用于分析植物材料中獨(dú)特的外源遺傳元件組的系統(tǒng)和方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請(qǐng)要求獲得2013年3月15日提交的標(biāo)題為"用于分析植物材料中獨(dú)特的外 源遺傳元件組的系統(tǒng)和方法"("SYSTEMANDMET冊(cè)DFORANALYSISOFPLANTMATERIALFOR 沈TOFUNIQ肥EXOGENOUSGE肥TICELEMENTS")的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/799, 330 的權(quán)益。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)設(shè)及植物生物技術(shù)。本公開(kāi)的實(shí)施方案設(shè)及獨(dú)特的外源異源元件在用于在 遺傳修飾植物和由遺傳修飾植物制備的產(chǎn)品的生產(chǎn)和商品化的過(guò)程中檢測(cè)和跟蹤轉(zhuǎn)基因 事件系統(tǒng)和方法中的應(yīng)用。
[0004] 背景
[0005] 遺傳修飾生物（GM0)，例如遺傳修飾植物，是由至少一個(gè)轉(zhuǎn)化事件定義的，轉(zhuǎn)化事 件通常設(shè)及將異源基因構(gòu)建體插入到受體生物中。異源基因構(gòu)建體通常由若干元件構(gòu)成， 包括至少一個(gè)感興趣的基因和用于對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行控制的調(diào)節(jié)元件。此外，構(gòu)建體的兩側(cè) 可W有來(lái)自克隆載體的DNA序列。大部分遺傳修飾的植物向來(lái)是用含有花挪菜花葉病毒 (CaMV) 35S啟動(dòng)子（P-35巧和/或CaMV35S終止子燈-35S)，或根癌±壤桿菌姻脂堿合酶 終止子（T-Nos)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。最常用的克隆載體來(lái)自地R322,其含有編碼氨節(jié)青霉素 抗生素抗性的基因化la),和含有編碼新霉素/卡那霉素抗生素抗性的基因（nptll)的載 體。
[0006] 可能由于許多原因而期望進(jìn)行GM0的檢測(cè)。例如，定性檢測(cè)可用于鑒定未授權(quán)的 GM0材料或運(yùn)樣的材料的使用。另外，還可能期望進(jìn)行檢測(cè)W鑒定安全或不安全的材料或 者確認(rèn)身份保持（identity-preserved)的材料的純度?？蓱?yīng)用定量檢測(cè)W遵守法定或合 同約定的GM0污染闊值（例如，在期望高純度的產(chǎn)品的情況下，例如在有機(jī)農(nóng)業(yè)（organic farming)或種子批號(hào)認(rèn)證（lotcedification)的情況下）。通過(guò)允許對(duì)GM0材料進(jìn)行跟 蹤，檢測(cè)也可W在安全評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理中發(fā)揮作用。在許多前述的應(yīng)用中，檢測(cè)方法需要有 高靈敏度。
[0007] 開(kāi)發(fā)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和鑒定GM0的有效分析方法可減少分析時(shí)間和相關(guān)成本， 在多年來(lái)一直是一個(gè)極其活躍的研究領(lǐng)域。Morrisetetal. (2008化ur.FoodRes. Technol. 227:1287-97。然而目前為止，還沒(méi)有制定足夠的策略，為當(dāng)前使用的許多異源基 因構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化事件提供足夠的檢測(cè)能力。DNA是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和定量GM0的優(yōu)先選擇 的分析物，因?yàn)樗蒞在從種子、飼料或者甚至高度加工后的食品樣品中萃取之后有效地 進(jìn)行檢測(cè)。
[0008] 優(yōu)選的現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中的事件特異性元件（例如，轉(zhuǎn)基 因序列）。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因事件中整合的大多數(shù)通用遺傳元件（例如啟動(dòng)子、報(bào)告基因、終止子） 被頻繁地在多種載體中使用，通過(guò)運(yùn)些遺傳元件跟蹤特定的事件是具有挑戰(zhàn)性的。
[0009] 由于檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)所期望的靈敏度，在運(yùn)些測(cè)定中通常首先通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)從樣品中擴(kuò)增DM?；赑CR的GMO檢測(cè)方法可W根據(jù)它們的特異性水平進(jìn)行分類。 每個(gè)類別相應(yīng)于在PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增的DNA的身份：（1)篩選祀標(biāo)；（2)基因特異性祀標(biāo)； (3)構(gòu)建體特異性祀標(biāo)；和（4)事件特異性祀標(biāo)。
[0010] 第一類PCR方法（即，擴(kuò)增篩選祀標(biāo)，例如P-35S,T-35S,T-Nos,bla,和omptll 遺傳元件）在檢測(cè)被轉(zhuǎn)化的材料中具有廣泛應(yīng)用。Matsuokaetal. (2002)J.Agric.Food 化em. 93:35-8。然而，運(yùn)些方法不能用于鑒定GMO,因?yàn)榇嬖诤Y選祀標(biāo)不一定意味著存在 GM0來(lái)源的DNA。例如，P-35S或T-35S的來(lái)源可能是天然存在的CaMVeWolfetal. (2000) Eur.FoodRes.Technol. 210:367-72。
[0011] 第二類PCR方法（即，擴(kuò)增感興趣的基因，例如化ylA基因）比第一類方法更有特 異性。Vaitilingometal. (1999)J.Agric.FoodQiem. 47:5261-6。感興趣的基因之間的 多樣性比可用的（且常用的）啟動(dòng)子和終止子之間的多樣性大，并且通常特定轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增 的陽(yáng)性信號(hào)表明樣品中存在GM來(lái)源的DNA。然而，運(yùn)些方法不能區(qū)分可能包含相同感興趣 基因（例如除草劑抗性基因）的不同GM0。隨著人們把常用的轉(zhuǎn)基因與其他轉(zhuǎn)基因堆疊，形 成對(duì)特定GM0而言特征性的特定組合運(yùn)種缺陷在未來(lái)將會(huì)更加成問(wèn)題。
[0012] 第^類？〇?方法祀標(biāo)（即，擴(kuò)增異源基因構(gòu)建體相鄰元件之間、例如啟動(dòng)子 和感興趣基因之間的接點(diǎn)）在當(dāng)今的技術(shù)限制下提供轉(zhuǎn)基因事件的唯一獨(dú)特的標(biāo)識(shí) (signature)。Zimmermanetal. (1998)Lebensm.-WissuTechnol. 31:664-7。不幸的是， 即使是事件特異性方法也具有其限制。例如，當(dāng)兩個(gè)GMO雜交時(shí)（例如，兩種不同的GMO玉 米，例如T25和Mon810)，所得雜交后代可能同時(shí)含有兩個(gè)事件的標(biāo)識(shí)，因此在PCR測(cè)試中無(wú) 法與其雙親區(qū)分。運(yùn)些檢測(cè)方法的另一個(gè)麻煩的限制是，每一種GM0均要鑒定一個(gè)特異的 引物對(duì)。而且，引物的設(shè)計(jì)和檢測(cè)測(cè)定法的實(shí)施需要有關(guān)于構(gòu)建體插入位點(diǎn)的信息，因此檢 測(cè)尚未表征的GM0是不可能的。
[0013] 新方法遵循一般的策略，包括選擇由不同檢測(cè)方法構(gòu)成的最優(yōu)的組來(lái)捜索和鑒定 樣品中存在的特定GM0。如ercietal. (2010)Anal.Bioanal.Chem.396:1991-2002。最 近有人提供了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了用于特定GMO的最佳檢測(cè)方法的信息，并且包 括許多GM0中插入的特定DNA序列和側(cè)翼元件。Dongetal. (2008)BMCBioinformatics 9:260。隨著新的GMO的引入，W及作為一項(xiàng)集合任務(wù)，人們針對(duì)GMO檢測(cè)中設(shè)及的實(shí)體的 檢測(cè)方法進(jìn)行研究，該數(shù)據(jù)庫(kù)要更新和增容。運(yùn)個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)期會(huì)成為執(zhí)行GM0測(cè)試的分析 實(shí)驗(yàn)室的有用工具。
[0014] 然而，在未來(lái)，根據(jù)運(yùn)種常規(guī)思維的GM0檢測(cè)將變得極其昂貴，因?yàn)樵絹?lái)越多的 GM0植物被批準(zhǔn)，其中每一種都會(huì)有其自身的最佳檢測(cè)方法。此外，將多個(gè)農(nóng)藝性狀組合在 單個(gè)GM0 中（"基因堆疊"）也越來(lái)越普遍。Taverniersetal. (2008化nviron.Biosafety Res.7:197-218?；蚨询B為GMO檢測(cè)帶來(lái)了一個(gè)艱難的挑戰(zhàn)。除了檢測(cè)來(lái)自個(gè)體植物 的單個(gè)種子或組織之外，還沒(méi)有現(xiàn)成的檢測(cè)方法能夠從兩種或更多種單性狀GM0和單堆 疊GM0 中充分區(qū)分組合存在的材料。Akiyama等（200f5)J.Ag;ric.FoodQiem. 55:5942-7; Holst-Jensen等（2006)J.Ag;ric.FoodQiem. 54:2799-809Javerniers等（2008)，同上。
[0015] 近年來(lái)，人們對(duì)基于DNA的檢測(cè)方法，包括微陣列/忍片和多重PCR,用于增加檢 測(cè)測(cè)定的靈敏度和輸出W及用于鑒定堆疊的GM0的潛力進(jìn)行了探索。參見(jiàn)，例如，Tengset al. (2007)BMCBiotechnol. 7:91。例如，Peanoetal. (200f5)Anal.Biochem. 346:90-100和 Prinsetal. (2008)BMCGenomics9:584報(bào)道了一種組合轉(zhuǎn)基因特異性連接反應(yīng)、被連接 寡核巧酸的PCR擴(kuò)增、雜交和微陣列檢測(cè)的方法。在運(yùn)種方法中使用多個(gè)寡核巧酸標(biāo)簽來(lái) 提供多重能力，運(yùn)些標(biāo)簽固定化在微陣列表面上，并祀定被擴(kuò)增的連接產(chǎn)物。人們預(yù)期將來(lái) 會(huì)需要針對(duì)含有類型多樣的大量事件的復(fù)雜樣品進(jìn)行靈敏的檢測(cè)，使用各種手段開(kāi)發(fā)GM0 檢測(cè)方法來(lái)應(yīng)對(duì)該預(yù)期，此類檢測(cè)方法和多重化工具是運(yùn)些手段的代表。
[0016] 公開(kāi)
[0017] 本文描述了一種系統(tǒng)，其提供了用于確定多個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)基因事件的存在的單一高特 異性、高靈敏性、基于PCR的檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)及其方法不需要任 何關(guān)于轉(zhuǎn)基因事件的整合位點(diǎn)的信息來(lái)實(shí)施該方法。在一些實(shí)例中，可W使用單獨(dú)一對(duì)寡 核巧酸引物（通用引物對(duì)）從許多不同外源構(gòu)建體擴(kuò)增多核巧酸，然后可W通過(guò)單一測(cè)定 特異性地檢測(cè)運(yùn)些多核巧酸。本文的實(shí)施方案利用獨(dú)特的核巧酸序列（在一組載體內(nèi)）， 運(yùn)些核巧酸序列可具有相似的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，且運(yùn)些序列（在本文的一些地方稱作"獨(dú)特 的外源遺傳元件"或"UGE")與特定的轉(zhuǎn)基因唯一相關(guān)，并且可W在與該組載體中其它運(yùn)樣 的獨(dú)特核巧酸基本上相同的測(cè)定系統(tǒng)中被檢測(cè)出來(lái)。本文的系統(tǒng)和方法可W提供用于檢測(cè) /篩選多個(gè)轉(zhuǎn)基因的單一手段，從而減少偶然存在測(cè)試（adventitiouspresencetesting) 所需的檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)的總數(shù)。
[0018] 一些實(shí)施方案提供了用于在植物或植物材料（例如種子）中鑒定異源核酸的方 法，其中該異源核酸包括5'多核巧酸、UGE、和3'多核巧酸。在具體的實(shí)施方案中，運(yùn)種方 法包括提供包含來(lái)自植物或植物材料的DNA的樣品；使DNA接觸與5'和3'多核巧酸特異 性雜交的寡核巧酸引物對(duì)；擴(kuò)增包含所述5'多核巧酸、所述UGE、和所述3'多核巧酸的擴(kuò) 增子訊使用特異性探針檢測(cè)U(iE(例如，在基于巧光的PCR測(cè)定系統(tǒng)，例如水解探針測(cè)定系 統(tǒng)中）。在特定的實(shí)施方案中，運(yùn)種方法包括通過(guò)對(duì)包含5'多核巧酸、UGE、和3'多核巧酸 的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢測(cè)UGE。正如本文中多個(gè)實(shí)施例所證明的，根據(jù)特定實(shí)施方案的方 法提供了令人驚訝的特異性，運(yùn)在一般的GM0檢測(cè)方法中是前所未有的。
[0019] 一些實(shí)施方案提供了用于在植物或植物材料中檢測(cè)至少一個(gè)異源核酸的系統(tǒng)。一 些系統(tǒng)包括一組載體，其中每一載體包含含有5'多核巧酸、UGE、和3'多核巧酸的異源核 酸，其中5'多核巧酸和3'多核巧酸是該載體組中通用的（即，共有的），并且其中每個(gè)載體 的UGE對(duì)該組而言是獨(dú)特的。一些系統(tǒng)可W包括通用的正向引物寡核巧酸，其與所述5'多 核巧酸特異性雜交，和通用的反向引物寡核巧酸，其與所述3'多核巧酸特異性雜交。特定 的系統(tǒng)可W包括一組探針?lè)肿樱渲忻總€(gè)探針?lè)肿觾H與該載體組中的僅一個(gè)UGE特異性雜 交。
[0020] 本文的系統(tǒng)和方法可用于在GM0植物中，包括在具有堆疊轉(zhuǎn)基因的GM0 植物中，鑒定大量轉(zhuǎn)基因事件的存在，并具有前所未有水平的特異性和可推廣性 (generaliz油ility)。在一些實(shí)例中，本文的系統(tǒng)和方法使得人們無(wú)需為了獲得良好的GM0 覆蓋而為不同的事件獨(dú)立地開(kāi)發(fā)檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)并組合不同的檢測(cè)方法，運(yùn)種策略可能是極 為昂貴的。
[0021] 可從隱多個(gè)感興趣的基因引入到包含UGE和通用引物位點(diǎn)的植物轉(zhuǎn)化載體中，并 且可W使用運(yùn)些載體獲得轉(zhuǎn)基因植物。借此，可W轉(zhuǎn)化多個(gè)基因并且可W使用單一的UGE 特異性檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中追蹤它們。對(duì)于用運(yùn)些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，可 W使用分離群體分組分析化ulkedsegregateanalysis)方法進(jìn)行測(cè)試，運(yùn)與既往可用的 技術(shù)相比，能夠顯著減少鑒定用于進(jìn)一步使用的轉(zhuǎn)基因植物所需的測(cè)定數(shù)目。而且，本文的 系統(tǒng)和方法由于有助于分析田間樣品中意圖性狀的存在W及非意圖性狀的不存在（偶然 存在（adventitiouspresence))，可W在性狀基因滲透程序中幫助進(jìn)行產(chǎn)業(yè)推進(jìn)決策。
[0022] 通過(guò)下面參考附圖對(duì)多個(gè)實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述，前述和其它特征將不言自 明。
[0023] 附圖簡(jiǎn)述
[0024] 圖1包括的示意圖是6個(gè)分別來(lái)自質(zhì)粒祀PP1135-PEPP1140的示例性含UGE的多 核巧酸（SEQIDNO: 55-60)的序列比對(duì)。F引物和R引物代表通用的正向和反向PCR引物。 [002引 圖2包括UGE特異性PCR測(cè)定的檢測(cè)結(jié)果。使用UGE特異性質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì) 照（W圓圈表示），使用非轉(zhuǎn)基因玉米DNA和無(wú)模板對(duì)照樣品作為陰性對(duì)照。樣品一式S份 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[002引圖3包括的檢測(cè)結(jié)果顯示，極低濃度的祀U(xiǎn)GEDNA可W用設(shè)計(jì)與之特異性雜交的 水解探針檢測(cè)到。在終點(diǎn)PCR中測(cè)試的模板（質(zhì)粒DNA)濃度范圍是0.OOOOOOlng-lng(從 左至右方向顯示）。納入無(wú)模板對(duì)照W測(cè)試非特異性（圓圈標(biāo)識(shí)）。
[0027]圖4包括使用基于巧光的水解PCR測(cè)定系統(tǒng)對(duì)一種質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果，該質(zhì)粒在非 轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA背景中包含祀U(xiǎn)GE(SEQIDNO: 3)。提供了祀和內(nèi)部對(duì)照的烙解曲線 分析和交叉點(diǎn)循環(huán)數(shù)（Cp)。
[0028] 圖5包括使用基于巧光的水解PCR測(cè)定系統(tǒng)對(duì)一種質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果，該質(zhì)粒在非 轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA背景中包含祀U(xiǎn)GE(SEQIDNO: 8)。提供了祀和內(nèi)部對(duì)照的烙解曲線 分析和交叉點(diǎn)循環(huán)數(shù)（Cp)。
[0029] 圖6包括顯示UGE克隆策略的示意圖。在示意圖中，叩TU"代表植物轉(zhuǎn)化單元， "ZP"代表包含UGE的擴(kuò)增子。"LB"和"RB"分別代