專利名稱：回收天然存在的大環(huán)內(nèi)酯用的新萃取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從通過(guò)發(fā)酵方法得到的物質(zhì)中將天然存在的中性大環(huán)內(nèi)酯，具體是三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯如雷帕霉素、32-去甲雷帕霉素、15-去氧雷帕霉素或FK-506與其它天然存在的組分分離的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及從發(fā)酵肉湯萃取提濃物和從母液提濃物中回收大三環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素的方法。
以雷帕霉素和FK-506為代表的三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯具有免疫抑制活性以抗菌和其它藥物活性，可用于治療皮膚及器官移植排斥、炎癥和自身免疫疾病，如狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病和多發(fā)性硬化病。
三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素、32-去甲雷帕霉素、15-去氧雷帕霉素和FK-506是在適當(dāng)?shù)臈l件下，由各種鏈霉菌屬菌株發(fā)酵制得的，它們都是中性化合物，因?yàn)闆](méi)有堿性氨基、酚基或羧基存在。雷帕霉素是通過(guò)在水介質(zhì)中培養(yǎng)S吸水菌NRRL5491而制得的。含有三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的絲菌體是從生長(zhǎng)介質(zhì)中回收并用如甲醇之類的有機(jī)溶劑萃取，以得到含有所需的三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯、相關(guān)化合物、酸性化合物(如脂肪酸)、堿性化合物(如生物堿和肽)以及中性親脂化合物(如脂肪)的混合物。一般發(fā)酵肉湯提取物被濃縮以便于運(yùn)輸和/或儲(chǔ)存，直到大環(huán)內(nèi)酯能被分離。在本發(fā)明之前從發(fā)酵肉湯提取物中分離和提純此三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯一直是使用各種化學(xué)和色譜技術(shù)來(lái)制取純物質(zhì)的昂貴實(shí)驗(yàn)室方法。[U.S. 5，091，389;U.S.3，993，749;WO 93/11130;Sehgal，J.of Antibiotics 28(10)727(1975)]。比如雷帕霉素發(fā)酵肉湯濃縮提取液只含有5～15%的雷帕霉素和不多于50%的酸性組分，雷帕霉素必須與其它組分分離。從發(fā)酵肉湯提取液中回收三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的方法一般包括在活性炭上吸附和從它上面解吸、溶解度選擇性操作和一次或幾次使用柱狀色譜和/或高壓液相色譜的消耗時(shí)間多且昂貴的色譜操作。迄今為止一直避免酸性或堿性條件，因?yàn)檎J(rèn)為像雷帕霉素這樣的三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯在酸性或堿性條件下是不穩(wěn)定的。在無(wú)機(jī)堿(如氫氧化鈉水溶液)、有機(jī)堿(如4-甲基氨基吡啶，DMAP或1，8-二唑雙環(huán)[5，4，0]+-烯-7，DBU)或無(wú)機(jī)酸水溶液(如鹽酸)和Lewis酸(如氯化鋅)等作用下，在水混溶性溶液如甲醇或四氫呋喃中的雷帕霉素會(huì)發(fā)生降解。[Steffan 等Tetrahedron Letter(布印刷中)，D.Yohanes和S.J.Danishefsky，Tetrahedron Letter 33(49)，7469-7472(1992);Luengo 等Tetrahedron Letter 34(6)，991-994(1993)和D.Yohannes 等，Tetrahedron Letters 34(13)，2075-2078(1993)]。
本發(fā)明提出了一個(gè)從濃縮發(fā)酵肉湯提取液中和從重結(jié)晶溶劑、研磨液和產(chǎn)品洗滌液中得到的它們的母液或濃縮液中回收大環(huán)內(nèi)酯，特別是三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯，更具體為雷帕霉素的比較快捷而有效的方法，本發(fā)明避免了在U.S. 5，091，389;U.S. 3，993，749;WO 93/11130;和Sehgal，在J.of Antibiotics 28(10)727(1975)中舉例的費(fèi)時(shí)、價(jià)昂的色譜分離。這個(gè)方法包括通過(guò)將含有大環(huán)內(nèi)酯的提濃液溶于適當(dāng)?shù)乃烊苄匀軇?、將酸性?或堿性組分分別抽提到堿或酸水溶液中以及使用選擇性溶解或萃取技術(shù)將濃縮液中的中性極性三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯與非極性中性物質(zhì)分離，從而使酸性和/或堿性組分與中性組分分離。雖然本說(shuō)明書中敘述的方法適用于發(fā)酵肉湯提取物或母液的提濃液，但只要發(fā)酵肉湯提取或重結(jié)晶、培養(yǎng)或洗滌所用的溶劑或混合劑對(duì)本方法是適合的、溶劑的量不過(guò)大，所有的提取溶液或母液溶液都可用于本發(fā)明的方法中。通過(guò)部分提濃可以減少溶劑的量。本發(fā)明的方法適用的任何溶液都可以認(rèn)為是含大環(huán)內(nèi)酯濃縮液。
通過(guò)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序可將由所述方法得到的產(chǎn)物提純可接受的純度。
下面程序1中概述了本發(fā)明的方法，在如下的對(duì)本發(fā)明方法的公開(kāi)中，非極性溶劑是一種非芳香的烴類，比如環(huán)己烷、環(huán)己烯、己烷、庚烷、戊烷等。與非芳烴相容的溶劑包括但不限于乙腈和二甲基甲酰胺。萃取這一術(shù)語(yǔ)表示將一種溶劑與另一種不混溶溶液充分混合，讓這些互不混溶溶液彼此分離、并從物理上從一層或一個(gè)相中分離出另一層或另一相。洗滌一詞當(dāng)用作溶液時(shí)表示一種萃取操作，當(dāng)用于固體時(shí)表示用一種固體基本不溶于其中的溶劑來(lái)漂洗該固體。母液一詞指的是從所選固體的水萃取液、洗滌液及研磨液的結(jié)晶濾液、洗滌液及回萃液中得到的有機(jī)溶劑的溶液。大環(huán)內(nèi)酯溶劑是一種將能溶解大環(huán)內(nèi)酯及伴生雜質(zhì)(如酸性或堿性組分)的溶劑或混合溶劑。大環(huán)內(nèi)酯非溶劑是一種大環(huán)內(nèi)酯基本不溶于其中，但在其中可溶解如脂肪之類中性組分的溶劑或混合溶劑。大環(huán)內(nèi)酯結(jié)晶溶劑是大環(huán)內(nèi)酯在其中可以進(jìn)行重結(jié)晶，或從研磨中的無(wú)定形態(tài)進(jìn)行結(jié)晶的溶劑或混合溶劑。在本方法需要將溶液進(jìn)行濃縮之處，指的是溶劑或混合溶劑有足夠的揮發(fā)度能夠在不降解的溫度及壓力條件下被蒸餾掉。
程序1 按照本發(fā)明，將無(wú)論是來(lái)自發(fā)酵肉湯萃取液濃縮液，還是來(lái)自結(jié)晶和/或洗滌溶劑的含有大環(huán)內(nèi)酯的濃縮液溶解于按其溶解此濃縮液的能力和易于除去來(lái)選擇的水不混溶性溶劑或混合溶劑中，這些溶劑包括但不限于二氯甲烷、甲基叔丁基醚、醋酸乙酯、甲苯、1-丁醇、醋酸乙酯/甲苯混合物、庚烷/醋酸乙酯混合物或己烷/二氯甲烷混合物。用堿的水溶液，包括氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化銨等，最好是氫氧化鈉，以0.1～5N的濃度，優(yōu)選以約0.1～1.0N，最優(yōu)選約0.1～0.5N的濃度來(lái)萃取酸性組分是特別適合的。有機(jī)堿如三乙胺不能像無(wú)機(jī)強(qiáng)堿水溶液那樣有效地除去此酸性組分，用濃度為0.1～5N，優(yōu)選約0.1～1.0N，最優(yōu)選約0.1～0.5N的無(wú)機(jī)酸水溶液來(lái)萃取堿性組分是適宜的，這些酸包括鹽酸、磷酸二氫甲、硫酸氫鈉等，最好是鹽酸。有機(jī)酸如三氟醋酸不能像無(wú)機(jī)酸那樣有效地除去此堿性組分。在約-5℃至約45℃，優(yōu)選約-5℃至約30℃，最優(yōu)選約-5℃至約10℃下進(jìn)行從含有大環(huán)內(nèi)酯的溶液中萃取出酸性和/或堿性成份的操作，為避免大環(huán)內(nèi)酯在酸或堿中可能發(fā)生的降解，此萃取工序應(yīng)不加延遲地完成。根據(jù)存在的酸性和/或堿性組分?jǐn)?shù)量的不同，無(wú)論是酸的萃取還是堿的萃取都可能不是必須的，只進(jìn)行酸性組分的萃取或只進(jìn)行堿性組分的萃取就可能足以從含大環(huán)內(nèi)酯的溶液中除去得以分離三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的足夠雜質(zhì)。
最好在一步省時(shí)間的萃取操作中從含大環(huán)內(nèi)酯濃縮液的溶液中除去酸性(或堿性)組分。通過(guò)用堿的水溶液(或酸的水溶液)來(lái)萃取得自含大環(huán)內(nèi)酯濃縮液溶液的一個(gè)等分部分，然后用pH計(jì)或其它測(cè)定pH值的方法來(lái)確定為了進(jìn)行萃取使這一等分部分具有使化學(xué)當(dāng)量上的堿(或酸)得以過(guò)剩時(shí)所需要的堿(或酸)的水溶液量就能夠確定在此萃取工序中使堿(或酸)呈現(xiàn)過(guò)量所需要的堿(或酸)水溶液的量。然后按要進(jìn)行萃取的溶液的量與從中所取出的等分部分的比例就能成比例地求出被取出等分部分的溶液萃取所需的堿(或酸)的水溶液的量。這樣就可以在一步完成酸性(或堿性)組分的萃取，而不用像用堿(或酸)水溶液進(jìn)行多次萃取那樣操作。很明顯，在含有大環(huán)內(nèi)酯的溶液中既要除去酸性組分，也要除去堿性組分的場(chǎng)合將需要分別用堿的水溶液和酸的水溶液進(jìn)行各自的萃取。例如，對(duì)于含有雷帕霉素濃縮溶液的溶液，用足以得到最終pH值為12的氫氧化鈉進(jìn)行一次萃取就足以基本除去所有的酸性組分。
用上述方法從溶液中回收的大環(huán)內(nèi)酯可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的普通提純技術(shù)被提純到所需的純度。如果需要，濾液和洗滌液可以再次用來(lái)回收大環(huán)內(nèi)酯。
在進(jìn)行了從含有大環(huán)內(nèi)酯的水不混溶性溶劑的溶液中除去酸性和/或堿性組分的萃取操作以后，可以用下面的方法之一將此大環(huán)內(nèi)酯與非極性中性組分分離(1)將與萃取出酸性和/或堿性組分并含有大環(huán)內(nèi)酯的水不混溶性溶劑的溶液可以互相混溶的大環(huán)內(nèi)酯非溶劑或混合非溶劑以足夠的數(shù)量加到含有大環(huán)內(nèi)酯的溶液中，使大環(huán)內(nèi)酯和可能還有與大環(huán)內(nèi)酯有關(guān)的產(chǎn)物不溶于得到的溶液當(dāng)中，并形成分離相，然后，無(wú)論是油或是固體都可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的普通分離技術(shù)來(lái)分開(kāi)。
(2)將萃取出酸性和/或極性組分的含有大環(huán)內(nèi)酯的與水不混溶溶劑的溶液進(jìn)行濃縮，并將含有殘留物的大環(huán)內(nèi)酯溶于大環(huán)內(nèi)酯可溶的溶劑中，此溶劑如乙腈或二甲基甲酰胺，再用非芳香烴溶劑如環(huán)己烷、己烷、庚烷或環(huán)己烯進(jìn)行萃取。分離大環(huán)內(nèi)酯可溶的溶劑層并進(jìn)行濃縮。然后用結(jié)晶溶劑研制含有殘留物的大環(huán)內(nèi)酯，就得到了大環(huán)內(nèi)酯(這時(shí)所述大環(huán)內(nèi)酯是固體);或者用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行提純(這時(shí)所述大環(huán)內(nèi)酯是油狀物)。另外，在用非芳烴溶劑萃取后的大環(huán)內(nèi)酯可溶溶劑可以如上面操作(1)那樣用相容的大環(huán)內(nèi)酯不溶的溶劑處理。
(3)將萃取出酸性和/或堿性組分的含有大環(huán)內(nèi)酯的與水不混溶溶劑的溶液進(jìn)行濃縮，并用大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)晶溶劑如二乙醚、二異丙基醚或甲基叔丁基醚將殘留物進(jìn)行研制。
另外，含有大環(huán)內(nèi)酯的濃縮液可以先按照上述(1)至(3)的方法之一進(jìn)行萃取以除去極性組分，然后將含有殘留物的大環(huán)內(nèi)酯溶于一種水不混溶性溶劑(如果當(dāng)初用的不是這種溶劑)，并用堿和/或酸的水溶液萃取以除去酸性和/或堿性組分。
上述方法具有意外發(fā)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)從含有大環(huán)內(nèi)酯的濃縮液在與水不混溶的溶劑中形成的溶液中進(jìn)行酸或堿的水溶液萃取操作時(shí)，像雷帕霉素這樣的大環(huán)內(nèi)酯不會(huì)分解。鑒于從放在溶液中的酸或堿會(huì)導(dǎo)致雷帕霉素發(fā)生可觀察到的降解這一事實(shí)，原來(lái)曾認(rèn)為會(huì)發(fā)生降解的。
此萃取方法極大地縮短了從所述濃縮液中回收大環(huán)內(nèi)酯所需要的時(shí)間，并避免了耗時(shí)與昂貴的色譜操作。
三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素是一種可溶于甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、稍溶于二乙基醚、難溶于己烷或石油醚、不溶于水的結(jié)晶固體。雷帕霉素具有如下所示的結(jié)構(gòu)。原子標(biāo)數(shù)系統(tǒng)是按《化學(xué)文摘》(CA)所用的那種。
如下各實(shí)例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明從發(fā)酵肉湯和母液的濃縮液中分離雷帕霉素的方法，不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。在如下各實(shí)例中，通過(guò)物理、光譜及色譜性質(zhì)與正式的雷帕霉素進(jìn)行比較，確認(rèn)分離出的產(chǎn)品確實(shí)為雷帕霉素。用高壓液相色譜測(cè)定了未重結(jié)晶的產(chǎn)品純度。
實(shí)施例1將濃縮的發(fā)酵肉湯萃取液(157.0克含雷帕霉素10.4%)放入600毫升二氯甲烷中，在0～5℃用0.5N的NaOH各150毫升洗滌三次，再用水洗滌直至洗滌液呈中性，再用鹽水洗滌。將二氯甲烷溶液濃縮，用140毫升二乙基醚研制70.5克殘留物。收集結(jié)晶的固體，用二乙基醚洗滌并干燥，得到6.3克雷帕霉素，純度91.7%，產(chǎn)率35.4%，二乙基醚過(guò)濾液進(jìn)行濃縮得到63.5克含雷帕霉素13.1%的油狀物。
實(shí)施例2將濃縮的發(fā)酵肉湯萃取物溶液(206.0克，雷帕霉素含量11.8%)放入800毫升甲基叔丁基醚中，并在0～5℃用3份各400毫升0.5N的NaOH溶液洗滌，然后用水洗滌直至洗滌水成中性。將此甲基叔丁基醚溶液濃縮，并用150毫升二乙基醚研制75.0克殘留物。收集晶狀固體，用二乙基醚洗滌并干燥，得到11.4克雷帕霉素，純度92.2%，產(chǎn)率43.3%。濃縮二乙基醚過(guò)濾液，得到具有11.3%雷帕霉素的油58.7克。
實(shí)施例3將濃縮的發(fā)酵肉湯萃取物溶液(10.58克，雷帕霉素含量10.4%)放入23毫升的乙腈中，并用2份23毫升的環(huán)己烷洗滌，然后濃縮。將殘留液溶于二氯甲烷，依次用3份各23毫升的0.5NNaOH溶液在0～5℃洗滌，用2份各23份0.5N的HCl在0-5℃洗滌，再用水洗到洗滌水呈中性。濃縮該二氯甲烷溶液，并用二乙基醚研制4.07克殘留物，收集晶狀固體，用二乙基醚洗滌并干燥，得到0.64克雷帕霉素，純度89.5%，產(chǎn)率58.2%。將二乙基醚過(guò)濾液得到3.36克含雷帕霉素9.8%的油狀物。
實(shí)施例4將加入到400毫升醋酸乙酯中的濃縮發(fā)酵肉湯萃取液(100.0克，雷帕霉素含量11.8%)在0～5℃用一次200毫升和2次各100毫升的0.5NNaOH溶液洗滌，然后在0～5℃用2次各200毫升0.5N鹽酸洗滌，最后用水洗至洗滌水呈中性為止。用100毫升醋酸乙酯反萃取洗滌水，將醋酸乙酯溶液合在一起。濃縮此醋酸乙酯溶液，并用45毫升二異丙基醚來(lái)研制43.2克殘留物。收集晶狀固體，用二異丙基醚洗滌并干燥，得到9.5克雷帕霉素純度85.3%，產(chǎn)率68.7%。濃縮此二異丙基醚過(guò)濾液得到31.6克雷帕霉素含量6.6%的油狀物。
實(shí)施例5將放于120毫升甲苯和25毫升醋酸乙酯混合物中的濃縮發(fā)酵肉湯萃取物溶液(25.2克，雷帕霉素含量10.4%)先后在0～5℃用三份各50毫升的0.5NNaOH溶液和在0～5℃用2份各50毫升0.5N鹽酸重復(fù)洗滌，再用水洗到洗滌水呈中性。將此128毫升的甲苯/醋酸乙酯溶液分成相等的兩分，進(jìn)一步用如下方法處理方法A.濃縮此64毫升甲苯/醋酸乙酯溶液，用11毫升二乙基醚研制5.7克殘留液。收集晶狀固體，再用二乙基醚洗滌并干燥，得到0.84克雷帕霉素，純度為92.7%，產(chǎn)率為64.1%。濃縮此二乙基醚過(guò)濾液得到4.3克雷帕霉素含量6.8%的油狀物。
方法B，濃縮此64毫升甲苯/醋酸乙酯溶液，用50毫升乙腈溶解9.0克殘留物。用2份各25毫升環(huán)己烷洗滌此乙腈溶液。然后濃縮此乙腈溶液并用11毫升二乙基醚研制4.3克殘留液。收集晶狀固體，用二乙基醚洗滌并干燥，得到0.81克雷帕霉素，純度為94.6%，產(chǎn)率61.8%。濃縮此二乙基醚過(guò)濾液得到3.0克雷帕霉素含量5.9%的油狀物。
實(shí)施例6用4000毫升甲基叔丁基醚研制母液濃縮液(996.0克，雷帕霉素含量21.6%)。收集結(jié)晶固體，并用500毫升甲基叔丁基醚洗滌并干燥，得到36.2克雷帕霉素(純度為95.1%，產(chǎn)率為13.8%)。用1份2000毫升和2份各1000毫升的0.5N氫氧化鈉在0～5℃洗滌過(guò)濾液。將堿性萃取液合在一起用500毫升甲基叔丁基醚洗滌一次。將甲基叔丁基醚過(guò)濾和萃取液合在一起并且水洗至洗滌水呈中性為止。將萃取水合在一起并用500毫升甲基叔丁基醚萃取。將甲基叔丁基醚溶液合在一起、濃縮，并用350毫升二異丙基醚研制377.1克殘留液。收集結(jié)晶固體，用二異丙基醚洗滌并干燥，得到126.7克雷帕霉素(純度為82.4%，產(chǎn)率為58.9%)。這樣從母液濃縮液中回收雷帕霉素總量為162.9克(72.7%)。濃縮此二異丙基醚過(guò)濾液得到157.9克雷帕霉素含量為20.9%的油狀物。
實(shí)施例7將放于2000毫升的二氯甲烷中的母液濃縮物溶液用3份500毫升的0.5N NaOH溶液在0～5℃洗滌，然后用1份200毫升的二氯甲烷萃取合在一起的堿水溶液萃取液。將有機(jī)溶液合在一起并用2份500毫升的0.5N鹽酸溶液在0～5℃洗滌。用1份200毫升的二氯甲烷萃取合在一起的酸水萃取液。用水洗滌合在一起的有機(jī)萃取液，直至洗滌水呈中性。濃縮此有機(jī)溶液，并用250毫升二丙基醚研制255.0克殘留液。收集結(jié)晶固體，用二異丙基醚洗滌并干燥，得到108.6克雷帕霉素(純度為86.6%，回收率為77.4%)。濃縮此二異丙基醚過(guò)濾液得到100.2克雷帕霉素含量23.1%的油狀物。
實(shí)施例8在0～5℃將400毫升0.5N NaOH水溶液加入到猛烈攪拌的冷凍(0～5℃)濃縮發(fā)酵肉湯萃取液(198.5克，雷帕霉素含量8.3%)在800毫升甲基叔丁基醚的溶液中，其加入速度應(yīng)使溫度保持在0～5℃。在劇烈攪拌5分鐘之后，除去下層堿水層并儲(chǔ)存在0～5℃。在0～5℃用2份200毫升的0.5NNaOH水溶液再次萃取有機(jī)層將堿水萃取液合在一起，并用200毫升甲基叔丁基醚進(jìn)行再次萃取。將甲基叔丁基醚合在一起，并用水滌直到洗滌水呈中性(pH＝7)。將水洗液合在一起，并用100毫升甲基叔丁基醚萃取。將甲基叔丁基醚溶液合在一起，用飽合氯化鈉水溶液洗滌，并在40℃下真空濃縮。用85毫升二異丙基醚在20～25℃研制殘留物至少1個(gè)小時(shí)，混合物冷卻至0～5℃過(guò)夜。用燒結(jié)玻璃Buchner漏斗收集結(jié)晶固體，并在20～25℃用4∶1二異丙基醚/甲基叔丁基醚混合物洗滌(5×20毫升或直至過(guò)濾液無(wú)色為止)。將結(jié)晶固體干燥至恒重得到12.0克雷帕霉素(91.2%純度，回收率66.4%)。濃縮甲基叔丁基醚過(guò)濾液及洗滌液得到63.9克含有雷帕霉素3.63%的膠狀物。
實(shí)施例9在攪拌下，在室溫將母液濃縮液(200克，雷帕霉素含量25%)溶于800毫升甲基叔丁基醚中。攪拌下的溶液被冷卻到0～5℃，并立即用預(yù)先冷卻至0～5℃的270毫升0.65N NaOH水溶液萃取，同時(shí)保持混合物的溫度在0～5℃。(以濃縮母液的一個(gè)等分部分為基礎(chǔ)測(cè)定為使萃取最終pH值為12所需要的NaOH水溶液的數(shù)量)。
將堿水層儲(chǔ)存在0～5℃，同時(shí)用5%的氯化鈉水溶液洗滌有機(jī)層，保持混合物在0～5℃。用100毫升甲基叔丁基醚反向萃取堿水萃取液。將有機(jī)層合在一起，并用3份各200毫升的5%氯化鈉溶液洗滌(最終水洗溶液的pH值為7.4)。在25～40℃的溫度和減壓(60～130毫米汞柱)下濃縮此有機(jī)溶液。在室溫和攪拌下，在30分鐘內(nèi)緩慢向殘留物中加入80毫升環(huán)己烷，并繼續(xù)攪拌直至完成結(jié)晶(3小時(shí))。在室溫下攪拌此混合物1個(gè)多小時(shí)，將冷卻至0～5℃的混合物在攪拌下過(guò)夜。然后在燒結(jié)玻璃Buchner漏斗收集灰白色的晶狀固體。用每份40毫升的2∶3甲基叔丁基醚/環(huán)己烯混合物洗滌5次。在35～40℃和在真空烘箱中將固體干燥至恒重，得到22.7克雷帕霉素(純度為90.6%，回收率為41.4%)。濃縮過(guò)濾液和洗滌液(甲基叔丁基醚和環(huán)己烯)得到60.1克雷帕霉素含量為37.5%的油狀物。
權(quán)利要求
1.將大環(huán)內(nèi)脂與在發(fā)酵肉湯萃取液中含有所述大環(huán)內(nèi)酯的母液的濃縮液中存在的酸性、堿性和非極性中性雜質(zhì)分離的方法，它包括下列各方法以任何順序進(jìn)行的一種或幾種a.用堿的水溶液萃取所述濃縮液在與水不混溶溶劑中的溶液，基本除去所有酸性雜質(zhì)；b.用酸的水溶液萃取所述濃縮液在與水不混溶溶劑中的溶液，基本除去所有堿性雜質(zhì)；c.用非芳香烴溶劑處理所述濃縮液溶液以除去中性非極性雜質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)與第一種溶劑不混溶而能溶解大環(huán)內(nèi)酯的第二種非芳烴溶劑來(lái)萃取含有大環(huán)內(nèi)酯的發(fā)酵肉湯萃取液濃縮液或母液濃縮液在第一種溶劑中的溶液，以除去其中的中性非極性組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用足夠數(shù)量的相容大環(huán)內(nèi)酯非溶劑來(lái)處理在萃取了酸性和/或堿性組分之后的含有大環(huán)內(nèi)酯的與水不混溶溶液，以使大環(huán)內(nèi)酯在得到的混合溶劑中不溶解并因此從溶液中分離，藉此可以將大環(huán)內(nèi)酯從混合溶劑中分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將進(jìn)行了酸性和/或堿性組分的萃取之后的含有大環(huán)內(nèi)酯的水不互溶性溶液濃縮，并通過(guò)與結(jié)晶化溶劑或混合溶劑混合使殘留物結(jié)晶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將進(jìn)行了酸性和/或堿性組分的萃取之后的含有大環(huán)內(nèi)酯的水不互溶性溶液濃縮，將殘留物溶于第一種溶劑，并用與第一種溶劑不相容但可溶解大環(huán)內(nèi)酯的非芳烴第二種溶劑萃取，以除去中性非極性雜質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中先將發(fā)酵肉湯萃取液濃縮液或母液濃縮溶于第一種溶劑中，并用與所述第一種溶劑不相容的非芳烴第二種溶劑進(jìn)行萃取以除去中性非極性雜質(zhì)，然后將在第一種溶劑中的溶液進(jìn)行濃縮，將殘留物溶于與水不相容的溶劑，并用堿和/或酸性水溶液萃取以除去酸性和/或堿性雜質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中大環(huán)內(nèi)酯是三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯是雷帕霉素或其天然存在的同系物或類似物，或者是FK-506或其天然存在的同系物或類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯是雷帕霉素，32-去甲雷帕霉素或15-脫氧雷帕霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯是雷帕霉素。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯是FK-506。
全文摘要
本發(fā)明涉及從發(fā)酵肉湯萃取液濃縮液或母液濃縮中回收大環(huán)內(nèi)酯抗菌素，特別是如雷帕霉素之類的三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的方法，按照此方法使用從所述濃縮液在與水不相容溶液中進(jìn)行堿或酸水溶液的萃取以除去在發(fā)酵工藝中形成的酸性或堿性組分，通過(guò)選擇性溶解度將非極性組分與大環(huán)內(nèi)酯分離。
文檔編號(hào)C12P19/44GK1109058SQ9411374
公開(kāi)日1995年9月27日 申請(qǐng)日期1994年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月5日
發(fā)明者C·格列特索斯 申請(qǐng)人:美國(guó)家用產(chǎn)品公司