專利名稱：橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種以繼代增殖的 胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體材料的橡膠樹高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
1991年馬來西亞橡膠研究所的Arokiaraj等在2周齡離體橡膠 苗的莖部用皮下注射器注入致癌農(nóng)桿菌541/71進行接種，3周后形 成腫瘤，8周后腫瘤直徑可達2cm，該腫瘤切下后可在不含激素的MS 基本培養(yǎng)基上自主生長，用TLC可檢測到腫瘤組織中含有由農(nóng)桿菌誘 導(dǎo)形成的章魚堿。腫瘤的形成包含了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并表明質(zhì)粒攜帶的 控制某些代謝物(如冠癭堿、植物激素合成)的基因在腫瘤細胞中得 到表達，這是最早關(guān)于橡膠樹基因工程的報道。1994-1998年 Arokiaraj等應(yīng)用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，都成功地將P-葡糖苷 酸酶(6Z/5")和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入橡膠中，在擴繁的第3代 無性系中仍正常表達，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，而這正是轉(zhuǎn)基因動植物 所需具備的一個重要特征，初步建立了橡膠的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從此， 利用脫分化愈傷組織進行轉(zhuǎn)化成了巴西橡膠轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)路線，但 是轉(zhuǎn)化效率極低。2000年法國熱帶農(nóng)業(yè)研究中心的Montoro等人利 用繼代的易碎內(nèi)珠被脫分化愈傷組織為受體進行轉(zhuǎn)化，研究了鈣在橡 膠農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的作用，但并沒有得到轉(zhuǎn)基因植株。2000年中國橡
膠研究所的李維國以花藥脫分化愈傷組織為受體，將木薯5Z "基因?qū)?入橡膠，并得到轉(zhuǎn)基因胚狀體和瓶苗，但轉(zhuǎn)基因瓶苗不能增殖。2003 年印度橡膠研究所的Jayashree等以花藥脫分化愈傷組織為受體，利 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將6Z^基因和6Z^基因成功轉(zhuǎn)入橡膠中，并在轉(zhuǎn)基因 后代中穩(wěn)定表達。2005年Montoro等在橡膠內(nèi)珠被脫分化愈傷組織 繼代及相關(guān)懸浮培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功得到轉(zhuǎn)基 因植株，但轉(zhuǎn)化過程中有大量玻璃化苗產(chǎn)生，相關(guān)組培技術(shù)還不完善。 2006年中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所陳雄庭等以6KS"基因為 報告基因，T^77/基因為篩選標記基因，用基因槍轟擊橡膠花藥脫分 化愈傷組織進行轉(zhuǎn)化實驗，將W/矮化基因?qū)氚臀飨鹉z，對基因 槍轉(zhuǎn)化橡膠愈傷組織的方法進行了探索，并初步確定W/基因已經(jīng) 整合到橡膠基因組中，但橡膠愈傷組織經(jīng)過基因槍轟擊后，褐化程度 比較嚴重，胚狀體再生率和出苗率都比較低。2007年中國熱帶農(nóng)業(yè) 科學(xué)院生物技術(shù)研究所彭明實驗室以長期繼代增殖的橡膠胚性愈傷 組織為轉(zhuǎn)化受體，過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新疆小擬南芥抗凍調(diào)節(jié)基因C9尸 及其下游功能基因aW7&轉(zhuǎn)入橡膠組織中，并得到大量轉(zhuǎn)基因胚狀 體。
20世紀70年代末我國科技工作者首次利用離體花藥相繼成功培 育出花粉單倍體及花藥二倍體植株，現(xiàn)在己可從花藥、內(nèi)珠被、子葉 培養(yǎng)經(jīng)過體細胞胚發(fā)生得到再生植株，但難以建立胚性細胞懸浮系和 轉(zhuǎn)化體系。
長期以來，以脫分化愈傷組織為受體進行基因槍或農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化是
世界橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的基本方法，但這類方法轉(zhuǎn)化效率極低，成 為制約橡膠樹基因工程研究的瓶頸，其存在的嚴重影響轉(zhuǎn)化效率的因 素主要有脫分化愈傷組織誘導(dǎo)分化成熟胚的頻率較低；脫分化愈傷 組織不宜于繼代增殖，繼代后胚分化率明顯下降；脫分化愈傷組織不 適應(yīng)轉(zhuǎn)化操作，操作過程中愈傷組織容易破碎，農(nóng)桿菌的毒害作用都 容易導(dǎo)致組織褐化壞死；脫分化愈傷組織對抑菌劑和篩選劑很敏感， 抑菌和篩選過程容易影響愈傷組織的生長和分化。
此外，多年的橡膠組織培養(yǎng)實踐表明，莖干、葉等其它部位培養(yǎng) 獲得的愈傷組織難以誘導(dǎo)出正常的胚狀體， 一般不用作遺傳轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種橡膠樹高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，它是利用橡 膠樹組織培養(yǎng)，橡膠樹花藥和內(nèi)珠被胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及繼代增 殖培養(yǎng)技術(shù)，并成功結(jié)合基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，大大提高橡膠樹遺 傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
本發(fā)明所設(shè)計的橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方法包括胚 性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程、轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程、遺 傳轉(zhuǎn)化過程、抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程、繼代后的抗性 胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程。
1、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程在橡膠樹花藥組織培養(yǎng)或內(nèi) 珠被組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇花藥或內(nèi)珠被的脫分化愈傷組織接入胚 性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)，可從部分褐化的脫分化愈傷上 初生鮮黃、松散、透明的胚性愈傷組織，這些胚性愈傷組織進一步誘
導(dǎo)能大量形成成熟胚。所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，并添加水解酪氨酸、麥芽糖、BA、 Kt、 NAA、 GA、 ABA。
2、 轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程挑選初生、鮮黃的胚性 愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基內(nèi)進行繼代增殖培養(yǎng)；所 述胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，并添 加2，4-D、 BA、 KT、 NAA、 GA、 TDZ。
3、 遺傳轉(zhuǎn)化過程利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以繼代增殖的 胚性愈傷組織為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化。
4、 抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程經(jīng)過轉(zhuǎn)化和篩選過 程，會從褐化的胚性愈傷組織內(nèi)再生鮮黃的抗性胚性愈傷組織，將抗 性胚性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基上進行多次繼代 大量增殖，以增加抗性胚性愈傷組織的數(shù)量，從而大大增加抗性胚狀 體的數(shù)量。
5、 繼代后的抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗培養(yǎng)過程將經(jīng)
多次繼代的抗性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚，并
使其進一步發(fā)育成成熟胚和成苗;胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減量，微量元素加量，并添加水解酪氨酸、 麥芽糖、BA、 KT、 NAA、 GA、 ABA。 本發(fā)明的優(yōu)點
1、以胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體克服了脫分化愈傷組織在轉(zhuǎn)化中的 嚴重不足，能大大提高形成成熟胚的效率，解決了轉(zhuǎn)化過程中胚誘導(dǎo)
率低的問題。
2、 利用繼代增殖的胚性愈傷組織進行轉(zhuǎn)化，能縮短成胚時間，進 一步提高成胚效率。
3、 抗性胚性愈傷組織增殖能力強，在不影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)成 胚能力的基礎(chǔ)上，選擇適宜的繼代次數(shù)進行繼代培養(yǎng)，能大大增加抗 性胚性愈傷組織的數(shù)量，從而能大大增加誘導(dǎo)出抗性胚狀體的數(shù)量。
4、 經(jīng)常剝?nèi)』ㄋ幓騼?nèi)珠被誘導(dǎo)脫分化愈傷組織費工、費錢，還受 花期、果期及氣候等自然條件的極大限制，利用繼代增殖的胚性愈傷 組織進行轉(zhuǎn)化可以彌補以上不足，提高實驗和生產(chǎn)效率。
5、 取轉(zhuǎn)化后的抗性胚狀體用于分子檢測，實驗表明有大量抗性 胚狀體為轉(zhuǎn)基因胚狀體，說明了橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方 法不但有高效的成胚率，還有高的轉(zhuǎn)化效率。
本發(fā)明工藝流程簡單，成本低，轉(zhuǎn)化后成胚率和轉(zhuǎn)化率均高，具 有很大的科學(xué)研究及應(yīng)用價值。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明所設(shè)計的橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方法包括胚 性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程、轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程、遺 傳轉(zhuǎn)化過程、抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程、繼代后的抗性 胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程。
1、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程在橡膠樹花藥組織培養(yǎng)或內(nèi)
珠被組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇花藥或內(nèi)珠被經(jīng)30 60天誘導(dǎo)的脫分
化愈傷組織接入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)，約3個月從 部分褐化的脫分化愈傷組織上會初生鮮黃、松散、透明的胚性愈傷組 織，這些胚性愈傷組織進一步誘導(dǎo)能大量形成成熟胚。所述胚性愈傷 組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪氨酸 (50 400 ) mg/L、麥芽糖3 9 % (g/v)、 BA (0. 2 4) mg/L、 Kt (0 4) mg/L、 NAA (0. 1 1) mg/L、 GA (0. 1 2) mg/L、 ABA (0. l 2) mg/L。
2、 轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程挑選初生、鮮黃的胚性 愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基內(nèi)進行繼代增殖培養(yǎng)，培 養(yǎng)室溫度保持在24 28。C，暗培養(yǎng)，20 30天繼代1次；所述胚性 愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加2， 4-D
(0. l 4)mg/L、BA(0 4)mg/L、KT(0. l 3)mg/L、 NAA (0 3)mg/L、 GA (0 2) mg/L、 TDZ (0 2)mg/L。
3、 遺傳轉(zhuǎn)化過程利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以繼代增殖的 胚性愈傷組織為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化。與橡膠脫分化愈傷組織的對比實 驗表明，橡膠樹胚性愈傷組織是更適宜轉(zhuǎn)化的好材料，在轉(zhuǎn)化、抑菌、 篩選、成胚各環(huán)節(jié)都表現(xiàn)出相當明顯的優(yōu)越性，具體表現(xiàn)為胚性愈傷 組織松散，轟擊或浸染較均勻，抑菌及篩選較容易；胚性愈傷組織繼代 增殖和誘導(dǎo)成胚能力強，長期繼代對誘導(dǎo)成胚能力影響不大，誘導(dǎo)抗性 胚狀體的安排較隨意，操作過程不大受時間限制，此外，轉(zhuǎn)化過程增加 了繼代次數(shù)反而增加了成胚數(shù)；胚性愈傷組織再生能力和抗褐化能力 強，受抑菌、篩選等轉(zhuǎn)化過程的副作用小等。在DO 0. 2 0. 4、 28°C、 侵染2 3 min、共培養(yǎng)2 d、抑菌良好的情況下進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，脫分 化愈傷組織的誘導(dǎo)成胚率只有0. 27%,然而，用繼代增殖的胚性愈傷組織 進行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)成胚率可達30%。
4、 抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程經(jīng)過轉(zhuǎn)化及篩選過 程，會從褐化的胚性愈傷組織內(nèi)再生鮮黃的抗性胚性愈傷組織，將抗 性胚性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基上進行多次繼代， 以增加抗性胚性愈傷組織的數(shù)量，從而大大增加誘導(dǎo)出抗性胚狀體的 數(shù)量。
5、 繼代后的抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程將 經(jīng)多次繼代的抗性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚， 并使其進一步發(fā)育成成熟胚和成苗；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減至1/5 1/2,微量元素增加l 2倍，并添加水解酪氨酸50 400 mg/L、麥芽糖2 9°/。 (g/v)、 BA(O. 2 3) mg/L、 KT(0 3) mg/L、 NAA(O. 1 1) mg/L、 GA(O. 1 2) mg/L、 ABA(O. 1 2) mg/L。
實施例
1、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程在橡膠樹花藥組織培養(yǎng)的基 礎(chǔ)上，選擇花藥經(jīng)50天脫分化的愈傷組織接入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中，經(jīng)約3個月的暗培養(yǎng)，將從部分褐化的脫分化愈傷上初生鮮 黃、松散、透明的胚性愈傷組織。所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪氨酸200mg/L、麥芽糖4 % (g/v)、 lmg/L BA、 lmg/L Kt、 0. 3mg/L NAA、 0. 5mg/L GA3、 0. lmg'/L
ABA。
2、 轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程挑選初生、鮮黃胚性愈
傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基內(nèi)進行繼代增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)
室溫度保持在26。C，暗培養(yǎng)，30天繼代1次。所述胚性愈傷組織繼 代增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加1. 5 mg/L 2、 4-D、 1 mg/L KT、 0. 5 mg/L NAA、 0. 2 mg/L TDZ。
3、 遺傳轉(zhuǎn)化的過程利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以繼代增殖的胚性愈 傷組織為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化，并得到再生的抗性胚性愈傷組織。
4、 抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程將抗性胚性愈傷組 織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基上進行多次繼代培養(yǎng)，以大大增 加抗性胚性愈傷組織的數(shù)量。
5、 繼代后的抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程選
擇適宜繼代次數(shù)的抗性胚性愈傷組織，接入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行
培養(yǎng)，2個月后會陸續(xù)誘導(dǎo)出胚，并能進一步發(fā)育成成熟胚和成苗。 所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減 半，微量元素增加1倍，并添加水解酪氨酸300mg/l、麥芽糖3%(g/v)， 蔗糖4%(g/v) 、 1 mg/L BA、 1 mg/L KT、 0. 2 mg/L NAA、 0. 8 mg/L GA3、 0. 2 mg/L ABA。
權(quán)利要求
1、一種橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程、轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程、遺傳轉(zhuǎn)化過程、抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程、繼代后的抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程；1)所述胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程是指在橡膠樹花藥組織培養(yǎng)或內(nèi)珠被組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇花藥或內(nèi)珠被經(jīng)30～60天誘導(dǎo)的脫分化愈傷組織接入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)，約3個月從部分褐化的脫分化愈傷組織上會初生鮮黃、松散、透明的胚性愈傷組織，這些胚性愈傷組織進一步誘導(dǎo)能大量形成成熟胚；所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪氨酸(50～400)mg/L、麥芽糖3～9％(g/v)、BA(0.2～4)mg/L、Kt(0～4)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L；2)所述轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)過程是指挑選初生、鮮黃的胚性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基內(nèi)進行繼代增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度保持在24～28℃，暗培養(yǎng)，20～30天繼代1次；所述胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加2，4-D(0.1～4)mg/L、BA(0～4)mg/L、KT(0.1～3)mg/L、NAA(0～3)mg/L、GA(0～2)mg/L、TDZ(0～2)mg/L；3)所述遺傳轉(zhuǎn)化過程是指利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以繼代增殖的胚性愈傷組織為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化；4)所述抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)過程是指經(jīng)過轉(zhuǎn)化及篩選過程，會從褐化的胚性愈傷組織內(nèi)再生鮮黃的抗性胚性愈傷組織，將抗性胚性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基上進行多次繼代，以增加抗性胚性愈傷組織的數(shù)量，從而大大增加誘導(dǎo)出抗性胚狀體的數(shù)量；5)所述繼代后的抗性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成胚及成苗的培養(yǎng)過程是指將經(jīng)多次繼代的抗性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚，并使其進一步發(fā)育成成熟胚和成苗；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減至1/5～1/2，微量元素增加1～2倍，并添加水解酪氨酸50～400mg/L、麥芽糖2～9％(g/v)、BA(0.2～3)mg/L、KT(0～3)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種橡膠樹胚性愈傷組織高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是以橡膠樹花藥或內(nèi)珠被為外植體進行組織培養(yǎng)，并誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生橡膠樹胚性愈傷組織；將胚性愈傷組織進行繼代增殖培養(yǎng)，并以增殖后的胚性愈傷組織為受體材料進行遺傳轉(zhuǎn)化；將轉(zhuǎn)化后得到的抗性胚性愈傷組織進行繼代和增殖培養(yǎng)；將繼代增殖后的抗性胚性愈傷組織，經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)過程誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生胚，并進一步成苗。本發(fā)明工藝流程簡單，轉(zhuǎn)化效率極高，成本低，克服了現(xiàn)有橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系成胚率極低等嚴重缺陷，彌補了橡膠樹轉(zhuǎn)化受體材料的獲得易受季節(jié)等自然條件限制的缺點，大大縮短了轉(zhuǎn)化周期，是一種高效的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化方法，具有很大的科研及應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK101186927SQ200710186439
公開日2008年5月28日 申請日期2007年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者明 彭, 旭 王, 輝 趙 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所