專利名稱：一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)基的制備方法，特別是一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法。
合成培養(yǎng)基是一種人工配制的適合動物細(xì)胞營養(yǎng)要求的混合物質(zhì)，一般分為用雞胚、血清消化液等天然成份配制而成的培養(yǎng)基以及應(yīng)用化學(xué)原料配制而成的合成培養(yǎng)基或者綜合培養(yǎng)基。從培養(yǎng)基的物理性質(zhì)來看，還可以分成加入凝固劑(如瓊脂)的固體培養(yǎng)基以及液體培養(yǎng)基。一般來說，液體培養(yǎng)基適用于動物細(xì)胞的培養(yǎng)，但是液體培養(yǎng)基容易變質(zhì)，也給貯存以及運(yùn)輸帶來諸多的不變，使細(xì)胞培養(yǎng)工作的效率受到了一定程度的影響。因此，把液體培養(yǎng)基改變成粉末狀的培養(yǎng)基便可克服上述缺陷，只要將粉末狀培養(yǎng)基按比例投入液體內(nèi)溶解后就可使用。在制備粉末狀培養(yǎng)基時，由于原料中各物質(zhì)的理化性質(zhì)不一，且含量相差懸殊，如何使混合后培養(yǎng)基中各成份分布均勻，培養(yǎng)基性能穩(wěn)定，成品溶解性好，并能提高產(chǎn)率，降低成本，長期以來一直是人們在制備工藝上渴望解決的問題。
本發(fā)明的目的在于提供制備粉末狀動物細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，使其制出的粉末狀動物細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，不易變質(zhì)，且各種成份分布均勻，容易溶解。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下方法1.將原料按性質(zhì)分組并稱量，所有原料依組分別用純水或乙醇溶解，然后將所有分組溶解后的溶液混合攪拌均勻，配成總濃度為30～40%的溶液，加入用NaOH溶解的酚紅和吐溫80，過濾除去少量不溶物，除菌后用高速旋轉(zhuǎn)噴霧干燥機(jī)噴霧干燥，其轉(zhuǎn)速3500轉(zhuǎn)/分以上，溶液流速為4～5立升/小時，干燥室熱風(fēng)溫度為220±10℃，風(fēng)速為8～10米/秒，用旋風(fēng)式粉末分離器收集粉末，其溫度在70～80℃，最后對成品進(jìn)行包裝。
本方法可將維生素A、D等液體原料制成固體粉末，且不會在高溫氣流中蒸發(fā)水份而使維生素遭到破壞。只要液體原料的含量不超過固體原料含量的1%，噴霧后液體原料也能被固體原料粉末所吸收。使用本方法所制得產(chǎn)品成份分布均勻，穩(wěn)定性好，形成的粉末溶解極為迅速。
方法2.根據(jù)原料中各化合物的理化性質(zhì)不同，分別對物料進(jìn)行低溫真空干燥和高溫干燥，對干燥后的原料進(jìn)行分組稱量，再次將原料進(jìn)行干燥，然后按原料分組的量從小到大依次投入球磨罐進(jìn)行混合球磨，制得成品后進(jìn)行包裝。
本方法可采用液體物料微膠囊理論，球磨時不必剔除液體物料，工藝操作簡單等特點，產(chǎn)率高，成本低，其產(chǎn)品具有較好的穩(wěn)定性。
方法3.將原料按其理化性質(zhì)分組稱量，分別將水不溶物及難溶物(如維生素A、E、D2、K等)溶于乙醇，其他物料用純水溶解，然后將所有溶液合并混合攪拌均勻，濾去不溶物后置入冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥制粉，制得成品后包裝。
采用該法制成的培養(yǎng)基成份含量精確，分布均勻，性能穩(wěn)定。
方法4.將部分原料(微量元素)分組稱量，然后分組溶解后溫和攪拌，過濾，冷凍干燥，制得凍干粉半成品A;將其他物料經(jīng)低溫真空干燥或高溫干燥，分組稱量后連半成品A再次干燥，然后混合球磨，制得成品后進(jìn)行包裝。
方法4尤其適合于原料中含有不穩(wěn)定物質(zhì)的培養(yǎng)基的生產(chǎn)，制出的產(chǎn)品穩(wěn)定性極好，成份分布均勻，且制備工藝成本較低。
綜上所述，本發(fā)明制備工藝簡單，成本低，產(chǎn)率高，所制出的動物細(xì)胞培養(yǎng)基具有性能穩(wěn)定、不易變質(zhì)、貯存方便、保存期長、重量輕、溶解性好等特點，提高了細(xì)胞培養(yǎng)工作的效率。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實施例1.
一、配方(單位毫克/升)L-氨基酸甲組:
精氨酸 100 胱氨酸 25組氨酸 25 異亮氨酸 25亮氨酸 25 賴氨酸鹽酸鹽 20苯丙氨酸 75 酪氨酸 10纈氨酸 10L-氨基酸乙組:
門冬氨酸 10 門冬酰胺 2.5谷氨酸 10 谷胱甘肽 0.5甘氨酸 5 羥脯氨酸 10
甲硫氨酸 7.5 脯氨酸 10絲氨酸 15 蘇氨酸 10谷氨酰胺 150 色氨酸 2.5維生素組:
生物素 100 泛酸鈣 125氨化膽堿 1.5 葉酸 500肌醇 17.5 煙酰胺 500對氨基苯甲酸 500 磷酸吡哆胺 500維生素B122.5 維生素B1500維生素B2100無機(jī)鹽葡萄糖組:
NaCl 3000 KCl 200Ca(NO3)250 葡萄糖 1000MgSO4·7H2O 25 Na2HPO4·12H2O 1000酚紅 2.5二、生產(chǎn)操作步驟1.將物料分別按組稱量并溶解，攪拌混和，過濾。
(1)稱取無機(jī)鹽葡萄糖組，置于20立升搪瓷桶中，加9立升離子交換水，加熱攪拌到完全溶解，冷卻備用;
(2)正確稱取L-氨基酸甲組各化合物，置于1立升三角燒瓶中，加入用離子交換水配制的1N HCl550毫升，在水浴中適當(dāng)加熱，攪拌使之溶解，冷卻備用;
(3)正確稱取L-氨基酸乙組各化合物，置于2立升三角燒瓶中，加入1立升離子交換水，攪拌使之溶解;
(4)正確稱取維生素組各化合物，置于1立升三角燒瓶中，加入500毫升離子交換水，攪拌使其溶解;
(5)稱取酚紅2.5毫克于缽中，加入1N NaOH20毫升，研磨使其溶解;
(6)將MgSO4·7H2O稱取后置于250毫升三角燒瓶中，加入100毫升離子交換水，加熱攪拌溶解;
(7)將Na2HPO4·12H2O稱取之后，置于2立升三角燒瓶中，加入1立升離子交換水，加熱攪拌溶解，冷卻備用;
將(2)～(5)所得到的溶液依次加到(1)溶液中去，攪拌混勻，而后將(6)溶液逐漸倒入(1)溶液中，邊加邊攪拌，防止產(chǎn)生沉淀，加完后再將(7)溶液緩慢加入，邊加邊攪拌，防止沉淀大量產(chǎn)生。
制得的溶液最終容量為14立升左右，pH值3～4，用布氏漏斗過濾，清液置于塑料汽油箱中。
2.噴霧干燥制成粉末。
將配制成的溶液在室溫中用轉(zhuǎn)盤式噴霧器噴成霧滴。轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)速為35000轉(zhuǎn)/分，溶液流入轉(zhuǎn)盤噴霧器的流速為4～5立升/小時;
噴霧器噴成的霧滴在園塔形干燥室中除去水份，此干燥室是單式立式向下并流型，采用電加熱空氣流，氣流的溫度為220℃，進(jìn)風(fēng)速度為8～10米/秒，直線流動;
干燥后的粉末和熱氣流經(jīng)過旋風(fēng)式分離器分離，在分離器固體粉末出口處用氈袋收集培養(yǎng)基粉末，分離器的溫度為70～80℃，收集一定量之后，將培養(yǎng)基粉末倒入塑料袋中，袋口扎緊置于干燥操作箱中。
粉末的產(chǎn)率為45～55%;
進(jìn)風(fēng)溫度不能過低，低于200℃時，粉末產(chǎn)率極低，不足10%，每次噴霧干燥的連續(xù)使用時間為4～5小時，連續(xù)使用時間過長，產(chǎn)品會焦化。
3.產(chǎn)品包裝。
噴霧干燥后的綜合培養(yǎng)基粉末極易吸濕潮解，包裝產(chǎn)品要在有空氣調(diào)節(jié)裝置的干燥室內(nèi)進(jìn)行，或在防潮的操作箱內(nèi)進(jìn)行。
為了在貯藏期防潮，保證產(chǎn)品不變質(zhì)，采用青霉素瓶包裝產(chǎn)品，并在鋁蓋軋封后浸蠟頭防潮。
為了使用方便，采用每100毫升中應(yīng)含固體培養(yǎng)基的量包裝，即以1.1克/100毫升及5.5克/500毫升兩種包裝，前者適用于醫(yī)療單位化驗用，后者適用于科研單位，開瓶后能一次配成液體培養(yǎng)基。
實施例2.
一、配方(單位毫克/升)無機(jī)鹽:
無水氯化鈣 200.00 硝酸鐵 0.72氯化鉀 400.00 無水硫酸鎂 97.07氯化鈉 6800.00 磷酸二氫鈉二水物 158.26氨基酸:
DL-丙氨酸 50.00 DL-天門冬氨酸 60.00L-精氨酸鹽酸鹽 70.00 DL-亮氨酸 120.00L-谷氨酰胺 100.00 甘氨酸 50.00
L-羥脯氨酸 10.00 L-異亮氨酸 40.00L-賴氨酸鹽酸鹽 70.00 DL-甲硫氨酸 30.00L-苯丙氨酸 50.00 L-脯氨酸 40.00DL-絲氨酸 50.00 DL-蘇氨酸 60.00DL-色氨酸 20.00 L-酪氨酸 42.56DL-纈氨酸 50.00L-組氨酸鹽酸鹽一水物 20.15L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物 0.097L-胱氨酸二鹽酸鹽 26.00DL-谷氨酸(一水物) 150.00維生素:
維生素C 0.05 磷酸生育酚 0.01d-生物素 0.01 維生素D20.10D-泛酸鈣 0.01 氯化膽堿 0.50葉酸 0.025 i-肌醇 0.05維生素K30.01 煙酸 0.025煙酰胺 0.025 對-氨基苯甲酸 0.05鹽酸吡哆醇 0.025 鹽酸吡哆醛 0.025核黃素 0.01 鹽酸硫胺素 0.01維生素A 0.14其它化合物:
腺嘌呤硫酸鹽 10.00 腺嘌呤三磷酸 1.00腺嘌呤一磷酸 0.20 膽固醇 0.20脫氧核糖 0.50 葡萄糖 1000.00
還原谷胱甘肽 0.05 鹽酸鳥嘌呤 0.30次黃嘌呤 0.354 酚紅 10.00核糖 0.50 乙酸鈉 50.00胸腺嘧啶 0.30 吐溫80 10.00尿嘧啶 0.80 黃嘌呤 0.344二、生產(chǎn)操作步驟1.干燥大多數(shù)的原料需要干燥，尤其是稱量多的葡萄糖和氯化鈉。干燥分為低溫真空干燥和高溫干燥兩種，根據(jù)化合物的性質(zhì)不同分別進(jìn)行;
2.分組稱量稱量要用不同數(shù)量級的天平進(jìn)行，按配方中數(shù)量準(zhǔn)確稱取。這種操作需要在無菌室中進(jìn)行;
3.分組逐步球磨將數(shù)量級相近的化合物合并在一起球磨均勻，合并時還需考慮化合物的氧化還原性質(zhì)，先是量小的加小球球磨，待其混合均勻后，加入量較多的化合物球磨，并增加球的數(shù)目和中球，待磨均勻后加入量多的化合物，并增加球的數(shù)目和大球來磨，此時加入pH指示劑酚紅，這樣磨出的產(chǎn)品外觀色澤呈桃紅色，每批一致。最后加入量最多的葡萄糖和氯化鈉，并增加大球進(jìn)行球磨，采用此法進(jìn)行球磨混合，得到的成品相當(dāng)均勻;
4.氯化鈉和葡萄糖在稱量后加入球磨之前必須經(jīng)干燥，氯化鈉采用高溫干燥，葡萄糖采用低溫真空干燥;
5.球磨完成后即為半成品，用無菌容器貯放，并要保持冷藏和干燥，并進(jìn)行抽樣檢驗，合格后進(jìn)入包裝車間包裝。
6.包裝按1升溶液培養(yǎng)基的重量準(zhǔn)確稱取后，放入耐高溫的復(fù)合鋁膜袋中，封口包裝，并盡量將袋中空氣趕出，復(fù)合鋁膜袋要經(jīng)過無菌處理。
以上操作要在無菌室中進(jìn)行。
實施例3.
一、將微量元素分組稱量后溶解1.將下列物料稱量后溶于100毫升乙醇中膽固醇 200毫克 維生素A 140毫克維生素E 10毫克維生素D2100毫克維生素K310毫克吐溫80 20毫克2.將下列物料稱量后溶于含有0.5毫升氨水的100毫升雙蒸水中，并加熱至60℃胸腺素 300毫克 尿嘧啶 300毫克黃嘌呤 300毫克 次黃嘌呤 300毫克3.將下列物料稱量后加入250毫升雙蒸水振動搖晃使其溶解葉酸 10毫克 核黃素 10毫克4.將下列物料溶于200毫升0.075N鹽酸溶液中，加熱至50℃生物素 10毫克 鹽酸鳥嘌呤 300毫克5.將下列物料溶于20毫升雙蒸水中腺嘌呤三磷酸 100毫克 腺苷酸 200毫克脫氧核糖 500毫克 谷胱甘肽 50毫克核糖 500毫克 D-泛酸鈣 10毫克維生素C 50毫克 氯化膽堿 500毫克i-肌醇 50毫克 煙酸 25毫克煙酰胺 25毫克 對氨基苯甲酸 50毫克鹽酸吡哆醛 25毫克 鹽酸吡哆醇 25毫克鹽酸硫胺素 10毫克二、合并溶液將上述五組溶液合并，最后再加入1000克葡萄糖，攪拌均勻后，定溶至1000毫升，配成溶液為1000份培養(yǎng)基的用量。
三、冷凍干燥將上述配成的溶液存放在搪瓷盤中，放進(jìn)冷凍干燥機(jī)內(nèi)，進(jìn)行冷凍干燥24～32小時，取出制得凍干粉A，備用。
四、分組稱量其他物料a組:氯化鈉 1020克 無水氯化鈣 30克氯化鉀 60克 無水醋酸鈉 7.5克無水硫酸鎂 14.7克 磷酸二氫鈉 23.74克硫酸腺嘌呤 1.5克 酚紅 7.50毫克硝酸鐵 108毫克b組:DL-丙氨酸 7.5克 DL-天門冬氨酸 9克L-谷氨酰胺 15克 甘氨酸 7.5克DL-異亮氨酸 6克 DL-亮氨酸 18克DL-甲硫氨酸 4.5克 DL-苯丙氨酸 7.5克L-羥脯氨酸 1.5克 L-脯氨酸 6克DL-絲氨酸 7.5克 DL-蘇氨酸 9克DL-色氨酸 3克 L-酪氨酸 6克DL-纈氨酸 7.5克 凍干粉A 153.94克L-精氨酸鹽酸鹽 10.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物 16.5毫克L-胱氨酸二鹽酸鹽 3.9克
DL-谷氨酸一水物 22.5克L-組氨酸鹽酸鹽一水物 3.28克L-賴氨酸鹽酸鹽 10.5克五、干燥1.將a組物料放進(jìn)烘箱里加溫105℃，干燥2小時左右;
2.取出已干燥過的a組物料與b組物料合并，再放進(jìn)真空箱抽真空干燥15小時以上。
六、球磨將上述干燥過的物料倒入球磨罐內(nèi)，再加入一定量的球，進(jìn)行連續(xù)10小時攪拌混合球磨，制得微粒粗細(xì)均勻粉末。
每球磨一批生產(chǎn)量為1.5公斤。
七、質(zhì)檢每生產(chǎn)一批產(chǎn)品經(jīng)檢驗，含量測試，合格者進(jìn)入包裝。
八、包裝在無菌環(huán)境中進(jìn)行包裝1.包裝前嚴(yán)格消毒包裝材料和工具;
2.包裝材料為復(fù)合膜，包裝規(guī)格為凈重9.85克/包。
將包裝好產(chǎn)品貯藏在干燥避光低溫中。
實施例4.
將199培養(yǎng)基的100倍濃縮液(配制方法見實施例1)置于不銹鋼冷凍盤中，倒入的濃縮液其厚度不超過1厘米，而后置于低溫冰箱(-30℃)內(nèi)預(yù)凍，一般放置24小時，使凍結(jié)物(物料盤)的溫度達(dá)到-30℃左右，然后進(jìn)入冷凍干燥的凍干室。凍干室內(nèi)擱板事先制冷到-20℃，放入物料盤，抽真空到0.1τ，維持該真空度到冷凍干燥結(jié)束。用二支點溫度計測量樣品溫度與凍干室溫度，待物料溫度為-20℃以下、凍干室溫度為-20℃、擱板溫度-20℃、冷凝器溫度-50℃、真空度顯示0.1τ之后，將擱板加熱到30℃，使物料中水分從固體狀態(tài)直接升華，一般在24小時可將物體中的水份升華完畢，此時溫度儀顯示物料溫度、凍干室溫度和擱板溫度都達(dá)到30℃，冷凝器溫度為-50℃，真空度為0.1τ，維持30分鐘，而后關(guān)機(jī)(即停止加熱和停止抽真空)，開啟真空蝶閥，使真空度緩緩下降，最后和大氣壓相同，打開凍干室，取出物料盤，迅速將樣品刮到瓶中。整個操作過程保持干燥無菌。產(chǎn)品得率為90%，產(chǎn)品含水量為3～5%。
本實施例也適用于冷凍干燥-球磨法中部分原料制成冷凍干粉。
權(quán)利要求
1.一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，依次包括原料分組稱量，分組溶解，混和攪拌，過濾，噴霧干燥，制得成品后包裝諸步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于所述的噴霧干燥是用高速旋轉(zhuǎn)噴霧器，速度為3500轉(zhuǎn)/分以上，溶液流速4～5立升/小時，干燥室熱風(fēng)溫度為220±10℃，風(fēng)速為8～10米/秒，分離器溫度為70～80℃。
3.一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，依次包括原料干燥，分組稱量，再次對原料進(jìn)行干燥，對分組后的原料逐步混合球磨，制得成品后包裝諸步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于原料的干燥為低溫真空干燥或高溫干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于所述的高溫干燥溫度為110℃以下，干燥時間為6小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于球磨時按原料分組量從小到大依次投入混合球磨。
7.一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，依次包括原料分組稱量，分組溶解，混合攪拌，過濾，冷凍干燥，包裝諸步驟。
8.一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，依次包括以下步驟a.將部分原料分組稱量，分組溶解，混和攪拌，冷凍干燥，制得凍干粉半成品;b.將其他原料以及凍干粉半成品按比例分組稱量、干燥、混合球磨，制得成品后包裝。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于所述的干燥為高溫干燥或低溫真空干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，其特征在于所述的高溫干燥溫度為110℃以下，干燥時間為6小時。
全文摘要
一種粉末型動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，采用原料分組稱量，分組溶解，混和攪拌，過濾，噴霧或冷凍干燥，包裝諸步驟；還提供了包括原料干燥，分組稱量，再次干燥，對分組后原料逐步混合球磨，包裝諸步驟以及冷凍干燥-球磨法的制備方法。本發(fā)明制備工藝簡單，成本低，產(chǎn)率高，制出的培養(yǎng)基具有性能穩(wěn)定、不易變質(zhì)、貯存方便、保存期長、重量輕、溶解性好等特點，適用于科研、醫(yī)療檢驗和藥物生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)，提高了細(xì)胞培養(yǎng)工作的效率。
文檔編號C12N5/06GK1099797SQ93112550
公開日1995年3月8日 申請日期1993年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月3日
發(fā)明者方美華, 徐俊杰, 王炳華, 王克勤, 葉爭, 邱俊 申請人:上?？颠_(dá)氨基酸廠, 方美華