專利名稱：家畜口蹄疫病素多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬遺傳工程領(lǐng)域。
家畜口蹄疫病毒是世界烈性家畜傳染病，可感染多種偶蹄類家畜，尤其對(duì)豬和牛的感染嚴(yán)重。家畜一旦染上此病，很快蔓延傳染，病勢(shì)發(fā)展甚快。目前抗口蹄疫病毒疫苗的傳統(tǒng)制備方法是采用組織培養(yǎng)法繁殖口蹄疫病毒，然后將病毒滅活成為死疫苗。另一種方法是通過(guò)各種減毒方法制得弱毒疫苗。這兩種疫苗雖然都有較好的免疫能力，但是制備的安全性很差，因?yàn)樵谒鼈兊纳a(chǎn)過(guò)程中需培養(yǎng)大量病毒，而該種病毒是空氣傳染，生產(chǎn)過(guò)程中與病毒接觸過(guò)的任何工具或器皿都有散毒的危險(xiǎn)。而且傳統(tǒng)的滅活疫苗與病毒弱毒疫苗一旦滅活或減毒不完全，甚至自然突變都可能有極少量病毒顆粒，它們?nèi)匀挥懈腥局虏〉哪芰ΑＴ诖笠?guī)模對(duì)動(dòng)物的免疫過(guò)程中，可能會(huì)導(dǎo)致極少量被免疫動(dòng)物發(fā)病而成為疾病大規(guī)模流行的病原中心與媒介。雖然目前采用基因重組方法，制備大量使用安全的抗原，但是如克隆VP1蛋白的基因制備的抗原免疫原性不強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效果尚不理想。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種能有效預(yù)防家畜口蹄疫病毒的、安全可靠的疫苗及其制備方法。
本發(fā)明是一種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗，是編碼口蹄疫病毒毒株VP1蛋白中有免疫原性的包含有20個(gè)氨基酸和14個(gè)氨基酸的DNA序列，該多肽疫苗是20個(gè)氨基酸和14個(gè)氨基酸的DNA序列串聯(lián)成的編碼20肽-14肽-20肽的基因，是三個(gè)免疫原性的肽段基因，介于其間的DNA連接序列共編碼13個(gè)氨基酸，它的核苷酸序列是AATTCATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTAGTACCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCATGAACGAGTCTTTCAACGAGCATCTCTGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGTAGCTCCAGTAAAACAGACTCTACAATGAGACGGTGGGCCCGCAGTGTTTGTCTTTTAGCATCGAGGTCATTTTGTCTGAGATGTTA
TCGAGCTCGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACAGCTCGAGCTTAAGTACCATGGGAGCTCCCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCATGTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCATGAGAACGAGTCTTTCAACGAGCATGAGACGGTACTCCTAG該基因從5'端到3'端之間有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，如EcoRI，KpnI，PstI，SmaI，SacI，EcoRI，KpnI，XhoI，KpnI，PstI，BamHI。該基因插入質(zhì)粒載體的β-半乳糖苷酶基因末端的EcoRI和BamHI兩個(gè)切點(diǎn)之間，如果插入質(zhì)粒載體pWR590，則在EcoRI的5'端有來(lái)自pWR590的SacI切點(diǎn)，在BamHI的3'端還有來(lái)自pWR590的XbaI，SalI，PstI，HindIII切點(diǎn)。
根據(jù)基因插入質(zhì)粒載體的大小，得到疫苗蛋白的分子量為30-140KDa。
這種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗的制備方法包括基因重組，重組融合蛋白的制備。先用常規(guī)化學(xué)合成方法合成編碼141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的小肽基因，將其串聯(lián)，加入13個(gè)氨基酸連接核苷酸序列，再與質(zhì)粒載體的大分子β-半乳糖苷酶基因末端連接，或者與乙肝病毒核心抗原基因連接，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌表達(dá)，將細(xì)菌表達(dá)的菌株置于營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度30-37℃，發(fā)酵時(shí)間9-24小時(shí)，發(fā)酵液中加入濃度為50-100ug/ml的氨芐青霉素和IPTG，發(fā)酵完畢經(jīng)過(guò)離心，粉碎細(xì)胞，再離心即可。用常規(guī)的化學(xué)合成方法合成編碼為141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的小肽基因。將這兩個(gè)DNA片段串聯(lián)成為編碼20肽-14肽-20肽的基因，然后插入質(zhì)粒載體的β-半乳糖苷酶基因。插入的質(zhì)粒載體可以是pWR590，也可以是pUC系列質(zhì)粒。具體操作同實(shí)施例。將重組融合蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)菌表達(dá)，轉(zhuǎn)入的細(xì)菌可以是大腸桿菌，或枯草桿菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，得到的白色沉淀即為重組融合蛋白。將該融合蛋白懸浮于尿素溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，證明融合蛋白占50%。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例。
用化學(xué)合成的基因片段為探針與轉(zhuǎn)化子原位雜交后選出的克隆子培養(yǎng)在含有50-100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30-37℃溫度下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。蛋白5mg。第一次注射后20天，再注射5mg進(jìn)行第二次免疫。第一次免疫注射后45天，用口蹄疫病毒3000ID50攻擊，保護(hù)率為100%。結(jié)果如表2表2.<
>實(shí)施例用化學(xué)方法合成編碼口蹄疫病毒的VP1蛋白中編碼141-160位氨基酸的DNA片段和編碼200-213位氨基酸的DNA片段，將上述兩個(gè)DNA片段串聯(lián)成為編碼20肽-14肽-20肽的基因，將其插入質(zhì)粒載體pWR590.先取0.5微克pWR590懸浮于TE緩沖液、用EcoRI和BamHI限制酶切點(diǎn)酶切，在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，經(jīng)酚處理和等體積酒精沉淀后，離心得到沉淀，然后懸浮于10微升水溶液中，同時(shí)加入10微升串聯(lián)基因，其DNA含量為0.2微克。兩者混合后，加入1單位T4連接酶，在15℃下保溫一夜，取200微升保存于-20℃的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，加入已進(jìn)行連接的DNA，在4℃冰浴中保持1小時(shí)，然后再加入0.5毫升LB培養(yǎng)基，在37℃中孵育，倒入帶有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37℃下一夜后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，再用化學(xué)合成的基因片段為探針進(jìn)行原位雜交后，選出克隆子。通過(guò)DNA序列分析，該克隆子中含有編碼20肽-14肽-20肽的基因，序列與設(shè)計(jì)相符。
重組融合蛋白制備時(shí)，用50毫升三角燒瓶將克隆子培養(yǎng)在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃溫度下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液，次日將種子液吸入16立升的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐中仍以LB培養(yǎng)基為培養(yǎng)液，并加入50μg/ml氨芐青霉素。發(fā)酵條件30-37℃下通氣培養(yǎng)，攪拌速度6000轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間5小時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)10小時(shí)，總共發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)后收集發(fā)酵液，以5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘收集菌體，棄去發(fā)酵液。菌體再懸浮在二倍體積的pH7.2、濃度為2-3毫升/克的濕菌體的磷酸緩沖液中，振蕩使細(xì)胞充分懸浮。用5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘收集菌體，棄去上層清液。再將菌體懸浮在破壁緩沖液中，用95瓦功率5分鐘超聲打碎細(xì)胞。超聲時(shí)注意用冰浴保持樣品在10℃以下。超聲打碎后在5000轉(zhuǎn)/分速度下離心20分鐘，去除上層清液，即得到白色沉淀的重組融合蛋白。將該融合蛋白懸浮于2M尿素溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，其融合蛋白含量占50%。
權(quán)利要求
1.一種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗，是口蹄疫病毒毒株編碼VP1蛋白中有免疫原性的包含有20個(gè)氨基酸和14個(gè)氨基酸的DNA序列，其特征在于該多肽疫苗是20個(gè)氨基酸和14個(gè)氨基酸的DNA序列串聯(lián)成的編碼20肽-14肽-20肽基因，其間的DNA連接序列共編碼13個(gè)氨基酸，它的核苷酸排列序列為AATTCATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGTACCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCAGGAACGAGTCTTTCAACGAGCATGAGAGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGTAGCTCCAGTAAAACAGACTCTGCAATTCGAGCTCCGGTGGGCCCGCAGTGTTTGTCTTTTAGCATCGAGGTCATTTTGTCTGAGACGTTAAGCTCGAGGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGCTTAAGTACCATGGGAGCTCCCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCATGAACGAGTCTTTCTTGCTCGTACTCTGCCATGAGAACGAGCATGAGACGGTACTCCTAG
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家畜口蹄疫病毒多肽疫苗，其特征在于疫苗蛋白的分子量為30-140KDa。
3.一種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗的制備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的制備，其特征在于(1)，用化學(xué)合成的方法合成編碼141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的小肽基因，并將其串聯(lián);(2)，將上述基因插入質(zhì)粒載體，連接在質(zhì)粒載體的β-半乳糖苷酶基因的末端，或者連接在乙肝病毒核心抗原基因上;(3)，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌表達(dá)，得到菌株;(4)，將菌株置于營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度30-37℃，發(fā)酵時(shí)間9-24小時(shí)，發(fā)酵液中加入濃度為50-100ug/ml的氨芐青霉素和IPTG，發(fā)酵完畢，經(jīng)過(guò)離心、粉碎細(xì)胞、再離心即可。
全文摘要
本發(fā)明是一種家畜口蹄疫病毒多肽疫苗及其制備方法。傳統(tǒng)口蹄疫病毒疫苗制備方法生產(chǎn)過(guò)程中安全性差，目前雖然有基因重組VP
文檔編號(hào)C12N15/00GK1090203SQ9311259
公開(kāi)日1994年8月3日 申請(qǐng)日期1993年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月21日
發(fā)明者鄭兆鑫, 徐泉興, 毛昌群, 尤永進(jìn), 金建平, 周智愛(ài), 郭杰炎, 趙洪興, 嚴(yán)維耀 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué), 上海畜牧獸醫(yī)研究所