法可以是如感染、直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、F-融合、微注射或電穿孔。外源多核苷酸可以非整合載體例如質(zhì)粒的方式保持，也可被整合到宿主基因組中。
“純化的”和“分離的”對于多肽或核苷酸序列來說是指給定分子以基本不含同種或同類型的其它生物大分子的形式存在。本文所用的術(shù)語“純化的”是指同類型生物大分子的含量以重量計(jì)至少為75％，優(yōu)選至少為85％，更為優(yōu)選的是至少95％，最優(yōu)選的是至少98％，也可含有水、緩沖劑以及其它小分子，特別是分子量小于1000的分子。
“藥學(xué)上可接受的載體”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員用于給人體給藥的任何載體，該載體本身不會引起任何不良副作用如產(chǎn)生抗體、發(fā)熱等等。適合的載體一般是大的、代謝慢的大分子，它可以是蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物或脫毒的病毒顆粒?；d體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。載體優(yōu)選含有甲狀腺球蛋白。
治療組合物一般含有藥學(xué)上可接受的載體如水、鹽水、甘油、乙醇等。另外，一些輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)等也可包含在這種組合物中。
本文所用的“治療有效量”是指能產(chǎn)生所需效果的用量。這種用量的不同取決于每個待治療的個體的健康和身體狀況、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所期望的保護(hù)程度、制劑、主治醫(yī)生對病癥的判斷，以及其它有關(guān)因素。預(yù)計(jì)這種用量將落在可通過常規(guī)試驗(yàn)確定的相對較寬的范圍內(nèi)。
現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用含有編碼KGF163的cDNA的重組苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)重組桿狀病毒感染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞(SF9)，從而在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)KGF時，產(chǎn)生了除KGF163以外的一個缺少含有單個糖基化位點(diǎn)的KGF163N末端區(qū)頭23個氨基酸殘基的KGF片段。這個截短的未糖基化的KGF片段稱為KGFdesl-23或KGF140，相對于稱為KGF163的天然全長形式而言對靶細(xì)胞的效力提高了7-10倍。KGFdesl-23的靶細(xì)胞專一性沒有改變。此外，與KGF163相反，高濃度的KGF片段對角質(zhì)形成細(xì)胞不產(chǎn)生任何毒性。與以前PCT專利申請WO90/08771提出的相反，這些研究表明KGF的靶細(xì)胞專一性不是由它的N-末端區(qū)域決定的。而且，本發(fā)明表明，N-末端截短的KGF事實(shí)上是一個改進(jìn)的KGF，它具有在治療應(yīng)用上更高的生物活性和降低了的細(xì)胞毒性。
大量的KGF片段可通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)，這種技術(shù)優(yōu)于從天然來源中分離純化KGF，再從N-末端切除頭23個氨基酸殘基的方法。由重組技術(shù)生產(chǎn)的KGF可使分離出的KGF產(chǎn)品中不含有細(xì)胞中常有的污染分子。完全不含有任何微量人類蛋白污染物的KGF成分確實(shí)易于在諸如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生。使用重組DNA技術(shù)，也可產(chǎn)生在自然界不存在的KGF片段，如那些可通過定點(diǎn)突變產(chǎn)生的變異體。
任何在所需宿主體內(nèi)允許表達(dá)KGF片段的啟動子都可用在本發(fā)明中。例如，在大腸桿菌中可以使用Lac操縱子的調(diào)控啟動子序列。另一例子是酵母乙醇脫氫酶(“ADH”)啟動子，它具有一個上游激活序列(“UAS”)調(diào)節(jié)ADH啟動子的活力。此外，一些病毒增強(qiáng)子也能在本發(fā)明中應(yīng)用。這些增強(qiáng)子不但擴(kuò)增而且調(diào)控在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這些增強(qiáng)子可整合到哺乳動物啟動子序列中，這些啟動子只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時才被激活，誘導(dǎo)物的例子有激素或酶底物，參見Sassone-Corsi和Borelli，Trends Genet.2215(1986)；Maniatis et al.，Science 2361237(1987)。本發(fā)明可使用的啟動子也包括桿狀病毒多角體雜交啟動子和p10啟動子。
本發(fā)明可使用的終止序列的例子有啤酒酵母α-因子終止子和桿狀病毒終止子。此外，可在某些宿主細(xì)胞中起作用的終止子也可使用。例如，SV40終止子可在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中起作用。
在本發(fā)明實(shí)施中，當(dāng)設(shè)計(jì)截短蛋白質(zhì)時，許多KGF是優(yōu)選的。其中一個例子是未糖基化的截去了天然KGF頭23個氨基酸的KGF。一個編碼優(yōu)選的截短KGF的cDNA如圖1所示。其它類型的KGF片段也是存在的，或者可由常規(guī)方法構(gòu)建。在所示的序列中，截短蛋白的切割位點(diǎn)由箭頭(a)表示，結(jié)果產(chǎn)生一個分子量為18KDa的蛋白質(zhì)。使用圖1的序列數(shù)據(jù)，以及指明的截短KGF的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得其它的編碼截短KGF的DNA序列。例如，結(jié)構(gòu)基因可進(jìn)行操作，從而改變單個核苷酸而保持原有的氨基酸，或改變數(shù)個核苷酸以修改氨基酸但卻不喪失生物活性。許多核苷酸可借助已知的技術(shù)被置換、插入或缺失，例如用體外突變和引物修復(fù)技術(shù)。結(jié)構(gòu)基因可在它的3’端和/或5’端截短而仍保持它的生物活性。
KGF片段編碼序列的構(gòu)建可通過合成編碼KGF片段的DNA序列或者通過改變已存在的或天然的KGF編碼序列來獲得所需的序列。天然的KGF編碼序列或多肽是指自然界存在著的。天然KGF的氨基酸序列如圖1所示。合成的KGF片段可基于已知的KGF氨基酸序列，采用所選的宿主細(xì)胞偏愛的密碼子來制備。參見Urdea et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 807461(1983)?；蛘?，所需的KGF片段編碼序列可利用基于附圖所示核酸序列的探針由核酸文庫來克隆。制備和探測核酸序列文庫的技術(shù)已有人描述過，如Sambrook et al.，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”(New York，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。其它的重組技術(shù)，如定點(diǎn)突變、PCR、酶切和連接也可用于構(gòu)建KGF片段編碼序列的衍生物和類似物。天然KGF多肽編碼序列易于進(jìn)行修飾以構(gòu)建其它類型的KGF多肽。
作為一個實(shí)例，KGF片段的類似物可由不影響KGF片段活性的保守性氨基酸置換來構(gòu)建。本發(fā)明進(jìn)一步考慮稱為突變蛋白的KGF片段類似物的子集，其中KGF片段中未形成二硫鍵的半胱氨酸被置換，一般由絲氨酸置換。這些突變蛋白可能比未修飾的KGF片段的穩(wěn)定溫度范圍要寬。這里所指的突變蛋白也包括那些比天然KGF片段缺少一些氨基酸的蛋白。突變蛋白將保持至少20％，優(yōu)選至少50％，最好至少80％的天然KGF片段活性。突變蛋白的編碼序列可通過天然KGF片段編碼序列的體外突變來構(gòu)建。
這些片段與天然KGF分子的不同在于氨基端和/或羧基端缺失氨基酸。所缺失氨基酸的多少是不重要的，只要KGF片段不含有N-末端糖基化位點(diǎn)并保持天然KGF分子至少20％的KGF活性。這些片段的編碼序列可容易地通過從天然KGF編碼序列或其變異體中切除不需要的核苷酸而構(gòu)建。
本發(fā)明的表達(dá)載體含有一個可在宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動子，該啟動子與KGF片段或類似物的編碼序列并列連接。表達(dá)載體可任選含有用于分泌的信號序列、終止子、選擇性標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)、以及與宿主細(xì)胞序列同源的序列。含有這些額外元件可優(yōu)化表達(dá)。
非天然的功能性啟動子也可使用，例如基于不同啟動子共同序列的合成啟動子。有效的啟動子也可以是雜交啟動子，即由調(diào)控區(qū)連接異源表達(dá)起始區(qū)組成的啟動子，雜交啟動子的實(shí)例有大腸桿菌的Lac操縱子連接到大腸桿菌tac轉(zhuǎn)錄激活區(qū)形成的啟動子；酵母乙醇脫氫酶(“ADH”)調(diào)控區(qū)連接到酵母甘油醛3-磷酸脫氫酶(“GAPDH”)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)形成的啟動子，參見美國專利4,876,197和4,880,734，這兩篇專利在此引入作為參考；以及細(xì)胞肥大病毒(“CMV”)增強(qiáng)子連接到猴病毒SV40啟動子形成的啟動子。
本發(fā)明的KGF片段或類似物的編碼序列也可以在讀碼中與信號序列連接。信號序列一般編碼一段起分泌作用、由能引導(dǎo)KGF片段或類似物到達(dá)細(xì)胞膜的疏水性氨基酸組成的氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，有一個加工位點(diǎn)位于信號序列和KGF片段之間，以便在體內(nèi)或體外在信號序列和KGF片段之間進(jìn)行切割。適合的信號序列是從分泌的內(nèi)源性宿主細(xì)胞蛋白的基因衍生而來的，例如酵母轉(zhuǎn)化酶基因，參見歐洲專利12873和日本專利62,096,086；A因子基因，參見美國專利4,588,684；干擾素信號序列，參見EP60057。
本發(fā)明用于酵母表達(dá)的優(yōu)選的一類分泌前導(dǎo)序列是截短的酵母α-因子前導(dǎo)序列，它含有“pre”信號序列的至少一部分和“pro”區(qū)域。可在本發(fā)明中使用的α-因子前導(dǎo)序列包括具有約83個氨基酸殘基的全長pre-proα-因子前導(dǎo)肽，以及一般具有約25到50個氨基酸殘基的截短α-因子前導(dǎo)肽，參見美國專利4,546,083和4,870,008[及美國專利申請]和歐洲專利EP324274，以上文獻(xiàn)在此引入作為參考?？稍诒景l(fā)明中使用的應(yīng)用α-因子前導(dǎo)序列片段的另外一些前導(dǎo)序列包括pre序列來自第一個酵母信號序列，但pro區(qū)域來自第二個酵母α-因子的雜交α-因子前導(dǎo)序列。(參見如PCT WO89/02463)。
f表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)編碼KGF片段或類似物的DNA序列以正確的讀碼和方向并列接入載體中時，就能用重組技術(shù)表達(dá)KGF片段和其類似物，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。當(dāng)要產(chǎn)生含有KGF片段的基因構(gòu)建體時，優(yōu)選的起始材料是編碼KGF片段的cDNA。雖然如需要的話KGF片段可以能被切割的雜交蛋白形式產(chǎn)生出來，但典型的方法是把截短的KGF基因插入在啟動子的下游，截短的KGF基因后面是終止子序列。一般來說，將使用能提高截短KGF和截短KGF多肽衍生物產(chǎn)率的宿主細(xì)胞特異性序列，適合的控制序列可加入到表達(dá)載體中，這些控制序列如增強(qiáng)子序列、多腺苷酸化序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。一旦分離出合適的編碼序列，它就可在許多不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)；例如那些在哺乳動物細(xì)胞、桿狀病毒、細(xì)菌和酵母中使用的表達(dá)系統(tǒng)。這些將在下文中討論。
i.哺乳動物系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。哺乳動物啟動子是能夠結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶和起動編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)向下游(3’)轉(zhuǎn)錄為mRNA的任何DNA序列。啟動子含有通常置于編碼序列5’端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以及通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30個堿基對(bp)處的TATA框。據(jù)認(rèn)為，該TATA框引導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點(diǎn)開始RNA合成。哺乳動物啟動子也含有一個一般位于TATA框上游100-200bp內(nèi)的上游啟動子元件。上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始速度，并可在任一方向起作用[Sambrook等人(1989)“哺乳動物細(xì)胞內(nèi)克降基因的表達(dá)”，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版]。
哺乳動物病毒基因常常是高度表達(dá)的，并具有廣泛的宿主范圍；因此編碼哺乳動物病毒基因的序列提供特別有用的啟動子序列，其實(shí)例包括SV40早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)和單純皰疹病毒啟動子。此外，從非病毒基因得到的序列如鼠金屬硫因基因也提供有用的啟動子序列。表達(dá)可以是組成型的也可以是調(diào)控(誘導(dǎo))型的，這取決于啟動子在激素反應(yīng)性細(xì)胞中是否能由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。
如與上述的啟動子元件一起存在著一個增強(qiáng)元件(增強(qiáng)子)，則一般會提高表達(dá)水平。增強(qiáng)子是一段調(diào)控DNA序列，當(dāng)與同源或異源啟動子連接并在正常RNA起始位點(diǎn)開始合成時，可刺激轉(zhuǎn)錄達(dá)1000倍。當(dāng)被置于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游，正?；蚍D(zhuǎn)的取向，或在離啟動子多于1000個核苷酸的位置時，增強(qiáng)子也是有效的[Maniatis et al.(1987)Science 2361237；Alberts et al.(1989)Mol.Biology ofthe Cell，2nd ed.]。從病毒中獲得的增強(qiáng)子元件特別有用，因其一般有較寬的宿主范圍。其實(shí)例包括SV40早期基因增強(qiáng)子[Dijkema et al.(1985)EMBOJ.4761]，和從勞氏肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)[Gorman et al.(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777]和從人細(xì)胞肥大病毒[Boshart etal.(1985)Cell 41521]衍生的增強(qiáng)子/啟動子。另外，一些增強(qiáng)子是可調(diào)節(jié)的，只有在誘導(dǎo)物如激素或金屬離子存在下才被激活[Sassone-Corsiand Borelli(1986)Trends Genet.2215；Maniatis et al.(1987)Science 2361237]。
DNA分子可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可直接與DNA分子連接，在這種情況下重組蛋白N-末端第1個氨基酸總是蛋氨酸，它是由起始密碼子ATG編碼的。如需要的話，該N-末端可通過在體外與溴化氰一起保溫而從蛋白質(zhì)上切除。
或者，通過構(gòu)建嵌合DNA分子使其編碼由能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)分泌外源蛋白的前導(dǎo)序列片段組成的融合蛋白，也可使外源蛋白從細(xì)胞內(nèi)分泌到培養(yǎng)基中。優(yōu)選的是在前導(dǎo)片段和外源基因之間編碼若干加工位點(diǎn)以便在體內(nèi)或在體外被切開。前導(dǎo)序列片段一般編碼由能引導(dǎo)蛋白從細(xì)胞中分泌的疏水性氨基酸組成的信號肽。腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)外源蛋白分泌的前導(dǎo)序列的一個例子。
一般來說，由哺乳動物細(xì)胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3’端的調(diào)控區(qū)，因此，它們與啟動子元件一起鄰接編碼序列。成熟mRNA的3’端是由定點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化形成的[Bimstiel et al.(1985)Cell 41349，Proudfoot and Whitelaw(1988)“Termination and 3’end processing of eukaryotic RNA.InTranscription and splicing(ed.B.D.Hames and D.M.Glover)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105]。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA又可翻譯成由DNA編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括從SV40衍生而來的此類信號[Sambrook et al.(1989)“在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)克隆的基因”，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊]。
當(dāng)含有內(nèi)含子(也稱為間插序列)時一些基因可更有效地表達(dá)。然而，一些cDNA曾在缺少剪接信號(也稱為剪接供體和受體位點(diǎn))的載體中有效地表達(dá)[參見如，Gothing and Sambrook(1981)Nature 293620]。內(nèi)含子是位于含有剪接供體和受體位點(diǎn)的編碼序列內(nèi)的一段非編碼間插序列。它們是在初級轉(zhuǎn)錄本聚腺苷酸化后由被稱為“剪接”的過程切除的[Nevins(1983)Annu.Rev.Biochem.52441；Green(1986)Annu.Rev.Genet.20671；Padgett et al.(1986)Annu.Rev.Biochem.551119；Krainer and Maniatis(1988)“RNA剪接”，轉(zhuǎn)錄和剪接(ed.B.D.Hames and D.M.Glover)]。
上述的各種成份包括啟動子、聚腺苷酸化信號、和轉(zhuǎn)錄終止序列一般一起被置于表達(dá)構(gòu)建體中。如需要，增強(qiáng)子、含有有效剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子和前導(dǎo)序列也可放入表達(dá)構(gòu)建體中。表達(dá)構(gòu)建體常保持在復(fù)制子中，如能穩(wěn)定保持在宿主如哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌中的染色體外元件(如質(zhì)粒)。哺乳動物復(fù)制系統(tǒng)包括那些從動物病毒衍生來的復(fù)制系統(tǒng)，它們需要有反式作用的因子才能復(fù)制。例如，含有乳頭多瘤空泡病毒如SV40[Gluzman(1981)Cell23175]或多形瘤病毒復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在有合適的病毒T抗原存在時，能復(fù)制到極高的拷貝數(shù)。哺乳動物復(fù)制子另外的例子包括那些從牛乳頭瘤病毒和EB病毒衍生而來的哺乳動物復(fù)制子。此外，復(fù)制子可含有兩個復(fù)制系統(tǒng)，使其能保持在如哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和在原核宿主內(nèi)進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。這種哺乳動物-細(xì)菌穿梭載體的例子包括pMT2[Kaufman et al.(1989)Mol.Cell Biol.9946]和pHEBO[Shimizu et al.(1986)Mol.CellBiol.61074]。
所用的轉(zhuǎn)化方法取決于所要轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體內(nèi)多核苷酸的包入、以及DNA直接微注射到細(xì)胞核內(nèi)。
本領(lǐng)域中已知的可作為宿主用于表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞系包括可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的許多無限增殖化細(xì)胞系，包括(但不限于)中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Hela細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)、以及一些其它細(xì)胞系。
ii.桿狀病毒系統(tǒng)編碼KGF的多核苷酸可插入到合適的表達(dá)載體如昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體中，并可并列地連接到載體中的控制元件上。載體構(gòu)建應(yīng)用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)。特別是，本發(fā)明使用的載體桿狀病毒表達(dá)載體是基本按照Kitts et al.，Biotechniques 14810-817(1993)的方法構(gòu)建的。
簡言之，先構(gòu)建KGF表達(dá)盒，方法是首先將KGF163C編碼序列插入到含有與桿狀病毒基因組部分序列(本文稱為“桿狀病毒序列”)同源并能夠與其同源重組的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)移載體中。桿狀病毒序列至少含有一段必需的多核苷酸序列，下面將詳細(xì)描述。將KGF編碼序列插入到轉(zhuǎn)移載體中，使其兩端都鄰接桿狀病毒序列。
將含有KGF編碼序列的轉(zhuǎn)移載體與缺少為產(chǎn)生功能性病毒所必需的多核苷酸序列的野生型桿狀病毒的突變體一起轉(zhuǎn)染到宿主昆蟲細(xì)胞中。在這方面，當(dāng)突變桿狀病毒與KGF表達(dá)盒重組時，轉(zhuǎn)染后可在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生功能性病毒。
以這種方式產(chǎn)生的功能性桿狀病毒摻入了KGF表達(dá)盒，適于轉(zhuǎn)染到新的宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生重組KGF和重組KGFdesl-23?；蛘?，這一過程也可由KGFdesl-23編碼序列代替KGF163編碼序列來進(jìn)行。
通常，表達(dá)系統(tǒng)的成份包括轉(zhuǎn)移載體，通常是細(xì)菌質(zhì)粒，它既含有桿狀病毒基因組片段又含有一些便于插入異源基因或需表達(dá)基因的限制位點(diǎn)；野生型桿狀病毒，它具有與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列(這使異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；合適的昆蟲宿主細(xì)胞和生長培養(yǎng)基。
在把截短的KGF DNA序列插入轉(zhuǎn)移載體后，將該載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中，使載體和病毒基因組進(jìn)行重組。表達(dá)包裝好的重組病毒，鑒定和純化重組噬菌斑。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒的形式從如Invitrogen，San DiegoCA(“MaxBac”Kit)買到。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，詳細(xì)描述參見Summers and Smith，得克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站公告No.1555(1987)(下文稱“Summers and Smith”)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
在把截短KGF DNA序列插入桿狀病毒基因組之前，上述的各種成份，包括啟動子、前導(dǎo)序列(如需要的話)、目的編碼序列、轉(zhuǎn)錄終止序列，通常組裝成一個中間位移構(gòu)建體(轉(zhuǎn)移載體)。這個構(gòu)建體可含有單個基因和并列連接的調(diào)控元件；多個基因，每個基因都有自己的一套并列連接的調(diào)控元件；或者受同一套調(diào)控元件調(diào)控的多個基因。中間位移構(gòu)建體常保持在復(fù)制子中，如能穩(wěn)定保持在宿主如細(xì)菌中的染色體外元件(如質(zhì)粒)。該復(fù)制子將有一個復(fù)制系統(tǒng)，使它能保持在適合的宿主中以便進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。
目前，最常用的把外源基因?qū)階cNPV的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。也設(shè)計(jì)了許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體。這些載體包括如pVL985，它把多角體蛋白的起始密碼子ATG改變?yōu)锳TT，并在ATT的下游32個堿基對處導(dǎo)入一個BamHI克隆位點(diǎn)，參見Luckow andSummers，Virology(1989)1731。
該質(zhì)粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號[Miller et al.(1988)Ann.Rev.Microbiol.，42177]，以及可供在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核細(xì)胞氨芐青霉素抗性基因(amp)和復(fù)制起點(diǎn)。
桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并起始編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)向下游轉(zhuǎn)錄(5’端向3’端)成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有通常位于編碼序列5’端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)一般包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還可含有第二個稱為增強(qiáng)子的區(qū)域，如果有的話，它通常距結(jié)構(gòu)基因很遠(yuǎn)。表達(dá)可以是調(diào)控性的或是組成性的。
在病毒感染后期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供特別有用的啟動子序列，其實(shí)例包括從編碼病毒多角體蛋白的基因(見Friesen等(1986)，“桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控”，桿狀病毒分子生物學(xué)(ed.WalterDoerfler)；歐洲專利申請公開127,839和155,476)和編碼p10蛋白的基因(Vlak et al.，(1988)，J.Gen.Virol.69765)衍生的序列。
編碼合適信號序列的DNA可從分泌的昆蟲或桿狀病毒蛋白的基因中衍生，例如，桿狀病毒多角體蛋白基因(Carbonell et al.(1988)Gene，73409)。此外，由于哺乳動物細(xì)胞翻譯后修飾(如信號肽切除、蛋白酶酶切和磷酸化)的信號似乎可被昆蟲細(xì)胞識別，分泌和細(xì)胞核積累所需的信號也似乎在無脊椎動物細(xì)胞和脊椎動物細(xì)胞間是保守的，所以非昆蟲來源的前導(dǎo)序列，例如從編碼人α-干擾素(Maeda et al.，(1985)，Nature 315592)、人胃泌素釋放肽(Lebacq-Verheyden et al.，(1988)，Molec.Cell Biol.83129)、人白細(xì)胞介素-2(Smith et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，828404)、小鼠白細(xì)胞介素-3(Miyajima et al.，(1987)Gene 58273)、人葡糖腦苷脂酶(Martin et al.(1988)DNA，799)的基因中衍生的前導(dǎo)序列，也能在昆蟲中起分泌作用。
重組多肽或聚蛋白可在胞內(nèi)表達(dá)，如在有合適的調(diào)控序列時表達(dá)也可分泌出來。非融合外源蛋白的高效胞內(nèi)表達(dá)通常需要異源基因，該異源基因最好有一個在ATG起始信號前含有合適的翻譯起始信號的短前導(dǎo)序列。如果需要，N-末端的蛋氨酸可通過在體外與溴化氰一起保溫而從成熟蛋白上切下。
此外，在天然狀態(tài)下不分泌的重組聚蛋白或蛋白都可以通過構(gòu)建嵌合DNA分子而從昆蟲細(xì)胞中分泌出來，該嵌合DNA分子編碼含有能在昆蟲細(xì)胞中分泌外源蛋白的前導(dǎo)序列的融合蛋白。前導(dǎo)序列片段一般編碼由能引導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的疏水性氨基酸組成的信號肽。
在插入截短KGF DNA序列和/或編碼表達(dá)產(chǎn)物前體的基因后，用轉(zhuǎn)移載體的異源DNA和野生型桿狀病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞宿主，通常用共轉(zhuǎn)染法。構(gòu)建體的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列一般含有2-5kb的桿狀病毒基因組片段。將異源DNA導(dǎo)入桿狀病毒所需位點(diǎn)的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見Summers and Smith，同上；Ju et al.，(1987)；Smith et al.，Mol.Cell Biol.(1983)32156；Luckow andSummers(1989))。例如，可通過同源雙交換重組插入一個基因如多角體蛋白基因內(nèi)；也可插入在所需的桿狀病毒基因中構(gòu)建的限制酶位點(diǎn)內(nèi)(Miller et al.，(1989)Bioassays 491)。當(dāng)代替多角體蛋白基因克隆在表達(dá)載體中時，DNA序列的5’和3’端都鄰接多角體蛋白特異性序列并且該DNA序列位于多角體蛋白啟動子的下游。
新形成的桿狀病毒表達(dá)載體隨后包裝成具感染性的重組桿狀病毒。同源性重組的發(fā)生是低頻率的(大約1％到5％)，因此，在共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的大部分病毒仍是野生型病毒。所以，必須有一種方法來鑒別重組病毒。本表達(dá)系統(tǒng)的一個優(yōu)點(diǎn)是可用肉眼篩選鑒別出重組病毒。由天然病毒產(chǎn)生的多角體蛋白在病毒感染后期可在感染細(xì)胞的細(xì)胞核中以很高的水平產(chǎn)生。積累的多角體蛋白形成含有包埋顆粒的包含體。這些包含體大至15μm，具強(qiáng)折射性，使其具有明亮的外觀，在光學(xué)顯微鏡下很容易看到。感染了重組病毒的細(xì)胞缺少包含體。為了區(qū)別野生型病毒和重組病毒，用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)把轉(zhuǎn)染上清液涂布在單層昆蟲細(xì)胞上。在光學(xué)顯微鏡下篩選有包含體(表明是野生型病毒)和無包含體(表明是重組病毒)的噬菌斑。參見“Current Protocols inMicrobiology”，Vol.2(Ausubel et al.eds)at16.8(Supp.10，1990)；Summers and Smith，同上；Miller et al.(1989)。
已構(gòu)建了用于感染數(shù)種昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒表達(dá)載體。例如，已構(gòu)建了用于以下昆蟲的重組桿狀病毒埃及伊蚊、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶、黑尾果蠅、草地夜蛾和粉紋夜蛾(PCT Pub No.WO89/046699；Carbonell et al.，(1985)J.Virol.56153；Wright(1986)Nature 321718；Smith et al.，(1983)Mol.Cell Biol.32156；一般性討論參閱Fraser，et al.(1989)InVitro Cell Dev.Biol.25225)。
用于在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中直接和融合表達(dá)異源多肽的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基可以買到。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見Summers and Smith(同上)。
修飾過的昆蟲細(xì)胞可在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以便穩(wěn)定保持該細(xì)胞中存在的質(zhì)粒。如果表達(dá)產(chǎn)物基因處于誘導(dǎo)控制下，宿主細(xì)胞可培養(yǎng)至高密度，然后再誘導(dǎo)表達(dá)?；蛘?，如果表達(dá)是組成型的，則產(chǎn)物連續(xù)不斷地表達(dá)進(jìn)入培養(yǎng)基中，這時營養(yǎng)培養(yǎng)基需要連續(xù)不斷地循環(huán)，同時移出目的產(chǎn)物并補(bǔ)加消耗的營養(yǎng)物。產(chǎn)物可用不同的技術(shù)純化，諸如層析如HPLC、親和層析、離子交換層析等；電泳；密度梯度離心；溶劑萃取等。如果需要，產(chǎn)物可適當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步純化以便去除幾乎所有的也分泌到培養(yǎng)基中或昆蟲細(xì)胞溶解產(chǎn)生的昆蟲蛋白，獲得至少基本上去除了宿主成份如蛋白、脂類和多糖的產(chǎn)物。
為了實(shí)現(xiàn)截短KGF的表達(dá)，從轉(zhuǎn)化體得到的重組宿主細(xì)胞在能表達(dá)重組截短KGF編碼序列的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這些條件的不同取決于所選擇的宿主細(xì)胞。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域的已知技術(shù)容易確定這些條件。
iii.細(xì)菌系統(tǒng)細(xì)菌表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細(xì)菌啟動子是任何能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶和起始向下游(3’)轉(zhuǎn)錄編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)生成mRNA的DNA序列。啟動子有一個通常位于編碼序列5’端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域一般含有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動子也可有稱為操縱基因的第二個區(qū)域，它可與RNA合成起點(diǎn)處的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。操縱基因允許負(fù)調(diào)控(誘導(dǎo)性)轉(zhuǎn)錄，因?yàn)榛蜃瓒舻鞍卓山Y(jié)合在操縱基因上從而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。組成型表達(dá)可在缺少負(fù)調(diào)控元件如操縱基因時發(fā)生。此外，正調(diào)控可通過一個基因活化蛋白結(jié)合序列來實(shí)現(xiàn)，所述結(jié)合序列如存在的話，通常位于RNA聚合酶結(jié)合序列附近(5’端)?；蚧罨鞍椎膶?shí)例有降解物活化蛋白(CAP)，它幫助啟動大腸桿菌中乳糖(ac)操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud et al.(1984)Annu.Rev.Genet.18173]。因此調(diào)控表達(dá)可以是正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或減弱轉(zhuǎn)錄。
編碼代謝途徑中酶的序列提供特別有用的啟動子序列，其實(shí)例包括從糖代謝酶類如半乳糖、乳糖(lac)[Chang et al.(1977)Nature 1981056]和麥芽糖衍生的啟動子序列。另外的例子包括從生物合成酶類如色氨酸(trp)[Goeddel et al.(1980)Nuc.Acids Res.84057；Yelverton et al.(1981)Nucl.Acids Res.9731；U.S.4,738,921；EPO Pub.Nos 036776and 121775]衍生的啟動子序列。β-內(nèi)酰胺酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weis-smann (1981)“The cloning of interferon and other mistakes.”InInterferon 3(ed.I.Gresser)]、λ噬菌體PL[Shimatake et al.(1981)Nature292128]和T5[U.S.4 689 406]啟動子系統(tǒng)也提供有用的啟動子序列。
此外，自然界不存在的合成啟動子也能起細(xì)菌啟動子的作用。例如，一種細(xì)菌或噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄活化序列可與另一種細(xì)菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接在一起，構(gòu)建出合成的雜交啟動子(美國專利4551433)。例如，tac啟動子是由trp啟動子和受lac阻遏物調(diào)控的lac操縱子序列組成的雜交trp-lac啟動子[Amann et al.(1983)Gene 25167；de Boer et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021]。而且，細(xì)菌啟動子可包括天然存在的非細(xì)菌來源的啟動子，這些啟動子能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄。天然存在的非細(xì)菌來源的啟動子也可與相容的RNA聚合酶聯(lián)合，從而在原核細(xì)胞中達(dá)到一些基團(tuán)的高水平表達(dá)。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)是一個聯(lián)合啟動子系統(tǒng)的例子[Studier et al.(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074]。此外，雜交啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱基因區(qū)域組成(EPO Pub.No.267851)。
除有功效的啟動子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)對在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因也是有用的。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)稱為Shine-Dalgano(SD)序列，包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個核苷酸處的長度為3-9個核苷酸的序列[Shine et al.(1975)Nature 25434]。據(jù)認(rèn)為，SD序列通過它與大腸桿菌16S rRNA3’端的堿基配對而促進(jìn)mRNA結(jié)合到核糖體上[Steitz et al.(1979)“信使RNA中的基因信號和核苷酸序列”，生物調(diào)控及發(fā)育基因表達(dá)(ed.R.F.Goldberger)]。用弱的核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)真核細(xì)胞基因和原核細(xì)胞基因[Sambrook et al.(1989)“在大腸桿菌中表達(dá)克隆的基因”，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊]。
DNA分子可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可直接連接DNA分子，在這種情況下N-末端的第一個氨基酸總是蛋氨酸，它是由ATG起始密碼子編碼的。如果需要，N-末端的蛋氨酸可通過在體外與溴化氰一起保溫或通過在體內(nèi)或體外與細(xì)菌蛋氨酸N-末端肽酶一起保溫而從蛋白質(zhì)上切除(EPO Pub.No.219237)。
融合蛋白提供了直接表達(dá)以外的另一種方法。一般是編碼內(nèi)源細(xì)菌蛋白或其它穩(wěn)定蛋白N-末端部分的DNA序列與異源編碼序列的5’端融合。表達(dá)時，該構(gòu)建體提供兩種氨基酸序列的融合。例如，λ噬菌體基因可連接在外源基因的5’端而在細(xì)菌中表達(dá)。所得的融合蛋白最好保留一個加工酶(因子Xa)位點(diǎn)使噬菌體蛋白從外源蛋白上切下[Nagai et al.(1984)Nature 309810]。融合蛋白也可由下列基因的序列構(gòu)成LacZ[Jia et al.(1987)Gene 60197]；trpE[Allen et al.(1987)J.Biotechnol.593；Makoff et al.(1989)J.Gen.Microbiol.13511]；Chey[EPO Pub.No.324647]。位于兩種氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一個可切割位點(diǎn)。另一個例子是泛素(ubiquitin)融合蛋白。這種融合蛋白是由最好保留了加工酶(如泛素特異性加工蛋白酶)位點(diǎn)從而能把泛素從外源蛋白上切下的泛素區(qū)域形成的。通過這種方法可分離出天然的外源蛋白[Miller et al.(1989)Bio/Technology 7698]。
此外，外源蛋白也可通過構(gòu)建嵌合DNA分子而從細(xì)胞中分泌出來，該嵌合DNA分子編碼的融合蛋白含有能使外源蛋白在細(xì)菌中分泌的信號肽序列片段[U.S.4,336,336]。信號序列片段一般編碼由指導(dǎo)蛋白從細(xì)胞中分泌的疏水性氨基酸組成的信號肽。該蛋白可分泌到生長培養(yǎng)基中(革蘭氏陽性細(xì)菌)或分泌到位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜間的周質(zhì)間隙內(nèi)(革蘭氏陰性細(xì)菌)。最好在信號肽片段和外源基因間編碼能在體內(nèi)或體外切割的加工位點(diǎn)。
編碼合適信號序列的DNA可從分泌的細(xì)菌蛋白的基因中得到，例如大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui et al.(1993)，基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)操作；Ghrayeb et al.(1984)EMBO J.32437]和大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列(phoA)[OKa et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。作為另一例子，各種桿菌菌株的α-淀粉酶基因的信號序列可用于從枯草桿菌中分泌異源蛋白[Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795582；EPO Pub.No.244042]。
一般來說，由細(xì)菌識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3’端的調(diào)控區(qū)域，因此與啟動子一起鄰接編碼序列。這些序列指導(dǎo)可翻譯成由DNA編碼的多肽的mRNA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止序列常包括能形成基環(huán)結(jié)構(gòu)的大約50個核苷酸的DNA序列，上述基環(huán)結(jié)構(gòu)有助于終止轉(zhuǎn)錄。所述序列包括從具有強(qiáng)啟動子的基因如大腸桿菌trp基因以及其它生物合成基因得到的轉(zhuǎn)錄終止序列。
一般來說，上述成份，包括啟動子、信號序列(如需要的話)、目的編碼序列、以及轉(zhuǎn)錄終止序列，被一起置于表達(dá)構(gòu)建體中。表達(dá)構(gòu)建體常保持在復(fù)制子中，如能在宿主如細(xì)菌中穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。該復(fù)制子有一個復(fù)制系統(tǒng)，使得它能保持在原核宿主中以進(jìn)行表達(dá)或克隆和擴(kuò)增。此外，復(fù)制子可是低或高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)是約5到200，一般為約10至150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主最好含有至少約10個質(zhì)粒，更為優(yōu)選的是至少約20個質(zhì)粒。選擇高拷貝數(shù)還是低拷貝數(shù)的載體取決于載體和外源蛋白對宿主的影響。
或者，表達(dá)構(gòu)建體也可用整合載體整合到細(xì)菌基因組中。整合載體一般含有至少一段與細(xì)菌染色體同源的序列以使載體整合。整合似乎是在載體中的同源DNA和細(xì)菌染色體之間發(fā)生重組的結(jié)果。例如，用各種桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體能整合到桿菌的染色體中(EPO Pub.No.127328)。整合載體也可由噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列組成。
一般來說，染色體外表達(dá)構(gòu)建體和整合表達(dá)構(gòu)建體可含有選擇性標(biāo)記以便篩選已轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株。選擇性標(biāo)記可在細(xì)菌宿主中表達(dá)，可包含使細(xì)菌對諸如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素具有抗性的基因[Davies et al.(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469]。選擇性標(biāo)記也可包括生物合成基因，如組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的基因。
或者，一些上述成份可共同置于轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體一般含有一個選擇性標(biāo)記。如上所述，該選擇性標(biāo)記或者保持在復(fù)制子中，或者插入到整合載體中。
已經(jīng)構(gòu)建出能用于轉(zhuǎn)化入許多細(xì)菌的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體，這些載體或者是染色體外復(fù)制子，或者是整合載體。例如，已構(gòu)建出用于如下細(xì)菌的表達(dá)載體枯草桿菌[Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPO Pub.Nos.036259和063953；PCT WO84/04541]；大腸桿菌[Shimatake et al.(1981)Nature 292128；Amann et al.(1985)Gene 40183；Studier et al.(1986)J.Mol.Biol.189113；EPO Pub.Nos.036776，136829和136907]；乳酪鏈球菌[Powell et al(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]；變青鏈球菌[Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655]；變青鏈霉菌[U.S.4,745,056]。
將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主的方法是本領(lǐng)域已知的，一般包括用CaCl2或其它試劑如二價陽離子和DMSO處理細(xì)菌的轉(zhuǎn)化方法。DNA也可用電穿孔的方法導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法通常因所要轉(zhuǎn)化的細(xì)菌種屬不同而不同。參見如，[Masson et al.(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273；Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPOPub.Nos.036259和063953；PCT Publication No.WO84/04541，桿菌]、[Miller et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；Wang et al.(1990)J.Bacteriol.172949，彎曲桿菌]；[Cohen et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower et al(1988)Nucl.Acids Res.166127；Kushner(1978) “用ColE1衍生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法”，基因工程國際基因工程討論會年鑒(eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)；Mandel etal.(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949318；埃希氏菌]；[Chassy et al.(1987)FEMS Microbiol.Lett.44173，乳桿菌]；[Fiedler et al.(1988)Anal.Biochem.17038，假單胞菌]；[Augustin et al.(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203，葡萄球菌]；[Baranyet al.(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)“用電穿孔法轉(zhuǎn)化乳鏈球菌”，鏈球菌遺傳學(xué)(ed.J.Ferretti and R.Curtiss III)；Perry et al.(1981)Infec.Immun.321295；Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti et al.(1987)Proc.4th Evr.Cong.Brotechnology 1412，鏈球菌]。
iv.酵母表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。酵母啟動子是任何能夠結(jié)合酵母RNA聚合酶和起始編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)下游(3’)方向轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子有一個通常位于編碼序列5’端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域一般包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(“TATA框”)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。酵母啟動子也可有稱為上游活化序列(UAS)的第二區(qū)域，如有的話，它通常位于結(jié)構(gòu)基因的遠(yuǎn)處。該UAS允許調(diào)控(誘導(dǎo)性)表達(dá)。組成型表達(dá)在缺少UAS時發(fā)生。調(diào)控表達(dá)可以是正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或減弱轉(zhuǎn)錄。
酵母是具有活性代謝途徑的發(fā)酵生物，因此編碼代謝途徑中的酶類的序列提供特別有用的啟動子序列，其實(shí)例包括乙醇脫氫酶(ADH)(EPO Pub.No.284044)、烯醇化酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶(PyK)(EPO Pub.No.329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供有用的啟動子序列[Myanohara et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801]。
此外，在自然界不存在的合成啟動子也能起酵母啟動子的作用。例如，一種酵母啟動子的UAS序列可與另一種酵母啟動子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域連接起來，從而構(gòu)建出合成的雜交啟動子。這種雜交啟動子的例子包括ADH調(diào)控序列與GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域連接形成的啟動子(U.S.4876197和U.S.4880734)。其他雜交啟動子的例子包括由ADH2、GAIA、GAL10或PHO5基因的調(diào)控序列與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域結(jié)合而構(gòu)成的啟動子(EPO Pub.No.164556)。而且，酵母啟動子也包括能結(jié)合酵母RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄的天然存在的非酵母來源的啟動子。這種啟動子的例子包括文獻(xiàn)中的啟動子[Cohen et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078；Henikoff et al.(1981)Nature 283835；Hollenberg et al.(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96119；Hollenberg et al.(1979)“在啤酒酵母中表達(dá)細(xì)菌抗生素抗性基因”，醫(yī)學(xué)、環(huán)境和商業(yè)上重要的質(zhì)粒(eds.K.N.Timmis andA.Puhler)；Mercerau-Puigalon et al.(1980)Gene 11163；Panthier et al.(1980)Curr.Genet.2109]。
DNA分子可以在酵母中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。啟動子序列可直接連接DNA分子，在這種情況下重組蛋白N-末端的第一個氨基酸總是由ATG起始密碼子編碼的蛋氨酸。如果需要，該N-末端蛋氨酸可通過在體外與溴化氰一起保溫而從蛋白上切下。
融合蛋白提供了酵母表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動物、桿狀病毒和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)以外的另一種選擇。一般是編碼內(nèi)源酵母蛋白或其它穩(wěn)定蛋白N-末端的DNA序列與異源編碼序列的5’端融合。在表達(dá)時這個構(gòu)建體提供兩種氨基酸序列的融合。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可連接在外源基因的5’端并在酵母中表達(dá)。在二種氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼切割位點(diǎn)。參見如EPO Pub.No.196056。另一個例子是泛素融合蛋白。這種融合蛋白是由最好保留了加工酶(如泛素特異性加工蛋白酶)位點(diǎn)從而能從外源蛋白上切除泛素的泛素區(qū)域形成的。因此通過這種方法可分離得到天然的外源蛋白(參見如PCT Pub.No.WO88/024066)。
此外，外源蛋白也可以通過構(gòu)建嵌合DNA分子而從細(xì)胞中分泌到生長培養(yǎng)基中，該嵌合DNA分子編碼的融合蛋白含有能使外源蛋白在酵母中分泌的前導(dǎo)序列片段。最好在前導(dǎo)序列片段和外源基因之間編碼加工位點(diǎn)，從而能在體內(nèi)或體外切割。該前導(dǎo)序列片段一般編碼由指導(dǎo)蛋白從細(xì)胞中分泌的疏水性氨基酸組成的信號肽編碼合適信號序列的DNA可從分泌的酵母蛋白的基因中得到，如酵母轉(zhuǎn)化酶基因(EPO Pub.No.012873；JPO Pub.No.62,096,086)和A因子基因(U.S.4,588,684)。另外，還有一些非酵母來源的前導(dǎo)序列如干擾素前導(dǎo)序列也能在酵母中起分泌作用(EPO Pub.No.060057)。
一類優(yōu)選的分泌前導(dǎo)序列是采用“pre”信號序列和“pro”區(qū)域的酵母α-因子基因片段的前導(dǎo)序列?？墒褂玫摩?因子片段類型包括全長的pre-proα-因子前導(dǎo)肽(約83個氨基酸殘基)以及截短的α-因子前導(dǎo)肽(一般約25到50個氨基酸殘基)(U.S.4,546,083和U.S.4,870,008；EPO Pub.No.324,274)。另外的使用有分泌功能的α-因子前導(dǎo)肽片段的前導(dǎo)肽包括由第一種酵母α因子的pre順序和第二種酵母α-因子的pro區(qū)域組成的雜交α-因子前導(dǎo)肽。參見如PCTPub.No.WO89/02463。
一般來說，由酵母識別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3’端的調(diào)控區(qū)域，因此與啟動子一起鄰接編碼序列。這些序列指導(dǎo)能翻譯成由DNA編碼的多肽的mRNA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止序列和由酵母識別的其它終止序列的例子有編碼糖酵解酶類的序列。
一般來說，上述成份，包括啟動子、前導(dǎo)序列(如需要的話)、目的編碼序列、以及轉(zhuǎn)錄終止序列，被一起置于表達(dá)構(gòu)建體中。表達(dá)構(gòu)建體常保持在那些能在宿主如酵母或細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定保持的復(fù)制子中，如染色體外元件(如質(zhì)粒)。該復(fù)制子可具有兩個復(fù)制系統(tǒng)，使其能保持在如酵母中用于表達(dá)，也能保持在原核細(xì)胞宿主中用于克隆和擴(kuò)增。這種酵母-細(xì)菌穿梭載體的實(shí)例包括YEp24[Botstein et al.(1979)Gene 817-24]；PCl/1[Brake et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646]；YRp17[Stinchcomb et al.(1982)J.Mol.Biol.158157]。此外，復(fù)制子可以是高或低拷貝數(shù)質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常約為5到200，一般約為10到150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主優(yōu)選含有至少約10個質(zhì)粒，更為優(yōu)選的是至少約20個質(zhì)粒。選擇高還是低拷貝數(shù)載體取決于載體和外源蛋白對宿主的影響。參見如Brake等人(同上)。
或者，表達(dá)構(gòu)建體也可用整合載體整合到酵母基因組中。整合載體一般含有至少一段與酵母染色體同源的序列以使載體整合，優(yōu)選含有兩段鄰接表達(dá)構(gòu)建體的同源序列。整合似乎是在載體中的同源DNA和酵母染色體之間發(fā)生重組的結(jié)果[Orr-Weaver et al.(1983)Methods inEnzymol.101228-245]?？赏ㄟ^選擇合適的同源序列加入整合載體中，可將該載體引導(dǎo)到酵母中的特定位置。參見Orr-Weaver等人(同上)。單個或更多的表達(dá)構(gòu)建體都可整合，這也許會影響重組蛋白的生產(chǎn)水平[Rine et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750]。包含在載體中的染色體序列既可以是載體中的單個片段，也可以是與染色體中相鄰片段同源并在載體中鄰接表達(dá)構(gòu)建體的兩個片段，前者導(dǎo)致整個載體的整合，后者則會導(dǎo)致只穩(wěn)定整合表達(dá)構(gòu)建體。
一般來說，染色體外表達(dá)構(gòu)建體和整合表達(dá)構(gòu)建體可以含有選擇性標(biāo)記以便選擇已轉(zhuǎn)化的酵母菌株。選擇性標(biāo)記可包括能在酵母宿主中表達(dá)的生物合成基因，如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7，以及G418抗性基因，這些基因使酵母細(xì)胞分別對衣霉素和G418有抗性。此外，合適的選擇性標(biāo)記也使酵母具有在毒性化合物如金屬離子存在下生長的能力。例如，含有CUP1選擇生標(biāo)記的酵母能在銅離子存在下生長[Butt et al.(1987)Microbiol.Rev.51；351]。
或者，上述的一些成份可一同置于轉(zhuǎn)化載體中。如上所述，轉(zhuǎn)化載體一般含有一個保持在復(fù)制子中或進(jìn)入整合載體中的選擇性標(biāo)記。
現(xiàn)已構(gòu)建出用于轉(zhuǎn)化入許多酵母中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體，這些載體中既有染色體外復(fù)制子，也有整合載體。例如，已構(gòu)建出用于下述酵母的表達(dá)載體白假絲酵母[Kurtz，et al.(1986)Mol.Cell Biol.6142]；麥芽糖酵母[Kunze，et al.，(1985)J.Basic Microbiol.25141]；多形漢遜氏酵母[Gleeson，et al.，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkampet al.(1986)Mol.Gen.Genet.202302]；脆壁克魯維酵母[Das，et al.，(1984)J.Bacteriol.1581165]；乳酸克魯維酵母[De Louvencourt et al.，(1983)J.Bacteriol.154737；Van den Berg et al.，(1990)Bio/Technology 8135]；季也蒙畢赤酵母[Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141]；巴斯德畢赤酵母[Cregg，et al.(1985)Mol.Cell Biol.53376；U.S.4,837,148和U.S.4,929,555]；啤酒酵母[Hinnen et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929；Ito et al.(1983)J.Bacteriol.153163]；彭貝裂殖酵母[Beach and Nurse(1981)Nature 300706]；解脂芪草酵母[Davidow et al(1985)Curr.Genet.10380-471；Gaillardin et al.(1985)Curr.Genet.1049]。
本領(lǐng)域中熟知的用于將外源DNA導(dǎo)入酵母宿主的方法一般包括轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球或轉(zhuǎn)化用堿性陽離子處理過的完整酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法通常因欲轉(zhuǎn)化的酵母種屬的不同而不同。參見如[Kurtz et al.(1986)Mol.Cell Biol.6142；Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141，假絲酵母]；[Gleeson et al.(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp etal.(1986)Mol.Gen.Genet.202302，漢遜氏酵母]；[Das et al.(1984)J.Bacteriol.1581165；De Louvencourt et al.(1983)J.Bacteriol.1541165；Van den Berg et al.(1990)Bio/Technology 8135，克魯維酵母]；[Cregget al.(1985)Mol.Cell Biol.53376；Kunze et al.(1985)J.Basic Microbiol.25141；U.S.4,837,148和U.S.4,929,555，畢赤酵母]；[Hinnen et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929；Ito et al.(1983)J.Bacteriol.153163，酵母]；[Beach and Nurse(1981)Nature 300706，裂殖酵母]；[Davidow et al.(1985)Curr.Genet.1039；Gaillardin et al.(1985)Curr.Genet.1049，芪草酵母]。
在本發(fā)明中，可將選擇性標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)和宿主細(xì)胞同源性序列置于表達(dá)載體中。選擇性標(biāo)記可用于篩選可能含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。這種標(biāo)記包括能使宿主細(xì)胞對諸如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、新霉素和四環(huán)素等藥物具有抗性的標(biāo)記。標(biāo)記也可包括宿主細(xì)胞生長所需的生物合成基因，如在組氨酸、色氨酸和亮氨酸合成途徑中的基因。因此，當(dāng)Leu(-)宿主細(xì)胞作為受體而用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，而且培養(yǎng)基中缺少亮氨酸時，只有攜有含Leu(+)基因質(zhì)粒的細(xì)胞才能存活。
在本發(fā)明中，可將復(fù)制起點(diǎn)摻入表達(dá)載體中使載體能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。這種復(fù)制起點(diǎn)包括能使表達(dá)載體在有合適蛋白存在下在細(xì)胞中以高拷貝數(shù)繁殖的復(fù)制起點(diǎn)，例如2μ和自主復(fù)制序列在酵母中是有效的，而病毒T-抗原復(fù)制起點(diǎn)在COS-7細(xì)胞中是有效的。
為了本發(fā)明的目的，表達(dá)載體可在細(xì)胞中整合到宿主細(xì)胞基因組中或保持自主狀態(tài)。為整合到宿主基因組中，此處的表達(dá)載體可含有與宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的序列同源的多核苷酸序列。同源性序列不必與表達(dá)載體連接。[例如，表達(dá)載體可通過一個未連接的二氫葉酸還原酶基因整合到CHO基因組中。]在酵母中，同源序列最好鄰接表達(dá)盒。本發(fā)明特別有效的同源酵母基因組序列是PCT WO90/001800所公開的序列，以及Genbank系列號J01331中所述的HIS4基因序列。
啟動子、終止子和其它任選的表達(dá)載體元件的選擇也取決于所選擇的宿主細(xì)胞，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明不取決于所選擇的宿主細(xì)胞。所需的蛋白表達(dá)水平及操作程序的簡易將決定最適合的宿主細(xì)胞。在本領(lǐng)域中已知有許多宿主可用于表達(dá)并可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
例如，本發(fā)明中適合表達(dá)KGF片段或類似物的細(xì)菌宿主包括彎曲桿菌屬、桿菌屬、埃希氏菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬。下列屬中的酵母可作為宿主使用假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、芪草酵母屬。在本發(fā)明中可用作宿主的無限增殖哺乳動物細(xì)胞包括CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(“BHK”)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(“COS”)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞如HepG2。許多昆蟲細(xì)胞宿主也適合表達(dá)KGF片段或類似物，這些昆蟲包括埃及伊蚊、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶、黑尾果蠅、草地夜蛾，參見PCT WO89/046699；Carbonell et al.J.Virol.56153(1985)；Wright，Nature 321718(1986)；Smith et al.，Mol.Cell Biol.32156(1983)；一般性敘述見Fraser，et al.in vitro Cell.Dev.Biol.25225(1989)。
將含有KGF片段或類似物的表達(dá)載體插入到宿主細(xì)胞中。任何本領(lǐng)域熟知的轉(zhuǎn)化技術(shù)都可用于把表達(dá)載體插入到宿主細(xì)胞中。例如，細(xì)菌宿主的轉(zhuǎn)化一般包括首先用CaCl2或其它試劑如二價陽離子和DMSO處理細(xì)菌，然后再把外源DNA導(dǎo)入處理過的細(xì)菌細(xì)胞中。DNA也可通過電穿孔或病毒侵染的方法導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明可采用的細(xì)菌宿主轉(zhuǎn)化方法包括在下列文獻(xiàn)中描述的方法Massonet al.FEMS Microbiol.Lett.60273(1989)；Palva et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582(1982)；EP Pub.Nos.036259和063953；PCT WO84/04541，桿菌)，Miller et al.Proc.Natl.Acad.Sci.85856(1988)；Wanget al.J.Bacteriol.172949(1990)，彎曲桿菌)，Cohen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.692110(1973)；Dower et al.Nucleic Acids Res.166127(1988)Kushner“用ColE1衍生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法”，基因工程國際基因工程討論會年數(shù)eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)(1978)Mandel et al.J.Mol.Biol.53159(1970)；Taketo，Biochim.Biophys.Acta 949318(1988)；埃希氏菌，Chassy et al.FEMS Microbiol.Lett.44173(1987)乳桿菌；Fiedler et al.Anal.Biochem.17038(1988)，假單胞菌；Angustin et al.FEMS Microbiol.Lett.66203(1990)，葡萄球菌，Barany et al.J.Bacteriol.144698(1980)；Harlander“乳酸鏈球菌電穿孔轉(zhuǎn)化方法”，鏈球菌遺傳學(xué)(ed.J.Ferretti和R.CurtissIII)(1987)Perry et al.Infec.Immun.321295(1981)；Powell et al.Appl.Environ.Microbiol.54655(1988)；Somkuti et al.Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412(1987)，鏈球菌。
本領(lǐng)域中熟知的轉(zhuǎn)化酵母宿主的方法一般包括原生質(zhì)球或經(jīng)堿性陽離子處理過的完整酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。酵母宿主也可用電穿孔法轉(zhuǎn)化，參見Methods in Enzymology，Vol.194，1991，“酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)介紹”。本發(fā)明所使用的轉(zhuǎn)化方法因所要轉(zhuǎn)化酵母種屬的不同而不同，包括下列文獻(xiàn)中所述的方法Kurtz et al.Mol.Cell Biol.6142(1986)；Kunze et al.J.Basic Microbiol.25141(1985)；假絲酵母；Gleeson et al.J.Gen.Microbiol.1323459(1986)；Roggenkamp et al.Mol.Gen.Genet.202302(1986)；漢遜氏酵母；Das et al.J.Bacteriol.1581165(1984)；De Louvencourt et al.J.Bacteriol.1541165(1983)；Van den Berg et al.Bio/Technology 8135(1990)；克魯維酵母；Cregget al.Mol.Cell Biol.53376(1985)；Kunze et al.J.Basic Microbiol.25141(1985)；美國專利4,837,148和4,929,555；畢赤酵母；Hinnen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929(1978)；Ito et al.J.Bacteriol.153163(1983)，酵母；Beach and Nurse，Nature 300706(1981)；裂殖酵母；Davidow et al.Curr.Genet.1039(1985)；Gaillardin et al.Curr.Genet.1049(1985)；芪草酵母。
本領(lǐng)域中用于將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的已知方法包括，例如，病毒感染、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、多核苷酸包入脂質(zhì)體內(nèi)，以及將DNA直接微注射到細(xì)胞核中。
用于將異源DNA導(dǎo)入桿狀病毒形成表達(dá)載體的方法以及轉(zhuǎn)化昆蟲宿主細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域中熟知的，參見Smith et al.，Mol.CellBiol.32156(1983)；Lucklow and Smmers，Virology 1731(1989)。例如，KGF片段DNA可通過同源雙交換重組而插入到多角體基因中。插入也可發(fā)生在所需桿狀病毒基因中構(gòu)建的限制酶位點(diǎn)處，參見Miller et al.Bioassays 491(1989)。KFG片段的DNA序列當(dāng)代替多角體基因被克隆在表達(dá)載體中時，它的5’和3’端兩側(cè)都鄰接多角體特異性序列并位于多角體啟動子的下游。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，新形成的桿狀病毒表達(dá)載體可以隨后包裝成具感染性的重組桿狀病毒。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，同源重組發(fā)生頻率很低，約在1％和5％之間。因此，通常轉(zhuǎn)染后形成的大部分桿狀病毒仍是野生型病毒。然而重組病毒可用已知的方法識別。例如，天然病毒在病毒感染后期在感染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生大量的多角體蛋白。積累的多角體蛋白形成含有包埋病毒顆粒的包含體。這些包含體大至15μm，高度折光，使其外觀明亮，很容易在光學(xué)顯微鏡下觀察到。由重組病毒感染的細(xì)胞中則無包含體。重組病毒和野生型病毒可通過涂布平皿來區(qū)分，即把轉(zhuǎn)染上清液或其稀釋液用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)涂布在單層昆蟲細(xì)胞上。形成的噬菌斑可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行篩選，出現(xiàn)包含體的是野生型病毒，不出現(xiàn)包含體的則是重組病毒。參見“Current Protocols in Microbiology”Vol.2(Ausubel et al.eds)at 16.8(Supp.10，1990)。
可以利用本領(lǐng)域已知的免疫測定和活性測定法測定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是否表達(dá)所需的KGF片段。例如，免疫螢光測定法可直接在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞上進(jìn)行而無須從細(xì)胞膜上分離KGF片段。在這種測定方法中，宿主細(xì)胞首先固定在固相載體如載玻片或微量滴定孔上。隨后，使固定化的宿主細(xì)胞接觸抗-KGF抗體。為了提高測定的靈敏度，固定化的細(xì)胞最好接觸第二種抗體，該第二種抗體是有標(biāo)記的并能與抗-KGF抗體結(jié)合。例如，第二種抗體可用熒光標(biāo)記物標(biāo)記。表達(dá)KGF片段的宿主細(xì)胞將被熒光標(biāo)記并能在顯微鏡下觀察到。
實(shí)施例1通過將人KGF cDNA克隆到如圖1所示的pAcC 13 Pst/Not1表達(dá)載體中，將該cDNA插入到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。該質(zhì)粒是從pAcC12衍生的，參見Munemitsu et al.Mol.Cell Biol.105977-5982(1990)。
根據(jù)現(xiàn)有的KGF N-末端氨基酸序列設(shè)計(jì)用于截短的18kd KGF的PCR寡核苷酸引物。參見Finch et al.Science 2752-755(1989)。在引物中摻入鄰接限制位點(diǎn)(PstI和NotI)，以便亞克隆到pAcC13表達(dá)載體中，pAcC13是pVL941轉(zhuǎn)移載體的衍生物，參Luckow et al.Virology 17031-39(1989)和Quilliam et al.Mol.Cell Biol.102901-2908(1990)。該表達(dá)載體是通過將KGF編碼片段插入到pAcC13的PstI/NotI多接頭位點(diǎn)中而構(gòu)建的。該KGF cDNA編碼成熟加工形式的KGF，即含有163個氨基酸殘基，在第14到第16位殘基上有一個潛在的N-糖基化位點(diǎn)的KGF。
條件培養(yǎng)基的準(zhǔn)備草地夜蛾Sf9昆蟲細(xì)胞用含有KGF1-163cDNA的苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒感染。稀釋到[XX10x]細(xì)胞/毫升后，在不含血清添加物、抗生素或殺真菌劑的Excell-400中培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時。收集培養(yǎng)液并在10000×g下離心30分鐘，去除上浮細(xì)胞及其它細(xì)胞碎片。該條件培養(yǎng)基然后用0.8μ濾膜(Millipore)過濾，大約5升這種培養(yǎng)基用具有3KDa截?cái)喾肿恿康腇iltron盒系統(tǒng)(Omega膜)濃縮至200毫升。
濃縮后，經(jīng)10000×g離心20分鐘收集從轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中獲得的條件培養(yǎng)基，然后該培養(yǎng)基用順序的肝素瓊脂糖(“HS”)親和層析法純化。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，大約1升Sf9細(xì)胞條件培養(yǎng)基使用具有截?cái)喾肿恿繛?-KDa的Omega膜(Filtron)進(jìn)行超濾，產(chǎn)生200毫升超濾保留液。
HSAC和Mono S陽離子交換層析將上清液調(diào)至pH7.2。取30毫升樣品上樣到事先用10mMTris-HCl pH7.3、150mM NaCl緩沖液平衡過的肝素瓊脂糖樹脂上。樹脂用平衡緩沖液充分洗至光吸收回到基線，然后將NaCl濃度從0.45M逐漸提高到1M和2M進(jìn)行階段洗脫。從各分部中取等份試樣用于細(xì)胞增殖測試，合并1M分部中最高生物活性的部分，合并的分部用10mM Tris pH7.2緩沖液稀釋5倍(終鹽濃度為0.2M NaCl)，該樣品用Super loop上樣到連接FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)的Mono S柱上。用線性梯度(10mM Tris pH7.3，0.2M NaCl到10mM Tris pH7.3，1M NaCl)洗脫。分部收集后測試各等份試樣的生物活性，合并活性分部。
將保留液調(diào)至pH7.3，然后上樣到含有大約30毫升床體積的HS柱上。該柱在4℃下展開約2小時。該柱用150毫升含有10mM Tris-HCl和0.15M NaCl的pH7.3平衡緩沖液中洗。滯留的蛋白用0.45M NaCl和1M NaCl洗脫。在洗脫時調(diào)節(jié)柱流速為約90毫升/小時，以3毫升為一分部進(jìn)行收集。
將HS親和層析步驟的有生物活性的1M NaCl分部合并，用10mM Tris pH7.3稀釋5倍，然后直接上Mono S HR 5/5柱(Pharmacia)。滯留的蛋白用0.2MNaCl到1MNaCl梯度洗脫?；钚苑植康纳餃y定用Balb-Mk細(xì)胞系進(jìn)行。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析由Mono S陽離子交換層析分離的生物活性蛋白分部。合并分部37-39和分部41-42，取10μl等份試樣加入到SDS和10mMDTT中。將這些樣品加熱變性，然后在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，隨后凝膠用銀染色。樣品無論在還原環(huán)境還是非還原環(huán)境中進(jìn)行電泳都得到相似的遷移圖譜。分部37-39中所含蛋白的表觀分子量為25Kd，而分部41-42中所含蛋白的表觀分子量為18Kd。
HS生物活性分部的層析圖譜表明了分部31到47的Balb/Mk生物活性分布，證明有2種分子存在，一種在0.55M NaCl處洗脫，另一種在0.6M NaCl處洗脫。
KGF活性的測定所獲分部中KGF活力的測定是基于各分部促進(jìn)BALB/C-Mk細(xì)胞生長的能力。為此，從某些分部中取10μl等份樣品稀釋到1毫升含有0.2％明膠的磷酸鹽緩沖液(“PBS”)中，從稀釋的分部中取10μl測試列接種在12孔聚簇板上的BALB/C-Mk細(xì)胞的生長刺激活性，每板有若干22mm的孔，每孔中有5×103個細(xì)胞。測得所有KGF活性都滯留在柱中并由1M NaCl洗脫下來。
用1M NaCl從HS柱上洗脫下來的KGF生物活性分部用陽離子交換FPLC柱層析法進(jìn)一步純化。將這些分部合并，用10mM TrispH7.3緩沖液稀釋5倍，然后直接上Mono S HR 5/5柱(Pharmacia)。
滯留在Mono S HR 5/5柱中的蛋白用0.2M NaCl到1M NaCl梯度洗脫。洗脫出的分部生物活性的測定用上述方法使用BALB/C-Mk細(xì)胞進(jìn)行。圖3表明分部31到47的活性分布。
在促細(xì)胞分裂測定中，在每孔裝有1ml補(bǔ)充10％小牛血清和抗生素的DMEM的12孔聚簇板中，每孔接種104個ABAE細(xì)胞和5×103個ACE細(xì)胞，接種密度為5×103個細(xì)胞/孔。參見Bohlen et al.EMBO41951-1956(1985)；Gospodarowicz et al.J.Cell Physiol.127121-136(1986)；Bellosta et al.J.Cell Biol.121705-713(1993)。在6小時培養(yǎng)后，以三個平行孔為一組用胰蛋白酶消化，然后計(jì)數(shù)細(xì)胞以確定平板效率。在第1、第3和第5天，從適當(dāng)稀釋過的每個樣品中取10μl等份試樣重復(fù)三次加到板上的孔內(nèi)。經(jīng)6天培養(yǎng)后，所有板用胰蛋白酶消化，然后用Coulter計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)測定細(xì)胞密度。
在第1天及以后每隔1天以指定的濃度加入KGF或堿性FGF。經(jīng)5天培養(yǎng)后，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用Coulter計(jì)數(shù)器測定最終細(xì)胞密度。
電泳(NaDodSO4/PAGE)按照由Laemmli et al.Nature 227680-685(1970)描述的步驟用NaDodSO4制備聚丙烯酰胺凝膠。將樣品在10mM DTT存在下煮沸3分鐘，然后在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。凝膠經(jīng)固定后用BioRad的試劑和方法進(jìn)行銀染色，參見Merri et al.Science 2111437-1438。合適的分子量標(biāo)記是BioRad產(chǎn)品。
細(xì)胞增殖測定柱分部和純化過的樣品的促細(xì)胞分裂活性用Balb/Mk細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行測定。將貯存培養(yǎng)物培養(yǎng)和保持在改良的低鈣伊格耳氏培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10％FCS、50μg/ml慶大霉素、0.25μg/ml兩性霉素B和10ng/ml aFGF。參見Gospodarowicz et al.J.Cell Physiol.142325-333。為進(jìn)行促細(xì)胞分裂測定，細(xì)胞以每孔5×103到1×104個細(xì)胞的密度在1ml補(bǔ)充了10％FCS的低鈣MEM中接種在12孔的聚簇板上(如Gospodarowicz等人所述)。樣品的加入和細(xì)胞培養(yǎng)5天后最終細(xì)胞密度的測定按照Gospodarowicz等人所述進(jìn)行。
最終純化的物質(zhì)促細(xì)胞分裂活性的測試在成年牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(“ABAE”)和腎上腺皮質(zhì)衍生的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(“ACE”細(xì)胞)上進(jìn)行，參見Gospodarowicz et al.Proc.Natl.Acad.Sci.734120-4124(1976)。貯存培養(yǎng)物在補(bǔ)充了10％FCS、50μg/ml慶大霉素和0.25μg/ml兩性霉素B的DMEM存在下保持，每星期在明膠化的組織培養(yǎng)皿上以1∶10的分流比傳代一次。
使用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，確定了KGFdesl-23N-末端第1到20位確實(shí)的氨基酸序列如下S1Y D M5E G G D I R V R R L F X R T Q本發(fā)明也包括編碼KGFdesl-23以及其它相對于FGF族中其它成員缺少了KGF163特有的非保守N-末端的較短KGF的DNA片段。
蛋白微量測序取二份標(biāo)稱100皮摩爾KGF163和KGFdesl-23樣品進(jìn)行埃德曼降解，并在離心吸附在聚偏二氟乙烯(PVDF，Applied Biosystems Biospin)上后進(jìn)行氨基酸分析。樣品加在Applied Biosystems 477A氣相蛋白測序儀上。使用Applied Biosystems提供的標(biāo)準(zhǔn)軟件和化學(xué)試劑進(jìn)行了20次埃德曼降解，PTH氨基酸的鑒定用自動聯(lián)機(jī)HPLC柱(120A型，Applied Biosystems)進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，該片段包含成熟全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子至少高2倍的促細(xì)胞分裂活性，并缺少含有成熟的全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子頭23個N末端氨基酸殘基的序列。
2.權(quán)利要求1所述的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，其中該片段具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子高7倍的促細(xì)胞分裂活性。
3.權(quán)利要求1所述的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，其中該片段具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子高10倍的促細(xì)胞分裂活性。
4.權(quán)利要求1所述的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，其中該片段具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子降低了的細(xì)胞毒性。
5.一種結(jié)合物，該結(jié)合物含有(a)一種角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，該片段包含成熟全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子至少高2倍的促細(xì)胞分裂活性，并缺少含有成熟的全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子頭23個N末端氨基酸殘基的序列；(b)一種毒素分子。
6.權(quán)利要求5的結(jié)合物，其中毒素分子選自蓖麻毒蛋白A、白喉毒素和皂草素。
7.權(quán)利要求5的結(jié)合物，其中所述片段具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子高7倍的促細(xì)胞分裂活性。
8.權(quán)利要求5的結(jié)合物，其中所述片段具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子高10倍的促細(xì)胞分裂活性。
9.一種治療組合物，該組合物含有(a)一種角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段，該片段包含成熟全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子氨基酸序列的一部分，其中所述部分具有比成熟的重組全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子至少高2倍的促細(xì)胞分裂活性，并缺少含有成熟的全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子頭23個N末端氨基酸殘基的序列；(b)一種藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種DNA分子，該DNA分子含有編碼權(quán)利要求1的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段的核苷酸序列。
11.一種DNA分子，該DNA分子含有編碼權(quán)利要求2的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段的核苷酸序列。
12.一種DNA分子，該DNA分子含有編碼權(quán)利要求3的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段的核苷酸序列。
13.一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求10的DNA分子和用于該DNA分子表達(dá)的調(diào)控序列。
14.權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其中該載體是桿狀病毒。
15.一種用權(quán)利要求13的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
17.一種制備角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子片段。
18.一種傷口愈合方法，該方法包括在需治療的傷口部位施用權(quán)利要求9的治療組合物并讓傷口愈合。
19.一種治療表皮過度增生疾病的方法，該方法包括在需要治療的部位施用權(quán)利要求5的結(jié)合物。
20.權(quán)利要求19所述的治療方法，其中所述疾病選自牛皮癬和基細(xì)胞癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及由成熟全長角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子KGF
文檔編號C12N15/12GK1129955SQ94193193
公開日1996年8月28日 申請日期1994年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月29日
發(fā)明者D·J·戈斯波達(dá)羅維茨, F·馬西阿茨 申請人:奇龍公司