本發(fā)明涉及酵素領(lǐng)域，尤其涉及一種高活性功能成分酵素的制備與測定。
背景技術(shù)：
酵素又稱為“酶”，是一種比細胞單位更小的一種蛋白質(zhì)，是一種生物催化劑，它承擔人體內(nèi)新陳代謝中各種化學反應，能增加組織各種生化反應(氧化、還原、分解、合成、轉(zhuǎn)化)的速率，人體內(nèi)凡是細胞的代謝，新生，分解，消化，合成等，都依靠酵素來完成，所以酵素又被稱之為“生命之泉”。
伴隨著人們年齡的增長，人們體內(nèi)的酵素會日益減少，由于現(xiàn)代社會競爭激烈，生活節(jié)奏加快，環(huán)境污染日益嚴重，酵素的活性也在下降，代謝功能也在不斷衰退。酵素的減少及活性的下降，會導致各種癥狀的出現(xiàn)，由于酵素作用的單一性，要預防和治療這些疾病，我們必須從膳食中攝取更多的酵素，然而酵素是非常脆弱的，在高溫烹飪(60℃以上就完全失去活性)、加工過程中就會失去活性，造成人們從食物中攝取的酵素很低，無法滿足人們的正常需要。
現(xiàn)有酵素的生產(chǎn)技術(shù)一般都是用多種雜果、谷物或者菌類等混合自然發(fā)酵而成，發(fā)酵所需時間過長(發(fā)酵加陳化一般最短需要6個月，有的甚至需要一年)，且發(fā)酵完得到的酵素產(chǎn)品中有益活菌含量比較低，保健功效不夠顯著。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種高活性功能成分的酵素的制備方法，該工藝能大大縮短發(fā)酵時間，并且能提高酵素產(chǎn)品中功能性活性成分的含量，能最大化利用菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶能力，使酵素功能更強大，有效提高酵素的各種保健功能。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
一種高活性功能成分酵素的制備方法，包括如下步驟：
(1)制備酵素原液：取水果作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，切碎，然后加入蜂蜜，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到水果酵素原液；此處除了選擇水果之外，也可以選擇蔬菜、食用菌、谷物、豆類、中藥材等其他食材作為原料。
(2)二次發(fā)酵：將酵素原液，接種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，發(fā)酵30-60天后，得到本發(fā)明的高活性功能成分酵素，將其保存于密封罐中。發(fā)酵時間根據(jù)取樣測脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶活力變化來確定，通常為30-60天。
步驟(2)中，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的接種量均為1-10％。優(yōu)選雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的接種量均為5-8％。
步驟(1)中，所述水果選自蘋果、梨、獼猴桃、石榴、火龍果、柚子、香蕉、檸檬、芒果、木瓜、葡萄、橙子、山楂、草莓中的一種或兩種以上任意比例的混合物。
步驟(1)中，所述原料水果與蜂蜜的重量比為1:0.5-2，優(yōu)選為1:1。
步驟(2)中，所述雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌市售可以購得，也可以通過下述方法制得：取培菲康三聯(lián)活菌膠囊3顆加入到滅菌后的錐形瓶中，加入50ml生理鹽水混勻，從錐形瓶中取1ml于試管中，再加入9ml無菌生理鹽水混勻，如此稀釋3次；
無菌條件下，從第三次稀釋后的菌液中取出0.5ml菌液，涂布于BBL培養(yǎng)基平皿上，半小時后37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧倒置培養(yǎng)48h，將平皿中菌落進行革蘭氏染色鏡檢，取陰性菌落接種于BBL培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)18h，制得雙歧桿菌；
無菌條件下，從第三次稀釋后的菌液中取出0.5ml菌液，涂布于酸化MRS培養(yǎng)基平皿上，半小時后37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧倒置培養(yǎng)48h，將平皿中菌落進行革蘭氏染色鏡檢，取陽性菌落接種于酸化的MRS培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h，制得嗜酸乳桿菌。
有益效果：本發(fā)明的制備方法有效的縮短了發(fā)酵時間(發(fā)酵時間一般是3-4個月，較現(xiàn)有技術(shù)整整縮短一半時間以上)，大大提高了生產(chǎn)效率，通過對復合菌發(fā)酵過程中活性成分的隨時監(jiān)測，最終確定了酵素整個發(fā)酵過程終止的最佳時間，從而確保活性成分達到最高值，顯著提高了其保健功效。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
備注：1.下述實施例中，脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶含量的測試方法如下：
(1)脂肪酶含量測定方法參考GB/T 23535-2009；
酶活定義：1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在40℃溫度和pH7.5條件下，1min水解底物產(chǎn)生1umol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以u/g(u/ml)表示。
脂肪酶在一定條件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單脂和甘油，所釋放的脂肪酸可用標準堿溶液進行中和滴定，用PH計或酚肽指示液指示反應終點，根據(jù)消耗的碘量，計算其酶活力。反應式為：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
(2)蛋白酶含量測定方法參考GB/T23527-2009；
酶活定義：1g固體酶粉(或1ml液體酶)，在40℃(酸性pH＝3.0、中性pH＝7.5、堿性pH＝10.5)條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個酶活力單位。
用雙蒸水配制濃度為2％的酵素待測溶液,規(guī)定1g固體酶粉(或1mL液體酶),在一定溫度和pH條件下,1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個酶活力單位,以μg(U/mL)表示。蛋白酶活力以“酵素1min水酪蛋白生成1μg氨基酸為一個酶活力單位”來表示。
(3)超氧化物歧化酶(SOD)的測試方法參考GB/T5009.171-2003。
25℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50％時所需的SOD量為一個活力單位。
利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應開始后先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線性時間維持在3～4min。加入酶液則抑制其自氧化速度，在325nm處測定溶液的吸光度。酶活性單位采用1mL反應液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50％時的酶定量為一個活力單位。
2.下述實施例中，采用的雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌通過如下方法制得：
取培菲康三聯(lián)活菌膠囊3顆加入到滅菌后的錐形瓶中，加入50ml生理鹽水混勻，從錐形瓶中取1ml于試管中，再加入9ml無菌生理鹽水混勻，如此稀釋3次，以此標記為10-1、10-2、10-3；
無菌條件下，從10-3試管中取出0.5ml菌液，涂布于BBL培養(yǎng)基(市場購買)平皿上，半小時后37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧倒置培養(yǎng)48h，將平皿中菌落進行革蘭氏染色鏡檢，取陰性菌落接種于BBL培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)18h，制得雙歧桿菌；
無菌條件下，從10-3試管中取出0.5ml菌液，涂布于酸化MRS培養(yǎng)基(市場購買)平皿上，半小時后37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧倒置培養(yǎng)48h，將平皿中菌落進行革蘭氏染色鏡檢，取陽性菌落接種于酸化的MRS培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h，制得嗜酸乳桿菌。
實施例1
(1)制備酵素原液：取蘋果、梨、獼猴桃、石榴、火龍果、柚子、香蕉、檸檬、芒果、木瓜各200g作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，切成片狀，混合均勻，加入蜂蜜，蜂蜜與水果重量比為1:1，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到酵素原液；測定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活達到11.5u/ml,蛋白酶酶活達到1056.6u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到526.5u/ml；
(2)二次發(fā)酵：接種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，接種量各為8％，二次發(fā)酵30天，即得，將酵素液保存于密封罐中。
測得：脂肪酶酶活達到52.8u/ml,蛋白酶酶活達到2859.3u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到1347.4u/ml。
對比例
(1)制備酵素原液：取蘋果、梨、獼猴桃、石榴、火龍果、柚子、香蕉、檸檬、芒果、木瓜各200g作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，切成片狀，混合均勻，加入蜂蜜，蜂蜜與水果重量比為1:1，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到水果酵素原液；
(2)將步驟(1)得到的水果酵素原液自然二次發(fā)酵30天，即得，將酵素液保存于密封罐中。
測得：脂肪酶酶活達到20.7u/ml，蛋白酶酶活達到1502.3u/ml，超氧化物歧化酶酶活達到701.8u/ml。
通過實施例1和對比例的檢測結(jié)果可以看出：二次發(fā)酵采用自然發(fā)酵得到的酵素中，三種酶的酶活相較于一次發(fā)酵酵有一定的提高，但變化不大；加入了雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的二次發(fā)酵得到的酵素中，三種酶的酶活有明顯提高。
實施例2
(1)制備酵素原液：取獼猴桃300g、石榴400g、橙子200g，山楂100g,草莓300g,檸檬400g作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，切成片狀，混合均勻，加入蜂蜜，蜂蜜與水果重量比為1.5:1，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到水果酵素原液；測定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活達到13.5u/ml，蛋白酶酶活達到1508.7u/ml，超氧化物歧化酶酶活達到554.1u/ml；
(2)二次發(fā)酵：接種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，接種量各為5％，二次發(fā)酵35天，即得，將酵素液保存于密封罐中。
測得：脂肪酶酶活達到62.2u/ml，蛋白酶酶活達到2922.1u/ml，超氧化物歧化酶酶活達到1415.5u/ml。
實施例3
(1)制備酵素原液：取金針菇200g、猴頭菇300g、木耳200g、銀耳100g、香菇300g、茶樹菇100g作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，切成片狀，混合均勻，加入蜂蜜，蜂蜜與食用菌重量比為0.5:1，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到酵素原液；測定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活達到5.5u/ml,蛋白酶酶活達到912.5u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到658.2u/ml；
(2)二次發(fā)酵：接種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，接種量各為6％，二次發(fā)酵45天，即得，將酵素液保存于密封罐中。
測得：脂肪酶酶活達到8.2u/ml,蛋白酶酶活達到1204.6u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到815.5u/ml。
實施例4
(1)制備酵素原液：取糙米400g、大豆100g、玉米胚芽200g，薏仁米200g，大麥150g作為原料，進行紫外消毒處理后，在潔凈條件下，混合均勻，加入蜂蜜，蜂蜜與谷物重量比為0.6:1，常溫下發(fā)酵30天，過濾，得到酵素原液；測定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活達到0.5u/ml,蛋白酶酶活達到655.5u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到911.4u/ml；
(2)二次發(fā)酵：接種雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，接種量各為8％，二次發(fā)酵50天，即得，將酵素液保存于密封罐中。
測得：脂肪酶酶活達到0.8u/ml,蛋白酶酶活達到774.1u/ml,超氧化物歧化酶酶活達到1155.8u/ml。
以上所述為本發(fā)明較為優(yōu)選的具體實施例，但本發(fā)明保護范圍并不局限于此，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及發(fā)明構(gòu)思進行相應改變的都應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。