專利名稱：植物組織轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用DNA轉(zhuǎn)運電流將DNA導入單子葉植物和雙子葉植物細胞的方法。該方法將質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移到完整的單子葉和雙子葉組織中。
植物的遺傳轉(zhuǎn)化一直采用兩種不同的方法進行。但是在應(yīng)用于單子葉植物，尤其是有商業(yè)價值的作物如谷類作物時，這兩種方法都受到限制。
第一種方法依賴于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的土壤微生物中誘瘤(Ti)質(zhì)粒的一個區(qū)域在該細菌感染寄主后與寄主細胞基因組融合的能力。因而該質(zhì)粒的遺傳操作可使外源DNA導入寄主細胞。但因為單子葉植物一般對這種微生物不敏感，所以該方法僅限于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。盡管用這種方法進行天門冬屬(Asparagus)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)公開(WO86/03776)，并已有通過農(nóng)桿菌將DNA轉(zhuǎn)移到谷類作物中的報導(Grimsleyetal.，Nature，325(1987)，177)，但還未證實確實可以發(fā)生轉(zhuǎn)化，即寄主細胞基因組吸收并整合了外源DNA或表達了所期望的新性狀。
第二種方法是通過植物原生質(zhì)體直接吸收核酸。這種吸收可以采用化學方法，即用聚乙二醇促進吸收(Paszkowskietal.，Meth.Enzym.118(1986)，668)，或采用微秒持續(xù)高壓電脈沖來完成。后一項技術(shù)稱為電穿孔或電注射，它的作用可能是通過在植物細胞膜上穿出暫時的縫隙，使外來核酸能順利通過細胞膜。參見例如Frommetal.，PNAS82(1985)，5824;Frommetal.，Nature319(1986)，791和WO87/06614。但這種方法成功與否取決于原生質(zhì)體再生成熟可育植株的能力。目前證明谷類作物中僅有水稻有這種能力。有人試圖將玉米原生質(zhì)體再生為可育植株(Gravesetal.，Theor.Appl.Genet.54(1979)，209)，但這些努力尚未取得成功。
用電穿孔方法將裸露的RNA轉(zhuǎn)移到雙子葉植物細胞中也已進行了研究。已證實煙草花葉病毒(TMV)的RNA可被煙草屬(Nicotiana)雙子葉植物的完整葉肉細胞吸收(Morikawaetal.，Gene41(1986)，121)。但據(jù)述該方法用于個體細胞時，所產(chǎn)生的細胞成活率很低，并且尚未清楚地證實寄主細胞是被轉(zhuǎn)化而不是被感染。進一步，即使將來能成功地進行個體單子葉細胞的電穿孔，也仍將存在從個體細胞再生完整植株的問題，尤其是再生可育的玉米植株。
敘述本發(fā)明時欲采用的術(shù)語是根據(jù)其本領(lǐng)域內(nèi)通用的含意。對于沒有通用含意或含意不清的，可對照下列定義“電轉(zhuǎn)化”是利用一種持久的、連續(xù)的直流電流誘導寄主或受體細胞吸收DNA并隨后將該遺傳物質(zhì)整合到寄主細胞基因組中;
“植物組織”指細胞群體;
“胚胎”是指特定器官或器官系統(tǒng)如根和莖進行不可見分化，但存在將產(chǎn)生各種器官的細胞層這樣一個發(fā)育階段;
“愈傷組織”是指由單個植物細胞或組織經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的植物細胞群;
“CM(30)”是一種人工玉米培養(yǎng)基，其成分示于表A;
“MTM”是一種用于培養(yǎng)玉米雄花穗的人工液體培養(yǎng)基，其成分如文獻所述(Pareddy，GreysonandWalden;Planta170(1987)，141);
“BSS”是一種用于蕓苔屬莖條(stemstrips)的人工液體培養(yǎng)基，其成分示于表B。
“TMM”是一種培養(yǎng)蕃茄胚胎的人工培養(yǎng)基，其成分示于表B。
“原生質(zhì)體”是指除去了細胞壁(通常是用酶消化)，但仍包有細胞膜的植物細胞;
“分生組織”由能夠充分地進一步分裂的細胞組成，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生胚性的初生組織或次生組織;
“基因組”在此用來指一個細胞內(nèi)所存在的全部遺傳物質(zhì)，包括染色體和染色體外的遺傳物質(zhì);
被DNA“轉(zhuǎn)化的”細胞是指含有該DNA的細胞，或其通過有絲分裂或減數(shù)分裂產(chǎn)生的、在其基因組中仍保留該DNA順序的子代細胞。
“膜通透”劑指用于哺乳動物細胞的膜通透劑。
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化植物細胞材料的方法，包括在電流存在下，使該細胞材料與含有DNA和細胞膜通透劑的轉(zhuǎn)化溶液接觸足以進行轉(zhuǎn)化的一段時間。
本發(fā)明的方法具有許多優(yōu)點。它能夠穿透多層細胞，因而可以采用整個組織而非單個細胞。細胞不受損傷，它們保留其生活力并能用來產(chǎn)生成熟可育植株。該方法還能夠轉(zhuǎn)化以前尚未成功轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的可育植株的方法，包括在電流存在下，使植物細胞與含有DNA和細胞膜通透劑的轉(zhuǎn)化溶液接觸足以進行轉(zhuǎn)化的一段時間，并在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的植物細胞。
為了區(qū)別本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法與利用短脈沖(一般為幾微秒至約400毫秒的數(shù)量級)電流的所謂電穿孔或電注射技術(shù)，將這種轉(zhuǎn)化方法定義為電轉(zhuǎn)化。
這樣，本發(fā)明利用更恒定、施加時間更長的電動勢(電壓)，將DNA運載或轉(zhuǎn)運至細胞膜并通過細胞膜。利用膜通透劑可有效地增強細胞膜的通透性。
任何植物材料都可用于本發(fā)明的電轉(zhuǎn)化。例如，本發(fā)明可設(shè)想植物組織、植物胚胎、分生組織如雄花穗或穗分生組織、腋芽、莖條、愈傷組織或細胞懸浮液的轉(zhuǎn)化。如果用玉米胚胎組織，該胚胎最好已到達Abbe和Stein(Am.J.Botany，41(1954)，286-287)所定義的發(fā)育階段3，即處在授粉后22至28天之間的一個階段。處在階段3的玉米胚一般約為3mm長，盾片節(jié)組織可由兩個將其分開的縊痕而從外部分辨。在胚根鞘內(nèi)，初生根已可辨認;在胚芽鞘內(nèi)，第一葉片和第二葉片已顯著增大。這個時期的特征是第三葉原基剛剛出現(xiàn)。所用的植物材料處于便于操作的離體形式。
本發(fā)明的方法便于在水平凝膠電泳系統(tǒng)例如瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)中實施，在該系統(tǒng)中，將所要轉(zhuǎn)化的植物材料和DNA置于樣品孔內(nèi)，使電流能從DNA流向植物材料。
如用胚胎組織，該胚胎置于樣品孔內(nèi)時，最好使含有分生組織的一側(cè)對著含有轉(zhuǎn)化溶液的樣品孔。然后將含有DNA(為便于后期選擇，該DNA可含有，例如一段編碼特定抗生素抗性的DNA順序)和膜通透劑的溶液置于含有植物細胞材料的樣品孔附近的樣品孔內(nèi)。膜通透劑最好是極性的，以便施加電壓時可將其與DNA一起運載至細胞膜并穿過細胞膜。合適的極性膜通透劑的例子包括DMSO、溶血卵磷脂、去污劑如十二烷基硫酸鈉和去利通-X，最好是DMSO。所用的這種膜通透劑的濃度應(yīng)足以使細胞膜具有暫時的通透性但不破壞細胞內(nèi)細胞器膜的完整性。這種濃度可在很大范圍內(nèi)變化，并將取決于所涉及的植物材料。較堅硬的植物細胞材料如雙子葉細胞材料，可承受例如濃度為10%的DMSO。一般來說，按轉(zhuǎn)化溶液的重量計算，膜通透劑的濃度為約1%-4%，最好約2%時，能得到良好的結(jié)果。轉(zhuǎn)化溶液中可任意地含有一種示蹤染料以便能監(jiān)測載體的進程。合適的示蹤染料的例子可以是溴酚藍、溴甲酚綠或二甲苯苯胺(xylenecyanol)。這些染料及它們在這方面的應(yīng)用在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。施加低壓電流，使其流動的方向從含有載體的樣品孔流向含有植物材料的樣品孔。此后，將該組織用無菌液洗滌并放于固體培養(yǎng)基上，以便使其在電轉(zhuǎn)化過程中所致的所有損傷得到恢復。在固體培養(yǎng)基上放置時間的長短取決于所處理的組織的年齡和大小，較年幼的和/或較小的組織在選擇步驟之前可能需要較長的恢復期。通常將組織在培養(yǎng)基上保持2-3天，然后對成功轉(zhuǎn)化的組織進行選擇。如果轉(zhuǎn)化載體上含有編碼特定抗生素抗性的DNA順序，則可通過將該組織與這種特定抗生素接觸來進行選擇。有些組織在選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)(對于胚胎來說是生根發(fā)芽)或生長，并產(chǎn)生葉綠素，這些組織已經(jīng)由于吸收并摻入了轉(zhuǎn)化DNA而獲得了抗生素抗性。
所施加的電壓應(yīng)足以有助于DNA的轉(zhuǎn)運而不超過能明顯損傷細胞的電壓。所利用的電壓可在很大范圍內(nèi)變化，并將取決于各種因素，如所采用的植物材料的類型和形式，以及所施加電壓的持續(xù)時間。這樣，如實例1所述，如果在凝膠電泳系統(tǒng)中將玉米胚置于200V電壓下5分鐘，則將有50%的玉米胚成活。(玉米可能是最堅硬的單子葉植物，一般雙子葉植物比單子葉植物的成活更好。)可采用高達110V的電壓而對胚胎沒有嚴重傷害，盡管可能推遲萌發(fā)。一般應(yīng)避免200V以上的電壓。另一方面，低至8V的電壓仍可獲得轉(zhuǎn)化。一般如果所施加的電壓為40-140V，則可獲得滿意的結(jié)果，例如50V-140V，更好是約50V-110V，最好是52V-80V。在實例中所采用的凝膠電泳系統(tǒng)中，電極距離為18cm。因此在這樣一個系統(tǒng)中施加例如50V的電壓將產(chǎn)生50V/18cm或2.78V/cm的電場強度。這就給出了一個所施加的電場強度的數(shù)量級的概念。這種系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流強度將取決于轉(zhuǎn)化溶液(凝膠等)和所施加的電壓。在實例1所用的電泳系統(tǒng)中，在52V電壓下產(chǎn)生約25mA的電流。
接觸電流的時間取決于各種因素，如含有組織的樣品孔和含有轉(zhuǎn)化溶液的樣品孔之間的距離，還取決于組織樣品的大小。因此，最短的時間是轉(zhuǎn)化溶液中的DNA在電場影響下流入含有植物材料樣品的凝膠區(qū)所需的時間。例如，如果這兩套樣品孔之間的距離在以52V電壓啟動電流時為1mm，則轉(zhuǎn)化溶液穿過玉米胚將需要約13-15分鐘，該溶液穿過較大的組織如初期雄花穗(tasselinitial)將需要約20分鐘。一般在接觸電壓5-25分鐘，尤其是10-25分鐘之后，可獲得良好的轉(zhuǎn)化率。
含有組織樣品和含有轉(zhuǎn)化溶液樣品的兩套樣品孔之間的距離，取決于轉(zhuǎn)化溶液的強度和載體凝膠的濃度，如果凝膠較稀，此距離最好大一些。
所要采用的DNA以載體形式較為方便，最好以質(zhì)粒的形式，該質(zhì)粒用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的標準DNA重組技術(shù)進行遺傳操作，使其含有轉(zhuǎn)化植物組織所需的DNA。
適用于本發(fā)明的DNA應(yīng)包括所有來自寄主或受體細胞以外的來源的DNA。因此，可用于本發(fā)明電轉(zhuǎn)化方法的這種有用的DNA的實例可包括編碼玉米醇溶蛋白(玉米貯藏蛋白)的DNA，或組織特異性啟動子，如玉米基因的啟動子，這些啟動子可用于嵌合構(gòu)建體。這樣一個啟動子的例子可以是可在根系中誘導的醇脫氫酶(ADH)啟動子。
用于本發(fā)明的較好的一類DNA可歸為外源DNA。這里所用的外源DNA一詞指所有來自寄主或受體物種以外來源的DNA。外源DNA包括，例如非寄主植物DNA、合成DNA順序、通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的順序，以及細菌、真菌、病毒、動物的DNA順序等等。
合適的外源DNA可包括非寄主植物啟動子，例如Ti和Ri質(zhì)粒的T-DNA啟動子、植物病毒啟動子如CaMV、TMV、BMV等。有用的外源DNA也可包括來自下列基因的外源結(jié)構(gòu)順序，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(npt-Ⅱ)、胭脂堿合酶(nos)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、草甘膦抗性基因(EPSP，賦予對草甘膦-5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶抗性的酶)和編碼一種晶體蛋白昆蟲毒素的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)型基因。參見例如，Adangetal.，Gene，36(1985)，289;Wongetal.，Pro.c.9thInt.SporeCong.(HochandSetlowEds，1985)。編碼一種晶體蛋白昆蟲毒素的蘇云金芽孢桿菌型基因的例子包括蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德變種(B.t.var.kurstaki)編碼一種蛋白毒素的基因和蘇云金芽孢桿菌黃粉
變種(B.t.var.tenebrionis)編碼一種蛋白毒素的基因，前一種蛋白毒素對鱗翅目幼蟲有毒，特別是對夜蛾科昆蟲(Noctuidea)，尤其是對谷實夜蛾(Heliothis zea)和煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，以及灰翅夜蛾屬昆蟲(Spodoptera)如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda);后一種蛋白毒素對鞘翅目害蟲(Coleoptera)有毒，特別是葉甲科昆蟲(Chrysomelidea)，尤其是葉甲屬昆蟲(Diabrotica)如長角葉甲(D.longicornis)、黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctata)和玉米根葉甲(D.virgifera)，以及馬鈴薯葉甲屬昆蟲(Leptinotarsa)如馬鈴薯葉甲(L.decemlineata)。前面提到的夜蛾屬、灰翅夜蛾屬、葉甲屬昆蟲都是侵染玉米等作物的害蟲。外源DNA還包括合成基因，如根據(jù)天然寄主植物基因合成的DNA順序，例如一種改變的玉米醇溶蛋白基因，它改變了這種玉米貯藏蛋白的氨基酸組成。本發(fā)明的外源DNA最好包含嵌合構(gòu)建體，如異源啟動子/結(jié)構(gòu)順序的結(jié)合。這種異源構(gòu)建體的例子包括ADH啟動子控制下的蘇云金芽孢桿菌毒素基因和某些可選擇的標記，如T-DNA啟動子或CaMV啟動子控制下的CAT或npt-Ⅱ結(jié)構(gòu)順序。這樣的結(jié)合可以按標準重組技術(shù)進行構(gòu)建(如Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)和DNA Cloning VolⅠandⅡ(D.Glober，Ed 1985))?？捎糜诒景l(fā)明的其他DNA順序或其結(jié)合，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
在一個較好的實施方案中，用一個可選擇的標記基因轉(zhuǎn)化植物材料，以便于鑒定成功轉(zhuǎn)化的組織。這樣的標記基因的例子有，例如編碼抗生素(如卡那霉素、潮霉素、新霉素和氯霉素)抗性的基因、除草劑抗性基因和顏色基因(例如花色素苷基因)。編碼抗生素的基因的存在將(例如)使轉(zhuǎn)化了的植物細胞在含有這種選擇性抗生素的培養(yǎng)基上成活和生長。
在另一個較好的實施方案中，轉(zhuǎn)化植物材料所用的基因編碼具有很高的商業(yè)或農(nóng)業(yè)價值的性狀，例如昆蟲抗性、除草劑抗性、病毒抗性、真菌抗性，或編碼干擾特定的生化途徑(如導致必需氨基酸合成的途徑)的酶。
在一個特別好的實施方案中，轉(zhuǎn)化植物材料所用的DNA含有一個可選擇的標記基因和一個或多個編碼其他所期望的性狀的DNA順序。使用標記基因意在使成功轉(zhuǎn)化的材料易于與未轉(zhuǎn)化的材料區(qū)分，從而有利于對材料進行后續(xù)的篩選，選出那些已在其基因組中摻入了共轉(zhuǎn)移基因或那些本身可能并不易于選擇的基因的材料。
按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物材料可進行培養(yǎng)并再生出可育的植株。
遺傳轉(zhuǎn)化的健康可育的單子葉植物是新穎的。因此，本發(fā)明提供的單子葉植物材料在其基因組中含有來自非寄主或受體物種來源的DNA，并能再生出健康可育的植株。
這里所用的健康一詞是要把本發(fā)明的植物與受病毒等天然感染的植物區(qū)別開。
本發(fā)明進一步提供健康可育的、其基因組中含有來自非寄主或受體物種來源的DNA的單子葉植物，或這種植物的某些部分，特別是這種植物的種子。
根據(jù)本發(fā)明的較好的單子葉植物材料或植物是禾本科(Gramineae)作物，特別是谷類作物，包括水稻、小麥、谷子、大麥、高粱、燕麥、黑麥、黑小麥和玉米，更特別的是選自小麥、谷子、大麥、高粱、黑麥、燕麥、黑小麥和玉米的谷類作物，最特別的是玉米。
但是應(yīng)當清楚，本發(fā)明的方法也是另一種方便的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法，這些雙子葉植物包括卷心菜(Brassicaoleracea)、蕃茄、向日葵、胡蘿卜、葫蘆、馬鈴薯、大豆、棉花等。
下列實例說明本發(fā)明，但并不限制其范圍。
溫度以攝氏度(℃)給出，百分數(shù)(%)是指重量百分數(shù)。電轉(zhuǎn)化基本上在室溫下進行，但在電壓影響下電泳系統(tǒng)的溫度可能升高。
表ACM(30)培養(yǎng)基(液體或固體)MS主要鹽NH4NO31.65g/lKNO31.90g/lCaCl2·2H2O 0.44g/lMgSO4·7H2O 0.37g/lKH2PO40.17g/lMS次要鹽H3BO36.20mg/lMnSO4·H2O 16.80mg/lZnSO4·7H2O 10.60mg/lKI0.83mg/lNa2MoO4·2H2O 0.25mg/lCuSO4·5H2O 0.025mg/lCoCl2·6H2O 0.025mg/l
維生素鹽酸硫胺0.25mg/lL-天門冬酰胺13.2mg/l甘氨酸7.7mg/l碳源蔗糖20mg/l瓊脂(固體)8g/l加蒸餾水至一升表BBSS培養(yǎng)基4×Difco鹽混合物1500ml/l煙酸0.5mg/l鹽酸吡哆醇0.5mg/l鹽酸硫胺1.0mg/l肌醇100mg/l萘乙酸0.2mg/l芐基腺嘌呤磷酸鹽1.0mg/l蔗糖30g/l瓊脂(固體)16g/l加蒸餾水至1升調(diào)pH至5.8TMM培養(yǎng)基4×Difco鹽混合物1250ml煙酸(0.5mg/ml)1ml
鹽酸吡哆醇(0.5mg/ml)1ml鹽酸硫胺(0.5mg/ml)2ml肌醇(100mg/ml)1mlIAA(0.1mg/ml)5ml蔗糖20g瓊脂(固體)8g加蒸餾水至490ml調(diào)pH至6.01Difco鹽混合物是Murashige和Skoogs(“MS”)主要鹽和次要鹽的市售混合物，4×是指貯液的濃度。
實例1在0.7%瓊脂糖凝膠的8個樣品孔中，每孔放一個階段3離體玉米(P3780)胚(已在冰箱中放置7天使其同步化)。在另外8個樣品孔中，每孔加15μl(10μg)質(zhì)粒DNA(H83E或H83R)、2μl溴酚藍染料和2%DMSO，其余為蒸餾水。這8個孔與前8個孔相距1mm并平行進行電泳。胚胎在樣品孔中的位置是使胚胎的含分生組織的一側(cè)朝向含有轉(zhuǎn)化溶液的樣品孔。質(zhì)粒H83E和H83R均含有pUC8質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有一個花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子〔核苷酸7013-7436，見Hohnetal.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，96(1982)，193〕、一個潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)編碼順序〔pLG83的BamHⅠ片段，見GritzandDavies，Gene，25(1983)，179〕、和一個胭脂堿合酶(NOS)終止區(qū)〔核苷酸682-437，見Bevanetal.，NucleicAcidsRes.，11(1983)，369〕。在質(zhì)粒H83E中，HPT順序相對于啟動子和終止區(qū)順序處于有義方向，而在質(zhì)粒H83R中處于反義方向。
將每塊凝膠置于加有450ml無菌Tris-乙酸-EDTA電泳緩沖液(pH8.0)的水平凝膠電泳系統(tǒng)(BRLH6)中。給凝膠通52V的電流，電泳方向為從DNA至胚胎，電泳時間為10，12.5或15分鐘。通電后，將胚胎用無菌CM(30)沖洗并在固體CM(30)培養(yǎng)基上放置3天。然后將胚胎轉(zhuǎn)移至含有100μg/ml潮霉素的CM(30)培養(yǎng)基中。電轉(zhuǎn)化處理11和14天后，對胚胎進行計數(shù)，結(jié)果如下11天時，所有胚胎均已萌發(fā)(已發(fā)育出根和芽)。11天和14天時，表C中的幼植體為綠色，表明由于摻入了pLG83基因而獲得了對潮霉素的抗性。對照(a)對應(yīng)于在該試驗中進行了電轉(zhuǎn)化，但而后在沒有潮霉素存在下生長的組織;對照(b)對應(yīng)于通過電流但沒有轉(zhuǎn)化溶液的存在，并且而后在潮霉素存在下生長的組織。非轉(zhuǎn)化的經(jīng)潮霉素選擇的對照變?yōu)榉酃P白色并停止生長。
表C對照H83EH83R日期(a)(b)1012.515分1012.515分11804446331480444633實例2用質(zhì)粒DNA處理14天后，收集實例1的每個試驗組中的綠色幼殖體(籽苗)并研碎，按十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取核酸〔Rogersetal.，PlantMol.Biol.，5(1985)，69〕。
將所收集的每組幼植體組織在液氮或干冰中研碎成細粉末，置于一試管中。將該混合物緩慢加熱至65℃，以1μl/mg加入CTAB溶液〔2%CTAB(W/V)，100mM Tris(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl和1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)〕，然后于65℃加熱3分鐘。加入等體積的sevag(CH3Cl3∶異戊醇＝24∶1)并混合。將該混合物以11kx離心30秒，將上相移入一個新試管，加入CTAB(10%W/V)和0.7M NaCl。重復離心，再次分離上相并用CTAB和NaCl稀釋。將1體積的CTAB沉淀緩沖液〔1%CTAB，50mM Tris(pH8.0)和10mM EDTA(pH8.0)和1M NaCl〕加熱至65℃10分鐘。完全再水化后，用2體積的乙醇再沉淀核酸，然后在冷室中離心13-15分鐘進行沉降。將所有樣品在微凝膠上進行電泳，表明存在有DNA。
將提取出的DNA加熱至100℃，加入20×SSPE(3.6M NaCl，200mM NaH2PO4，pH7.4，20mM EDTA，pH7.4)，將該溶液冷卻并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進行點吸印分析。將其與缺刻翻譯的DNA(BRL藥盒批號＃5210和H83E)雜交(Rigby et al.，J.Mol.Biol.，113(1977)，237)。用2×SSPE和0.1%SDS沖洗硝酸纖維素，然后于50℃加熱1小時，接著于室溫下在1×SSPE和0.1%SDS中攪拌1小時，然后對X-光膠片曝光(Maniatis et al.，MolecularCloningALaboratoryManual(1983))。結(jié)果有10%經(jīng)點吸印處理的樣品出現(xiàn)了強雜交，因此表明產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化。
實例3在無菌條件下將玉米(cvx.Oh43和Se60)初期雄花穗(長1.0-1.5cm)切碎(PareddyandGreyson，PlantCellTissueOrganCult.，5(1985)，119)，并保持在MTM培養(yǎng)基上直至進行電轉(zhuǎn)化處理。按實例1的方法將雄花穗和轉(zhuǎn)化溶液置于電泳裝置中的0.7%瓊脂糖凝膠中，通52V的電流13分鐘。轉(zhuǎn)化溶液含有或者a)8μl(10μg)H83E質(zhì)粒、2%DMSO和29μl蒸餾水，或者b)15μl(10μg)H83R質(zhì)粒、2%DMSO和22μl蒸餾水。通電后，將雄花穗移入加有50μg/ml慶大霉素的無菌CM(30)培養(yǎng)基中，小心地沖洗一小段時間。慶大霉素起抗菌素的作用。然后將它們置于含50mlMTM培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，將這些培養(yǎng)瓶置于窗檻上。處理兩天后，每瓶加入5μg/ml潮霉素。
加入潮霉素6天后，3個經(jīng)H83R處理的雄花穗中已有一個死亡(已停止生長并變白)。加入10天后，15個經(jīng)H83E處理的雄花穗中已有2個死亡。加入13天后，又有2個經(jīng)H83E處理的雄花穗死亡。其余雄花穗繼續(xù)生長，直至加潮霉素25天后一直保持綠色。進而，有1個用H83E處理的雄花穗產(chǎn)生了花粉。
實例4按實例1的方法，將取自卷心菜〔意大利栽培品種，CrGC-9(CruciferGeneticsCo-operative-9)〕芽莖上部二節(jié)間的莖條(約1×3×4mm)與轉(zhuǎn)化溶液一起置于電泳裝置中的0.7%瓊脂糖凝膠中，通52V的電流15分鐘。轉(zhuǎn)化溶液含有15μl(10μg)pZO25質(zhì)粒DNA、2μl溴酚藍染料和2%DMSO。
通電后，將莖條移入無菌BSS培養(yǎng)基中一小段時間，然后移入含20μg/ml潮霉素的選擇培養(yǎng)基中1星期，最后移入含5μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中1星期。轉(zhuǎn)移至未加潮霉素的BSS培養(yǎng)基時，有24個莖條產(chǎn)生了愈傷組織。2個月后，它們生出芽，將它們移入霧室(mistchamber)的土壤中，使其生根。
將兩種經(jīng)潮霉素選擇的蕓苔屬植物的葉片切成小片，在含有25μg/ml潮霉素的BSS培養(yǎng)基上進行次級選擇。這些小片維持綠色并生成芽。它們移入具有一半鹽濃度而且沒有潮霉素的BSS時還生出根。對這兩種同樣的初級轉(zhuǎn)化體的葉片也進行了分析，看是否存在潮霉素基因。在液氮中冷凍每種葉片(約0.2g)，在研缽中將其研碎成粉末。至此，向研缽內(nèi)的組織中加入15ml冰冷的蔗糖緩沖液(含15%蔗糖、50mMTrispH8.0、50mMEDTA)及0.25MNaCl，并繼續(xù)研磨。將漿液傾入5mlWheaton毛球璃勻漿器中，用手研磨5-10次。然后將漿液移入1.5mlEppendorf管中，以6500rpm離心3分鐘。然后將粗制的細胞核沉淀再懸浮于0.5ml冰冷的蔗糖緩沖液(如上，但無NaCl)。加入1μl焦碳酸二乙酯，于室溫下攪拌該懸浮液。下一步，加入5μl20%SDS并攪拌，然后于70℃加熱10分鐘。加入50μl5M乙酸鉀并攪拌該溶液。然后將該管在冰上冷卻30分鐘。
沉淀出鉀-SDS組分并于4℃離心15分鐘。將上清液移入一個潔凈的1.5ml小管中，用苯酚∶氯仿反復萃取，直至顏色消失且界面清晰。用乙醇進行沉淀，將溶液于室溫下離心5分鐘以回收DNA。
分析轉(zhuǎn)化體是否引入了潮霉素基因。對全DNA進行定量并用限制性酶TaqⅠ切割。用水平凝膠(0.7%瓊脂糖)以70V電泳約3小時分離DNA片段，如BioradZetaProbe吸印膜說明書所述，用DNA毛細管轉(zhuǎn)移堿吸印法，將DNA片段轉(zhuǎn)移至BioradZetaProbe膜上。預(yù)雜交后，仍按上述說明書進行雜交和洗滌，吸印的膜吸印的膜即用來做放射自顯影。
按照Amersham Multiprime DNA Labeling Systems Manual第1-28頁給出的低熔瓊脂糖法，用32P-CTP標記所分離的潮霉素基因的1kb片段。在轉(zhuǎn)化的DNA中存在特征性的1.4和0.7kb片段，而在對照DNA中沒有。
質(zhì)粒pZO25與H83E(來自實例1)基本相同，只是其HPT編碼順序由核苷酸197-1251組成，并且被修飾，206位的鳥嘌呤被腺嘌呤所置換。
實例5按實例1的方法，將階段3離體玉米胚和轉(zhuǎn)化溶液置于電泳裝置中的0.7%瓊脂糖凝膠中，通52V的電流13分鐘。轉(zhuǎn)化溶液含有15μl(10μg)pZO33質(zhì)粒DNA、2%DMSO和22μl蒸餾水。
通電后，用無菌液體CM(30)培養(yǎng)基沖洗胚胎，將其置于固體CM(30)培養(yǎng)基上。未進行質(zhì)粒DNA的選擇。以通常的方式將所得到的籽苗培育成成年玉米植株，然后進行異花傳粉得到F1植株。使F1植株穗軸上的種子萌發(fā)并生長1星期，以進行CAT試驗，從而確定這些穗軸含有轉(zhuǎn)化體。種植所得到的可能為陽性穗軸上的另一些種子，收集所得植株的根，以CAT試驗進行測試。在頭8個可能為轉(zhuǎn)化的穗軸中，有2個表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化。
分析CAT陽性F1轉(zhuǎn)化體的葉片中是否引入了CAT基因順序。DNA的萃取、切割、分離、吸印及探測等方法均與實例4所給出的方法一致。當pZO33(35S-CAT-NOS)質(zhì)?；蛴迷撡|(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基因組DNA用限制性酶HindⅢ和EcoRⅠ切割時，釋放出特征性的1.2kb片段，用CAT基因進行探測。在這個子代群中，1.2kb片段總是與一個1.4kb片段相連。從用來產(chǎn)生此F1代的雄花穗中提取的DNA，和從所有陽性個體提取的DNA，都含有1.2kb和1.4kb片段。相反，所有的對照(3780的核DNA、3780和F1雜交3780的全DNA)則沒有這些片段。
質(zhì)粒pZO33在pTZ19R(可購自Pharmacia和USBiochemical)的SacⅠ位點含有一個CaMV35S啟動子(核苷酸7069-7569);在PstⅠ位點含有來自Tu9(AltonandVapnek，Nature，282(1979)，864)的773bp氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，該基因的兩個TaqⅠ端變?yōu)镻stⅠ;在PstⅠ和HindⅢ位點之間含有一個NOS終止區(qū)(核苷酸682-437)。
CAT試驗如下CAT試驗1.提取籽苗或其他組織A.將籽苗或其他組織在150μl(或其倍數(shù))0.25MTris-HClpH7.8中研碎。
B.樣品在冰上進行聲處理(2檔3次脈沖)。
C.將樣品以12Kg離心3分鐘，將上清液移入一潔凈試管中。
D.將樣品在水浴中加熱至65℃12分鐘，然后冷卻至室溫。
E.將樣品離心30秒，收集上清液用于CAT試驗。
2.每個反應(yīng)準備一支管。另外為大腸桿菌(E.Coli)CAT準備一支對照管(13×100cm管)。
陰性對照可能的轉(zhuǎn)化體陽性CAT對照上清液100μl100μl-10mMTrispH7.8--99μlCAT(0.5單位/μl)--1μl14C氯霉素 3μl 3μl 3μlH2O 57μl 57μl 57μl＊4mM乙酰輔酶A20μl20μl20μl-總計180μl180μl180μl＊于37℃保溫5分鐘，使反應(yīng)混合液處于室溫。
3.于37℃保溫樣品1-2小時。
4.用2ml冷的水飽和的乙酸乙酯終止反應(yīng)。加1ml H2O使界面更清晰。
5.用帕拉膠膜(Parafilm)蓋住試管，置＃1檔旋渦振蕩約1分鐘。
6.在IEC中置＃5檔離心3-5分鐘。
7.將上層轉(zhuǎn)移至小試管(13×75)。
8.在通風櫥中于N2下干燥至干(約45分鐘-避免過分干燥)。
9.干燥樣品的同時，準備TLC層析缸和溶劑，溶劑為100ml氯仿∶甲醇(95∶5)。在層析缸的所有側(cè)壁上放一根燈芯。
10.準備一塊20×20cm硅膠60TLC板。用鉛筆在距底部1.5cm處畫一條線。用交叉線標明樣品位置。用上行層析進行分離。
11.樣品干燥后，再懸浮于30μl乙酸乙酯(未經(jīng)水飽和)中。
12.用10μl微量吸移管將樣品點在很小的面積內(nèi)。點樣時用一個吹風機吹層析板。
13.將層析板置于層析缸內(nèi)，使溶劑前沿到達距層析板頂部約3mm處(40-50分鐘)。
14.在通風櫥中使層析板在空氣中干燥15或20分鐘，然后與一片膠片(經(jīng)預(yù)閃光)一起放進暗盒中，室溫下過夜。
15.第二天顯影此膠片。
實例6按實例1的方法，將蕃茄胚胎(BurpeesSuperBeefsteakVFN)置于水平電泳系統(tǒng)的0.7%瓊脂糖凝膠的樣品孔中，這些樣品孔鄰近那些含有轉(zhuǎn)化溶液的樣品孔。轉(zhuǎn)化溶液中含有10μgpZO60或pZO67質(zhì)粒DNA、2%DMSO和溴酚藍示蹤染料。給胚胎通52V的電流約15分鐘。
電轉(zhuǎn)化后，將胚胎移入TMM培養(yǎng)基進行2-3天的恢復。然后將胚胎在含有25μg/ml潮霉素的選擇性蕃茄培養(yǎng)基上放置10天。未處理的對照籽苗在這一選擇中無一成活。然后將轉(zhuǎn)化體移至含有0.5mgIAA的培養(yǎng)基中，在移栽至土壤中之前生根。
分析這些初級轉(zhuǎn)化體的葉片中是否存在所引入的DNA，具體說來就是潮霉素基因。如實例4所述從植物組織中分離全DNA，用限制性酶TaqⅠ切割并分離，吸印后進行雜交。轉(zhuǎn)化的DNA中存在有特征性的潮霉素片段(1.4，0.7和0.4kb)，而對照DNA中則沒有。
質(zhì)粒pZO60是從pUC8質(zhì)粒構(gòu)建的，該pUC8質(zhì)粒帶有pZO25的35S啟動子、HPT編碼順序及NOS終止區(qū)(見實例4)，后面緊接第二個NOS終止區(qū)的拷貝。
質(zhì)粒pZO67是從pUC8質(zhì)粒構(gòu)建的，該pUC8質(zhì)粒帶有H83E的35S啟動子(見實例1)、RAJ-260的PstⅠ片段上的β-葡糖苷酸(CUS)編碼區(qū)(Jeffersonetal.，PNAS，83(1986)，8447)、以及NOS終止區(qū)，后面緊接pZO25的35S啟動子、HPT順序及NOS終止區(qū)(見實例4)。
實例7按實例1的方法，將階段3玉米胚置于水平凝膠系統(tǒng)的0.7%瓊脂糖凝膠的樣品孔中，這些樣品孔鄰近含有轉(zhuǎn)化溶液的樣品孔。轉(zhuǎn)化溶液含有10μg蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德變種(Btk)/HPT質(zhì)粒(pZO85-BTK/HPT)DNA、2%DMSO和溴酚藍示蹤染料。給胚胎通52V的連續(xù)電流約15分鐘，然后將胚胎轉(zhuǎn)移至CM(30)培養(yǎng)基中進行選擇，看是否獲得了潮霉素抗性。將那些表現(xiàn)出潮霉素抗性的幼殖體培育成較大的籽苗。用標準生物檢測法，測試這些幼殖體對實夜蛾屬昆蟲(如煙芽夜蛾)和灰翅夜蛾屬昆蟲等害蟲的抗性。轉(zhuǎn)化的籽苗與未處理的標準物相比，表現(xiàn)出對實夜蛾屬和灰翅夜蛾屬昆蟲的敏感性降低。
質(zhì)粒pZO85是如下構(gòu)建的。將含有來自pRAJ275(可從ClontechLaboratories購得)的β-葡糖苷酸酶(GUS)編碼順序的SalⅠ-EcoRⅠ片段進行修飾，使3′端的EcoRⅠ位點變?yōu)閜stⅠ位點。此GUS基因的特點是，有一個NcoⅠ位點跨過編碼順序的起始密碼子(ATG)。pZO85由pZO33(見實例5)中存在的35S啟動子和NOS順序，以及上述Sal-Pst片段(代替CAT基因)組成。
通過用含有修飾的Btk順序的pAMVBTS(Bartonetal.，PlantPhysiol.，85(1987)，1103)的Nco-Pst片段取代pZO85的NcoⅠ-PstⅠ片段，制備pZO85-BTK-HPT。此順序后面緊接pZO33的35S啟動子和NOS終止區(qū)(見實例5)及pZO25的HPT順序(見實例4)。
實例8以與實例7類似的方式，用一種質(zhì)粒處理階段3玉米胚。該質(zhì)粒含有蘇云金芽孢桿菌黃粉 變種(DSM2803)編碼一種對鞘翅目昆蟲(如黃瓜十一星葉甲)有毒的蛋白的基因，以及一個編碼潮霉素抗性的標記基因。使如此轉(zhuǎn)化的胚胎進行恢復，培養(yǎng)于實例7中所用的培養(yǎng)基中。如此獲得的轉(zhuǎn)化的籽苗表現(xiàn)出對黃瓜十一星葉甲的敏感性降低(與未處理的標準物相比)。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化植物細胞材料的方法，包括在電流存在下，將該細胞材料與含有DNA和一種膜通透劑的轉(zhuǎn)化溶液接觸足以使DNA轉(zhuǎn)運至植物材料并產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的一段時間。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的DNA為載體DNA。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的DNA為質(zhì)粒DNA。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中的DNA來自非寄主或受體物種來源。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的DNA含有一個編碼除草劑和/或昆蟲抗性的基因。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中，將待轉(zhuǎn)化的植物細胞和DNA材料置于水平凝膠電泳系統(tǒng)的樣品孔中，使電流能從DNA流向植物細胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的膜通透劑為一種極性膜通透劑，選自二甲亞砜、溶血卵磷脂、十二烷基硫酸鈉及其他去污劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的膜通透劑為二甲亞砜。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的轉(zhuǎn)化溶液含有1-4%(重量)的二甲亞砜。
10.權(quán)利要求1-9的方法，其中的電流電壓在約40V-140V的范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中的電壓在約50V-110V的范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求1-11的方法，其中通電流的最短時間為轉(zhuǎn)化溶液中的DNA流入含有植物細胞樣品的凝膠區(qū)所需的時間。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的通電時間至少為5分鐘。
14.權(quán)利要求13的方法，其中的通電時間為5-25分鐘。
15.權(quán)利要求14的方法，其中的通電時間為10-20分鐘。
16.權(quán)利要求1-15的方法，其中的植物材料為植物組織、植物胚胎、分生組織、腋芽、莖條或愈傷組織。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的植物材料為單子葉植物材料。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的植物材料來自禾本科作物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的植物材料來自谷類作物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的植物材料來自小麥、谷子、大麥、高粱、黑麥、燕麥、黑小麥或玉米。
21.權(quán)利要求20的方法，其中的植物材料為玉米植物材料。
22.權(quán)利要求16的方法，其中的植物材料為雙子葉植物材料。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的植物材料來自卷心菜。
24.權(quán)利要求22的方法，其中的植物材料為蕃茄植物材料。
25.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的可育植株的方法，包括按權(quán)利要求1-24的方法轉(zhuǎn)化植物細胞材料，并在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的植物細胞。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求1-25的方法，基本上如本文的實例所述。
27.用根據(jù)權(quán)利要求1-24或26的方法獲得的植物材料。
28.用根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法獲得的轉(zhuǎn)化的可育植株。
29.單子葉植物細胞材料，該材料在其植物基因組中含有來自非寄主或受體物種來源的DNA，并能再生出健康的可育植株。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的植物細胞材料，它來自禾本科作物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的植物細胞材料，它是一種谷類作物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的植物細胞材料，選自小麥、谷子、大麥、高粱、黑麥、燕麥、黑小麥和玉米。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的植物細胞材料，它是玉米。
34.健康的可育單子葉植物，在其植物基因組中含有來自非寄主或受體物種來源的DNA。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求34的植物，它是一種禾本科作物。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求35的植物，它是一種谷類作物。
37.一種根據(jù)權(quán)利要求36的植物，選自小麥、谷子、大麥、高粱、黑麥、燕麥、黑小麥和玉米。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求37的植物，它是玉米。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的玉米，該玉米對害蟲或除草劑的敏感性降低。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的玉米，該玉米對害蟲的敏感性降低。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的玉米，該玉米對昆蟲的敏感性降低。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的玉米，該玉米對鱗翅目害蟲的敏感性降低。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的玉米，該玉米對鞘翅目害蟲的敏感性降低。
44.根據(jù)權(quán)利要求34-43的植物的種子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化植物材料的方法，該方法包括在電流存在下，使材料與含有DNA和膜通透劑的轉(zhuǎn)化溶液接觸足以進行轉(zhuǎn)化的一段時間，本發(fā)明還提供如此獲得的植物材料和可育植株。本發(fā)明還提供新的轉(zhuǎn)化的植物材料，特別是玉米。
文檔編號C12N5/10GK1030442SQ8810235
公開日1989年1月18日 申請日期1988年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1987年5月5日
發(fā)明者沙倫·克拉麗斯·哈維·阿爾菲尼托, 保羅·沙澤·迪特里希, 林·艾倫·默里, 拉爾夫·邁克爾·辛尼巴爾迪 申請人:山道士有限公司