本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的富鋅豌豆小肽及其制備方法。

背景技術(shù)：

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是人體識(shí)別和消滅外來(lái)侵入的任何異物(病毒、細(xì)菌等)，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，免疫力是人體識(shí)別和排除“異己”的生理反應(yīng)，人體內(nèi)執(zhí)行這一功能的是免疫系統(tǒng)。免疫力低下的身體易于被感染或患癌癥，各種原因使免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮保護(hù)作用，在此情況下，極易招致細(xì)菌、病毒、真菌等感染，因此免疫力低下最直接的表現(xiàn)就是容易生病。因經(jīng)常患病，加重了機(jī)體的消耗，所以一般有體質(zhì)虛弱、營(yíng)養(yǎng)不良、精神萎靡、疲乏無(wú)力、食欲降低、睡眠障礙等表現(xiàn)，生病、打針吃藥便成了家常便飯。每次生病都要很長(zhǎng)時(shí)間才能恢復(fù)，而且常常反復(fù)發(fā)作。長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致身體和智力發(fā)育不良，還易誘發(fā)重大疾病。深層原因是免疫力低下或免疫力不健全。當(dāng)人體免疫功能失調(diào)，或者免疫系統(tǒng)不健全時(shí)，下列問(wèn)題就會(huì)反復(fù)發(fā)作：感冒反復(fù)發(fā)作、扁桃體炎反復(fù)發(fā)作、哮喘反復(fù)發(fā)作、支氣管炎反復(fù)發(fā)作、肺炎反復(fù)發(fā)作、腹瀉反復(fù)發(fā)作，所以千萬(wàn)不可小視。提高免疫力比較簡(jiǎn)單地是平時(shí)多注意補(bǔ)鋅，日常的飲食中多吃像核桃、蛋黃、生蠔、海產(chǎn)品等鋅豐富的食物。

豌豆味甘、性平，歸脾、胃經(jīng)，具有益中氣、止瀉痢、調(diào)營(yíng)衛(wèi)、利小便、消癰腫、解乳石毒之功效。對(duì)腳氣、癰腫、乳汁不通、脾胃不適、呃逆嘔吐、心腹脹痛、口渴泄痢等病癥，有一定的食療作用。豌豆是一種營(yíng)養(yǎng)性食品，蛋白含量為22％。豌豆中所含的膽堿有助于防止動(dòng)脈硬化；所含植物血球凝集素與萊豆、扁豆所含凝集素的作用類似，能凝集人體的紅細(xì)胞，促進(jìn)有絲分裂；能激活腫瘤病人的淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生淋巴毒素，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞有非特異性的傷害作用。因此，豌豆特別適合免疫力低下的人群食用。

肽，是源于蛋白、優(yōu)于蛋白的多功能化合物，是當(dāng)前國(guó)際最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸通過(guò)肽鍵共價(jià)連接形成的聚合物，蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物也是肽，一般地將2肽～10肽(2肽由2個(gè)氨基酸構(gòu)成，n肽由n個(gè)氨基酸構(gòu)成)或相對(duì)分子質(zhì)量小于2000d的肽稱為寡肽或小肽(如谷胱甘肽)，將10個(gè)以上氨基酸組成的稱為多肽。小肽可由蛋白質(zhì)經(jīng)酶解等方式獲得，與蛋白質(zhì)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：①小肽是體現(xiàn)信息的信使，具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能：有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用；②小肽活性更高，在微量和低濃度的情況下，能發(fā)揮更高的生理作用；③小肽分子量小，易消化吸收，食用安全性極高。

微量元素又稱痕量元素，雖然在人體內(nèi)的含量并不多，但是與人的生存和健康息息相關(guān)，對(duì)人的生命起至關(guān)重要的作用。它們的攝入過(guò)量、不足、不平衡或缺乏都會(huì)不同程度地引起人體生理的異?；虬l(fā)生疾病。微量元素最突出的作用是與生命活力密切相關(guān)，僅僅像火柴頭那樣大小或更少的量就能發(fā)揮巨大的生理作用。值得注意的是這些微量元素通常情況下必須直接或間接由土壤供給，但大部分人往往不能通過(guò)飲食獲得足夠的微量元素。這每種微量元素都有其特殊的生理功能。盡管它們?cè)谌梭w內(nèi)含量極小，但它們對(duì)維持人體中的一些決定性的新陳代謝卻是十分必要的。一旦缺少了這些必需的微量元素，人體就會(huì)出現(xiàn)疾病，甚至危及生命。比較明確的是約30％的疾病直接是微量元素缺乏或不平衡所致。

鋅是人體必需的微量元素，但不能在體內(nèi)合成，只能依靠外來(lái)食物提供。鋅是人體許多重要酶的組成成分，在蛋白質(zhì)和核酸的合成、維護(hù)紅細(xì)胞的完整性以及在造血過(guò)程中都起著重要作用，是促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵元素，尤其對(duì)兒童大腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。鋅可提高免疫能力，缺鋅可造成機(jī)體內(nèi)一些免疫功能降低，如呼吸道容易反復(fù)感染，皮膚易生苔癬等。要想讓我們的生命之花常開，我們就應(yīng)該攝取足夠的鋅元素。

富鋅豌豆小肽不僅能更進(jìn)一步提高鋅元素的吸收率，而且還能使人體攝入兩類物質(zhì)(小肽和微量元素)，各自并協(xié)同發(fā)揮提高機(jī)體免疫力的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用的富鋅豌豆小肽，本發(fā)明的第二目的是提供該富鋅豌豆小肽在制備用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健食品及藥品中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用的富鋅豌豆小肽，其特征在于采用以下工藝步驟制備：

富鋅豌豆小肽的制備：將氯化鋅(或葡萄糖酸鋅，或乳酸鋅)溶于去離子水配制成濃度為10～15mg/ml的溶液，按溶液與豌豆蛋白比例8～12:1的比例加入豌豆蛋白，攪拌均勻，加熱煮沸10～15分鐘，待冷卻至約30～50℃，以稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值1.0～3.0，加入0.5～2％胃蛋白酶，保溫1～3小時(shí)，調(diào)節(jié)ph值7.0～9.0，加入0.5～2％胰蛋白酶，保溫3～5小時(shí)，煮沸10～15分鐘，離心，沉淀?xiàng)壢?，上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量為3kd的超濾膜超濾，透過(guò)液加于da201-c大孔吸附樹脂柱上，以水洗脫，棄去水洗液，再以50～90％(v/v)乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇并繼續(xù)濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(60℃)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度為180～200℃，出風(fēng)溫度為90～100℃)，收集噴干粉，即得富鋅豌豆小肽。經(jīng)檢測(cè)，富鋅豌豆小肽肽含量為60％～90％，鋅的富集率＞95％。

經(jīng)過(guò)上述方法制備的富鋅豌豆小肽，用于制備成下述制劑：

(1)按富鋅豌豆小肽:玉米油:蜂蠟:卵磷脂比例為10:35:4:1混合物料，經(jīng)研磨，制備成軟膠囊劑；

(2)按富鋅豌豆小肽:聚乙二醇400:丙二醇比例為10:38:2混合物料，經(jīng)研磨，制備成軟膠囊劑；

(3)富鋅豌豆小肽，加入常規(guī)輔料，制備成口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑。

但本發(fā)明不限于上述劑型。制劑工藝所用的輔料可以用其他常規(guī)的輔料代替，如淀粉、糊精、糖粉、蜂蜜、甘油、羧甲基纖維素鈉等；富鋅豌豆小肽也可與其他藥用物質(zhì)合用，共同達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。

本發(fā)明的第二目的是提供上述富鋅豌豆小肽的用途，其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，其可用于制備提高免疫力的食品、保健食品及藥品。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明富鋅豌豆小肽，制備簡(jiǎn)便，成本低廉；豌豆小肽與微量元素協(xié)同發(fā)揮提高機(jī)體免疫力的作用，同時(shí)具有毒副作用小、無(wú)耐藥性、不易殘留等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到綠色食品純天然的要求，能獲得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

藥效試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明富鋅豌豆小肽的提高免疫力的作用，發(fā)明人進(jìn)行了藥效學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)方法及結(jié)果如下：

(1)對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

①受試藥物及動(dòng)物

富鋅豌豆小肽，自制，含豌豆小肽(以總肽量計(jì))為82.7％，含鋅3.08％。臨用前采用無(wú)菌去離子水配成一定濃度藥液，灌胃給藥。

豌豆小肽，自制，含豌豆小肽(以總肽量計(jì))81.9％。臨用前采用無(wú)菌去離子水配成一定濃度藥液，灌胃給藥。

葡萄糖酸鋅(食品級(jí)，純度＞98％)。臨用前采用無(wú)菌去離子水配成一定濃度藥液，灌胃給藥。

昆明種小鼠，spf級(jí)，雌性，體重18～22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：2015000515110。

②試驗(yàn)方法及結(jié)果

取小鼠，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為：富鋅豌豆小肽組(30mg/kg)、豌豆小肽組(30mg/kg)、葡萄糖酸鋅組(6.5mg/kg)、空白對(duì)照組，連續(xù)灌胃給予7d，2次/d，并于末次給藥1h后將各組小鼠尾部按其體重1/10負(fù)重，然后分別投入一直徑50cm，水深40cm，水溫(16±1)℃容器中觀察各組動(dòng)物游泳時(shí)間，并以沉入水底為觀察指標(biāo)。結(jié)果見表1。

表1對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響(x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*p<0.o5，**p<0.o1。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明：富鋅豌豆小肽組小鼠的游泳時(shí)間與空白對(duì)照組比較差異有顯著性差異(p<0.o1)；豌豆小肽組和葡萄糖酸鋅組小鼠的游泳時(shí)間與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.05)。說(shuō)明富鋅豌豆小肽能顯著延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間。

(2)對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

①受試藥物及動(dòng)物同上。

②試驗(yàn)方法及結(jié)果

取小鼠，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為：富鋅豌豆小肽組(30mg/kg)、豌豆小肽組(30mg/kg)、葡萄糖酸鋅組(6.5mg/kg)、空白對(duì)照組，連續(xù)灌胃給予10d，2次/d，并于末次給藥1h后將各組小鼠脫頸椎處死，剖取胸腺和脾臟分別稱重，得出臟器指數(shù)。結(jié)果見表2。

表2對(duì)小鼠免疫器官重量的影響(x±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*p<0.o5，**p<0.o1。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明：富鋅豌豆小肽組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較差異有顯著性差異(p<0.o1)；豌豆小肽組和葡萄糖酸鋅組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.05)。說(shuō)明富鋅豌豆小肽能顯著提高胸腺和脾臟指數(shù)。

具體實(shí)施方式

下面列舉實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，各實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明：

實(shí)施例1

富鋅豌豆小肽的制備：將氯化鋅(或葡萄糖酸鋅，或乳酸鋅)溶于去離子水配制成濃度為12mg/ml的溶液，按溶液與豌豆蛋白比例10:1的比例加入豌豆蛋白，攪拌均勻，加熱煮沸15分鐘，待冷卻至約45℃，以稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值2.0，加入1.5％胃蛋白酶，保溫2小時(shí)，調(diào)節(jié)ph值8.0，加入1.0％胰蛋白酶，保溫4小時(shí)，煮沸15分鐘，離心，沉淀?xiàng)壢?，上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量為3kd的超濾膜超濾，透過(guò)液加于da201-c大孔吸附樹脂柱上，以水洗脫，棄去水洗液，再以75％(v/v)乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇并繼續(xù)濃縮至相對(duì)密度為1.12(60℃)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度為180～200℃，出風(fēng)溫度為90～100℃)，收集噴干粉，即得富鋅豌豆小肽。

實(shí)施例2

富鋅豌豆小肽的制備：將氯化鋅(或葡萄糖酸鋅，或乳酸鋅)溶于去離子水配制成濃度為14mg/ml的溶液，按溶液與豌豆蛋白比例8:1的比例加入豌豆蛋白，攪拌均勻，加熱煮沸10分鐘，待冷卻至約50℃，以稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值3.0，加入2％胃蛋白酶，保溫3小時(shí)，調(diào)節(jié)ph值7.5，加入2％胰蛋白酶，保溫5小時(shí)，煮沸10分鐘，離心，沉淀?xiàng)壢ィ锨逡和ㄟ^(guò)相對(duì)分子質(zhì)量為3kd的超濾膜超濾，透過(guò)液加于da201-c大孔吸附樹脂柱上，以水洗脫，棄去水洗液，再以60％(v/v)乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇并繼續(xù)濃縮至相對(duì)密度為1.15(60℃)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度為180～200℃，出風(fēng)溫度為90～100℃)，收集噴干粉，即得富鋅豌豆小肽。

實(shí)施例3

取實(shí)施例1方法所得的富鋅豌豆小肽100g，按富鋅豌豆小肽:玉米油:蜂蠟:卵磷脂比例為10:35:4:1混合物料，經(jīng)研磨30分鐘，以明膠、純化水、甘油、氧化鐵黑按100:100:40:1比例制作軟膠囊囊皮膠液，控制膠盒溫度40～50℃，保溫罐35～45℃，噴體溫度30～40℃，壓制成軟膠囊，每粒內(nèi)容物重0.45g，17℃～27℃冷風(fēng)干燥3～5h定型，洗丸、干燥、選丸、包裝，制備成軟膠囊成品。

實(shí)施例4

取實(shí)施例1方法所得的富鋅豌豆小肽100g，按富鋅豌豆小肽:聚乙二醇400:丙二醇比例為10:38:2混合物料，經(jīng)研磨30分鐘，以明膠、純化水、甘油、氧化鐵黑按100:100:40:1比例制作軟膠囊囊皮膠液，控制膠盒溫度40～50℃，保溫罐35～45℃，噴體溫度30～40℃，壓制成軟膠囊，每粒內(nèi)容物重0.45g，17℃～27℃冷風(fēng)干燥3～5h定型，洗丸、干燥、選丸、包裝，制備成軟膠囊成品。

實(shí)施例5

取實(shí)施例2方法所得的富鋅豌豆小肽100g，加淀粉至總量為200g，混合均勻，流化床造粒，填裝膠囊，包裝，制備成膠囊成品。