專利名稱：引發(fā)抗n-羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂免疫反應(yīng)的疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的活性特異性免疫治療領(lǐng)域，其中提供了用于產(chǎn)生或增加抗N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂，特別是抗N—羥乙酰GM3(NGcGM3)之抗體免疫反應(yīng)的、可用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗組合物。
神經(jīng)節(jié)苷脂是含有唾液酸并在所有哺乳動物細胞膜中表達的鞘糖脂。它們包含糖極性部分和疏水N—脂酰鞘氨醇(鞘氨醇和長鏈脂肪酸)。
這些化合物插入到脂質(zhì)雙層中，使留下寡糖鏈的外細胞膜暴露于外部環(huán)境。
神經(jīng)節(jié)苷脂表達隨著細胞分化階段和生長方式的不同而變化。在致癌轉(zhuǎn)化期間發(fā)生的分化和去分化與神經(jīng)節(jié)苷脂分布的改變有關(guān)。
此外，哺乳動物組織中某些神經(jīng)節(jié)苷脂的表達是受到種的限制的。這些神經(jīng)節(jié)苷脂(稱為嗜異物)含有N—羥乙酰神經(jīng)氨酸，并存在于除人和雞以外的大多數(shù)種中(小鼠、大鼠、狗、馬、豬等)。
N—羥乙酰化神經(jīng)節(jié)苷脂的這種“非自身”特征對于這些化合物在人體內(nèi)的免疫原性具有很重要的影響。這一事實是在20年代由Hanganatziu和Deicher(H—D)間接地觀察到的，當時曾普通使用馬血清治療某些疾病。
這些病人發(fā)生了稱為血清病的疾病。顯示他們的血清可與馬抗血清的成分及不同種的紅細胞發(fā)生反應(yīng)。
后來作為馬紅細胞神經(jīng)節(jié)苷脂提取了這些H—D抗原并將它們的主要抗原決定基限定為NGcNAd(2→3)Galβ(1→4)Glc(1→R)。
用培養(yǎng)的人腫瘤細胞和H—D抗血清進行的實驗證明，在一組人腫瘤中存在這些抗原。因此，看來似乎已發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性抗原。
最近使用借助疏水或共價鍵與其他載體，如腦膜炎雙球菌的OMPC(外膜蛋白質(zhì)復(fù)合物)偶聯(lián)的GD3進行的小鼠體內(nèi)免疫原性實驗，并沒有成功地改善抗神經(jīng)節(jié)苷脂之抗體反應(yīng)的性質(zhì)。
GD3的“自身”抗原特性，可能是以與T細胞依賴性抗原相似的特征阻礙免疫反應(yīng)的主要原因(Livingston et al.，(1993)Vaccinell，1199—1204)。
了解了嗜異抗原之免疫原性的優(yōu)點和其在乳腺腫瘤中的表達后，推測以N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂為基礎(chǔ)的治療疫苗在人乳腺癌的治療中可能是有效的。
鑒定適當?shù)目乖瓉碓磳τ谝呙玳_發(fā)是很重要的。尚未描述具有這種特性的天然來源的N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂。
另一方面，已報導(dǎo)了N—羥乙酰化神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的總體合成(Ogawa et al.，美國專利4,950,750號)。但這種代用品作為疫苗的抗原來源使用是有問題的，即所得到的抗神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的抗體一般都不識別原有的神經(jīng)節(jié)苷脂。
然而，本發(fā)明提供了一種適用的天然抗原來源。GN3和NGcGM3是用于工業(yè)化生產(chǎn)mAbs的雜交瘤細胞中的主要神經(jīng)節(jié)苷脂，這對于治療疫苗的可行性是一個重要事實。
在結(jié)合的疫苗中使用單克隆抗體作為蛋白質(zhì)載體在以前幾乎是沒有的，而且在腫瘤治療疫苗中也未曾使用，然而使用它們作載體卻具有免疫定靶和激活宿主免疫系統(tǒng)的優(yōu)點。
本發(fā)明提供了刺激或增強抗N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂免疫抗體反應(yīng)的疫苗組合物。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防或治療腫瘤的疫苗組合物，其含有與適當?shù)妮d體偶聯(lián)的(通過疏水或共價鍵)，有效量的純N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂，主要是NGcGM3和/或其衍生物和/或其相應(yīng)的寡糖，并含有例如可以是天然來源的佐劑或單克隆抗體(mAb)。
后來使用無牛血清培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)實驗，并借助氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測腫瘤活組織之神經(jīng)節(jié)苷脂提取物中與脂質(zhì)結(jié)合的NGcNA的存在，結(jié)果顯示所研究的樣品中N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂的水平低于總唾液酸的0.05％(Furukawa et al.，(1988)J.Biol.Chem，263，18507)。
從上述結(jié)果可以看出，N—羥乙酰化神經(jīng)節(jié)苷脂作為腫瘤免疫治療的靶沒有實際價值。
然而本發(fā)明中顯示，乳腺癌似乎是一個例外。N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂是以相對大的量存在的(古巴專利申請131/93號)。
已在腫瘤，主要神經(jīng)外胚層衍生的腫瘤治療探索中使用腫瘤相關(guān)神經(jīng)節(jié)苷脂作為靶(Gangliosides and Cancer，Ed.H.F.Oettgen(1989).P.7)。
這些手段總地是基于兩個原則用特異性mAb進行被動免疫治療和用所提到的神經(jīng)節(jié)苷脂進行主動免疫治療。
已用吸附到BCG上的GM2神經(jīng)節(jié)苷脂對患黑素瘤病人進行了免疫接種。檢測這些病人體內(nèi)的IgM和IgG同型抗GM2抗體的存在。顯示有較高滴度的病人更加延遲了腫瘤復(fù)發(fā)時間達15個月(Livingston.et al.，(1989)Cancer Res.49,7045—7050)。
此外，已在患黑素瘤病人身上進行了一期臨床試驗。用單獨的或包裹在脂質(zhì)體中的得自原發(fā)腫瘤細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂混合物免疫，顯示有低抗體滴度的抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、GD3、GM2和9—O—乙酰GD3的IgG同型抗體。
該抗體反應(yīng)持續(xù)時間短，而且不能通過重復(fù)免疫得以保持或增加。但有免疫反應(yīng)的病人再次顯示有顯著意義的延遲復(fù)發(fā)(Por-toukalain et al.(1991)，Int.J.Cancer 49，893—899)。
為了改善抗神經(jīng)節(jié)苷脂免疫反應(yīng)，已開始使用蛋白質(zhì)—GM2神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合物，特別是KLH—GM2對黑素瘤病人進行臨床試用。
迄今所得到的結(jié)果表明產(chǎn)生了較高滴度的LgM抗體，并且存在有效應(yīng)物性質(zhì)的特異性IgG抗體，但該免疫反應(yīng)不是典型的T細胞依賴性抗原次級反應(yīng)(Livingston 1993，Proceedings of the Conference“Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines”，The N.Y.Acadenyof Science；abst.24)。
本發(fā)明的另一個目的是使用用于工業(yè)生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤生物量作為神經(jīng)節(jié)苷脂的適當生物學(xué)來源。
本發(fā)明的一個重要方面在于從工業(yè)化生產(chǎn)mAb的雜交瘤生物量得到羥乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂。特別是可按這種方法得到存在于乳腺癌中的抗原NGcGM3。借助疏水結(jié)合或共價結(jié)合載體蛋白質(zhì)，特別是mAb將該神經(jīng)節(jié)苷脂和/或其衍生物和/或其相應(yīng)寡糖偶聯(lián)到適當?shù)妮d體上。
1.從雜交瘤生物量得到神經(jīng)節(jié)苷脂使用改動的Hakomori氏方法(HaKomori et al，(1974)Methodsin Enzymology，Vol.32，PartB，350)處理得自發(fā)酵罐中生產(chǎn)mAb的雜交瘤生物量。
加2—5升甲醇后勻漿處理經(jīng)過濾培養(yǎng)基所得到的生物量(0.5—1kg)。再加2—5升甲醇后于回流下提取5至20小時。
加熱過濾提取物，并在—20℃和—70℃之間的溫度下將所得到的透明液放置48小時。
4℃下離心回收沉淀物，并進行中度堿處理(0.2NNaOH—MeO-H，37℃處理1至7小時)。
然后用HCl—MeOH 0.2N中和并在40℃以下的溫度下濃縮至干。
于4℃對碳酸鹽緩沖液(pH7)徹底透析脫鹽，然后凍干。
在DEAE Sephadex A25(Pharmacia Sweden)中經(jīng)離子交換層析得到單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂部分。用在MeOH中的0.02M NaAC洗脫Ac形式產(chǎn)物(基質(zhì)體積/所用樣品1mL DEAE Sephadex/0.1—1μmolNANA)。
于4℃透析脫鹽后，凍干該部分。
用裝有硅膠60(230—400目，Merck，Germany)的吸附層析柱純化神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和NGcGM3。
平衡含有10至409硅膠的柱并用CCl3H∶MeOH∶NH32.5M(v/v)65∶25∶4洗脫。
混合單獨含有GM3和NGcGM3的部分并干燥之。
使用10×20cm硅膠60平板(Merck，Germany)，以HPTLC法進行柱監(jiān)測，其中使用的溶劑系統(tǒng)為在0.25％KCl中的CCl3H∶MeOH∶NH32.5M(50∶40∶10)，且使用間苯二酚試劑染色(Sven-nerholm L.；Biochem.Biophys.Acta 24(1957)，604—611)。
還使用間苯二酚法對神經(jīng)節(jié)苷脂進行定量。所得GM3和NGcGM3的量在20—60mg之間。
2.疫苗免疫原的構(gòu)成作為免疫原制劑的抗原，可使用下列任何一種存在于腫瘤中的N—羥乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂；用不同的間隔基在其還原末端進行了適當修飾，從而有利于它們接近免疫系統(tǒng)之不同成分的它們的寡糖；或者經(jīng)在N—脂酰鞘氨醇中摻入功能性基團(氨基、羧基或醛基團)而進行修飾，從而使之與載體蛋白質(zhì)共價結(jié)合的這些神經(jīng)節(jié)苷脂的衍生物。
可使用任何生理上耐受的蛋白質(zhì)作為載體蛋白質(zhì)。它們應(yīng)攜帶游離氨基和羧基基團，以允許使用任何常規(guī)結(jié)合方法(SPDP、碳化二亞胺、還原性胺化等)共價結(jié)合到上述抗原上。
鼠類單克隆抗體或不同細菌，如腦膜炎雙球菌的外膜蛋白質(zhì)可以是適當?shù)妮d體蛋白質(zhì)。
對于那些有已知一級氨基酸序列的蛋白質(zhì)，可使用預(yù)測輔助T細胞抗原決定基的數(shù)學(xué)規(guī)則系統(tǒng)選擇適當?shù)慕Y(jié)合方法。這樣，即能避免因偶聯(lián)抗原而產(chǎn)生的這些抗原決定基的可能換壞。在本申請中，發(fā)明人使用了Margalit等人(J.Immunol.138，2213—2219，1987)描述的規(guī)則系統(tǒng)。
使用天然神經(jīng)節(jié)苷脂作為腦膜炎雙球菌外膜蛋白質(zhì)復(fù)合物所適合的蛋白脂質(zhì)體的成分。制備這種類型的免疫原需要使用脫氧膽酸鈉(0.1—1％)或十二烷基硫酸鈉(0.1—1％)或Brij96(0.1—1％)預(yù)先分散腦膜炎雙球菌的蛋白脂質(zhì)體。
在超聲浴中分散10—30分鐘，然后加入含5至20倍過量神經(jīng)節(jié)苷脂(或使之成為多價疫苗的神經(jīng)節(jié)苷脂)的溶液。將所得分散液再次超聲處理5—20分鐘，并在室溫下放置30分鐘。最后進行透析直到?jīng)]有去污劑。
本發(fā)明的免疫原制劑的最有效的配方中每個蛋白質(zhì)質(zhì)量單位含有2至5個神經(jīng)節(jié)苷脂質(zhì)量單位。最有效的神經(jīng)節(jié)苷脂劑量單位含10—400μg神經(jīng)節(jié)苷脂。
在構(gòu)成結(jié)合的免疫原(共價結(jié)合到載體蛋白質(zhì)上的抗原)時，可使用神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖或結(jié)構(gòu)上修飾的神經(jīng)節(jié)苷脂。
當使用神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖作為免疫原時，必須加入一個間隔臂以增大距離，從而避免折曲性并使之更易于接近免疫系統(tǒng)。
作為間隔基試劑，可使用在鏈的一端含有一個游離氨基，另一端含有羧基或氨基的脂族化合物(3至10個碳原子)。
最好使用氰基氫硼化鈉作為還原劑，經(jīng)還原性胺化反應(yīng)進行糖與間隔基試劑的偶聯(lián)(Stoll M.S.et al，Biochem.J.256，661—664，1988)。
典型的反應(yīng)條件是寡糖(5—25μmol)，間隔臂(250—1250μmol)，氰基氫硼化鈉(5—25mg)，反應(yīng)溫度(40—70℃)，反應(yīng)時間(24—72小時)。
然后以相對于寡糖量3—5倍的摩爾過量，在室溫下反應(yīng)6—10小時，使如此得到的胺化寡糖偶聯(lián)到3—(2—吡啶基二硫代)丙酸N—琥珀酰亞氨酯(SPDP，Carlsson J.，Biochem.J.173，723—737，1978)上。
然后有必要使用相對于寡糖量的3—5摩爾過量在室溫下反應(yīng)4—12小時，將載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)到SPDP上。
在室溫下，用10—50mM二硫蘇糖醇溶液將SPDP—蛋白質(zhì)復(fù)合物還原1—5小時。最后進行胺化寡糖—SPDP和還原的蛋白質(zhì)—SPDP復(fù)合物間的偶聯(lián)，反應(yīng)中使用的糖是相對于蛋白質(zhì)中游離氨基數(shù)目2—5倍摩爾過量的。反應(yīng)在室溫下進行24—72小時。
在這些條件下，有10—100摩爾的寡糖(或其質(zhì)量上的等同物)被偶聯(lián)到載體蛋白質(zhì)上。
構(gòu)成將用于多價疫苗中之免疫原的另一個途徑包括以前描述過的兩種方法形成其中一個或多個神經(jīng)節(jié)苷脂被非共價結(jié)合的蛋白脂質(zhì)體，以及共價結(jié)合一個其上面已偶聯(lián)了間隔臂的來自神經(jīng)節(jié)苷脂的寡糖。
下列實施例舉例說明本發(fā)明實施例1.從雜交瘤生物量中分離GM3和NGcM3使用改動的Hakomori氏方法(Hakomori et al.，(1974)，Methodsin Enzymology.Vol.32，PartB，350)加工從生產(chǎn)單克隆抗體ior t3的發(fā)酵罐得到的雜交瘤生物量(CIMAB S.A.，Cuba)。
作用勻漿器，與甲醇(2.5L)一起勻漿經(jīng)過濾培養(yǎng)基得到的雜交瘤生物量(500g)。再次加入乙醇(2.5L)并在回流下提取10小時。加熱過濾提取物并在-20℃下將所得透明液體放置2天。
4℃離心回收沉淀物并對其進行中度堿處理(0.2N NaOH/MeO-H，37℃，2小時)。用0.2N HCl中和后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，并在4℃下對碳酸鹽緩沖液(pH7.0)廣泛透析使固體物脫鹽。將經(jīng)過透析的產(chǎn)物冷凍干燥。
在DEAE Sephadex A—25(Ac-)中進行離子交換層析，用NaAc0.02M(在MeOH中)洗脫得到單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂部分。透析脫鹽后凍干該部分，重新溶解在CCl2H∶MeOH∶NH32.5M(65∶25∶4)中并加于35克硅膠60柱上。
用CCl2H∶MeOH∶NH32.5M(65∶25∶4)的混合物洗柱，得到相應(yīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂部分。
混合單獨含GM3和NGcGM3的部分并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥之。
在硅膠60平板上用高效薄層層析法(HPTLC)檢測硅膠分離的不同部分中的神經(jīng)節(jié)苷脂含量，其中使用CCl3H/MeOH/NH3(50∶40∶10；2.5M，在0.25％KCl中)溶劑系統(tǒng)并用間苯二酚染色。
GM3的產(chǎn)率為30mg，NGcGM3的產(chǎn)率為25mg。
實施例2基于使神經(jīng)節(jié)苷脂NGcGM3非共價偶聯(lián)到腦膜炎雙球菌外膜蛋白質(zhì)復(fù)合物(OMPC)上得到免疫原使用由“Carlos J.Finlay”研究所提供的腦膜炎雙球菌的OMPC(C.Campa et al.，EP 301992)。
在超聲浴中，將10mg OMPC在0.3％脫氧膽酸鈉的溶液中分散10分鐘。然后，加入含20mg NGcGM3的溶液。再次將所得分散液超聲幅射5分鐘，并將其放置30分鐘。
使用100KD膜透析5天，從去污劑中分離出可溶性復(fù)合物OM-PC—NGcGM3。
對蛋白質(zhì)使用Bio—Rad試劑，對唾液酸使用間苯二酚，檢測神經(jīng)節(jié)苷脂摻入蛋白質(zhì)中的程度。
結(jié)果測得每毫克OMPC中摻入2mg NGcGM3。
實施例3基于將NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的寡糖成分共價結(jié)合到P3鼠類mAb上得到免疫原(新糖蛋白)a)NGcGM3寡糖成分(NGcGM3OS)的分離。
借助超聲波粉碎器將10mg NGcGM3溶解在4mL MeOH中并用臭氧處理(Wiegandt H.and Baschang G.Z.Natarforsch.，20b164—166，1965)10分鐘。
將此溶液蒸發(fā)至干并經(jīng)過夜攪拌將殘留物分散于10mL Na2CO3(0.1M)中，然后用DOWEX50W—X8中和并通過燒結(jié)的玻璃漏斗過濾。
用HCCl3提取所得溶液，用HPTLC分析水相以確定反應(yīng)是否完成。
從應(yīng)用角度，進一步根據(jù)陽性間苯二酚染色結(jié)果證實寡糖的存在。
最后在Sephadex G—25柱上純化NGcGM3OS，并用HAc 0.1M洗脫。
根據(jù)H1核磁共振和質(zhì)譜(FAB譜)分析結(jié)果確定NGcGM3OS的結(jié)構(gòu)。
b)NGcGM3OS的反應(yīng)性胺化。
將10μmol NGcGM3OS溶解在5mL含500μmol 1，8—二胺3，6—二氧代辛烷的甲醇中，用氬氣清洗并于50℃反應(yīng)2小時，然后加入10mg NaBH3CN并于50℃繼續(xù)反應(yīng)40小時。
在氬氣環(huán)境下干燥反應(yīng)混合物并加入AcH以除掉過量的NaB-H3CH。
使修飾的寡糖在Biogel P—2柱上脫鹽并在CM—纖維素柱上純化之(Zopt et al.，Methods Enzymol.50171—175，1978)。
使用硅膠60平板以HPTLC法鑒定胺化的衍生物，其中使用吡啶—乙酸乙酯—乙酸—水(6∶3∶1∶3)或氯仿—甲醇—0.2％氯化鈣(60∶35∶8)作為溶劑并用苔黑酚或間苯二酚試劑進行檢測。
c)胺化NGcGM3OS與偶聯(lián)劑3—(2—吡啶基二硫代)丙酸N—琥珀酰亞氨酯(SPDP)的反應(yīng)。
將10μmol寡糖溶解在磷酸鹽緩沖溶液100mM、NaCl 0.1M(pH7.5)中，然后加入30—50μmol SPDP并在室溫下反應(yīng)6小時。
使用Biogel P2柱純化所得到的衍生物。
使用步驟b中所述的同樣平板、溶劑和檢測系統(tǒng)，以HPTLC法鑒定所得到的衍生物。
d)單克隆抗體P3與SPDP的反應(yīng)。
將10mg P3單克隆抗體—以高特異性識別結(jié)合到脂質(zhì)上之N—羥乙酰神經(jīng)氨酸的IgM mAb—在室溫下溶解在磷酸鹽緩沖溶液100mM，NaCl 0.1M(pH7.5)中。向該溶液中加入5mg SPDP并持續(xù)反應(yīng)8小時。在Sephadex G—50柱上分離并用磷酸鹽緩沖溶液0.1M(pH6)5mM EDTA洗脫P3—SPDP。
混合含蛋白質(zhì)的部分并用于下列步驟。
e)用二硫蘇糖醇還原P3—SPDP衍生物。
為了還原新產(chǎn)生的二硫橋鍵，加入溶于磷酸鹽緩中溶液0.1M(pH6)、5mM EDTA中的25mM二硫蘇糖醇，并在室溫下反應(yīng)2小時。
在使用上述同樣溶液洗脫的Sephadex G—50柱上分離所得到的衍生物。
基于在分光光度計中檢測343nm波長處的消光增加并應(yīng)用朗伯—比爾定律(Lamberb—Beer Law)，計算偶聯(lián)過程中所形成的游離硫代吡啶，以估計與P3偶聯(lián)的SPDP的摩爾數(shù)。所用硫代吡啶的摩爾消光系數(shù)為7.06×10-9×M-1×cm-1。
f)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的糖。
使步驟C中得到的糖類衍生物與步驟e中得到的蛋白質(zhì)反應(yīng)48小時。
使用Sephadex G—50柱從反應(yīng)產(chǎn)物中分離所得到的新糖蛋白。
使用針對糖的間苯二酚試劑和針對蛋白質(zhì)的Bio—Rad試劑，經(jīng)計算唾液酸含量估測與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的糖的量。
在這些條件下每摩爾P3得到25摩爾NGcGM3OS。
還在非還原條件下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)，然后進行Western印跡分析并與抗神經(jīng)節(jié)苷脂特異性mAb反應(yīng)，以研究與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的糖。
實施例4使用預(yù)先用神經(jīng)節(jié)苷脂NGcGM3溶解，然后共價偶聯(lián)到NGcGM3OS上的腦膜炎雙球菌OMPC得到免疫原(新糖蛋白)a)溶解OMPC。
OMPC的溶解是按實施例2的方法完成的。
b)將NGcGM3OS偶聯(lián)到OMPC—NGcGM3可溶性復(fù)合物上。
按實施例3的步驟a中所述方法得到寡糖NGcGM3OS，按實施例3的步驟b中所述方法進行還原性胺化，并按實施例3的步驟C中所述方法偶聯(lián)到SPDP上。
同時，按實施例3的步驟d中所述方法將可溶性蛋白質(zhì)復(fù)合物OMPC—NGcGM3偶聯(lián)到SPDP試劑上，按實施例3的步驟e中所述方法用二硫蘇糖醇還原，最后按實施例3的步驟e中所述方法偶聯(lián)到適當?shù)奶巧稀?br> 各步驟中所用試劑的量和反應(yīng)條件均與實施例3中所規(guī)定者相同。
用于鑒定不同NGcGM3衍生物之性質(zhì)的分析方法，以及用于鑒定OMPC和其衍生物之性質(zhì)的分析方法，均與實施例3中所述者相同。
所達到的摻入程度的每毫克OMPC蛋白脂質(zhì)體摻入1mgNGcGM3OS。
實施例5疫苗組合物的免疫學(xué)性質(zhì)免疫接種雞用上述不同形式的疫苗組合物免疫雞并研究所獲得的特異性體液免疫反應(yīng)。
使用一組在一個月期間每周用1mg NGcGM3(在0.6mL PBS中，加完全弗氏佐劑)免疫的雞作為參照。
第4次免疫接種后兩周進行加強免疫并于4天后給動物放血。
用各疫苗制劑處理的各組雞均使用同樣的免疫程序。
使用神經(jīng)節(jié)苷脂NGcGM3作為抗原，以ELISA法和TLC免疫染色法評估免疫反應(yīng)。
就預(yù)免疫血清來說，所有用疫苗制劑免疫的各組雞均可見抗NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂特異性抗體水平的增加。
對照組也顯示出抗體反應(yīng)增加，但是為IgM型抗體的增加；而疫苗制備則在大多數(shù)被免疫動物體內(nèi)始終顯示為特異性IgG反應(yīng)。
實施例6乳腺腫瘤中表達的神經(jīng)節(jié)苷脂手術(shù)期間得到10個乳腺腫瘤活體組織。對樣品進行組織學(xué)分類并儲存于-70℃下備用。
按照下述方法處理這些腫瘤向濕的并已稱重的腫瘤中加入3倍體積的蒸餾水，然后在冷環(huán)境(4℃)下勻漿。
用Lowry方法檢測勻漿樣品中的總蛋白質(zhì)含量。向剩余部分的各樣品中加5倍體積CCl3H—CH3OH(2∶1)的混合物并于37℃下攪拌1小時。然后加入CH3OH將CCl3H∶CH3OH的比例調(diào)到1∶1并重復(fù)上述提取步驟。離心最后的混合物，分離上清液。
再次于37℃用CCl3H∶CH3OH∶H2O(1∶2∶0.8)的混合物將所得沉淀物攪拌提取2小時。再次離心分離上清液。
混合兩部分上清液，并濃縮至干得到各腫瘤總脂質(zhì)的混合物。
將溶解于5mL CCl3H∶CH3OH(9∶1)中的總脂質(zhì)的混合物加于苯基Sepharose柱(2mL)上。用3倍體積的同一溶劑混合物洗柱，再用CCl3H∶CH3OH(85∶15)洗柱。
然后用5倍體積CCl3H∶CH3OH(1∶1)和5倍體積CH3OH洗脫神經(jīng)節(jié)苷脂。
按Sonnino等人(Anal.Biochem.128(1983)，104—114)所述方法，用HPTLC和2d—HPTLC法研究腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂混合物的各個樣品。用密度檢測法估計主要神經(jīng)節(jié)苷脂的相對量。
所得結(jié)果表明乳腺腫瘤中主要神經(jīng)節(jié)苷脂是GM3(平均值356.4ng/mg蛋白質(zhì))和GD3(平均值133.1ng/mg蛋白質(zhì))，其次是GD1a和GT1b。
正常乳腺組織中GM3和GD3的表達量平均值(分別為183.5和48.6ng/mg蛋白質(zhì))低于乳腺腫瘤組織中GM3和GD3的表達量。
為了鑒定小乳腺腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂的性質(zhì)，還對集中的總質(zhì)量83克的腫瘤組織進行了研究。
按前述方法處理并提取該腫瘤塊。
在DEAE Toyopearl柱中對神經(jīng)節(jié)苷脂的總混合物進行離子交換層析，并再次對總酸性部分進行Q—Sepharose柱層析，從梯度洗脫系統(tǒng)得到9管洗脫物。以結(jié)合有FAB—MS的2d—HPTLC法進行層析分析，并用對O—乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂特異的單克隆抗體進行TLC免疫染色分析，以檢測所研究的樣品中OAcGD3和OAcGT3的存在。
還有可能檢測乳腺腫瘤的神經(jīng)節(jié)苷脂混合物中與NGcGM3有相同Rf的帶的存在。用可與H—D抗原反應(yīng)的抗體進行的TLC免疫染色分析結(jié)果表明還存在另外2種羥乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂。
用H—D和抗OAc神經(jīng)節(jié)苷脂對得自10個個體之腫瘤的神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物進行TLC免疫染色分析。結(jié)果示于表1中。
用4個腫瘤組織研究了乳腺腫瘤中不同類型脂結(jié)合之唾液酸的相對量。
為此目的，將各神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物置于0.5％HCl/MeOH，于100℃甲醇解2小時。
在N2氣氛下干燥樣品，并加入0.5μg苯基—α—N—乙酰氨基葡糖苷作為內(nèi)部標準品。然后在乙酸酐∶吡啶混合物(1∶1)中100℃反應(yīng)30分鐘，使樣品乙?；?。
加MeOH蒸發(fā)除去過量乙酸酐后，將樣品溶解在CCl3H中并在配有OV—17柱(0.25mm×5m)的Jeol DX—304裝置中使用電子沖擊模型對樣品進行GC/MS分析。
柱溫度為228℃，噴射器溫度為260℃。所用載體氣體是流速為0.5mL/分的He。結(jié)果示于表II中。
表I.在從人乳腺腫瘤中分離的總神經(jīng)節(jié)苷脂部分中存在的H-D抗原
注(a)用H—D抗體進行TLC免疫染色。
(b)7305、3735、3782等是個別的人乳腺腫瘤樣品。
(c)NGNAN—羥乙酰神經(jīng)氨酸(N—羥乙酰的)。
(d)U1和U2未知的N—羥乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂(N—羥乙?；?。
(e)+，低活性；+++，中活性；++++，高活性；-，無活性。
表II.唾液酸種類(組分)的分析
注(a)3849、3464、3931、3806為個別腫瘤樣品(見表1)。
(b)NANAN-乙酰神經(jīng)氨酸。
NGNAN-羥乙酰神經(jīng)氨酸。
O-Ac NANAO-乙酰N-乙酰神經(jīng)氨酸。
(c)數(shù)值為總脂結(jié)合的唾液酸的百分數(shù)。
權(quán)利要求
1.刺激或增強抗N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂之抗體免疫反應(yīng)的疫苗組合物，其包含根據(jù)不同情況非共價或共價偶聯(lián)到適當?shù)鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物載體上的適當量的N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂和/或其衍生物和/或其相應(yīng)的寡糖，并另外含有任何適當?shù)淖魟?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂是N—羥乙酰GM3(NGcGM3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的疫苗組合物，其特征在于NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂和/或其衍生物和/或NGcGM3寡糖的有效量為10至400μg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1—3之任一項的疫苗組合物，其具有腦膜炎雙球菌的外膜蛋白質(zhì)復(fù)合物(OMPC)作為所說的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1—4之任一項的疫苗組合物，其特征在于，用N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂溶解腦膜炎雙球菌的OMPC，然后使用間隔臂，借助共價鍵將其偶聯(lián)到N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂寡糖上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和2的疫苗組合物，其特征在于具有作為載體蛋白質(zhì)的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗組合物，其特征在于使用間隔臂以共價鍵將單克隆抗體偶聯(lián)到N—羥乙酰化神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖上。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7之任一項的疫苗組合物，其特征在于間隔臂是含3—10個碳原子的飽和或未飽和的二胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求4和5的疫苗組合物，特征在于佐劑是天然來源的或單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，特征在于天然佐劑是由鋁鹽構(gòu)成的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，特征在于單克隆抗體是P3。
12.根據(jù)權(quán)利要求6至8之任一項的疫苗組合物，特征在于佐劑是天然來源的或單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物，特征在于天然佐劑是QS21或DETOX。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物，特征在于天然佐劑是鋁鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于另外還含有純化的GM3神經(jīng)節(jié)苷脂和/或所說神經(jīng)節(jié)苷脂的衍生物和/或相應(yīng)的寡糖。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于還另外含有純化的GD3神經(jīng)節(jié)苷脂和/或所說神經(jīng)節(jié)苷脂的衍生物和/或相應(yīng)的寡糖。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項的疫苗組合物，其中神經(jīng)節(jié)苷脂是從生物來源純化的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的疫苗組合物，特征在于生物來源是用于工業(yè)生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤生物量。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項的疫苗組合物用于預(yù)防和治療腫瘤。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗組合物用于預(yù)防和治療乳腺腫瘤。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗組合物用于刺激或增強抗GM3神經(jīng)節(jié)苷脂、其衍生物和/或相應(yīng)寡糖的免疫反應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的疫苗組合物用于刺激或增強抗GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、其衍生物和/或相應(yīng)寡糖的免疫反應(yīng)。
23.治療乳腺腫瘤的方法，包括給哺乳動物服用有效量的含有N—羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂或其寡糖或其衍生物以及適當佐劑的疫苗。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中神經(jīng)節(jié)苷脂是N—羥乙?！狦M3。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中每個劑量單位給藥10至400μg神經(jīng)節(jié)苷脂。
26.生產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂的方法，其包括下列步驟a)培養(yǎng)雜交瘤，b)分離雜交瘤生物量，c)提取和/或分離神經(jīng)節(jié)苷脂部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤的活性特異性免疫治療領(lǐng)域，其中提供了用于產(chǎn)生或增加抗N-羥乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂，特別是抗N-羥乙酰GM3(NG
文檔編號C12P19/26GK1122247SQ9411350
公開日1996年5月15日 申請日期1994年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月29日
發(fā)明者R·P·勞里古茲, L·E·F·莫里納, G·M·勞里古茲, A·C·潑列茲, O·G·V·荷南德茲 申請人:分子免疫中心