本發(fā)明涉及醬油調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提高大曲及醬醪谷氨酰胺酶活力的醬油原油的制備方法。

背景技術(shù)：

大豆蛋白和小麥面筋蛋白中富含谷氨酰胺，據(jù)報(bào)道面筋蛋白中谷氨酰胺占總蛋白的20％以上。醬油發(fā)酵過(guò)程中大豆蛋白和小麥面筋蛋白被水解為游離氨基酸和小分子肽。游離的谷氨酰胺不穩(wěn)定，容易進(jìn)一步自身降解生產(chǎn)焦谷氨酸。谷氨酰胺酶可將不穩(wěn)定的谷氨酰胺脫酰胺生成游離谷氨酸。因此谷氨酰胺酶對(duì)提高醬油發(fā)酵的風(fēng)味具有重要影響。傳統(tǒng)米曲霉、醬油曲霉制曲得到的醬油大曲一般谷氨酰胺酶活力在1-3gtu/g，受菌種、制曲溫度和制曲時(shí)間等多種因素影響。

國(guó)內(nèi)外在高壓力對(duì)蛋白酶、脂肪酶、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、果膠酶、淀粉酶等酶制劑的活力的影響方面做了大量研究。一般認(rèn)為：在較低的壓力下，酶的活力略下降，但其失活是可逆的，有時(shí)還會(huì)使某些在常壓下受到抑制的酶活性增強(qiáng)。而在較高的壓力下，酶活性顯著下降，且多為不可逆失活(chakrabortys，kaushikn，raops，etal.high-pressureinactivationofenzymes:areviewonitsrecentapplicationsonfruitpureesandjuices[j].comprehensivereviewsinfoodscience&foodsafety，2014，13(4):578–596.)。

吳奕兵發(fā)現(xiàn)在壓力范圍80mpa～110mpa之間，超高壓均質(zhì)壓力對(duì)過(guò)氧化物酶酶活影響不顯著(p>0.05)，在140mpa下，有5％的酶活喪失(吳奕兵.超高壓均質(zhì)對(duì)胡蘿卜汁理化性質(zhì)及酶和微生物的影響[d].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.)。劉平返現(xiàn)超高壓處理對(duì)木瓜蛋白酶活力均有顯著影響(p<0.05)，200mpa、37℃、20min處理時(shí)，酶活力在所選處理范圍內(nèi)達(dá)到最大，較常壓下的酶活力提高了6.8％。紅外光譜結(jié)果表明:超高壓處理后，木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與酶活力變化相關(guān)性較差；熒光光譜結(jié)果顯示:200mpa、37℃處理木瓜蛋白酶20min，228nm波長(zhǎng)激發(fā)后木瓜蛋白酶的外源性熒光強(qiáng)度達(dá)到最低(2023)，熒光強(qiáng)度變化與酶活力變化規(guī)律有良好的相關(guān)性(劉平，胡志和，吳子健等.超高壓對(duì)木瓜蛋白酶構(gòu)象及酶活力的影響[j].食品科學(xué)，2015，36(23):23-27.)。葛梅研究了超高壓處理對(duì)菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響，發(fā)現(xiàn)壓力300mpa、溫度30℃、保壓10min時(shí)菠蘿蛋白酶的纖溶活性比未處理樣高65.54％；300mpa保壓10min(30℃)處理的菠蘿汁在模擬胃液和腸液各處理4h后，纖溶活性殘留率分別為37.91％和85.33％，均高于鮮榨汁。說(shuō)明通過(guò)調(diào)整超高壓處理?xiàng)l件，可以提高菠蘿汁中菠蘿蛋白酶的纖溶活性及其對(duì)模擬胃腸液的耐受性(葛梅，梁娟，潘見等.超高壓處理對(duì)菠蘿汁中菠蘿蛋白酶纖溶活性的影響[j].食品工業(yè)科技，2014，35(17):75-79.)。蘇光明研究了超高壓對(duì)米曲霉胞外酶活性的調(diào)控及其在傳統(tǒng)黃豆醬生產(chǎn)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)較低壓力的超高壓處理可激活醬曲ppo活性，在壓力為200～300mpa、保壓時(shí)間為10min時(shí)，ppo酶活性增加到116～135％，而當(dāng)處理壓力大于350mpa，ppo活性呈顯著下降；通過(guò)模型擬合，ppo的壓變動(dòng)力學(xué)在不同的壓力范圍內(nèi)呈現(xiàn)不同的特征：100～200mpa的hpp處理對(duì)醬曲ppo激活符合兩段式一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(r2≥0.970)；而350～500mpa的hpp處理對(duì)ppo的鈍化效果符合兩段式動(dòng)力學(xué)模型與一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的混合模型(r2≥0.995)。醬曲中性蛋白酶(ph＝7.5)和堿性蛋白酶(ph＝10.0)受壓力的影響規(guī)律類似，在150～500mpa壓力范圍內(nèi)，酶的壓變動(dòng)力學(xué)模型符合兩段式一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。中性和堿性蛋白酶經(jīng)100～300mpa壓力處理活性有顯著提高。250～300mpa、5～10min的超高壓處理，醬曲中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性分別從對(duì)照樣品的39.7和48.68uml-1升高至120uml^-1以上，酶活性的增加比均超過(guò)240％；而較高的壓力處理(350～500mpa，0～20min)對(duì)蛋白酶的活性有顯著的鈍化作用(蘇光明.超高壓對(duì)米曲霉胞外酶活性的調(diào)控及其在傳統(tǒng)黃豆醬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[d].浙江大學(xué),2015.)。由上述文獻(xiàn)可見，目前大部分研究主要集中在利用超高壓(100mpa以上)處理較短時(shí)間(小于1h)。

迄今為止，尚未見利用高壓長(zhǎng)時(shí)間處理提高大曲的酶活力，特別是大曲谷氨酰胺酶活力的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)高壓處理提高大曲谷氨酰胺酶活力的醬油原油的制備方法，醬油大曲通過(guò)高壓處理后，顯著提高了谷氨酰胺酶的活力，制備的醬油原油中谷氨酸的含量提高40％以上。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

(1)將豆粕或大豆經(jīng)蒸煮后，與面粉混合，冷卻后，接種米曲霉曲精，制曲，得醬油大曲；

(2)將醬油大曲進(jìn)行高壓處理；

(3)采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油釀造方法發(fā)酵，壓榨、過(guò)濾，滅菌，得醬油清液。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述面粉與豆粕或大豆的質(zhì)量比為0.2:1-1:1。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述蒸煮的條件為：蒸煮溫度為110-125℃，蒸煮的時(shí)間為5-20min。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，接種的米曲霉曲精占豆粕或大豆重量的0.03wt％-0.10wt％。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述制曲的條件為：培養(yǎng)的溫度為28℃～36℃，相對(duì)濕度為70％～95％，培養(yǎng)的時(shí)間為30h～72h。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述高壓處理是將醬油大曲置于50-90mpa壓力下靜置3-6h。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油釀造方法參照gb18186-2000。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述發(fā)酵的時(shí)間為90-180天。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述滅菌是在80～95℃熱處理20～30min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明在醬油制備過(guò)程中，將制備的大曲通過(guò)高壓處理后，顯著提高了谷氨酰胺酶的活力(2～3倍)，制備的醬油原油中谷氨酸的含量提高40％以上；

(2)本發(fā)明制備的醬油鮮味和厚味明顯優(yōu)于未高壓處理的醬油，且蛋白回收率顯著提高。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。

醬油原油中谷氨酸含量測(cè)定

氨基酸檢測(cè)條件：4ml樣品與1ml15wt％的磺基水楊酸溶液混合沉淀樣品中大分子的蛋白和多肽，4℃下反應(yīng)1h，4℃下10000*g離心15min，過(guò)濾，樣品經(jīng)過(guò)微濾膜(0.22μmol)處理；用液相離子交換柱(分離柱ts263，membrapure)分離氨基酸，茚三酮顯色，流速為60μl/min，除脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm，其余均在570nm處檢測(cè)。各氨基酸濃度采用外標(biāo)計(jì)算，單位為mg/ml。

谷氨酰胺酶活力測(cè)定：在37℃，ph6.0條件下將l-谷氨酰胺(濃度1％)轉(zhuǎn)化為1μmol的l-谷氨酸所需的酶量。

蛋白酶活力測(cè)定：sb/t10317-1999。

淀粉酶活力測(cè)定：使用ph6.50磷酸緩沖液，參考蛋白酶提取方法提取淀粉酶液，測(cè)定參照michaelsomogyi的方法(michaels.modificationsoftwomethodsfortheassayofamylase[j].clinchem，1960，6(1):23-35)。

氨肽酶活力測(cè)定：參照吳慶勛等的方法進(jìn)行測(cè)定(吳慶勛.氨肽酶高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[d].江南大學(xué)，2006.)。

實(shí)施例1

(1)9.5kg豆粕經(jīng)110℃蒸煮20min后，與1.9kg面粉混合，冷卻至25℃后，接種占豆粕重量0.03％(w/w)的米曲霉曲精(上海佳民釀造食品有限公司光明牌曲精)，培養(yǎng)的溫度為28℃，相對(duì)濕度為95％，培養(yǎng)時(shí)間為72h制曲，得醬油大曲1號(hào)；

(2)將醬油大曲1號(hào)于50mpa壓力環(huán)境中靜置3h；

(3)采用高鹽稀態(tài)醬油釀造方法(gb18186-2000)發(fā)酵90天，壓榨、過(guò)濾，95℃熱處理30min，得醬油清液1號(hào)。

測(cè)定醬油大曲1號(hào)的蛋白酶、淀粉酶、氨肽酶和谷氨酰胺酶活力，以及醬油清液1號(hào)的游離氨基酸組成。

空白醬油樣品的發(fā)酵工藝為：

(1)9.5kg豆粕經(jīng)110℃蒸煮20min后，與1.9kg面粉混合，冷卻至25℃后，接種占豆粕重量0.03％(w/w)的米曲霉曲精(上海釀造一廠曲精)，培養(yǎng)的溫度為28℃，相對(duì)濕度為95％，培養(yǎng)時(shí)間為72h制曲，得空白醬油大曲1號(hào)；

(2)采用高鹽稀態(tài)醬油釀造方法(gb18186-2000)發(fā)酵90天，壓榨、過(guò)濾，95℃熱處理30min，得空白醬油清液1號(hào)。

測(cè)定空白醬油大曲1號(hào)的蛋白酶、淀粉酶、氨肽酶和谷氨酰胺酶活力，以及空白醬油清液1號(hào)的游離氨基酸組成。

醬油大曲1號(hào)和空白醬油大曲1號(hào)的蛋白酶和谷氨酰胺酶活力，以及醬油清液的游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1蛋白酶和谷氨酰胺酶活力，以及醬油清液的游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果

由表1可見，醬油大曲經(jīng)過(guò)高壓處理后，蛋白酶、淀粉酶和氨肽酶活力變化不大，但谷氨酰胺酶活力提高了3倍以上。

實(shí)施例2

(1)10kg豆粕經(jīng)125℃蒸煮5min后，與10kg面粉混合，冷卻至25℃后接種占豆粕重量0.1％(w/w)的米曲霉曲精(上海佳民釀造食品有限公司光明牌曲精)，培養(yǎng)的溫度為36℃，相對(duì)濕度為90％，培養(yǎng)時(shí)間為30h制曲，得大曲；

(2)將大曲分別在50-100mpa壓力下進(jìn)行處理，并測(cè)定大曲谷氨酰胺酶活力，處理?xiàng)l件和測(cè)定結(jié)果見表3。

表3高壓處理?xiàng)l件及結(jié)果

由表3可見，經(jīng)過(guò)50-90mpa壓力3-6h處理后醬油大曲的谷氨酰胺酶提高了2-3倍；但處理時(shí)間超過(guò)6h后，醬油大曲谷氨酰胺酶的活力呈明顯下降趨勢(shì)。此外，100mpa處理1h后，醬油大曲的谷氨酰胺酶活力也顯著下降。

實(shí)施例3

(1)10kg豆粕經(jīng)120℃蒸煮10min后，與5kg面粉混合，冷卻至30℃后，接種占豆粕重量0.05％(w/w)的米曲霉曲精(上海佳民釀造食品有限公司光明牌曲精)，培養(yǎng)的溫度為32℃，濕度為75％，培養(yǎng)時(shí)間為48h制曲，得醬油大曲2號(hào)；

(2)將醬油大曲2號(hào)在90mpa壓力環(huán)境中靜置3h；

(3)采用高鹽稀態(tài)醬油釀造方法(gb18186-2000)發(fā)酵120天，壓榨、過(guò)濾，90℃熱處理25min，得醬油清液2號(hào)。

測(cè)定醬油大曲2號(hào)的蛋白酶、淀粉酶、氨肽酶和谷氨酰胺酶活力，以及醬油清液2號(hào)的游離氨基酸組成。

空白醬油樣品的發(fā)酵工藝為：

(1)10kg豆粕，經(jīng)120℃蒸煮10min后，與5kg面粉混合，冷卻后接種占豆粕重量0.05％(w/w)的米曲霉曲精(上海佳民釀造食品有限公司光明牌曲精)，培養(yǎng)的溫度為32℃，濕度為75％，培養(yǎng)時(shí)間為48h制曲，得空白醬油大曲2號(hào)；

(2)采用高鹽稀態(tài)醬油釀造方法(gb18186-2000)發(fā)酵120天，壓榨、過(guò)濾，90℃熱處理25min，得空白醬油清液2號(hào)。

測(cè)定空白醬油大曲2號(hào)的蛋白酶、淀粉酶、氨肽酶和谷氨酰胺酶活力，以及空白醬油清液2號(hào)的游離氨基酸組成。

實(shí)施例1的醬油清液1號(hào)、空白醬油清液1號(hào)，以及實(shí)施例3的醬油清液2號(hào)、空白醬油清液2號(hào)的游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果

由表3可見，采用本發(fā)明制備的醬油的氨態(tài)氮含量和氨基酸轉(zhuǎn)化率與空白樣品相比無(wú)明顯變化，但醬油原油中谷氨酸含量較空白樣品提高了40％以上；蛋白回收率較空白樣增加了3％以上，這是高壓處理導(dǎo)致大豆蛋白變性，更易被酶解。

實(shí)施例4

對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例3所制備醬油的鮮味和厚味進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法：由15位25-35歲有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的男性和女性組成，采用5分制進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以4個(gè)樣品中呈味強(qiáng)度最高的樣品為5分；第二名得4分；第三名得3分；第四名得2分，最后平均得到總分，感官評(píng)分結(jié)果見表4。

表4制備醬油的鮮味和厚味感官評(píng)價(jià)

由表4可知，醬油清液1號(hào)、醬油清液2號(hào)的鮮味和厚味與空白醬油清液1號(hào)、空白醬油清液2號(hào)相比明顯提高。