專利名稱：通過2-(羧乙硫基)乙酰-7-adca和3-(羧甲硫基)丙酰-7-adca有效生產(chǎn)7-adca的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備和回收7—氨基去乙酸頭孢烷酸(7—ADCA)的生物合成方法。
β—內(nèi)酰胺抗生素構(gòu)成最重要的一類抗生素化合物，并具有悠久的臨床應(yīng)用歷史。這類抗生素中，突出的有青霉素和頭孢菌素。這些化合物分別由絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和產(chǎn)黃枝頂孢(Acremonium chrysogenum)天然產(chǎn)生。
經(jīng)過經(jīng)典的菌種改進(jìn)技術(shù)，使產(chǎn)黃青霉和產(chǎn)黃枝頂孢的抗生素生產(chǎn)水平比過去幾十年大大提高了。隨著對產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素的生物合成途徑的了解增多和重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，現(xiàn)在有了改進(jìn)生產(chǎn)菌株和將這些化合物體內(nèi)衍生化的新工具。
β—內(nèi)酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鑒定，對其相應(yīng)基因已進(jìn)行了克隆，如見Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)，245—264(生物合成途徑和酶)，及Aharonowitz，Cohen和Martin的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461—495(基因克隆)。
產(chǎn)黃青霉中青霉素生物合成的頭兩步是三種氨基酸L—5—氨基—5—羧基戊酸(L—α—氨基己二酸)(A)、L—半胱氨酸(C)和L—纈氨酸(V)縮合成三肽LLD—ACV，然后該三肽環(huán)化形成異青霉素N。該化合物含有典型的β—內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。第三步涉及通過?；D(zhuǎn)移酶(AT)的作用以疏水側(cè)鏈交換L—5—氨基—5—羧基戊酸的親水側(cè)鏈。在生產(chǎn)青霉素G的工業(yè)方法中，選擇的側(cè)鏈?zhǔn)潜交宜?PA)。EP—A—0532341中公開了己二酸(5—羧基戊酸)原料的應(yīng)用。摻入該底物導(dǎo)致產(chǎn)生了具有5—羧基戊酰側(cè)鏈的青霉素衍生物，即5—羧基戊?！?—氨基青霉烷酸。這種摻入是由于已證明酰基轉(zhuǎn)移酶具有寬的底物特異性(Behrens等，J.Biol.Chem.175(1948)，751—809；Cole，Process.Biochem.1(1966)，334—338，Ballio等，Nature 185(1960)，97—99)。如EP—A—0448180中所述，由AT介導(dǎo)的酶促交換反應(yīng)發(fā)生在一種細(xì)胞器—微體中。
頭孢菌素比青霉素貴得多。一個(gè)原因是一些頭孢菌素(如cephalexin)是由青霉素經(jīng)若干步化學(xué)轉(zhuǎn)化而制得的。另一個(gè)原因是迄今只能發(fā)酵出具有D—5—氨基—5—羧基戊酰側(cè)鏈的頭孢菌素。在此方面迄今最重要的起始物頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，這就意味著使用麻煩而又昂貴的柱技術(shù)進(jìn)行費(fèi)時(shí)費(fèi)錢的分離工藝。這樣獲得的頭孢菌素C須經(jīng)若干化學(xué)和酶促轉(zhuǎn)化才能轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熡妙^孢菌素。
中間體7—ADCA現(xiàn)今是青霉素G經(jīng)化學(xué)衍生而產(chǎn)生。產(chǎn)生7—ADCA需要的化學(xué)步驟涉及5—元青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)擴(kuò)環(huán)成為6—元的頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)。但來自絲狀細(xì)菌帶棒鏈霉菌(StreptomycesClavuligerus)的擴(kuò)環(huán)酶可以進(jìn)行這種環(huán)擴(kuò)張。當(dāng)被引入產(chǎn)黃青霉中時(shí)，它能將青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)轭^孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)，如Cantwell等在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283—289；及EP—A—0532341和EP—A—0540210中所述。已對擴(kuò)環(huán)酶從生化和功能方面進(jìn)行了充分表征(EP—A—0366354)，也對其相應(yīng)的基因進(jìn)行了表征。已描述了cefE基因(EP—A—0233715)和DNA序列的物理圖譜，及cefE在產(chǎn)黃青霉中的轉(zhuǎn)化研究。
適當(dāng)擴(kuò)環(huán)酶的另一來源是絲狀細(xì)菌Nocardia lactamdurans(早期稱為Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA序列(分別見Cortes等，J.Gen.Mierobiol.133(1987)，3165—3174；及Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453—458)。
更具體地講，EP—A—0532341描述了擴(kuò)環(huán)酶結(jié)合5—羧基戊酰側(cè)鏈作為原料在產(chǎn)黃青霉中的應(yīng)用，5—羧基戊酰側(cè)鏈用作產(chǎn)黃青霉中酰基轉(zhuǎn)移酶的底物。這導(dǎo)致形成5—羧基戊?！?—APA，后者通過引入產(chǎn)黃青霉株中的擴(kuò)環(huán)酶產(chǎn)生5—羧基戊?！?—ADCA。最后，建議去除5—羧基戊酰側(cè)鏈生成終產(chǎn)物7—ADCA。專利申請EP—A—0540210描述了制備7—ACA的相似方法，包括將ADCA環(huán)的3—甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)變?yōu)锳CA的3—乙酰氧甲基側(cè)鏈的額外步驟。但上述專利申請沒有提供經(jīng)濟(jì)有效的方法，因?yàn)槭紫葲]有認(rèn)識到擴(kuò)環(huán)酶在細(xì)胞中及時(shí)表達(dá)與?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行的問題。
而本發(fā)明提供一種生產(chǎn)7—ADCA的有效方法，其中擴(kuò)環(huán)酶和?；D(zhuǎn)移酶同時(shí)表達(dá)。
另外，本發(fā)明描述了新側(cè)鏈前體3’—羧甲硫基丙酸的應(yīng)用。該前體通過產(chǎn)黃青霉被非常有效地引入到相應(yīng)的青霉素中，后者接下來在擴(kuò)環(huán)酶的作用下擴(kuò)環(huán)。
而且，迄今還沒有關(guān)于脫乙?；皬陌l(fā)醇液中回收7—ADCA衍生物的有效方法的描述。本發(fā)明提供一種回收7—ADCA衍生物的有效的溶劑萃取步驟。
通過本發(fā)明，提供了一種真正有效的全面的7—ADCA制備方法，其包括迄今為止在現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開也沒有提示的反應(yīng)步驟。
通過應(yīng)用本發(fā)明和類似于EP—A—0540210中的類似描述，還可以用這種有效全面的方法制備7—ACA。附圖的簡要說明

圖1質(zhì)粒pMcTNE的功能圖。
圖2質(zhì)粒pMcTSE的功能圖。
圖3質(zhì)粒pMcTNde的功能圖。
圖4質(zhì)粒pGNETA的功能圖。
圖5質(zhì)粒pGSETA的功能圖。
圖6質(zhì)粒pANETA的功能圖。
圖7質(zhì)粒pASETA的功能圖。
圖8與PCR產(chǎn)物1序列(上線)并行的Nocardia lactamduranscefE的DNA序列(Coque等，同上)(下線)。序列表的簡要說明SEQ ID No.1—13用于構(gòu)建帶棒鏈霉菌和Nocardia lactamduranscefE基因的產(chǎn)黃青霉表達(dá)盒的寡核苷酸。
SEQ ID No.14Nocardia lactamdurans cefE的DNA序列(Coque等，見上)。
因此本發(fā)明提供一種制備和回收7—氨基去乙酸頭孢烷酸(7—ADCA)的方法，包括a)在絲狀真菌表達(dá)信號序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控下，用擴(kuò)環(huán)基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌株；
b)在培養(yǎng)基中發(fā)酵所述菌株并向所述培養(yǎng)基中加入3’—羧甲硫基丙酸或其鹽或酯，它們適于產(chǎn)生2—(羧乙硫基)乙?！?—(羧甲硫基)丙酰—6—氨基青霉烷酸(2—(羧乙硫基)乙?！?—APA和3—(羧甲硫基)丙酰—6—APA)，這些6—APA衍生物就地?cái)U(kuò)環(huán)形成2—(羧乙硫基)—乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA；c)從發(fā)酵液中回收2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA；d)將所述2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA脫乙?；患癳)回收結(jié)晶的7—ADCA。
e)步優(yōu)選為一過濾步驟。
擴(kuò)環(huán)酶的表達(dá)優(yōu)選在各個(gè)AT基因控制元件的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控下進(jìn)行，使所述兩種酶的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行。
優(yōu)選在低于約4.5的pH下用一種和水不混溶的有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液濾液，從發(fā)酵液中回收2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA，再在pH4—10間用水將其反萃取。另外，還提供了包含擴(kuò)環(huán)酶編碼DNA的重組DNA載體，其中擴(kuò)環(huán)酶之編碼DNA與產(chǎn)黃青霉AT基因或A.nidulans gpdA基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件有效地連接，以及用此載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明涉及在產(chǎn)黃青霉中應(yīng)用功能性基因構(gòu)建物以體內(nèi)擴(kuò)張青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)，并結(jié)合應(yīng)用生物合成酶的新底物，以形成頭孢菌素生物合成中的關(guān)鍵中間體—7—氨基去乙酸頭孢烷酸，或7—ADCA—的衍生物。該衍生物具有充許進(jìn)行有效溶劑萃取的化學(xué)組成，從而提供一種在經(jīng)濟(jì)效益上有吸引力的回收方法。
產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化原則上可用不同的DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)如PEG—Ca介導(dǎo)的原生質(zhì)體攝入、電穿孔或基因槍技術(shù)，及轉(zhuǎn)化子選擇來完成。例如，見Van den Hondel en Punt在Applied Molecular Genetics of Fungi(Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，eds)中的“對絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移和載體發(fā)展”一文，Cambridge University Press(1991)。已描述了顯性和非顯性選擇標(biāo)記的應(yīng)用(Van den Hondel，同上)。已描述了同源性(產(chǎn)黃青霉衍生的)和異源性(非產(chǎn)黃青霉衍生的)選擇標(biāo)記。
在存在或不存在載體序列時(shí)、與非選擇性DNA物理連接或不連接的不同轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記(同源或異源)在轉(zhuǎn)化子選擇中的應(yīng)用是熟知的。
優(yōu)選使用同源性選擇標(biāo)記選擇產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化子，以限制引入產(chǎn)黃青霉中外源DNA的量。最優(yōu)選使用顯性選擇標(biāo)記，它可以從轉(zhuǎn)化株中選擇性去除，如A.nidulans或其它絲狀真菌的amdS基因(歐洲專利申請No.94201896.1)。這些產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記的優(yōu)選特征在方法和產(chǎn)品的注冊中非常有利，因?yàn)樵诖朔椒ㄖ胁簧婕叭魏慰股乜剐詷?biāo)記或不會向環(huán)境中引入抗生素抗性標(biāo)記。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，可從菌株中選擇性去除的amdS選擇性標(biāo)記使得可以利用同一顯性選擇重復(fù)進(jìn)行幾輪轉(zhuǎn)化。表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉新菌株的這種無選擇標(biāo)記特性，對工業(yè)菌株改進(jìn)工程中高產(chǎn)菌株的迅速發(fā)展是關(guān)鍵性的。
按此方法，由擴(kuò)環(huán)酶介導(dǎo)的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)被引入產(chǎn)黃青霉中并在其中表達(dá)，例如在菌株Wisconsin 54—1255中。該擴(kuò)環(huán)反應(yīng)還可以在提高了β—內(nèi)酰胺產(chǎn)率的產(chǎn)黃青霉變體中進(jìn)行。很明顯，此時(shí)應(yīng)對培養(yǎng)基條件稍做調(diào)整以得到有效的生長。
另外，將cefE基因置于各個(gè)絲狀真菌基因控制元件的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制之下，優(yōu)選在來自產(chǎn)黃青霉酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)基因控制元件的控制之下，從而使其在最佳時(shí)間范圍內(nèi)表達(dá)，與?；D(zhuǎn)移的自身的作用同步。這些措施對青霉素分子上擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的效力是關(guān)鍵的。
除擴(kuò)環(huán)酶和酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的同時(shí)表達(dá)外，擴(kuò)環(huán)酶部分與微體(?；D(zhuǎn)移酶的細(xì)胞內(nèi)位置)中的酰基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞內(nèi)共定位可能對開發(fā)經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)工藝是有利的。這些優(yōu)選實(shí)施方案在減少青霉素付產(chǎn)物的量方面起很大作用，7—ADCA終產(chǎn)物中的這些付產(chǎn)物是注冊當(dāng)局不允許的。
總之，本發(fā)明描述了按照同時(shí)表達(dá)的方法，引入產(chǎn)黃青霉中的擴(kuò)環(huán)酶活性如何影響青霉素環(huán)的擴(kuò)環(huán)。
按照本發(fā)明，通過加入3’—羧甲硫基丙酸或其鹽或酯，在產(chǎn)黃青霉中產(chǎn)生3—內(nèi)酰胺中間體2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA。適當(dāng)?shù)柠}例如為鈉鹽或鉀鹽。通過簡單的溶劑萃取從培養(yǎng)液中回收相同產(chǎn)物，例如以下方法過濾發(fā)酵液，向?yàn)V液中加入與水不混溶的有機(jī)溶劑。調(diào)節(jié)pH以從水層中萃取頭孢菌素。pH范圍必須低于4.5；優(yōu)選在4到1之間，更優(yōu)選在2到1之間。這樣就將頭孢菌素與發(fā)酵液中存在的許多其它雜質(zhì)分離。優(yōu)選使用小體積有機(jī)溶劑，得到頭孢菌素濃溶液，以使體積流速減小。第二種可能性是在pH4或更低時(shí)萃取整個(gè)發(fā)酵液。優(yōu)選使用與水不混溶的有機(jī)溶劑在pH4—1之間萃取發(fā)酵液。
可以使用不影響頭孢菌素分子的任何溶劑。適當(dāng)?shù)娜軇├鐬橐宜岫□?、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、醇如丁醇等。?yōu)選使用1—丁醇或異丁醇。
然后在pH10，優(yōu)選在6—9下用水反萃取頭孢菌素。再次大大減小終體積。在0—50℃，優(yōu)選室溫下進(jìn)行回收。
這樣得到的頭孢菌素水溶液用適當(dāng)?shù)拿柑幚恚猿?—(羧乙硫基)—乙酰和3—(羧甲硫基)丙酰側(cè)鏈，得到目標(biāo)產(chǎn)物7—ADCA。
優(yōu)選使用固定化酶以能夠重復(fù)使用該酶。EP—A—022262中廣泛描述了這種顆粒的制備方法和酶的固定化方法。水溶液的pH值例如為4—9，此時(shí)頭孢菌素的降解反應(yīng)最小，而所希望的酶轉(zhuǎn)化此時(shí)是最優(yōu)化的。因此，向頭孢菌素水溶液中加入酶的同時(shí)保持pH在此適當(dāng)?shù)乃?，例如通過加入無機(jī)堿如氫氧化鉀溶液，或應(yīng)用陽離子交換樹脂。當(dāng)反應(yīng)完成后過濾除去固定化酶。另一可能性是在固定床或流化床柱中應(yīng)用固定化酶，或在溶液中使用酶并通過膜過濾除去產(chǎn)物。然后，在與水不混溶的有機(jī)溶劑存在下酸化反應(yīng)混合物。
適當(dāng)?shù)拿咐缪苌约賳伟鶶Y77，該微生物在62、177、178和179位的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)有突變。還可以使用衍生自其它假單胞微生物的酶，優(yōu)選假單胞SE83，它在相應(yīng)于假單胞菌SY77中62、177、178和179位的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上有或無突變。
調(diào)節(jié)pH至0.1到1.5后，分離各層，調(diào)節(jié)水層pH至2到5。然后過濾出結(jié)晶的7—ADCA。
脫?；€可以按本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法進(jìn)行，例如通過在低于10℃的溫度下加入五氯化磷，然后于室溫或更低溫度下加入異丁醇形成偕氯代亞胺側(cè)鏈。
提供以下實(shí)施例用于說明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1
鏈霉菌和諾卡氏菌的cefE基因在產(chǎn)黃青霉中的表達(dá)a.基因克隆和基因轉(zhuǎn)化的一般程序基因克隆程序中所用的通用技術(shù)用于本申請。這些技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、合成寡核苷酸的合成、DNA的核苷酸序列分析、DNA的酶連接和限制性酶切、大腸桿菌載體亞克隆、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子選擇、DNA的分離和純化、通過Southern印跡分析和32p標(biāo)記的探針表征DNA及通過隨機(jī)引物32P標(biāo)記DNA。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中非常熟悉的，在許多文獻(xiàn)中有充分的描述。例如見Sambrooke等的Molecu-lar Cloning，a laboratory Manual，Cold Spring Harbor，U.S.A.(1989)，Innes等的PCR protocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990)，及McPherson等的PCR，a Practical Approach，IRL Press(1991)。
用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌和選擇轉(zhuǎn)化子的一般程序包括制備真菌原生質(zhì)體、DNA轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體再生條件、純化和表征轉(zhuǎn)化子。這些程序都是本領(lǐng)已知的并有充分的文獻(xiàn)描述Finkelstein和Ball(編)，Biotechnology of Filamentous Fungi，technology and products，Butterworth—Heinemann(1992)；Bennett和Lasure(編)，More Gene Manipulationin Fungi，Academic Press(1991)；Turner，Biotechnology(Puhler編)，第二次全面修正版，VCH(1992)。
Bennett和Lasure(同上)和Finkelstein及Ball(同上)對基因克隆和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)在產(chǎn)黃青霉中的更具體應(yīng)用有充分的描述。
—用市售的DNA合成儀(Applied Biosystems，CA，U.S.A)按制造商的說明合成DNA寡核苷酸。
—用市售的自動PCR儀(Perkin Elmer，U.S.A)和Ultma DNA聚合酶(Perkin Elmer)按制造商的說明進(jìn)行PCR。
—使用hGC PCR方法(Duton等，Nucleic Acids Res.21，(No.12)(1993)2953—2954)以能夠擴(kuò)增N.lactamdurans和帶棒鏈霉菌染色體DNA的cefE編碼區(qū)。
—限制酶和其它DNA修飾酶購自BRL(MD，U.S.A)并按制備商的說明使用之。
—大腸桿菌載體pBluescript得自Stratagene(CA，U.S.A)。
—所用的其它化學(xué)品均為分析純，得自各種供應(yīng)商。
—基于序列特異性熒光標(biāo)記的檢測，用自動DNA序列分析儀(Applied Biosystems)按制造商的說明進(jìn)行DNA核苷酸序列分析。b.微生物的培養(yǎng)帶棒鏈霉菌ATCC 27064生長在胰蛋白酶大豆培養(yǎng)液(Difco)中。該菌株的染色體DNA用于分離cefE基因(Kovaceuic等，J.Bacte-riol.(1984)，754—760)。
Norcadia lactamdurans ATCC 27382也生長在胰蛋白酶大豆培養(yǎng)液(Difco)中。該菌株的染色體DNA用于分離cefE基因(Coque等，同上)。
產(chǎn)黃青霉Wisconsin 54—1255(ATCC 28089)生長在YPD完全培養(yǎng)基中(YPD1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。該菌株的染色體DNA用于分離cefE基因表達(dá)所需的penDE基因5’和3’調(diào)控區(qū)。產(chǎn)黃青霉ATCC 28089也用作cefE基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的宿主。產(chǎn)黃青霉的其它菌株，包括改進(jìn)了β—內(nèi)酰胺產(chǎn)率的突變菌株Wisconsin 54—1255也適用。根據(jù)所用的轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記，可使用在pyrG、niaD或facA基因中含有突變的產(chǎn)黃青霉菌株。這些突變菌株可按本領(lǐng)域熟知的方法獲得(Cantoral，Bio/Technol.5(1987)，494—497；Gouka等，J.Biotechn.20(1991)，189—200；及Gouka等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1993)，514—519)。
為了產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體而進(jìn)行的產(chǎn)黃青霉的培養(yǎng)也在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行。
根據(jù)所用產(chǎn)黃青霉的具體菌株和應(yīng)用的轉(zhuǎn)化子選擇方法不同，原生質(zhì)體產(chǎn)生和再生程序可稍有不同。
大腸桿菌WK6(Zell和Fritz，EMBO J.6(1987)，1809—1815)、XLI—Blue(stratagene)和HB101(Boyer和Rlland—Dussoix，J.Mol.Biol.，41(1969)，459；Bolivar和Backman，Messages Enzymol.68(1979)，2040)用標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌培養(yǎng)基(Sambrook，同上)保持并培養(yǎng)。c.CefE表達(dá)盒的構(gòu)建cefE表達(dá)盒列于表I中，其中也列出了這些質(zhì)粒所用的名稱。表I所構(gòu)建的cefE表達(dá)盒名詞1tac＝trp—lac雜合啟動子2gpd＝A.nidulans gpdA基因的5’—末端3AT＝產(chǎn)黃青霉pen DE基因的3’—末端4AT＝產(chǎn)黃青霉pen DE基因的5’—末端
文獻(xiàn)中公開的帶棒鏈霉菌cefE基因(kovacevic，同上)；N.lactamdurans cefE基因(coque，同上)；A.nidulans gpdA基因(Barredo等，Gene 83(1989)，291—300；Diez等，Mol.Gen Genet.218(1989)，575—576)的核苷酸序列用于設(shè)計(jì)列于表II中的合成寡核苷酸。表II用于構(gòu)建N.lactamdurans和帶棒鏈霉菌cefE基因的產(chǎn)黃青霉表達(dá)盒的寡核苷酸<
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C1.大腸桿菌cefE表達(dá)質(zhì)粒pMCTSE和pMCTNE的構(gòu)建在使用N.lactamdurans的染色體DNA和寡核苷酸1和2進(jìn)行的第一個(gè)PCR中，獲得作為0.9kb PCR產(chǎn)物的N.lactamdurans cefE開放讀碼框架，其含有5’—端的單—NdeI限制位點(diǎn)和3’—端的單—XbaI位點(diǎn)。PCR，2帶棒鏈霉菌cefE在使用帶棒鏈霉菌的染色體DNA和寡核苷酸3和4的第二個(gè)PCR中，獲得作為0.9kb PCR產(chǎn)物的帶棒鏈霉菌cefE開放讀碼框架，它也含有5’—端的單一NdeI限制位點(diǎn)和3’—端的單一XbaI限制位點(diǎn)。
為了cefE基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)及通過DNA序列分析表征PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物1和2克隆在載體pMCTNde中，該質(zhì)粒為pMC—5的衍生物(Stanssens等，Nucleic Acids Res.17(1989)，4441)。通過插入編碼tac啟動子的片段從pMC 5—8(歐洲專利申請No.0351029)衍生得到質(zhì)粒pMCTNde，tac啟動子后有RBS位點(diǎn)和NdeI克隆位點(diǎn)(圖3)PCR產(chǎn)物1和2用NdeI和XbaI消化，并連接到經(jīng)NdeI—XbaI消化的載體pMCTNde中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌WK6。選擇對氯霉素有抗性的轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子用于分離質(zhì)粒DNA。先通過限制酶消化產(chǎn)生預(yù)期的限制片段來分析cefE表達(dá)盒的插入。最后通過自動DNA序列分析來分析含有預(yù)定限制酶位點(diǎn)的質(zhì)粒。
質(zhì)粒pMCTSE(圖2)中帶棒鏈霉菌cefE開放讀碼框架的DNA序列與文獻(xiàn)公開的序列(kovacevic，見上)具有100％的一致率。
含有N.lactamdurans cefE開放讀碼框架的、所分析的所有克隆的DNA序列(圖8)與文獻(xiàn)公開的序列(coque，同上)不同。
文獻(xiàn)公開的N.lactamdurans cefE基因?qū)?yīng)的氨基序列在第41個(gè)氨基酸位為脯氨酸(見SEQ ID No.14)。在PCR1所得克隆中沒有該脯氨酸。此質(zhì)粒被稱為pMCTNE(圖1)。
C2.產(chǎn)黃青霉cefE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR，3gpdA啟動子在此第三個(gè)PCR中，使用pAN—1質(zhì)粒DNA(Punt等，Gene 56(1987)，117—124)和寡核苷酸5和6，所述質(zhì)粒DNA含有A.nidu-lans gpdA啟動子控制下的大腸桿菌hph基因，作為0.9kb的PCR產(chǎn)物獲得了gpdA啟動子，其在5’端含有單一EcoRI制限位點(diǎn)，在3’—端含有單一NdeI位點(diǎn)。PCR，4AT啟動子在第四個(gè)PCR中，使用產(chǎn)黃青霉的染色體DNA和寡核苷酸7和8獲得1.5kb的AT啟動子片段，它在5’—端含單一EcoRI限制位點(diǎn)，在3’—端含有單一NdeI位點(diǎn)。PCR，5AT終止子和N.lactamdurans cefE基因的3’—末端在第5個(gè)PCR中，使用產(chǎn)黃青霉染色體DNA及分別用寡核苷酸9＋10，11＋10獲得0.5kb的pen DE(AT)終止子區(qū)。從而這些PCR產(chǎn)物含有cefE基因的3’—端序列，其有或無微體靶向信號序列，該信號序列由C—末端氨基酸序列ARL組成(Muller等，Biochem-ica et Biophysica Acta 1116(1992)，210—213)。
設(shè)計(jì)寡核苷酸使PCR產(chǎn)物5’—端引入單一BspEI位點(diǎn)，在PCR產(chǎn)物3’—端引入speI位點(diǎn)。PCR，6AT終止子和帶棒鏈霉菌基因的3’—末端在第6個(gè)PCR中，用產(chǎn)黃青霉的染色體DNA及分別用寡核苷酸12＋10，13＋10獲得0.5kb的penDE(AT)終止子區(qū)。這些PCR產(chǎn)物從而含有帶或不帶微粒靶向信號序列的帶棒鏈霉菌cefE基因的3’—末端，該信號序列由C—末端氨基酸序列SKL組成(De Hoop等，Biochem.J.286(1992)，657—669)。
設(shè)計(jì)寡核苷酸使得在PCR產(chǎn)物5’—端引入單一BglI位點(diǎn)，在PCR產(chǎn)物3’—端引入單一SpeI位點(diǎn)。
為了使cefE基因在產(chǎn)黃青霉中獲得表達(dá)，將gpdA啟動子和AT啟動子片段連接到來自質(zhì)粒pMCTNE和pMCTSE的cefE片段上。將這些連接后的片段克隆到載體pBluescriptII KS中。
用EcoRI和NdeI消化PCR3產(chǎn)物。pMCTNE和pMCTSE用NdeI和XbeI消化。通過瓊脂糖凝膠電泳分離限制片段。從瓊脂糖凝膠純化0.9kb的cefE編碼片段。將EcoRI—NdeI啟動子片段與NdeI—XbaIcefE片段一起連接到用EcoRI—XbaI消化后的載體pBluescript II KS中。這樣就得到下列質(zhì)粒pGSE和pGNE。
為了獲得cef基因在產(chǎn)黃青霉中的最佳表達(dá)，我們選擇在上述青霉表達(dá)質(zhì)粒中cefE基因后克隆AT終止信號序列。GNETA-pGNEWApPCR5產(chǎn)物用Bsp EI和SpeI消化并連接到BspEI和SpeI消化的載體pGNE中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。從這些轉(zhuǎn)化子分離到的質(zhì)粒通過限制片段分析隨后經(jīng)DNA序列分析來表征。這樣就得到下列質(zhì)粒pGNEWA和pGNE-TA(圖4)。pGSETA-pGSEWAPCR 6產(chǎn)物用BglI和SpeI消化并連接到BglI和SpeI消化的載體pGSE中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。從這些轉(zhuǎn)化子分離的質(zhì)粒也通過限制片段分析和隨后經(jīng)DNA序列分析進(jìn)行表征。這樣得到下列質(zhì)粒pGSEWA和pGSETA(圖5)。pANETA、pANEWA和pASETA和pASEWA質(zhì)粒pGNETA、pGNEWA、pGSETA和pGSEWA用EcoRI和NdeI消化。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離限制片段，并從該凝膠純化4.5kb的片段。
PCR4產(chǎn)物用EcoRI和NdeI消化并與上述純化的片段連接。連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸肝菌HB101后，選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。
讓轉(zhuǎn)化子生長并分離其質(zhì)粒，經(jīng)限制片段分析再用DNA序列分析來表征。這樣獲得目標(biāo)構(gòu)建物，即pANETA(圖6)、pANEWA、pASETA(圖7)和pASEWA。d.產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化使用Ca—PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。
按照Cantoral(見上)、Gouka等(J.Biotechn.，見上)和Gouka等(Appl.Microbiol.Biotechnol.見上)描述的步驟，總質(zhì)粒或純化的cefE表達(dá)盒(無大腸桿菌載體序列)用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉的菌株，分別用pyrG、niaD、facA或amdS(Beri等，Curr.Genet.11(1987)，639—641)基因作為選擇標(biāo)記。
通過使用純化形式的同源性pyrG，niaD或facA選擇標(biāo)記(不含大腸桿菌載體序列)，獲得轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株，它們不含細(xì)菌抗性基因。
歐洲專利申請No.94201896.1描述了獲得無選擇標(biāo)記基因的重組菌株的方法。該方法被成功地用于含有A.nidulan與amdS基因作為顯性選擇標(biāo)記的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化子。
這樣僅有的外源性質(zhì)元件是0.9kb的cefE編碼區(qū)和可能的0.9kb的gpbA啟動子區(qū)。e.轉(zhuǎn)化子的分析通過在選擇性培養(yǎng)基上重復(fù)培養(yǎng)來純化產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化子。單一的穩(wěn)定菌落用于制備瓊脂傾面以產(chǎn)生孢子并篩選含有cefE表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子。將從瓊脂板上轉(zhuǎn)化子得到的新生菌絲體片段煮沸，用于獲得足夠的模板DNA，以利用PCR技術(shù)有效地篩選存在cefE基因的數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化子。(Seth，F(xiàn)ungal Genetics Conference，Asilomar(1991)，在Fungal Genetics Newsletter 38，55中的摘要)。通過這一操作估價(jià)了轉(zhuǎn)化子的效力。
還用生物檢測進(jìn)行了轉(zhuǎn)化子篩選。轉(zhuǎn)化子在含有所選側(cè)鏈前體的瓊脂培養(yǎng)基上生長。大腸桿菌ESS 2231用作瓊脂涂層中的指示細(xì)菌，該瓊脂層還含有Bacto penase以能夠按本領(lǐng)域熟知的方法區(qū)別青霉素和頭孢菌素產(chǎn)物，這些方法例如描述在Guttierez等，Mol，Gen.Genet.225(1991)，56—64中。
如d.節(jié)所述，用孢子接種產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)基。在25℃培養(yǎng)72小時(shí)后，從菌絲體分離染色體DNA。用識別6bp序列的限制酶如EcoRI或PstI消化該DNA。
用瓊脂糖凝膠分離DNA片段，并印在基因篩選尼龍膜上(NewEngland Nuclear)。用作cefE基因序列之探針的32P標(biāo)記PCR 2產(chǎn)物與Southern印跡雜交。用市場供應(yīng)的標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim)，在α32P dCTP存在下通過隨機(jī)引物標(biāo)記達(dá)到純化的PCR2產(chǎn)物的標(biāo)記。
檢測含cefE編碼序列的轉(zhuǎn)化子對cefE基因產(chǎn)物的表達(dá)，本文稱為擴(kuò)環(huán)酶活性。
在青霉素生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇的轉(zhuǎn)化子(見實(shí)施例2)。
在一時(shí)間參數(shù)的試驗(yàn)中，發(fā)酵48、72和96小時(shí)后取菌絲體樣品。制備菌絲體萃取物并測定粗萃取物中的擴(kuò)環(huán)酶活性，基本按Rollins等在Can.J.Microbio1.34(1988)，1196—1202中所述方法進(jìn)行。按Alvarez等在Antimicrob.Agent Chem.31(1987)，1675—1682中所述方法，測定具有擴(kuò)環(huán)酶活性的轉(zhuǎn)化子的?；D(zhuǎn)移酶活性。
通過這些分析，選擇了具有不同水平?；D(zhuǎn)移酶和擴(kuò)環(huán)酶酶活性的轉(zhuǎn)化子，以發(fā)酵生產(chǎn)7—ADCA衍生物。實(shí)施例22—(羧乙硫基)乙?！?—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA的發(fā)酵生產(chǎn)和分離產(chǎn)黃青霉株Wisconsin 54—1255(ATCC 28089)用實(shí)施例1中所述DNA構(gòu)建物之一轉(zhuǎn)化，并以2×106分生孢子/ml接種在下列組成的種子培養(yǎng)基中(g/l)葡萄糖，30；(NH4)2SO4，10；KH2PO4，10；痕量元素溶液I(MgSO4·7H2O，25；FeSO4·7H2O，10；CuSO4·5H2O，0.5；ZnSO4·7H2O，2；Na2SO4，50；MnSo4·H2O，2；CaCl2·2H2O，5)，10(ml/l)(消毒前pH6.5)。
該種子培養(yǎng)物在25—30℃孵育48—72小時(shí)，然后用于接種10—20體積的生產(chǎn)培養(yǎng)基，其含有(g/l)乳糖，80；麥牙糖，20；CaSO4，4；脲，3；MgSO4·7H2O，2；KH2PO4，7；NaCl，0.5；(NH4)2SO4，6；FeSO4·7H2O，0.1；3’—羧甲基硫基丙酸，5；痕量元素溶液II(CuSO4·5H2O，0.5；ZnSO4·7H2O，2；MnSO4·H2O，2；Na2SO4，50)，10(ml/l)(消毒前pH5.5—6.0)。然后繼續(xù)孵育96—120小時(shí)。
生產(chǎn)發(fā)酵結(jié)束后，通過離心或過濾除去菌絲體，在反相柱上用高壓液相色譜(HPLC)分析2—(羧乙硫基)—乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA。HPLC儀使用Beckman System Gold，由126型程序化溶劑系統(tǒng)、507型自動進(jìn)樣器、168型二極管陣列檢測器和System Gold數(shù)據(jù)系統(tǒng)(5.10)組成。固定相使用兩個(gè)串聯(lián)的Chromspher C18圓柱型柱(100×3mm，Chrompack)。流動相以0.5ml/min的流速15分鐘內(nèi)由100％0.07M pH4，8磷酸緩沖液到25％乙腈和75％pH4.8磷酸緩沖液的線性梯度。用合成的2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA作為參照物，在260nm對2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的產(chǎn)率進(jìn)行定量。
比較聯(lián)機(jī)UV和NMR光譜證實(shí)了峰的鑒定。
過濾發(fā)酵液后，向?yàn)V液中加入約0.1體積的1—丁醇。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，在室溫?cái)嚢璐嘶旌衔?分鐘。分離后，將有機(jī)層蒸發(fā)進(jìn)一步用于化學(xué)脫?；?實(shí)施例3)或用0.33體積pH8的水反萃取并進(jìn)一步用于酶促脫酰化(實(shí)施例4和5)。實(shí)施例32—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA的脫酰化室溫下向3g(8mmol)2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA的混合物中加入3.5ml(36mmol)N，N—二甲基苯胺，13ml二氯甲烷和2.6ml(21mmol)三甲基氯代甲硅烷。攪拌30分鐘后，將此反應(yīng)混合物冷卻至約-50℃，并一次加入1.8g(8.5mmol)五氯化磷。保持溫度在-40℃計(jì)2小時(shí)，然后冷卻反應(yīng)混合物至-65℃。然后用12ml(137mmol)異丁醇處理，加入速度應(yīng)使溫度不超過-40℃。再攪拌2小時(shí)后，將此溶液傾入15ml水中，然后立即加入5ml 4.5N氨水。慢慢加入固體碳酸氫銨調(diào)節(jié)pH至4。冷卻至5℃后，過濾混合物，7—ADCA結(jié)晶用5ml丙酮水溶液(1∶1)洗滌并分離。實(shí)施例4用假單胞菌SY77?；竿蛔凅w對2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA進(jìn)行酶促脫?；褂锰禺愋怎；冈谝徊矫阜磻?yīng)中進(jìn)行2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的轉(zhuǎn)化，該酰化酶從假單胞菌SY77?；附?jīng)區(qū)域定向誘變衍生而來。EP—A—0453048中描述了關(guān)于提高了對2—(羧乙硫基)乙酰和3—(羧甲硫基)丙酰側(cè)鏈活性的假單胞SY77?；竿蛔凅w的構(gòu)建和鑒定。在此突變體中，假單胞菌SY77酰化酶α—亞單位中178位的酪氨酸已被組氨酸替代。過濾收集產(chǎn)生該突變?；傅拇竽c桿菌細(xì)胞并重懸于含140mM NaCl的10mM pH7.4的磷酸緩沖液中。然后超聲破壞這些細(xì)胞。除去細(xì)胞碎片后，收集含?；富钚缘纳锨逡骸Ｍㄟ^一系列色譜步驟進(jìn)一步純化該?；?1)在快流型Q—Sepharose上于pH8.8的離子交換色譜；(2)在苯基—Sepharose上的疏水作用色譜；和(3)在Sephacryl S200HR柱上的凝膠滲透色譜。
將純化的?；腹潭ㄔ谟擅髂z和脫乙酰殼多糖混合物組成的顆粒上。在臨加入酶之前用戊二醛處理這些顆粒。
在一有攪拌裝置的池形反應(yīng)器中進(jìn)行2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA的轉(zhuǎn)化。首先將頭孢菌素水溶液加入反應(yīng)器中，然后在恒定攪拌下將溶液溫度升至30℃，用氫氧化鉀將pH固定在8。然后加入固定化酶開始轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化過程中持續(xù)記錄反應(yīng)器中的pH并保持在8。反應(yīng)中釋放的3’—羧甲硫基丙酸用KOH滴定。將加入的KOH量積分化并在平板記錄儀上記錄。從反應(yīng)器中取樣并如實(shí)施例2中所述HPLC方法分析2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA及7—ADCA以監(jiān)測此轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
反應(yīng)完成后，過濾去除固定化酶，調(diào)節(jié)濾液pH至1并加入乙酸丁酯。分離各層，調(diào)節(jié)含7—ADCA之水相的pH至3。濾出結(jié)晶的7—ADCA。實(shí)施例5用假單胞菌SE 83?；笇?—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA進(jìn)行酶促脫?；磳?shí)施例4中方法進(jìn)行2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙酰—7—ADCA的轉(zhuǎn)化，但使用假單胞菌SE83?；缸鳛轷；福玫较嗤Y(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種制備和回收7—氨基去乙酸頭孢烷酸(7—ADCA)的方法，包括a)在絲狀真菌表達(dá)信號的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控之下，用擴(kuò)環(huán)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌株；b)所述菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵，并向所述培養(yǎng)基中加入3’—羧甲硫基丙酸或其鹽或酯，它們適于產(chǎn)生2—(羧乙硫基)乙酰—和3—(羧甲硫基)丙?！?—氨基青霉烷酸(2—(羧乙硫基)乙?！?—APA和3—(羧甲硫基)丙?！?—APA)，所述6—APA衍生物就地?cái)U(kuò)環(huán)形成2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCAc)從發(fā)酵液中回收2—(羧乙硫基)乙?！?—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA；d)將所述2—(羧乙硫基)乙酰—7—ADCA和3—(羧甲硫基)丙?！?—ADCA脫酰化；及e)回收結(jié)晶的7—ADCA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)黃青霉菌株在AT基因表達(dá)信號的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控下用擴(kuò)環(huán)酶轉(zhuǎn)化。
3.權(quán)利要求l或2的方法，其中(e)步為過濾步驟。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中(c)步為過濾步驟、和在PH低于約4.5時(shí)用與水不混溶的有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液濾液，再在PH4—10下用水將其反萃取。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)環(huán)酶來自帶棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)或Nocardia lactamdurans。
6.一種重組DNA載體，它含有與絲狀真菌表達(dá)信號的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列有效連接的擴(kuò)環(huán)酶編碼DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組DNA載體，其中擴(kuò)環(huán)酶編碼DNA與AT基因表達(dá)信號的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列有效連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的載體，其中擴(kuò)環(huán)酶編碼DNA衍生自帶棒鏈霉菌或Nocardia lactamdurans。
9.用權(quán)利要求6、7或8之任一項(xiàng)定義的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
全文摘要
改進(jìn)了使用表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化菌株、通過2-(羧乙硫基)乙酰-7-ADCA和3-(羧甲硫基)丙酰-7-ADCA制備和回收7-氨基去乙酸頭孢烷酸(7-ADCA)的全面有效的方法。
文檔編號C12N15/55GK1128045SQ94192933
公開日1996年7月31日 申請日期1994年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月30日
發(fā)明者R·A·L·波文伯格, B·P·科伊科曼, A·霍伊科瑪, J·M·范德拉恩, J·韋爾威基, E·德弗盧姆 申請人:吉斯特·布羅卡迪斯公司