本發(fā)明涉及用于制備包含甜菊醇糖苷的組合物的生物催化方法，所述組合物包括高度純化的甜菊醇糖苷組合物。本發(fā)明還涉及新的甜菊醇糖苷、及其分離方法和新甜菊醇糖苷的用途。發(fā)明背景高強(qiáng)度甜味劑具有高于蔗糖甜度水平許多倍的甜度水平。它們基本上是無熱量的并且通常用于低熱和減熱產(chǎn)品中，包括食品和飲料。高強(qiáng)度甜味劑不會(huì)引起升糖反應(yīng)，這使其適用于針對(duì)糖尿病和其他對(duì)控制碳水化合物攝入感興趣的人群的產(chǎn)品中。甜菊醇糖苷是一類在甜菊(steviarebaudianabertoni)的葉中發(fā)現(xiàn)的化合物，甜菊是南美某些地區(qū)土生土長的菊科(asteraceae)(菊科(compositae))多年生灌木。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上通過單堿基甜菊醇來表征，因位置c13和c19的碳水化合物殘基的存在而不同。它們?cè)谔鹁杖~中累積，構(gòu)成總干重的大約10％-20％。基于干重，在甜菊葉中發(fā)現(xiàn)的四種主要的糖苷通常包括蛇菊苷(9.1％)、萊鮑迪苷a(3.8％)、萊鮑迪苷c(0.6-1.0％)和杜克苷a(0.3％)。其他已知甜菊醇糖苷包括萊鮑迪苷b、c、d、e、f和m、甜菊醇雙苷(steviolbioside)和懸鉤子苷(rubusoside)。盡管用于從甜菊制備甜菊醇糖苷的方法是已知的，但這些方法中的許多不適用于商業(yè)使用。因此，對(duì)簡單、有效且經(jīng)濟(jì)的用于制備包含甜菊醇糖苷的組合物的方法仍然存在需求，所述組合物包括高度純化的甜菊醇糖苷組合物。另外，對(duì)于新的甜菊醇糖苷及其制備和分離方法仍然存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于制備包含靶甜菊醇糖苷的組合物的生物催化方法，通過將包含有機(jī)底物的起始組合物與微生物和/或生物催化劑接觸，由此產(chǎn)生包含靶甜菊醇糖苷的組合物。起始組合物包含有機(jī)化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物選自多元醇和各種碳水化合物。靶甜菊醇糖苷可以是任何甜菊醇糖苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊醇單苷(steviolmonoside)、甜菊醇雙苷、懸鉤子苷、杜克苷b、杜克苷a、萊鮑迪苷b、萊鮑迪苷g、蛇菊苷、萊鮑迪苷c、萊鮑迪苷f、萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷i、萊鮑迪苷e、萊鮑迪苷h、萊鮑迪苷l、萊鮑迪苷k、萊鮑迪苷j、萊鮑迪苷m、萊鮑迪苷m2、萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷d2、萊鮑迪苷n、萊鮑迪苷o或合成的甜菊醇糖苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是萊鮑迪苷a。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是萊鮑迪苷d。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是萊鮑迪苷m。微生物可以是包含至少一種適用于將起始組合物轉(zhuǎn)化成靶甜菊醇糖苷的生物催化劑的任何微生物。生物催化劑可以位于微生物表面上和/或微生物內(nèi)部。生物催化劑包括甜菊醇生物合成酶和udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羥戊酸(mva)途徑酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非-甲羥戊酸-2-c-甲基-d-赤蘚醇-4-磷酸途徑(mep/doxp)酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶選自香葉基香葉基二磷酸合成酶、柯巴基(copalyl)二磷酸合成酶、貝殼杉烯合成酶、貝殼杉烯氧化酶、異貝殼杉烯酸13-羥化酶(kah)、甜菊醇合成酶、脫氧木酮糖5-磷酸合成酶(dxs)、d-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(dxr)、4-二磷酸胞苷(cytidyl)-2-c-甲基-d-赤蘚醇合成酶(cms)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶(cmk)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤蘚醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶(mcs)、1-羥基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸合成酶(hds)、1-羥基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸還原酶(hdr)、乙酰乙酰基-coa硫解酶、截短的hmg-coa還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、細(xì)胞色素p450還原酶等。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物來提供靶甜菊醇糖苷的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。微生物可以是任一種合適的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物可以是例如大腸桿菌(e.coli)、酵母屬(saccharomycessp.)、曲霉屬(aspergillussp.)、畢赤酵母屬(pichiasp.)、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、耶氏酵母屬(yarrowiasp.)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是合成的。在一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶選自u(píng)gt74g1、ugt85c2、ugt76g1、ugt91d2或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至懸鉤子苷形成蛇菊苷的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugt91d2或與ugt91d2具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt91d2變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至蛇菊苷形成萊鮑迪苷a的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷a形成萊鮑迪苷d的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugt91d2或與ugt91d2具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt91d2變體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷d形成萊鮑迪苷m的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷i形成萊鮑迪苷m的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugtsl或與ugtsl具有高于75％氨基酸序列同一性的ugtsl變體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是任一種能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷e形成萊鮑迪苷m的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在特定實(shí)施方案中，udp-葡葡糖基轉(zhuǎn)移酶是ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括再循環(huán)udp來提供udp-葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過提供再循環(huán)催化劑和再循環(huán)底物來再循環(huán)udp，使得使用催化量的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和udp-葡萄糖來進(jìn)行甜菊醇糖苷底物變成靶甜菊醇糖苷的生物轉(zhuǎn)化(圖3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，再循環(huán)催化劑是蔗糖合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，再循環(huán)底物是蔗糖。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括純化包含靶甜菊醇糖苷的組合物?？梢酝ㄟ^任何合適的方法，如，例如，結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取、色譜分離或這些方法的組合，來純化包含靶甜菊醇糖苷的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，純化產(chǎn)生包含基于無水基礎(chǔ)高于約80％重量的靶甜菊醇糖苷的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化產(chǎn)生包含高于約90％重量的靶甜菊醇糖苷的組合物。在特定實(shí)施方案中，組合物包含高于約95％重量的靶甜菊醇糖苷。靶甜菊醇糖苷可以是任何多晶形或無定形形式，包括水解物、溶劑化物、無水物或其組合。本發(fā)明還提供了包含通過所公開的方法制備的組合物的消費(fèi)產(chǎn)品。合適的消費(fèi)品包括，但不限于，食品、飲料、藥物組合物、煙草制品、營養(yǎng)保健品組合物、口服衛(wèi)生組合物和化妝品組合物。本發(fā)明還提供新的甜菊醇糖苷rebd2和rebm2，其分別是rebd和rebm的異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離并純化的rebd2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離并純化的rebm2。rebd2和rebm2也存在于本文中公開的任一種消費(fèi)品中。在特定實(shí)施方案中，提供了包含rebd2和/或rebm2的飲料。本文中還提供了制備rebd2和rebm2的方法。兩者都是在reba至rebd的生物轉(zhuǎn)化過程中形成的。認(rèn)為rebm2從原位rebd2的生物轉(zhuǎn)化形成。本文中還提供了通過具有β-1,6-葡糖苷酶活性的酶，選擇性水解rebd2和/或rebm2中的1,6-β-糖苷鍵的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了選擇性水解rebd2和/或rebm2中的1,6-β-糖苷鍵，至少一種酶選自糖苷酶(nc-iubmbec3.2.1.)、葡糖苷酶、葡聚糖酶、isolase(011410；nationalenzymecompany，usa)、aromase(gly0151441；amanoenzyme，日本)、柚皮苷酶(nah0550102；amanoenzyme，日本)、纖維素酶(例如，來自里氏木霉(trichodermareesei)atcc26921的纖維素酶；sigmac2730)、纖維二糖酶(例如，來自米曲霉(aspergillusniger)的纖維二糖酶，sigmac6105)、viscozymel(sigmav2010)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于制備包含rebd2的組合物的方法，其包括：(a)將包含reba的起始組合物與能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebd2的組合物，和(b)分離包含rebd2的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本本發(fā)明是用于制備包含rebm的組合物的方法，其包括：(a)將包含rebd的起始組合物與能夠?qū)ebd轉(zhuǎn)化成rebm的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebm的組合物，和(b)分離包含rebm的組合物。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于制備包含rebm的組合物的方法，其包括：(a)將包含reba的起始組合物與能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebd的組合物，和(b)任選地，分離包含rebd的組合物，(c)將包含rebd的組合物與能夠?qū)ebd轉(zhuǎn)化成rebm的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebm的組合物，和(d)分離包含rebm的組合物。組合物可以進(jìn)一步被純化，以提供基于干基具有高于約95％總量的純度的rebd或rebm。附圖簡述包括附圖來提供本發(fā)明的進(jìn)一步理解。附圖說明了本發(fā)明的實(shí)施方案并且與描述一起用于解釋本發(fā)明實(shí)施方案的原理。圖1顯示了rebm的結(jié)構(gòu)。圖2顯示了從蛇菊苷生物催化生產(chǎn)rebm。圖3顯示了使用酶ugt76g1以及伴隨經(jīng)由蔗糖合成酶的udp至udp葡萄糖的再循環(huán)，從蛇菊苷生物催化生產(chǎn)reba。圖4顯示了rebm的ir譜。圖5顯示了如實(shí)施例14中詳述的，從rebd生物催化生產(chǎn)rebm的產(chǎn)物的hplc色譜。具有24.165分鐘停留時(shí)間的峰對(duì)應(yīng)于未處理的rebd。具有31.325分鐘停留時(shí)間的峰對(duì)應(yīng)于rebm。圖6顯示了通過生物催化從rebd產(chǎn)生的純化rebm的hplc色譜。圖7顯示了rebm標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜。圖8顯示了rebm標(biāo)準(zhǔn)品以及從rebd的生物轉(zhuǎn)化純化的rebm的共同注入的hplc色譜。圖9顯示了rebm標(biāo)準(zhǔn)品以及從rebd生物合成后純化的rebm的1hnmr譜的重疊。圖10顯示了從rebd生物催化產(chǎn)生后純化的rebm的hrms譜。圖11顯示了半合成甜菊醇糖苷混合物的lc-ms分析，批號(hào)cb-2977-106，顯示出tic(a)、1.8分鐘處的峰的ms(b)、4.1分鐘處的rebm2峰的ms(c)、6.0分鐘處的rebd峰的ms(d)、7.7分鐘處的rebd2峰的ms(e)、9.4分鐘處的峰的ms(f)、15.2分鐘處的萊鮑迪苷a峰的ms(g)、16.5分鐘處的峰的ms(h)和18.3分鐘處的峰的ms(i)。圖12顯示了半合成甜菊醇糖苷混合物的痕跡，批號(hào)cb-2977-106。色譜網(wǎng)格線不均勻，因?yàn)闄z測器在注入后14分鐘重新校準(zhǔn)。圖13顯示了半合成甜菊醇糖苷混合物的hplc分析，批號(hào)cb-2977-106(a)、分離的rebm2(b)、分離的rebd(c)和分離的rebd2(d)。圖14顯示了rebd2的1hnmr譜(500mhz，吡啶-d5)。圖15顯示了rebd2的13cnmr譜(125mhz，吡啶-d5)。圖16顯示了rebd2的13cnmr譜(125mhz，吡啶-d5)的展開。圖17顯示了rebd2的1h-1hcosy譜(500mhz，吡啶-d5)。圖18顯示了rebd2的hsqc-dept譜(500mhz，吡啶-d5)。圖19顯示了rebd2的hmbc譜。圖20顯示了rebd2的hmbc譜(500mhz，吡啶-d5)的展開。圖21顯示了rebm2的1hnmr譜(500mhz，d2o)。圖22顯示了rebm2的13cnmr譜(500mhz，d2o/tsp)。圖23顯示了rebm2的13cnmr譜(125mhz，d2o/tsp)的展開。圖24顯示了rebm2的1h-1hcosy譜(500mhz，d2o)。圖25顯示了rebm2的hsqc-dept譜(500mhz，d2o)。圖26顯示了rebm2的hmbc譜(500mhz，d2o)。圖27顯示了rebm2的hmbc譜(500mhz，d2o)的展開。圖28顯示了針對(duì)實(shí)施例47中進(jìn)行的分析的hplc色譜。圖29顯示了針對(duì)實(shí)施例47中進(jìn)行的分析的hplc色譜。圖30顯示了實(shí)施例47中進(jìn)行的lc-cad分析。圖31顯示了如實(shí)施例47中所述的esi-tof質(zhì)譜。圖32顯示了如實(shí)施例47中所述的質(zhì)譜。圖33顯示了如實(shí)施例47中所述的ms/ms譜。圖34顯示了如實(shí)施例47中所述的ms/ms譜。圖35顯示了如實(shí)施例47中所述的1hnmr的結(jié)果。圖36顯示了如實(shí)施例47中所述的1hnmr的結(jié)果。圖37顯示了如實(shí)施例47中所述的1hnmr的結(jié)果。圖38顯示了如實(shí)施例47中所述的13cnmr的結(jié)果。圖39顯示了如實(shí)施例47中所述的13cnmr的結(jié)果。圖40顯示了如實(shí)施例47中所述的1h-1hcosy的結(jié)果。圖41顯示了如實(shí)施例47中所述的hsqc-dept的結(jié)果。圖42顯示了如實(shí)施例47中所述的hmbc的結(jié)果。圖43顯示了如實(shí)施例47中所述的hmbc的結(jié)果。圖44顯示了如實(shí)施例47中所述的noesy的結(jié)果。圖45顯示了如實(shí)施例47中所述的noesy的結(jié)果。圖46顯示了如實(shí)施例47中所述的1dtocsy的結(jié)果。圖47顯示了如實(shí)施例47中所述的1dtocsy的結(jié)果。圖48顯示了如實(shí)施例47中所述的1dtocsy的結(jié)果。圖49顯示了如實(shí)施例47中所述的1dtocsy的結(jié)果。圖50顯示了如實(shí)施例47中所述的1dtocsy的結(jié)果。圖51顯示了hplc(cad)圖，該圖顯示了蛇菊苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷a。圖52顯示了hplc(cad)圖，該圖顯示了萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m。圖53a-e顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例20的hplc測試結(jié)果。圖54顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例21的hplc測試結(jié)果。圖55a-e顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例22的hplc測試結(jié)果。圖56a-b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例23的hplc測試結(jié)果。圖57a-b顯示了lc-ms色譜，該色譜顯示了實(shí)施例24的lc-ms測試結(jié)果。圖58顯示了圖，該圖顯示了實(shí)施例25的反應(yīng)特征。圖59a-b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例28的hplc測試結(jié)果。圖60a-b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例29的hplc測試結(jié)果。圖61顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例30的hplc測試結(jié)果。圖62顯示了ls-ms色譜，該色譜顯示了實(shí)施例31的ls-ms測試結(jié)果。圖63a-c顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例32的hplc測試結(jié)果。圖64顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例35的hplc測試結(jié)果。圖65顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例37的hplc測試結(jié)果。圖66顯示了圖，該圖顯示了實(shí)施例43的hplc結(jié)果。圖67顯示了圖，該圖顯示了實(shí)施例46的反應(yīng)特征。圖68a-f顯示了實(shí)施例49的反應(yīng)特征。圖69a-c顯示了圖，該圖顯示了實(shí)施例50的hplc結(jié)果。圖70a-d顯示了實(shí)施例51的反應(yīng)特征圖。圖71顯示了實(shí)施例52的反應(yīng)特征圖。圖72a顯示了實(shí)施例54的反應(yīng)特征圖。圖72b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例54的hplc分析。圖73a顯示了實(shí)施例55的反應(yīng)特征圖。圖73b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例55的hplc分析。圖74a顯示了實(shí)施例56的反應(yīng)特征圖。圖74b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例56的hplc分析。圖75a顯示了實(shí)施例57的反應(yīng)特征圖。圖75b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例57的hplc分析。圖76a顯示了實(shí)施例58的反應(yīng)特征圖。圖76b顯示了hplc色譜，該色譜顯示了實(shí)施例58的hplc分析。詳述本發(fā)明提供了用于制備包含靶甜菊醇糖苷的組合物的生物催化方法，通過將包含有機(jī)底物的起始組合物與微生物接觸，由此產(chǎn)生包含靶甜菊醇糖苷的組合物。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于從起始組合物制備甜菊醇糖苷的有效生物催化方法，所述甜菊醇糖苷特別是蛇菊苷、rebe、reba、rebd、rebd2、rebm和rebm2。如本文中使用的，“生物催化”或“生物催化的”是指使用天然或遺傳工程化的生物催化劑，如細(xì)胞、蛋白酶，對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)步驟的化學(xué)轉(zhuǎn)化。生物催化包括發(fā)酵、生物合成和生物轉(zhuǎn)化方法。分離的酶和完整細(xì)胞生物催化方法都是本領(lǐng)域已知的。生物催化劑蛋白酶可以是天然產(chǎn)生的蛋白或是重組蛋白。本文中所列的所有序列，包括任何核酸或氨基酸序列，包括與本文中所述的核酸或氨基酸序列具有>75％、>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％序列同一性的變體。如本文中使用的，術(shù)語“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于天然產(chǎn)生的甜菊醇糖苷，例如，甜菊醇單苷、甜菊醇雙苷、懸鉤子苷、杜克苷b、杜克苷a、萊鮑迪苷b、萊鮑迪苷g、蛇菊苷、萊鮑迪苷c、萊鮑迪苷f、萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷i、萊鮑迪苷e、萊鮑迪苷h、萊鮑迪苷l、萊鮑迪苷k、萊鮑迪苷j、萊鮑迪苷m、萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷m2、萊鮑迪苷d2、萊鮑迪苷n、萊鮑迪苷o，合成甜菊醇糖苷，例如，酶糖基化的甜菊醇糖苷，及其組合。甜菊醇及其糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)(glc＝葡萄糖)起始組合物如本文中使用的，“起始組合物”是指含有一種或多種包含至少一個(gè)碳原子的有機(jī)化合物的任何組合物(通常是水溶液)。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物選自多元醇和各種碳水化合物。術(shù)語“多元醇”是指含有超過一個(gè)羥基基團(tuán)的分子。多元醇可以是分別含有2、3和4個(gè)羥基基團(tuán)的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇還可以含有超過四個(gè)羥基基團(tuán)，如戊元醇、己元醇、庚元醇等，其分別含有5、6或7個(gè)羥基基團(tuán)。另外，多元醇還可以是糖醇、多元醇(polyhydricalcohol)或多元醇(polyalcohol)，其是碳水化合物的還原形式，其中羰基基團(tuán)(醛或酮，還原糖)已經(jīng)還原成伯或叔羥基基團(tuán)。多元醇的實(shí)例包括，但不限于，赤蘚醇、麥芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、木糖醇、異麥芽酮糖醇、丙二醇、丙三醇、蘇糖醇、半乳糖醇、氫化異麥芽酮糖、還原的異麥芽低聚糖、還原的木糖低聚糖、還原的龍膽-低聚糖、還原的麥芽糖糖漿、還原的葡萄糖糖漿、氫化淀粉水解物、多羥糖醇(polyglycitol)和糖醇或任何其他能夠被還原的碳水化合物。術(shù)語“碳水化合物”是指通式(ch2o)n(其中n為3-30)的被多個(gè)羥基基團(tuán)取代的醛或酮化合物，及其寡聚物和聚合物。本發(fā)明的碳水化合物另外可以在一個(gè)或多個(gè)位置被取代或脫氧。如本文中使用的，碳水化合物包括未修飾的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物和修飾的碳水化合物。如本文中使用的，短語“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”和“修飾的碳水化合物”是同義的。修飾的碳水化合物表示其中已經(jīng)添加、去除或取代至少一個(gè)原子或其組合的任何碳水化合物。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的單糖、雙糖、低聚糖和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任選可以在任何相應(yīng)的c-位置脫氧，和/或被一個(gè)或多個(gè)部分取代，所述部分如氫、鹵素、鹵代烷基、羧基、?；?、酰基氧、氨基、酰胺、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巰基、亞氨基、磺酰基、硫基、亞磺酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺、膦?；?、次膦?；?、磷?；?、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨基甲酰、磷酸基、膦酸基(phosphonato)，或任何其他可行的官能團(tuán)，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物起到改善甜味劑組合物的甜味的作用。根據(jù)本發(fā)明可以使用的碳水化合物的實(shí)例包括，但不限于，塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各種環(huán)糊精、環(huán)狀低聚糖、各種類型的麥芽糖糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、蘇糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麥芽糖、轉(zhuǎn)化糖、異海藻糖、新海藻糖、異麥芽酮糖、赤蘚糖、脫氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纖維二糖、支鏈淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、巖藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸-內(nèi)酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜低聚糖、異麥芽低聚糖(異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖封端的低聚糖、龍膽低聚糖(龍膽二糖、龍膽三糖、龍膽四糖等)、山梨糖、黑曲霉低聚糖、帕拉金糖低聚糖、果糖低聚糖(蔗果三糖、真菌四糖等)、麥芽四糖醇、麥芽三糖醇、麥芽低聚糖(麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖、麥芽庚糖等)、淀粉、菊粉、菊粉-低聚糖、乳果糖、蜜二糖、蜜三糖、核糖、異構(gòu)化液體糖(如高果糖玉米糖漿)、偶聯(lián)糖和大豆低聚糖。另外，本文中使用的碳水化合物可以是d-或l-構(gòu)型。起始組合物可以是合成的或純化的(部分或完全)、商業(yè)上可獲得的或制得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是甘油。在另一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是葡萄糖。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是蔗糖。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是淀粉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是麥芽糖糊精。在另一個(gè)實(shí)施方案中，起始組合物是甜菊醇糖苷。如本文中所述的，起始組合物的有機(jī)化合物用作用于生產(chǎn)靶甜菊醇糖苷的底物。靶甜菊醇糖苷本發(fā)明方法的靶甜菊醇糖苷可以是通過本文中公開的方法制備的任一種甜菊醇糖苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷選自甜菊醇單苷、甜菊醇雙苷、懸鉤子苷、杜克苷b、杜克苷a、萊鮑迪苷b、萊鮑迪苷g、蛇菊苷、萊鮑迪苷c、萊鮑迪苷f、萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷i、萊鮑迪苷e、萊鮑迪苷h、萊鮑迪苷l、萊鮑迪苷k、萊鮑迪苷j、萊鮑迪苷m、萊鮑迪苷m2、萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷d2、萊鮑迪苷n、萊鮑迪苷o或其他甜菊醇糖苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是reba。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是rebe。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是rebd。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是rebd2。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是rebm。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，靶甜菊醇糖苷是rebm2。靶甜菊醇糖苷可以是任一種聚合或無定形形式，包括水解物、溶劑化物、無水或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebd的生物催化方法。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebd2的生物催化方法。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebm的生物催化方法。在更多實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebm2的生物催化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebi的生物催化方法。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于生產(chǎn)rebe的生物催化方法。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括從起始組合物中分離靶甜菊醇糖苷?？梢酝ㄟ^任何合適的方法，如，例如，結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取、色譜分離或這些方法的組合，來分離靶甜菊醇糖苷。在特定實(shí)施方案中，本文中所述的方法獲得高度純化的靶甜菊醇糖苷組合物。如本文中使用的，術(shù)語“高度純化的”是指基于無水基礎(chǔ)具有高于約80％重量的靶甜菊醇糖苷的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，高度純化的靶甜菊醇糖苷組合物基于無水基礎(chǔ)含有高于約90％重量的靶甜菊醇糖苷，如，例如，基于干基，高于約91％、高于約92％、高于約93％、高于約94％、高于約95％、高于約96％、高于約97％、高于約98％或高于約99％靶甜菊醇糖苷含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebm時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基具有高于約90％重量的rebm含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebm時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebm含量的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebm2時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基具有高于約90％重量的rebm2含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebm2時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebm2含量的組合物。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebd時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的rebd含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebd時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebd含量的組合物。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebd2時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的rebd2含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebd2時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebd2含量的組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是reba時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的reba含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是reba時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的reba含量的組合物。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebe時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的rebe含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebe時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebe含量的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebi時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的rebi含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是rebi時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的rebi含量的組合物。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基高于約90％重量的蛇菊苷含量的組合物。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，當(dāng)靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷時(shí)，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于約95％重量的蛇菊苷含量的組合物。微生物在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將微生物與起始組合物接觸，以產(chǎn)生包含靶甜菊醇糖苷的組合物。微生物可以是具有適用于將起始組合物轉(zhuǎn)化成靶甜菊醇糖苷的生物催化劑的任何微生物。這些生物催化劑在微生物的基因組內(nèi)被編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物可以是，例如，大腸桿菌(e.coli)、酵母屬(saccharomycessp.)、曲霉屬(aspergillussp.)、畢赤酵母屬(pichiasp.)、芽孢桿菌屬(bacillussp.)、耶氏酵母屬(yarrowiasp.)等。生物催化劑可以位于微生物細(xì)胞的表面上和/或微生物細(xì)胞的內(nèi)部?？梢詮奈⑸锓蛛x出生物催化劑并用于將起始組合物轉(zhuǎn)化成靶甜菊醇糖苷。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式，包括但不限于微生物細(xì)胞的裂解、離心、過濾，來實(shí)現(xiàn)所述分離?？梢詮奈⑸锾崛∩锎呋瘎?胞外酶)并用于將起始組合物轉(zhuǎn)化成靶甜菊醇糖苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物催化劑是甜菊醇生物合成酶和udp-糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。甜菊醇生物合成可以是任何甜菊醇生物合成酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羥戊酸(mva)途徑酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非-甲羥戊酸2-c-甲基-d-赤蘚醇-4-磷酸途徑(mep/doxp)酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，甜菊醇生物合成酶選自香葉基香葉基二磷酸合成酶、柯巴基二磷酸合成酶、貝殼杉烯合成酶、貝殼杉烯氧化酶、異貝殼杉烯酸13-羥化酶(kah)、甜菊醇合成酶、脫氧木酮糖5-磷酸合成酶(dxs)、d-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(dxr)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤蘚醇合成酶(cms)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶(cmk)、4-二磷酸胞苷-2-c-甲基-d-赤蘚醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶(mcs)、1-羥基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸合成酶(hds)、1-羥基-2-甲基-2(e)-丁烯基4-二磷酸還原酶(hdr)、乙酰乙酰基-coa硫解酶、截短的hmg-coa還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、細(xì)胞色素p450還原酶等，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物來提供靶甜菊醇糖苷的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是游離的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于從無機(jī)或有機(jī)材料制得的固體支持物上。適用于固定微生物的固體支持物的非限制性實(shí)例包括衍化的纖維素或玻璃、陶瓷、金屬氧化物或膜。例如，微生物可以通過共價(jià)連接、吸附、交聯(lián)、包埋或包膠，固定于固體支持物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物在水性介質(zhì)中，所述水性介質(zhì)包含水和選自碳源、能源、氮源、微量元素、維生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽、有機(jī)酸和礦物酸、堿等的各種成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽。氮源可以包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含緩沖劑。合適的緩沖劑包括，但不限于，pipes緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含磷酸緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述介質(zhì)還可以包括有機(jī)溶劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至懸鉤子苷，由此產(chǎn)生蛇菊苷的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt91d2或與ugt91d2具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt91d2變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至懸鉤子苷，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷e的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugtsl2或與ugtsl2具有高于75％氨基酸序列同一性的ugtsl2變體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷e，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷d的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至蛇菊苷，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷a的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷a，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷d和/或萊鮑迪苷d2和/或萊鮑迪苷m2的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt91d2或ugtsl2或其與ugt91d2或ugtsl2具有高于75％氨基酸序列同一性的變體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷i，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷m的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugtsl或與ugtsl具有高于75％氨基酸序列同一性的ugtsl變體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷e，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷m的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶能夠添加至少一個(gè)葡萄糖單體，以產(chǎn)生靶甜菊醇糖苷，與選自以下geninfo識(shí)別號(hào)列表的至少一種酶具有高于75％氨基酸序列同一性，優(yōu)選選自表1中呈現(xiàn)的組，并且更優(yōu)選選自表2中呈現(xiàn)的組。表1表2gi編號(hào)登錄號(hào)來源460409128xp.004249992.1番茄460386018xp.004238697.1番茄460409134xp.004249995.1番茄460410132xp.004250485.1番茄460410130xp.004250484.1番茄460410128xp.004250483.1番茄460378310xp.004234916.1番茄209954733bag80557.1枸杞209954725bag80553.1枸杞在再另一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶是能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)葡萄糖單體添加至萊鮑迪苷d，由此產(chǎn)生萊鮑迪苷m和/或萊鮑迪苷m2的任何udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是例如ugt76g1或與ugt76g1具有高于75％氨基酸序列同一性的ugt76g1變體。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括再循環(huán)udp，以提供udp-葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過提供再循環(huán)催化劑來再循環(huán)udp，即，能夠udp-葡萄糖生產(chǎn)過剩的生物催化劑，并再循環(huán)底物，使得使用催化量的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和udp-葡萄糖進(jìn)行底物甜菊醇糖苷轉(zhuǎn)化成靶甜菊醇糖苷(圖3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，udp-葡萄糖再循環(huán)催化劑是蔗糖合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，再循環(huán)底物是蔗糖。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括水解rebd2和/或rebm2中的1,6-β-糖苷鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過提供β-葡糖苷酶水解rebd2和/或rebm2中的1,6-β-糖苷鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，與udp-再循環(huán)生物催化劑和ugt一起提供β-葡糖苷酶，以最小化最終反應(yīng)混合物中的rebd2和/或rebm2的含量并最大化rebm的產(chǎn)量。在特定實(shí)施方案中，為了最小化最終反應(yīng)混合物中的rebd2和/或rebm2含量和最大化rebm的產(chǎn)量，與udp-再循環(huán)催化劑ugt76g1和ugtsl2或其與ugt76g1或ugtsl2具有高于75％氨基酸序列同一性的變體一起提供β-葡糖苷酶。任選地從所得到的組合物中純化靶甜菊醇糖苷?？梢酝ㄟ^任何合適的方法來實(shí)現(xiàn)從反應(yīng)介質(zhì)中純化靶甜菊醇糖苷，以提供高度純化的靶甜菊醇糖苷組合物。合適的方法包括結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取(液相或固相)、色譜分離、hplc(制備性或分析)，或這些方法的組合?；衔锖头椒ū景l(fā)明還提供了分離和高度純化的rebd2。rebd2是rebd的異構(gòu)體并具有以下結(jié)構(gòu)：13-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-3-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)氧]等效-16-貝殼杉烯-19-酸(ent-kaur-16-en-19-oicacid)-[(6-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)酯]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于無水基礎(chǔ)具有高于約95％重量純度的rebd2，如，例如，高于約96％重量、高于約97％重量、高于約98％重量或高于約99％重量。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在甜菊醇糖苷混合物中提供了具有高于約95％重量純度的rebd2，如，例如，高于約96％重量、高于約97％重量、高于約98％重量或高于約99％重量。本發(fā)明還提供了包含rebd2的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備rebd2的方法，包括：a.將包含reba的起始組合物與能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebd2的組合物；和b.分離包含rebd2的組合物。在一些實(shí)施方案中，能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的酶是udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，如，例如，ugt91d2、ugtsl、ugtsl_sc、ugtsl2(gino.460410132版本xp_004250485.1)、gino.460409128(ugtsl)版本xp_004249992.1、gino.115454819版本np_001051010.1、gino.187373030版本acd03249.1、gino.222619587版本eee55719.1、gino.297795735版本xp_002865752.1或eugt11。能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的酶可以是固定的或以重組微生物的形式來提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶是固定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以重組微生物的形式來提供酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是游離的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于由無機(jī)或有機(jī)材料制成的固體支持物上。適用于固定微生物的固體支持物的非限制性實(shí)例包括衍化的纖維素或玻璃、陶瓷、金屬氧化物或膜。微生物可以例如，通過共價(jià)連接、吸附、交聯(lián)、包埋或包膠，固定于固體支持物上。合適的微生物包括，但不限于，大腸桿菌、酵母屬、曲霉屬、畢赤酵母屬、芽孢桿菌屬、耶氏酵母屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物在水性介質(zhì)中，所述水性介質(zhì)包含水和選自碳源、能源、氮源、微量元素、維生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽、有機(jī)酸和礦物酸、堿等的各種成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽。氮源可以包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含緩沖劑。合適的緩沖劑包括，但不限于，pipes緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述介質(zhì)還可以包括有機(jī)溶劑。在特定實(shí)施方案中，酶是能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并且包含在大腸桿菌中。在更特別的實(shí)施方案中，酶選自u(píng)gt91d2、ugtsl、ugtsl_sc、ugtsl2(gino.460410132版本xp_004250485.1)、gino.460409128(ugtsl)版本xp_004249992.1、gino.115454819版本np_001051010.1、gino.187373030版本acd03249.1、gino.222619587版本eee55719.1、gino.297795735版本xp_002865752.1或eugt11，并且包含在大腸桿菌中。在再更特別的實(shí)施方案中，酶是ugtsl2并且包含在大腸桿菌中。可以通過任何合適的方法來實(shí)現(xiàn)從反應(yīng)介質(zhì)中分離rebd2，以提供包含rebd2的組合物。合適的方法包括，但不限于，裂解、結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取(液相或固相)、色譜分離、hplc(制備性或分析)，或這些方法的組合。在特定的實(shí)施方案中，可以通過裂解和離心來實(shí)現(xiàn)分離。在一些實(shí)施方案中，分離可以獲得基于無水基礎(chǔ)低于約95％重量的rebd2純度，并且組合物可以含有例如甜菊醇糖苷和/或殘余的反應(yīng)產(chǎn)物?？梢詫瑀ebd2的組合物進(jìn)一步純化，來提供高度純化的rebd2，即，基于無水基礎(chǔ)具有高于約95％重量純度的rebd2。在一些實(shí)施方案中，可以將包含rebd2的組合物進(jìn)一步純化，以提供基于無水基礎(chǔ)具有高于約96％、高于約97％、高于約98％或高于約99％重量純度的rebd2?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式來實(shí)現(xiàn)純化，所述方式包括但不限于，結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取(液相或固相)、色譜分離、hplc(制備性或分析)，或這些方法的組合。在特定實(shí)施方案中，使用hplc來純化rebd2。在更特別的實(shí)施方案中，使用半制備性hplc來純化rebd2。例如，可以使用兩步半制備性hplc純化。第一步利用c18柱，使用含有a(水中25％mecn)和b(水中30％mecn)的移動(dòng)相，所述移動(dòng)相具有以下梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000第二步利用相同的柱和條件，但只使用等度移動(dòng)相：水中20％mecn。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到特定的柱、移動(dòng)相、注射體積和其他hplc參數(shù)可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離和高度純化的rebm2。rebm2是rebm的異構(gòu)體并具有以下結(jié)構(gòu)：(13-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-3-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)氧]等效-16-貝殼杉烯-19-酸[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-6-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)酯])在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于無水基礎(chǔ)具有高于約95％重量純度的rebm2，如，例如，高于約96％重量、高于約97％重量、高于約98％重量或高于約99％重量。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在甜菊醇糖苷混合物中提供了具有高于約95％重量純度的rebm2，如，例如，高于約96％重量、高于約97％重量、高于約98％重量或高于約99％重量。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在甜菊提取物中提供了具有高于約95％重量純度的rebm2，如，例如，高于約96％重量、高于約97％重量、高于約98％重量或高于約99％重量。本發(fā)明還提供了包含rebm2的組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在reba生物轉(zhuǎn)化成rebd的過程中產(chǎn)生rebm2。如上所述，reba生物轉(zhuǎn)化成rebd還產(chǎn)生了rebd2。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備rebm2的方法，包括：a.將包含reba和/或rebd2的起始組合物與能夠?qū)eba和/或rebd2轉(zhuǎn)化成rebm2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebm2的組合物；和b.分離包含rebm2的組合物。不希望受理論的束縛，當(dāng)前認(rèn)為途徑從reba轉(zhuǎn)化成rebd2開始，接著是rebd2轉(zhuǎn)化成rebm2。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備rebm2的方法，包括：a.將包含rebd2的起始組合物與能夠?qū)ebd2轉(zhuǎn)化成rebm2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebm2的組合物；和b.分離包含rebm2的組合物。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備rebm2的方法包括：a.將包含reba的起始組合物與能夠?qū)eba轉(zhuǎn)化成rebd2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebd2的組合物；b.任選地，分離包含rebd2的組合物；c.將包含rebd2的起始組合物與能夠?qū)ebd2轉(zhuǎn)化成rebm2的酶、udp-葡萄糖和任選的udp-葡萄糖再循環(huán)酶接觸，以產(chǎn)生包含rebm2的組合物；和d.分離包含rebm2的組合物。酶可以是udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，如，例如，ugt91d2、ugtsl、ugtsl_sc、ugtsl2(gino.460410132版本xp_004250485.1)、gino.460409128(ugtsl)版本xp_004249992.1、gino.115454819版本np_001051010.1、gino.187373030版本acd03249.1、gino.222619587版本eee55719.1、gino.297795735版本xp_002865752.1或eugt11。酶可以是固定的或在重組微生物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶是固定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶在重組微生物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是游離的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于由無機(jī)或有機(jī)材料制成的固體支持物上。適用于固定微生物的固體支持物的非限制性實(shí)例包括衍化的纖維素或玻璃、陶瓷、金屬氧化物或膜。微生物可以例如，通過共價(jià)連接、吸附、交聯(lián)、包埋或包膠，固定于固體支持物上。合適的微生物包括，但不限于，大腸桿菌、酵母屬、曲霉屬、畢赤酵母屬、芽孢桿菌屬、耶氏酵母屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物在水性介質(zhì)中，所述水性介質(zhì)包含水和選自碳源、能源、氮源、微量元素、維生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽、有機(jī)酸和礦物酸、堿等的各種成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽。氮源可以包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含緩沖劑。合適的緩沖劑包括，但不限于，pipes緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑。在特定實(shí)施方案中，所述介質(zhì)包含磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述介質(zhì)還可以包括有機(jī)溶劑。在特定實(shí)施方案中，酶是能夠?qū)eba和/或rebd2轉(zhuǎn)化成rebm2的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并且包含在大腸桿菌中。在更特別的實(shí)施方案中，酶選自u(píng)gt91d2、ugtsl、ugtsl_sc、ugtsl2(gino.460410132版本xp_004250485.1)、gino.460409128(ugtsl)版本xp_004249992.1、gino.115454819版本np_001051010.1、gino.187373030版本acd03249.1、gino.222619587版本eee55719.1、gino.297795735版本xp_002865752.1或eugt11并且包含在大腸桿菌中。在再更特別的實(shí)施方案中，酶是ugtsl2并且包含在大腸桿菌中。可以通過任何合適的方法來實(shí)現(xiàn)從反應(yīng)介質(zhì)中分離rebm2，以提供包含rebm2的組合物。合適的方法包括，但不限于，裂解、結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取(液相或固相)、色譜分離、hplc(制備性或分析)，或這些方法的組合。在特定的實(shí)施方案中，可以通過裂解和離心來實(shí)現(xiàn)分離。在一些實(shí)施方案中，分離可以獲得基于無水基礎(chǔ)低于約95％重量的rebm2純度，并且組合物可以含有例如甜菊醇糖苷和/或殘余的反應(yīng)產(chǎn)物?？梢詫瑀ebm2的組合物進(jìn)一步純化，來提供高度純化的rebm2，即，基于無水基礎(chǔ)具有高于約95％重量純度的rebm2。在一些實(shí)施方案中，可以將包含rebm2的組合物進(jìn)一步純化，以提供基于無水基礎(chǔ)具有高于約96％、高于約97％、高于約98％或高于約99％重量純度的rebm2。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式來實(shí)現(xiàn)純化，所述方式包括但不限于，結(jié)晶、通過膜分離、離心、提取(液相或固相)、色譜分離、hplc(制備性或分析)，或這些方法的組合。在特定實(shí)施方案中，使用hplc來純化rebm2。在更特別的實(shí)施方案中，使用半制備性hplc來純化rebm2。例如，可以使用兩步半制備性hplc純化。第一步利用c18柱，使用含有a(水中25％mecn)和b(水中30％mecn)的移動(dòng)相，所述移動(dòng)相具有以下梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000第二步利用相同的柱和條件，但只使用等度移動(dòng)相：水中20％mecn。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到特定的柱、移動(dòng)相、注射體積和其他hplc參數(shù)可以改變。根據(jù)本發(fā)明制備的純化甜菊醇糖苷可以用于各種消費(fèi)品中，所述消費(fèi)品包括但不限于食品、飲料、藥物組合物、煙草制品、營養(yǎng)保健品組合物、口腔衛(wèi)生組合物和化妝品組合物。本發(fā)明獲得的高純度rebm，具有1291.29的分子量，c56h90o33的分子式，cas注冊(cè)號(hào)1220616-44-3，并且結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)于圖1中，是白色和無味的粉末形式。當(dāng)與10％蔗糖溶液相比時(shí)，化合物甜度比糖甜約200倍。紅外吸收光譜顯示于圖4中。純的rebm化合物的其他特性包括249-250℃的熔點(diǎn)和50％乙醇中[α]d25-19.0°的比旋(c＝1.0)。rebm在水中的溶解度為大約0.3％，并且隨著溫度的提高而提高。rebm溶于甲醇、乙醇、正丙醇和異丙醇的稀溶液中。然而，其不溶于丙酮、苯、氯仿和醚。根據(jù)本發(fā)明獲得的rebm是熱和ph穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以“按原樣”使用或結(jié)合其他甜味劑、香精和食品成分使用。香精的非限制性實(shí)例包括酸橙、檸檬、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠蘿、芒果、苦杏仁、可樂、肉桂、糖、棉花糖和香草香精。其他食品成分的非限制性實(shí)例包括香精、酸化劑、有機(jī)酸和氨基酸、著色劑、填充劑、改性淀粉、樹膠、質(zhì)構(gòu)劑、防腐劑、抗氧化劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和膠凝劑。根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以制成各種聚合形式，包括但不限于，水解物、溶劑化物、無水、無定形形式和/或其混合物。根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以作為高強(qiáng)度天然甜味劑摻入食品、飲料、藥物組合物、化妝品、口香糖、餐桌上用的產(chǎn)品、谷類、乳制品、牙膏和其他口腔組合物等中。作為增甜化合物的高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以作為唯一的甜味劑來使用，或可以與其他天然產(chǎn)生的高強(qiáng)度甜味劑一起使用，如蛇菊苷、reba、rebb、rebc、rebd、rebe、rebf、甜菊醇雙苷、杜克苷a、懸鉤子苷、羅漢果苷、甜味蛋白、新橙皮苷二氫查耳酮、甘草酸及其鹽、索馬甜、紫蘇糖、pernandulcin、mukurozioside、白元參苷、糙蘇苷-i、二甲基-六氫芴-二羧酸、abrusoside、巴西甘草甜素、carnosifloside、甜茶樹苷、pterocaryoside、polypodosidea、巴西紅木素、hernandulcin、phillodulcin、菝葜苷、根皮苷、三葉苷、二氫黃酮醇、二氫榭皮素-3-醋酸鹽、新落新婦苷(neoastilibin)、反式-肉桂醛、莫納甜及其鹽、selligueaina、蘇木精、莫內(nèi)林、水龍骨甜素、pterocaryosidea、pterocaryosideb、馬檳榔甜素、pentadin、改味糖蛋白、仙茅甜蛋白、neoculin、綠原酸、西那林、羅漢果甜味劑、羅漢果苷v、賽門苷等等在特定的實(shí)施方案中，rebd2和/或rebm2可以與甜味劑組合物一起使用，所述甜味劑組合物包含選自reba、rebb、rebd、nsf-02、羅漢果苷v、赤蘚醇及其組合物的化合物。高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，也可以結(jié)合合成的高強(qiáng)度甜味劑來使用，所述合成的高強(qiáng)度甜味劑如三氯蔗糖、安賽蜜鉀、阿斯巴甜、阿力甜、糖精、橘皮苷二氫查耳酮、環(huán)己基氨基磺酸鹽、紐甜、甘素、suosanadvantame、其鹽等。此外，高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以結(jié)合天然甜味劑遏制劑來使用，所述天然甜味劑遏制劑如匙羹藤酸、勿甜素、ziziphin、lactisole等等。rebd、rebd2、rebm和/或rebm2也可以結(jié)合各種鮮味(umami)增強(qiáng)劑。rebd、rebd2、rebm和/或rebm2可以與鮮味和甜味氨基酸混合，所述氨基酸如谷氨酸鹽、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸酯、賴氨酸和色氨酸。高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm，可以結(jié)合一種或多種選自碳水化合物、多元醇、氨基酸及其相應(yīng)的鹽、聚氨基酸及其相應(yīng)的鹽、糖酸及其相應(yīng)的鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、有機(jī)鹽(包括有機(jī)酸鹽和有機(jī)堿鹽)、無機(jī)鹽、苦味化合物、風(fēng)味劑和風(fēng)味成分、澀味化合物、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、表面活性劑、乳化劑、黃酮類化合物、醇、聚合物及其組合物的添加劑來使用。高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以結(jié)合多元醇或糖醇來使用。術(shù)語“多元醇”是指含有超過一個(gè)羥基基團(tuán)的分子。多元醇可以是各自含有2、3和4個(gè)羥基基團(tuán)的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇還可以含有超過四個(gè)羥基基團(tuán)，如戊醇、己醇、庚醇等，其各自含有5、6或7個(gè)羥基基團(tuán)。另外，多元醇還可以是碳水化合物還原形式的糖醇、多元醇或多醇，其中羰基基團(tuán)(醛或酮，還原糖)已經(jīng)還原成伯或仲羥基基團(tuán)。多元醇的實(shí)例包括，但不限于，赤蘚醇、麥芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、肌醇、異麥芽酮糖醇、丙二醇、甘油、蘇糖醇、半乳糖醇、氫化異麥芽酮糖、還原的異麥芽糖寡糖、還原的木糖寡糖、還原的龍膽低聚糖、還原的麥芽糖糖漿、還原的葡萄糖糖漿、氫化淀粉水解產(chǎn)物、多羥糖醇和糖醇，或任何其他能夠被還原且沒有不利地影響甜味劑組合物味道的碳水化合物。高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以結(jié)合減熱甜味劑，如d-塔格糖、l-糖、l-山梨糖、l-阿拉伯糖等等。高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，還可以結(jié)合各種碳水化合物。術(shù)語“碳水化合物”通常是指通式(ch2o)n(其中n為3-30)的被多個(gè)羥基基團(tuán)取代的醛或酮化合物，及其低聚物和聚合物。本發(fā)明的碳水化合物可以另外在一個(gè)或多個(gè)位置被取代或脫氧。本文中使用的碳水化合物包括未修飾的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物和修飾的碳水化合物。本文中使用的短語“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”和“修飾的碳水化合物”是同義的。修飾的碳水化合物表示任何碳水化合物，其中至少一個(gè)原子已經(jīng)被添加、去除或取代，或其組合。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的單糖、雙糖、低聚糖和多糖。碳水化合物或取代的碳水化合物任選可以是在任何相應(yīng)的c-位置脫氧的，和/或被一個(gè)或多個(gè)部分取代，所述部分如氫、鹵素、鹵代烷基、羧基、?；Ⅴ；?、氨基、酰胺、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巰基、亞氨基、磺?；⒘蚧喕酋；?、氨磺?；?、烷氧羰基、甲酰胺、膦?；?、次膦酰基、磷?；?、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨基甲酰、磷、膦酸基，或任何其他可行的官能團(tuán)，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物起到改善甜味劑組合物的甜味的作用。根據(jù)本發(fā)明可以使用的碳水化合物的實(shí)例包括，但不限于，阿洛酮糖、松二糖、阿羅糖、塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各種環(huán)糊精、環(huán)狀低聚糖、各種類型的麥芽糖糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、蘇糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麥芽糖、轉(zhuǎn)化糖、異海藻糖、新海藻糖、異麥芽酮糖、赤蘚糖、脫氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纖維二糖、支鏈淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、巖藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸-內(nèi)酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜低聚糖、異麥芽低聚糖(異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖封端的低聚糖(xylo-terminatedoligosaccharides)、龍膽低聚糖(龍膽二糖、龍膽三糖、龍膽四糖等)、山梨糖、黑曲霉低聚糖、帕拉金糖低聚糖、果糖低聚糖(蔗果三糖、真菌四糖等)、麥芽四糖醇、麥芽三糖醇、麥芽低聚糖(麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖、麥芽庚糖等)、淀粉、菊粉、菊粉-低聚糖(inulo-oligosaccharide)、乳果糖、蜜二糖、蜜三糖、核糖、異構(gòu)化液體糖(如高果糖玉米糖漿)、偶聯(lián)糖和大豆低聚糖。另外，本文中使用的碳水化合物可以是d-或l-構(gòu)型。根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以結(jié)合各種生理活性物質(zhì)或功能性成分來使用。功能性成分通常歸成如類胡蘿卜素、膳食纖維、脂肪酸、皂苷、抗氧化劑、營養(yǎng)保健品、黃酮類化合物、異硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇(plantsterol)和甾烷醇(stanol)(植物甾醇(phytosterol)和植物甾烷醇(phytostanol))；多元醇；益生元；益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白質(zhì)；維生素和礦物質(zhì)這樣的類別。功能性成分還可以基于其健康益處來歸類，如心血管、膽固醇-降低和抗炎。示例性功能性成分提供于wo2013/096420中，將其內(nèi)容由此按引用并入。根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以用作高強(qiáng)度甜味劑，以產(chǎn)生具有改善的味道特征的零熱量、減熱或糖尿病飲料和食品。其還可以用于其中不能使用糖的飲料、食品、藥品和其他產(chǎn)品中。此外，高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，不僅可以用作用于專用于人食用的飲料、食品和其他產(chǎn)品的甜味劑，也可以用于具有改善的特征的動(dòng)物飼料和草料中。其中高度純化的靶甜菊醇糖苷(特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2)可以用作增甜化合物的消費(fèi)品的實(shí)例包括，但不限于，含醇飲料，如伏特加、葡萄酒、啤酒、利口酒和清酒等；天然汁液；清涼飲料；碳酸軟飲料；低熱飲料；零熱量飲料；減熱飲料和食品；酸奶飲品；速溶汁液；速溶咖啡；粉末類型的速溶飲料；罐頭產(chǎn)品；糖漿；發(fā)酵的大豆醬；醬油；醋；沙拉醬；蛋黃醬；番茄醬；咖喱；湯；速溶肉湯；粉末狀醬油；粉末狀醋；各種類型的餅干；米餅；克力架；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果凍；布??；果脯和腌制蔬菜；鮮奶油；果醬；桔子醬；花醬；奶粉；冰淇淋；果汁冰糕；包裝在瓶中的蔬菜和水果；罐裝和煮沸的豆；在甜味醬汁中煮沸的肉和食品；農(nóng)業(yè)蔬菜食品；海產(chǎn)品；火腿；香腸；魚火腿；魚香腸；魚醬；油炸魚產(chǎn)品；干燥的海產(chǎn)品；冷凍食品；腌制的海藻；腌制的肉；番茄；藥品；等等。原則上，其可以具有無限的應(yīng)用。在如食品、飲料、藥品、化妝品、餐桌上用的產(chǎn)品和口香糖這些產(chǎn)品的制造過程中，可以使用常規(guī)方法，如混合、捏合、溶解、酸浸、滲透、滲濾、噴灑、霧化、灌輸和其他方法。此外，根據(jù)本發(fā)明獲得的高度純化的靶甜菊醇糖苷，特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2，可以以干的形式或液體形式來使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含rebd2的餐桌上用的甜味劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含rebm2的餐桌上用的甜味劑?？梢栽谑称窡崽幚碇盎蛑螅尤敫叨燃兓陌刑鹁沾继擒?。高度純化的靶甜菊醇糖苷(特別是rebd、rebd2、rebm和/或rebm2)的含量取決于使用目的。如以上討論的，可以單獨(dú)加入或結(jié)合其他化合物。本發(fā)明還涉及使用rebd2增強(qiáng)飲料甜度。本發(fā)明還涉及包含rebm2增強(qiáng)飲料甜度。因此，本發(fā)明提供了包含甜味劑和作為甜味增強(qiáng)劑的rebd2和/或rebm2的飲料，其中rebd2和/或rebm2以等于或低于其各自的甜度感知閾值的濃度存在。如本文中使用的，術(shù)語“甜味增強(qiáng)劑”是指能夠增強(qiáng)或加強(qiáng)組合物(如飲料)中的甜味感知的化合物。術(shù)語“甜味增強(qiáng)劑”與術(shù)語“甜味增效劑”、“甜度增效劑”、“甜度增大劑”和“甜度強(qiáng)化劑”同義。如本文中概括使用的術(shù)語“甜味識(shí)別閾值濃度”是人味覺可感知的甜味化合物的最低已知濃度，通常為約1.0％蔗糖當(dāng)量(1.0％se)。通常，當(dāng)以等于或低于給定的甜味增強(qiáng)劑的甜味識(shí)別閾值濃度存在時(shí)，甜味增強(qiáng)劑可以增強(qiáng)或加強(qiáng)甜味劑的甜味，而自身沒有提供任何可感知的甜味；然而，甜味增強(qiáng)劑自身在高于其甜味識(shí)別閾值濃度的濃度下可以提供甜味。甜味識(shí)別閾值濃度對(duì)于特定的增強(qiáng)劑是特異性的，并且可以基于飲料基質(zhì)而改變。可以通過品嘗測試遞增濃度的給定增強(qiáng)劑直至檢測到給定飲料基質(zhì)中高于1.0％蔗糖當(dāng)量，來容易地測定甜味識(shí)別閾值濃度。提供約1.0％蔗糖當(dāng)量的濃度被認(rèn)為是甜味識(shí)別閾值。在一些實(shí)施方案中，甜味劑以約0.5％至約12％重量，如，例如，約1.0％重量、約1.5％重量、約2.0％重量、約2.5％重量、約3.0％重量、約3.5％重量、約4.0％重量、約4.5％重量、約5.0％重量、約5.5％重量、約6.0％重量、約6.5％重量、約7.0％重量、約7.5％重量、約8.0％重量、約8.5％重量、約9.0％重量、約9.5％重量、約10.0％重量、約10.5％重量、約11.0％重量、約11.5％重量或約12.0％重量的量存在于飲料中。在特定實(shí)施方案中，甜味劑以約0.5％至約10％，如，例如，約2％至約8％、約3％至約7％或約4％至約6％重量的量存在于飲料中。在特定實(shí)施方案中，甜味劑以約0.5％至約8％重量的量存在于飲料中。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，甜味劑以約2％至約8％重量的量存在于飲料中。在一個(gè)實(shí)施方案中，甜味劑是傳統(tǒng)的熱量甜味劑。合適的甜味劑包括，但不限于，蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖漿和高果糖淀粉糖漿。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甜味劑是赤蘚醇。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，甜味劑是稀有糖。合適的稀有糖包括，但不限于，d-阿洛糖、d-阿洛酮糖、l-核糖、d-塔格糖、l-葡萄糖、l-果糖、l-阿拉伯糖、d-松二糖、d-明串珠菌二糖及其組合?？紤]了甜味劑可以單獨(dú)使用，或結(jié)合其他甜味劑使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-阿洛糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-阿洛糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-阿洛酮糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-阿洛酮糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-核糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-核糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-塔格糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-塔格糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，稀有糖是l-葡萄糖。在更特別的實(shí)施方案中，l-葡萄糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是l-果糖。在更特別的實(shí)施方案中，l-果糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是l-阿拉伯糖。在更特別的實(shí)施方案中，l-阿拉伯糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-松二糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-松二糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，稀有糖是d-明串珠菌二糖。在更特別的實(shí)施方案中，d-明串珠菌二糖以約0.5％至約10％重量，如，例如，約2％至約8％的量存在于飲料中。與不存在甜味增強(qiáng)劑的相應(yīng)飲料相比時(shí)，以等于或低于其甜味識(shí)別閾值的濃度添加甜味增強(qiáng)劑提高了包含甜味劑和甜味增強(qiáng)劑的飲料檢測到的蔗糖當(dāng)量。此外，在不存在任何甜味劑的情況中，可以通過超過含有相同濃度的至少一種甜味增強(qiáng)劑的溶液的可檢測甜度的量來提高甜度。因此，本發(fā)明還提供了一種用于增強(qiáng)包含甜味劑的飲料的甜度方法，包括提供包含甜味劑的飲料并添加選自rebd2、rebm2或其組合的甜味增強(qiáng)劑，其中rebd2和rebm2以等于或低于其甜味識(shí)別閾值的濃度存在。將等于或低于甜味識(shí)別閾值濃度的rebd2和/或rebm2加入含有甜味劑的飲料中，可以將檢測到的蔗糖當(dāng)量從1.0％提高至約5.0％，如，例如，約1.0％、約1.5％、約2.0％、約2.5％、約3.0％、約3.5％、約4.0％、約4.5％或約5.0％。以下實(shí)施例說明了本發(fā)明針對(duì)制備高度純化的靶甜菊醇糖苷(特別，rebd、rebd2、rebm和/或rebm2)的優(yōu)選實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于實(shí)施例中所列的材料、比例、條件和程序，其只是說明性的。實(shí)施例1ugt76g1的體內(nèi)產(chǎn)生將ncoi和ndei限制位點(diǎn)添加至genbank登錄號(hào)no.aar06912.1中所述的初始核酸序列中。密碼子優(yōu)化后，獲得了以下的核酸序列：ccatggcccatatggaaaacaaaaccgaaaccaccgttcgtcgtcgtcgccgtattattctgtttccggttccgtttcagggtcatattaatccgattctgcagctggcaaatgtgctgtatagcaaaggttttagcattaccatttttcataccaattttaacaaaccgaaaaccagcaattatccgcattttacctttcgctttattctggataatgatccgcaggatgaacgcattagcaatctgccgacacatggtccgctggcaggtatgcgtattccgattattaacgaacatggtgcagatgaactgcgtcgtgaactggaactgctgatgctggcaagcgaagaagatgaagaagttagctgtctgattaccgatgcactgtggtattttgcacagagcgttgcagatagcctgaatctgcgtcgtctggttctgatgaccagcagcctgtttaactttcatgcacatgttagcctgccgcagtttgatgaactgggttatctggatccggatgataaaacccgtctggaagaacaggcaagcggttttccgatgctgaaagtgaaagatatcaaaagcgcctatagcaattggcagattctgaaagaaattctgggcaaaatgattaaacagaccaaagcaagcagcggtgttatttggaatagctttaaagaactggaagaaagcgaactggaaaccgtgattcgtgaaattccggcaccgagctttctgattccgctgccgaaacatctgaccgcaagcagcagcagcctgctggatcatgatcgtaccgtttttcagtggctggatcagcagcctccgagcagcgttctgtatgttagctttggtagcaccagcgaagttgatgaaaaagattttctggaaattgcccgtggtctggttgatagcaaacagagctttctgtgggttgttcgtccgggttttgttaaaggtagcacctgggttgaaccgctgccggatggttttctgggtgaacgtggtcgtattgttaaatgggttccgcagcaagaagttctggcacacggcgcaattggtgcattttggacccatagcggttggaatagcaccctggaaagcgtttgtgaaggtgttccgatgatttttagcgattttggtctggatcagccgctgaatgcacgttatatgagtgatgttctgaaagtgggtgtgtatctggaaaatggttgggaacgtggtgaaattgcaaatgcaattcgtcgtgttatggtggatgaagaaggtgaatatattcgtcagaatgcccgtgttctgaaacagaaagcagatgttagcctgatgaaaggtggtagcagctatgaaagcctggaaagtctggttagctatattagcagcctgtaataactcgag使用ndei和xhoi克隆位點(diǎn)合成基因并亞克隆至pet30a+載體中后，通過電穿孔將ugt76g1_pet30a+質(zhì)粒引入大腸桿菌b121(de3)和大腸桿菌ec100中。將獲得的細(xì)胞生長于存在卡那霉素的皮氏培養(yǎng)皿中并且選擇合適的克隆，使其在液體lb培養(yǎng)基中生長(錐形燒瓶)。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中，并且將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃。將含有pet30a+_ugt76g1質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下振蕩8小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有60g/l過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基(novagen)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。培養(yǎng)物獲得顯著生長并且獲得了良好的od。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍，產(chǎn)生12.7g細(xì)胞濕重。通過添加bugbustermaster混合物(novagen)進(jìn)行裂解并且通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。使用融化的裂解產(chǎn)物進(jìn)行活性測試。實(shí)施例2ugt76g1的體外生產(chǎn)使用來自promega的s30t7高產(chǎn)量表達(dá)系統(tǒng)試劑盒。將4μg來自大腸桿菌ec100的ugt76g1_pet30a+質(zhì)粒與80μls30premixplus混合并加入72μls30t7提取物。加入無核酸酶水，以獲得200μl的總體積，并且將所得到的溶液在30℃下孵育2小時(shí)。將180μl用于催化測試反應(yīng)中。實(shí)施例3ugt91d2的體外生產(chǎn)將ncoi和ndei限制側(cè)添加至如genbank登錄號(hào)ace87855.1中所述的初始核酸序列。密碼子優(yōu)化后，獲得以下核酸序列：ccatggcacatatggcaaccagcgatagcattgttgatgatcgtaaacagctgcatgttgcaacctttccgtggctggcatttggtcatattctgccgtatctgcagctgagcaaactgattgcagaaaaaggtcataaagtgagctttctgagcaccacccgtaatattcagcgtctgagcagccatattagtccgctgattaatgttgttcagctgaccctgcctcgtgttcaagaactgccggaagatgccgaagcaaccaccgatgttcatccggaagatattccgtatctgaaaaaagcaagtgatggtctgcagccggaagttacccgttttctggaacagcatagtccggattggatcatctatgattatacccattattggctgccgagcattgcagcaagcctgggtattagccgtgcacattttagcgttaccaccccgtgggcaattgcatatatgggtccgagcgcagatgcaatgattaatggtagtgatggtcgtaccaccgttgaagatctgaccacccctccgaaatggtttccgtttccgaccaaagtttgttggcgtaaacatgatctggcacgtctggttccgtataaagcaccgggtattagtgatggttatcgtatgggtctggttctgaaaggtagcgattgtctgctgagcaaatgctatcatgaatttggcacccagtggctgccgctgctggaaaccctgcatcaggttccggttgttccggtgggtctgctgcctccggaagttccgggtgatgaaaaagatgaaacctgggttagcatcaaaaaatggctggatggtaaacagaaaggtagcgtggtttatgttgcactgggtagcgaagttctggttagccagaccgaagttgttgaactggcactgggtctggaactgagcggtctgccgtttgtttgggcatatcgtaaaccgaaaggtccggcaaaaagcgatagcgttgaactgccggatggttttgttgaacgtacccgtgatcgtggtctggtttggaccagctgggcacctcagctgcgtattctgagccatgaaagcgtttgtggttttctgacccattgtggtagcggtagcattgtggaaggtctgatgtttggtcatccgctgattatgctgccgatttttggtgatcagccgctgaatgcacgtctgctggaagataaacaggttggtattgaaattccgcgtaatgaagaagatggttgcctgaccaaagaaagcgttgcacgtagcctgcgtagcgttgttgttgaaaaagaaggcgaaatctataaagccaatgcacgtgaactgagcaaaatctataatgataccaaagtggaaaaagaatatgtgagccagttcgtggattatctggaaaaaaacacccgtgcagttgccattgatcacgaaagctaatgactcgag使用ncoi和xhoi克隆位點(diǎn)合成基因并亞克隆至pet30a+后，通過電穿孔，將ugt91d2_pet30a+引入大腸桿菌ec100中。在卡那霉素存在下，使獲得的細(xì)胞生長并且選擇合適的克隆，使其在液體lb培養(yǎng)基中生長(錐形燒瓶)。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中，并且將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃。將來自promega的s30t7高產(chǎn)量蛋白表達(dá)系統(tǒng)試劑盒用于蛋白質(zhì)的體外合成。將4μgugt91d2-pet30a+質(zhì)粒與80μls30premixplus混合并加入72μls30t7提取物。加入無核酸酶水，以獲得200μl的總體積，并且將所得到的溶液在30℃下孵育2小時(shí)。將5μl用于sds-page分析，同時(shí)將剩余的45μl用于催化測試反應(yīng)中。實(shí)施例4使用體內(nèi)產(chǎn)生的ugt76g1的催化反應(yīng)反應(yīng)的總體積為5.0ml，具有以下組成：50mm磷酸鈉緩沖液ph7.2，3mmmgcl2，2.5mmudp-葡萄糖，0.5mm蛇菊苷和500μlugt76g1融化的裂解產(chǎn)物。在135rpm的軌道振蕩器上在30℃下運(yùn)行反應(yīng)。對(duì)于每個(gè)樣品，用40μl2nh2so4和420μl甲醇/水(6/4)驟冷460μl反應(yīng)混合物。立即將樣品離心并且在通過hplc(cad)分析前保持在10℃。hplc表明蛇菊苷幾乎完全轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷a，如圖51中所示的。實(shí)施例5使用體外產(chǎn)生的ugt91d2的催化反應(yīng)反應(yīng)的總體積為0.5ml，具有以下組成：50mm磷酸鈉緩沖液ph7.2，3mmmgcl2，3.8mmudp-葡萄糖，0.1mm萊鮑迪苷a和180μl體外產(chǎn)生的ugt91d2。在135rpm的軌道振蕩器上在30℃下運(yùn)行反應(yīng)。對(duì)于每個(gè)樣品，用45μl2nh2so4和405μl60％meoh驟冷450μl反應(yīng)混合物。離心后，通過hplc(cad)分析上清液。hplc表明了在120小時(shí)后，4.7％的萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d。實(shí)施例6使用體外產(chǎn)生的ugt76g1的催化反應(yīng)反應(yīng)的總體積為2ml，具有以下組成：50mm磷酸鈉緩沖液ph7.2，3mmmgcl2，3.8mmudp-葡萄糖，0.5mm萊鮑迪苷d和180μl體外產(chǎn)生的ugt76g1。在135rpm的軌道振蕩器上在30℃下運(yùn)行反應(yīng)。對(duì)于每個(gè)樣品，用40μl2nh2so4和360μl60％meoh驟冷400μl反應(yīng)混合物。離心后，通過hplc(cad)分析上清液。hplc表明了在120小時(shí)后，80％的萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m，如圖52中所示的。對(duì)于實(shí)施例7至12，使用了以下縮寫：lbgkp培養(yǎng)基：20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素或氨芐青霉素lb培養(yǎng)基：(20g/lluria肉湯lennox)實(shí)施例7通過pet30a+質(zhì)粒和bl21(de3)表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性將pet30a+_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21(de3)表達(dá)菌株(lucigene.express電感受態(tài)細(xì)胞)中。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有卡那霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為10.58g。通過添加8.1ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和3.5ml水來裂解3.24g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例8通過pet30a+質(zhì)粒和tuner(de3)表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性通過熱休克處理，將pet30a+_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至tuner(de3)表達(dá)菌株(novagentunertm(de3)感受態(tài)細(xì)胞)中。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有卡那霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入100ml含有50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩15小時(shí)。將4.4ml這種培養(yǎng)物用于接種200ml含有l(wèi)b的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使該培養(yǎng)基在37℃下攪拌，直至獲得0.9的od(600nm)，此后，加入400μl100mmiptg溶液，并且使培養(yǎng)基在30℃下攪拌4小時(shí)。通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為1.38g。通過添加4.9ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和2.1ml水來裂解獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例9通過pmal質(zhì)粒和bl21表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性使用nde1和sal1克隆位點(diǎn)，將合成的ugt76g1基因亞克隆至pmal質(zhì)粒后，通過熱休克處理，將pmal_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21表達(dá)菌株(newenglandbiolabsbl21感受態(tài)大腸桿菌)中。在氨芐青霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l氨芐青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為5.86g。通過添加9.6ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和4.1ml水來裂解2.74g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例10通過pmal質(zhì)粒和arcticexpress表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性通過熱休克處理，將pmal_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至articexpress表達(dá)菌株(agilentarcticexpress感受態(tài)細(xì)胞)中。在氨芐青霉素和遺傳霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素和遺傳霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和遺傳霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l氨芐青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在12℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。68小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為8.96g。通過添加8.73ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和3.79ml水來裂解2.47g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例11通過pcoldiii質(zhì)粒和arcticexpress表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性使用nde1和xho1克隆位點(diǎn)，將合成的ugt76g1基因亞克隆至pcoldiii質(zhì)粒后，通過熱休克處理，將pcoldiii_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至arcticexpress表達(dá)菌株(agilentarcticexpress感受態(tài)細(xì)胞)中。在氨芐青霉素和遺傳霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素和遺傳霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和遺傳霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在12℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。63小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為6.54g。通過添加9.8ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和4.2ml水來裂解2.81g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例12通過pcoldiii質(zhì)粒和origami2(de3)表達(dá)菌株制備的ugt76g1的制備和活性通過熱休克處理，將pcoldiii_ugt76g1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至origami2(de3)表達(dá)菌株(novagenorigamitm2(de3)感受態(tài)細(xì)胞)中。在氨芐青霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8h，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在12℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。68小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為2.53g。通過添加6.0ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和1.9ml水來裂解1.71g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并保持冷凍。實(shí)施例13活性的測定使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用500μl融化的裂解產(chǎn)物，用于將蛇菊苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷a以及將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m，以5ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。針對(duì)不同ugt76g1制備物的結(jié)果概括于下表中。*注釋按照每ml裂解產(chǎn)物來提及蛇菊苷和萊鮑迪苷m的轉(zhuǎn)化活性。在30℃和ph7.2下，在1小時(shí)中，1u將轉(zhuǎn)化1μmol底物。實(shí)施例14用于萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m的50ml規(guī)模反應(yīng)將5ml實(shí)施例12的裂解產(chǎn)物用于50ml規(guī)模的萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m。反應(yīng)介質(zhì)由50mm磷酸鈉緩沖液ph7.2、3mmmgcl2、2.5mmudp-葡萄糖和0.5mm萊鮑迪苷d組成。使反應(yīng)在30℃下振蕩90小時(shí)后，加入50ml乙醇，并將所得到的混合物在-20℃下振蕩1小時(shí)。在5000g下離心10分鐘后，通過超濾(vivaflowmwco30000)純化上清液。獲得78ml透過液，并用9ml乙醇稀釋9ml截留物，并再次接受超濾(vivaflowmwco30000)。獲得另外的14ml濾液，將其與第一個(gè)透過液合并。將合并的透過液在30℃下減壓濃縮，直至獲得32ml澄清溶液。產(chǎn)品混合物的hplc痕跡顯示于圖5中。在配備了雙泵、自動(dòng)取樣機(jī)和恒溫柱室的agilent1200系列上進(jìn)行hplc。所述方法是等度的，使用由70％水(0.1％甲酸)：30％乙腈的移動(dòng)相。流速為0.1μl/分鐘。使用的柱為phenomenexprodigy5μods(3)100a；250×2mm。柱溫維持在40℃。注入體積為20-40μl。實(shí)施例15使用pmal質(zhì)粒和bl21表達(dá)菌株的ugt91d2的制備使用nde1和sal1克隆位點(diǎn)，將合成的ugt91d2基因亞克隆至pmal質(zhì)粒后，通過熱休克處理，將pmal_ugt91d2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21表達(dá)菌株(newenglandbiolabsbl21感受態(tài)大腸桿菌)中。在氨芐青霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l氨芐青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為12.32g。通過添加7.7ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和3.2ml水來裂解2.18g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并直接用于活性測試。實(shí)施例16使用pmal質(zhì)粒和arcticexpress表達(dá)菌株的ugt91d2的制備通過熱休克處理，將pmal_ugt91d2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至arcticexpress表達(dá)菌株(agilentarcticexpress感受態(tài)細(xì)胞)中。在氨芐青霉素和遺傳霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素和遺傳霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和遺傳霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l氨芐青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌16小時(shí)，接著在12℃下再攪拌50小時(shí)，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為15.77g。通過添加9.0ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和3.8ml水來裂解2.57g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并直接用于活性測試。實(shí)施例17使用pet30a+質(zhì)粒和tuner(de3)表達(dá)菌株的ugt91d2的制備通過熱休克處理，將pet30a+_ugt91d2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至tuner(de3)表達(dá)菌株(novagentunertm(de3)感受態(tài)細(xì)胞)中。在卡那霉素素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有卡那霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入100ml含有50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩15小時(shí)。將6.2ml這種培養(yǎng)物用于接種500ml含有l(wèi)b的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使該培養(yǎng)基在37℃下攪拌，直至獲得0.9的od(600nm)，此后，加入500μl100mmiptg溶液(培養(yǎng)基中的iptg濃度為100μm)，并且使培養(yǎng)基在30℃下攪拌4小時(shí)。通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為4.02g。通過添加6.8ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和2.8ml水來裂解1.92g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并直接用于活性測試。實(shí)施例18使用pet30a+質(zhì)粒和arcticexpress表達(dá)菌株的ugt91d2的制備通過熱休克處理，將pet30a+_ugt91d2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至arcticexpress(de3)表達(dá)菌株(agilentarcticexpress感受態(tài)細(xì)胞)中。在氨芐青霉素和遺傳霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中的lb瓊脂上。選擇合適的克隆并使其在含有氨芐青霉素和遺傳霉素的液體lbgkp培養(yǎng)基中生長。加入甘油并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和遺傳霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下振蕩8小時(shí)，并隨后用于接種400ml含有60g/l“過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基”(novagen，參照71491-5)、10g/l甘油和50mg/l氨芐青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基在20℃下攪拌16小時(shí)，接著在12℃下再攪拌50小時(shí)，同時(shí)取樣測量od(600nm)和ph。60小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。獲得的細(xì)胞濕重為16.07g。通過添加11.4ml“bugbustermaster混合物”(novagen，參照71456)和4.8ml水來裂解3.24g獲得的沉淀。通過離心收集裂解產(chǎn)物并直接用于活性測試。實(shí)施例19ugt91d2體內(nèi)制備物的活性測定使用50mm磷酸鈉緩沖液ph7.2中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用1000μl裂解產(chǎn)物用于懸鉤子苷轉(zhuǎn)化成蛇菊苷，以5ml規(guī)模進(jìn)行活性測試。取樣并通過hplc分析。針對(duì)不同ugt91d2制備物的結(jié)果概括于下表中。*注釋：按照每ml裂解產(chǎn)物來提及活性。在30℃和ph7.2下，在1小時(shí)中，1u將轉(zhuǎn)化1μmol底物。實(shí)施例20用于萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的其他酶從公眾數(shù)據(jù)庫鑒定了以下的udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因，通過dna2.0合成并隨后在pet30a+載體中亞克隆。微量滴定平板位置基因名稱內(nèi)部參照reba轉(zhuǎn)化成rebdc908201a1gi115454819_np_001051010.1s115n01a1有活性c908201g2gi187373030_acd03249.1s115n01g2有活性c908201a7gi460409128_xp_004249992.1s115n05a7有活性c912666e1gi222619587_eee55719.1s115n06e1有活性c912666c2gi297795735_xp_002865752.1s115n06c2有活性氨基酸序列如下：>gi|115454819|ref|np_001051010.1|os03g0702500[粳稻日本晴(oryzasativajaponicagroup)]mddahssqsplhvvifpwlafghllpcldlaerlaarghrvsfvstprnlarlppvrpelaelvdlvalplprvdglpdgaeatsdvpfdkfelhrkafdglaapfsafldtacaggkrpdwvladlmhhwvalasqergvpcamilpcsaavvassapptessadqreaivrsmgtaapsfeakrateefategasgvsimtrysltlqrsklvamrscpelepgaftiltrfygkpvvpfgllpprpdgargvskngkhdaimqwldaqpaksvvyvalgseapmsadllrelahgldlagtrflwamrkpagvdadsvlpagflgrtgerglvttrwapqvsilahaavcaflthcgwgsvveglqfghplimlpilgdqgpnarilegrklgvavprndedgsfdrggvagavravvveeegktffanarklqeivadrereercidefvqhltswnelknnsdgqyp>gi|187373030|gb|acd03249.1|udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶[糙伏毛燕麥(avenastrigosa)]mavkdeqqsplhillfpflapghlipiadmaalfasrgvrctilttpvnaaiirsavdrandafrgsdcpaidisvvpfpdvglppgvengnaltspadrlkffqavaelrepfdrfladnhpdavvsdsffhwstdaaaehgvprlgflgssmfagscnestlhnnpletaaddpdalvslpglphrvelrrsqmmdpkkrpdhwallesvnaadqksfgevfnsfhelepdyvehyqttlgrrtwlvgpvalaskdmagrgstsarspdadsclrwldtkqpgsvvyvsfgtlirfspaelhelargldlsgknfvwvlgragpdssewmpqgfadlitprgdrgfiirgwapqmlilnhralggfvthcgwnstlesvsagvpmvtwprfadqfqneklivevlkvgvsigakdygsgienhdvirgeviaesigklmgsseesdaiqrkakdlgaearsavenggssyndvgrlmdelmarrssvkvgediiptndgl>gi|460409128|ref|xp_004249992.1|predicted：花青素-3-o-糖苷2-o-糖苷葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶樣[番茄(solanumlycopersicum)]mspklhkelffhslykktrsnhtmatlkvlmfpflayghispylnvakkladrgfliyfcstpinlkstiekipekyadsihlielhlpelpqlpphyhttnglppnlnqvlqkalkmskpnfskilqnlkpdlviydilqrwakhvaneqnipavklltsgaavfsyffnvlkkpgvefpfpgiylrkieqvrlsemmsksdkekeledddddddllvdgnmqimlmstsrtieakyidfctaltnwkvvpvgppvqdlitndvddmelidwlgtkdenstvfvsfgseyflskedmeevafalelsnvnfiwvarfpkgeernledalpkgflerigergrvldkfapqprilnhpstggfishcgwnsamesidfgvpiiampmhldqpmnarlivelgvaveivrdddgkihrgeiaetlkgvitgktgeklrakvrdisknlktirdeemdaaaeeliqlcrngn>gi|222619587|gb|eee55719.1|假定蛋白o(hù)sj_04191[粳稻日本晴(oryzasativajaponicagroup)]mhvvmlpwlafghilpfaefakrvarqghrvtlfstprntrrlidvppslagrirvvdiplprvehlpehaeatidlpsndlrpylrraydeafsrelsrllqetgpsrpdwvladyaaywapaaasrhgvpcaflslfgaaalcffgpaetlqgrgpyaktepahltavpeyvpfpttvafrgnearelfkpslipdesgvsesyrfsqsiegcqlvavrsnqefepewlellgelyqkpvipigmfpppppqdvagheetlrwldrqepnsvvyaafgsevkltaeqlqrialgleaselpfiwafrappdagdgdglpggfkervngrgvvcrgwvpqvkflahasvggflthagwnsiaeglangvrlvllplmfeqglnarqlaekkvavevardeddgsfaandivdalrrvmvgeegdefgvkvkelakvfgddevndryvrdflkclseykmqrqg>gi|297795735|ref|xp_002865752.1|udp-葡糖醛酸基/udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白[琴葉擬南芥(arabidopsislyrata)琴葉亞種]mddkkeevmhiamfpwlamghllpflrlskllaqkghkisfistprnilrlpklpsnlsssitfvsfplpsisglppssessmdvpynkqqslkaafdllqpplteflrlsspdwiiydyashwlpsiakelgiskaffslfnaatlcfmgpssslieesrstpedftvvppwvpfkstivfryhevsryvektdedvtgvsdsvrfgytidgsdavfvrscpefepewfsllqdlyrkpvfpigflppviedddddttwvrikewldkqrvnsvvyvslgteaslrreeltelalgleksetpffwvlrnepqipdgfeervkgrgmvhvgwvpqvkilshesvggflthcgwnsvvegigfgkvpiflpvlneqglntrllqgkglgvevlrderdgsfgsdsvadsvrlvmiddageeirekvklmkglfgnmdeniryvdelvgfmrndessqlkeeeeeddcsddqssevssetdekelnldlkeekrrisvykslssefddyvanekmg在含有質(zhì)粒的微滴定平板中接收測試的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒作為凍干固體在每個(gè)分開的孔中。質(zhì)粒的懸浮。向每個(gè)孔中，加入24μl超純無菌水，并且將微滴定平板在室溫下振蕩30分鐘。隨后，將平板在4℃下孵育1小時(shí)。通過上下吸移，進(jìn)一步混合每個(gè)孔的內(nèi)容物。使用1μl懸浮液，通過qubit2.0分析進(jìn)行質(zhì)粒定量。測定的質(zhì)粒含量為：微量滴定平板位置內(nèi)部參照[質(zhì)粒]ng/μlc908201a1s115n01a132.8c908201g2s115n01g241.0c908201a7s115n05a756.6c912666e1s115n06e164.0c912666c2s115n06c231.4用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃的冰箱中取出化學(xué)感受態(tài)ec100細(xì)胞的等份試樣并且儲(chǔ)存在冰上。使細(xì)胞在冰上融化10分鐘。將10μl上述質(zhì)粒溶液的稀釋液加入1.5ml的無菌微管中(使得用50pgdna轉(zhuǎn)化每個(gè)細(xì)胞)并且儲(chǔ)存在冰上。將100μl化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞加入每個(gè)微管中。在冰上孵育化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)?；旌衔?0分鐘后，進(jìn)行了42℃下30秒的熱休克。在冰上再進(jìn)行孵育2分鐘。向每個(gè)微管中，加入300μlsoc培養(yǎng)基，并將所得到的混合物轉(zhuǎn)移至無菌的15ml試管中。在37℃下孵育1小時(shí)，同時(shí)在135rpm下振蕩，將混合物涂布在含有50μg/ml卡那霉素的固體luria肉湯培養(yǎng)基上。使皮氏培養(yǎng)皿在37℃下孵育16小時(shí)。甘油中的儲(chǔ)液的制備和質(zhì)粒的純化。向50ml無菌falcon試管中，加入10ml含有50μg/ml卡那霉素的luria肉湯培養(yǎng)基。給培養(yǎng)基接種從上述皮氏培養(yǎng)皿中分離的克隆，并使培養(yǎng)物在37℃下孵育16小時(shí)，同時(shí)在135rpm下振蕩。向含有300μl60％無菌甘油溶液的1.5ml的無菌微管中，加入600μl培養(yǎng)物。將儲(chǔ)液儲(chǔ)存在-80℃。將剩余的培養(yǎng)物在10℃下，在5,525g下，離心10分鐘，并且除去上清液后，將沉淀物儲(chǔ)存在冰上。根據(jù)qiagenqiaprepspinminiprep試劑盒(參照：27106)純化所產(chǎn)生的質(zhì)粒，并且在260nm下測量了質(zhì)粒產(chǎn)量。將質(zhì)粒溶液儲(chǔ)存在4℃。如下測定了質(zhì)粒含量：微量滴定平板位置測試的內(nèi)部參照[質(zhì)粒]ng/μlc908201a1s115n01a1115.7c908201g2s115n01g2120.4c908201a7s115n05a7293.8c912666e1s115n06e1126.1c912666c2s115n06c298.8酶的體外表達(dá)。根據(jù)promegas30t7高產(chǎn)量蛋白表達(dá)系統(tǒng)(參照：l1110)試劑盒，將18μl質(zhì)粒溶液(含有大約1.5μg質(zhì)粒)用于體外表達(dá)。如下產(chǎn)生了表達(dá)培養(yǎng)基：將制備的表達(dá)培養(yǎng)基混合物加入質(zhì)粒溶液中并且使溶液在30℃下孵育3小時(shí)，同時(shí)每45分鐘混合該混合物。將5μl混合物冷凍，同時(shí)將剩余的用于針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的催化測試。針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的催化測試。將430μl含有0.5mm萊鮑迪苷a、3mmmgcl2、50mm磷酸鹽緩沖劑(ph7.2)和2.5mmudp-葡萄糖的反應(yīng)混合物加入1.5ml無菌微管中。加入52μl酶表達(dá)培養(yǎng)基并使所得到的混合物在30℃下反應(yīng)24小時(shí)。在2小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)后取出125μl樣品并加入115μl60％甲醇和10μl2nh2so4中。將驟冷的樣品在rt下在18,000g下離心2分鐘。將200μl轉(zhuǎn)移至hplc小瓶中并分析。hplc分析。如下進(jìn)行hplc測試：裝置儀器條件柱溫55℃檢測uv205nm；bw400nmcad檢測分析持續(xù)時(shí)間15分鐘注入的體積10μl流速1ml/分鐘移動(dòng)相梯度方案時(shí)間(分鐘)含有0.04％醋酸的水％甲醇％0406082575102575114060154060以下提供了hplc測試結(jié)果并顯示于圖53a-e中：酶s115n05a7對(duì)于reba轉(zhuǎn)化成rebd具有最高活性(大約22.4％)。至少三種酶產(chǎn)生了顯著含量的未知糖苷(標(biāo)記為rebunk；之后鑒定為rebd2)連同rebd。實(shí)施例21體外產(chǎn)生的eugt11的活性通過dna2.0合成了專利申請(qǐng)wo/2013/022989a2中所述的eugt11基因并隨后在pet30a+載體中亞克隆。氨基酸序列如下：>gi|41469452|gb|aas07253.1|推定的udp-葡糖醛酸基和udp葡糖基轉(zhuǎn)移酶[粳稻日本晴(oryzasativajaponicagroup)]eugt11酶來自專利申請(qǐng)wo/2013/022989a2mhvvicpllafghllpcldlaqrlacghrvsfvstprnisrlppvrpslaplvsfvalplprveglpngaesthnvphdrpdmvelhlrafdglaapfseflgtacadwvmptssaprqtlssnihrnssrpgtpapsgrllcpitphsntleraaeklvrssrqnararsllaftspplpyrdvfrsllglqmgrkqlniahetngrrtgtlplnlcrwmwkqrrcgklrpsdvefntsrsneaispigaslvnlqsiqspnpravlpiassgvravfigrartstptpphakparsaaprahrppssvmdsgysssyaaaagmhvvicpwlafghllpcldlaqrlasrghrvsfvstprnisrlppvrpalaplvafvalplprveglpdgaestndvphdrpdmvelhrrafdglaapfseflgtacadwvivdvfhhwaaaaalehkvpcammllgsahmiasiadrrleraetespaaagqgrpaaaptfevarmklirtkgssgmslaerfsltlsrsslvvgrscvefepetvpllstlrgkpitflglmpplhegrredgedatvrwldaqpaksvvyvalgsevplgvekvhelalglelagtrflwalrkptgvsdadllpagfeertrgrgvvatrwvpqmsilahaavgaflthcgwnstieglmfghplimlpifgdqgpnarlieaknaglqvarndgdgsfdregvaaairavaveeesskvfqakakklqeivadmacheryidgfiqqlrsykd在含有質(zhì)粒的微滴定平板中接收測試的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒作為凍干固體在每個(gè)分開的孔中。質(zhì)粒的懸浮。向每個(gè)孔中，加入24μl超純無菌水，并且將微滴定平板在室溫下振蕩30分鐘。隨后，將平板在4℃下孵育1小時(shí)。通過上下吸移，進(jìn)一步混合每個(gè)孔的內(nèi)容物。使用1μl懸浮液，通過qubit2.0分析進(jìn)行質(zhì)粒定量。測定的質(zhì)粒含量為：微量滴定平板位置試驗(yàn)的內(nèi)部參照[質(zhì)粒]ng/μlc912666g4s115n08g419.2用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃的冰箱中取出化學(xué)感受態(tài)ec100細(xì)胞的等份試樣并且儲(chǔ)存在冰上。使細(xì)胞在冰上融化10分鐘。將10μl上述質(zhì)粒溶液的稀釋液加入1.5ml的無菌微管中(使得用50pgdna轉(zhuǎn)化每個(gè)細(xì)胞)并且儲(chǔ)存在冰上。將100μl化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞加入每個(gè)微管中。在冰上孵育化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞/質(zhì)?；旌衔?0分鐘后，進(jìn)行了42℃下30秒的熱休克。在冰上再進(jìn)行孵育2分鐘。向每個(gè)微管中，加入300μlsoc培養(yǎng)基，并將所得到的混合物轉(zhuǎn)移至無菌的15ml試管中。在37℃下孵育1小時(shí)，同時(shí)在135rpm下振蕩，將混合物涂布在含有50μg/ml卡那霉素的固體luria肉湯培養(yǎng)基上。使皮氏培養(yǎng)皿在37℃下孵育16小時(shí)。甘油中的儲(chǔ)液的制備和質(zhì)粒的純化。向50ml無菌falcon試管中，加入10ml含有50μg/ml卡那霉素的luria肉湯培養(yǎng)基。給培養(yǎng)基接種從上述皮氏培養(yǎng)皿分離的克隆，并使培養(yǎng)物在37℃下孵育16小時(shí)，同時(shí)在135rpm下振蕩。向含有300μl60％無菌甘油溶液的1.5ml的無菌微管中，加入600μl培養(yǎng)物。將儲(chǔ)液儲(chǔ)存在-80℃。將剩余的培養(yǎng)物在10℃下，在5,525g下，離心10分鐘，并且除去上清液后，將沉淀物儲(chǔ)存在冰上。根據(jù)qiagenqiaprepspinminiprep試劑盒(參照：27106)純化所產(chǎn)生的質(zhì)粒，并且在260nm下測量了質(zhì)粒產(chǎn)量。將質(zhì)粒溶液儲(chǔ)存在4℃。如下測定了質(zhì)粒含量：微量滴定平板位置測試的內(nèi)部參照[質(zhì)粒]ng/μlc912666g4s115n08g438.4eugt11的體外表達(dá)。根據(jù)promegas30t7高產(chǎn)量蛋白表達(dá)系統(tǒng)(參照：l1110)試劑盒，將18μl稀釋的質(zhì)粒溶液(含有大約1.5μg質(zhì)粒)用于體外表達(dá)。產(chǎn)生了表達(dá)培養(yǎng)基，如下：將制備的表達(dá)培養(yǎng)基混合物加入質(zhì)粒溶液中并且使溶液在30℃下孵育3小時(shí)，同時(shí)每45分鐘混合該混合物。將5μl混合物冷凍，同時(shí)將剩余的用于針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的催化測試。針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的催化測試。將430μl含有0.5mm萊鮑迪苷a、3mmmgcl2、50mm磷酸鹽緩沖劑(ph7.2)和2.5mmudp-葡萄糖的反應(yīng)混合物加入1.5ml無菌微管中。加入52μl酶表達(dá)培養(yǎng)基并使所得到的混合物在30℃下反應(yīng)24小時(shí)。在2小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)后取出125μl樣品并加入115μl60％甲醇和10μl2nh2so4中。將驟冷的樣品在rt下在18,000g下離心2分鐘。將200μl轉(zhuǎn)移至hplc小瓶中并分析。hplc分析。按照實(shí)施例20中所述的進(jìn)行hplc測試。hplc測試結(jié)果顯示于圖54中。實(shí)施例22酶的體內(nèi)生產(chǎn)在體內(nèi)產(chǎn)生了實(shí)施例20中所述的酶。通過熱休克，將含有對(duì)應(yīng)于酶的基因的pet30a+載體引入大腸桿菌bl21(de3)中。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中，并選擇合適的克隆，使其在液體lb培養(yǎng)基中(錐形燒瓶)生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將含有pet30a+_ugt質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下振蕩8小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有60g/l過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基(novagen)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素。將預(yù)培養(yǎng)物加入400ml的這種培養(yǎng)基中，并使溶液在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。培養(yǎng)物獲得顯著生長并且獲得了良好的od。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。以下提及了以下的細(xì)胞濕重(cww)產(chǎn)量。gi編號(hào)版本cww115454819np_001051010.19.2g187373030acd03249.17.4g460409128xp_004249992.16.8g222619587eee55719.17.5g297795735xp_002865752.18.8g通過添加bugbustermaster混合物(novagen)進(jìn)行裂解，通過離心收集裂解產(chǎn)物，并新鮮使用?；钚缘臏y定。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用1,000μl融化的裂解產(chǎn)物，用于轉(zhuǎn)化萊鮑迪苷a，以5ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。hplc分析。按照實(shí)施例20中所述的進(jìn)行了hplc測試。以下提供了針對(duì)不同的酶的結(jié)果并顯示于圖55a-e中。gi編號(hào)版本45小時(shí)后的轉(zhuǎn)化rebd選擇性115454819np_001051010.11.1％100％187373030acd03249.10.8％100％460409128xp_004249992.162.1％43.6％222619587eee55719.12.9％未檢測到rebd297795735xp_002865752.10.0％未檢測到rebd實(shí)施例23糖苷的鑒定通過lc-ms另外測試代表gino.460409128的反應(yīng)混合物，特別是實(shí)施例20的樣品“12400s115n05a7t24h130627aba”(下文稱為s115n05a7)和實(shí)施例22的樣品“12400s129n04t45h130712aba”(下文稱為s129n04)，來鑒定未知的糖苷。使用了agilent1200系列hplc系統(tǒng)，其配備了雙泵(g1312b)、自動(dòng)取樣機(jī)(g1367d)、恒溫柱室(g1316b)、dad檢測儀(c1315c)，連接agilent6110amsd，并與“l(fā)c/msdchemstation”軟件配合。儀器條件移動(dòng)相梯度方案時(shí)間(分鐘)a(％)：甲酸0.1％b(％)：乙腈075258.5752510.0712916.57030在3.5分鐘的lcms系統(tǒng)上觀察到的化合物對(duì)應(yīng)于樣品“s115n05a7”(實(shí)施例20)中的化合物“未知＠4.508”和樣品“s129n04”(實(shí)施例22)中的化合物“未知＠rt4.526”。lcms數(shù)據(jù)表明這種化合物在其結(jié)構(gòu)中具有六個(gè)葡糖苷殘基(c56h90o33)，并且發(fā)現(xiàn)了是rebm的異構(gòu)體，命名為rebm2(對(duì)于討論，參見實(shí)施例40)。而在7.6分鐘的lcms上觀察到的化合物對(duì)應(yīng)于樣品“s115n05a7”(實(shí)施例20)中的化合物“rebunk”和樣品“s129n04”(實(shí)施例22)中的化合物“rebunk”。lcms數(shù)據(jù)表明“rebunk”在其結(jié)構(gòu)中具有五個(gè)葡糖苷殘基(c50h80o28)，并且發(fā)現(xiàn)了是rebd的異構(gòu)體，命名為rebd2(對(duì)于討論，參見實(shí)施例39)。以下提供了這些化合物的比例和lcms色譜。實(shí)施例24糖苷的鑒定連同purecirclesdnbhd(馬來西亞)生產(chǎn)的甜菊葉提取物“mld1”，通過lc-ms另外測試了代表gino.460409128的反應(yīng)混合物，特別是實(shí)施例22的樣品“12400s129n04t45h130712aba”(下文稱為s129n04)，來測定天然出現(xiàn)的s129n04糖苷。圖57a-b中的測試表明實(shí)施例23中在3.5分鐘的lcms系統(tǒng)上觀察到的化合物(c56h90o33；之后證實(shí)為rebm2)和實(shí)施例23中在7.6分鐘的lcms系統(tǒng)上觀察到的化合物(c50h80o28；rebunk；之后證實(shí)為rebd2)出現(xiàn)在甜菊植物的提取物中。實(shí)施例25萊鮑迪苷e轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d反應(yīng)的總體積為5.0ml，具有以下組成：100mm磷酸鉀緩沖液ph7.5，3mmmgcl2，2.5mmudp-葡萄糖，0.5mm萊鮑迪苷e和500μlugt76g1融化的裂解產(chǎn)物(ugt76g1基因在pet30a+載體中克隆并在大腸桿菌bl21(de3)中表達(dá))。在135rpm的軌道振蕩器上在30℃下運(yùn)行反應(yīng)。為了取樣，用30μl2nh2so4和270μl甲醇/水(6/4)驟冷300μl反應(yīng)混合物。立即將樣品離心并且在通過hplc(cad檢測)分析前保持在10℃。獲得了圖58中顯示的反應(yīng)特征，對(duì)應(yīng)于萊鮑迪苷e完全轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d。實(shí)施例26用于將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m的ugt76g1的定向進(jìn)化從genbank(aar06912.1)中所述的ugt76g1的氨基酸序列開始，鑒定了在各種氨基酸位置的不同突變，所述突變可以改變將萊鮑迪苷d(rebd)轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m(rebm)的酶的活性。這種通過dna2.0proteingpstm策略設(shè)計(jì)的突變列表隨后用于合成96個(gè)含有這些突變中的3、4或5個(gè)的變體基因，所述突變對(duì)于在大腸桿菌中的表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。將基因在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿中的固體lb培養(yǎng)基中生長。選擇合適的克隆，使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將含有pet30a+_ugt76g1var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的這些儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基中(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下在96微滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得顯著生長并獲得了良好的od(600nm；1cm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。用100μl新鮮裂解產(chǎn)物進(jìn)行了活性測試，所述裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、7和24小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m所述的分析方法，通過hplc(cad檢測)來測定轉(zhuǎn)化和初始速率。結(jié)果顯示于下表中。*突變?nèi)缦伦⑨專撼跏及被?位置-新氨基酸：例如，位置33的丙氨酸突變成甘氨酸注釋為a33g。實(shí)施例27ugtsl2的體內(nèi)產(chǎn)生ugtsl2(gi_460410132/xp_004250485.1)氨基酸序列：matnlrvlmfpwlayghispflniakqladrgfliylcstrinlesiikkipekyadsihlielqlpelpelpphyhttnglpphlnptlhkalkmskpnfsrilqnlkpdlliydvlqpwaehvaneqnipagklltscaavfsyffsfrknpgvefpfpaihlpevekvkireilakepeeggrldegnkqmmlmctsrtieakyidyctelcnwkvvpvgppfqdlitndadnkelidwlgtkhenstvfvsfgseyflskedmeevafalelsnvnfiwvarfpkgeernledalpkgflerigergrvldkfapqprilnhpstggfishcgwnsamesidfgvpiiampihndqpinaklmvelgvaveivrdddgkihrgeiaetlksvvtgetgeilrakvreisknlksirdeemdavaeeliqlcrnsnksk通過熱休克，將含有ugtsl2基因的pet30a+載體引入大腸桿菌b121(de3)中。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中，并選擇合適的克隆，使其在液體lbg培養(yǎng)基中(錐形燒瓶)生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將含有pet30a+_ugtsl2質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基中(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下振蕩8小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有60g/l過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基(novagen)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素。將預(yù)培養(yǎng)物加入200ml的這種培養(yǎng)基中，并使溶液在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。培養(yǎng)物獲得顯著生長并且獲得了良好的od。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍，獲得6.22g細(xì)胞濕重。通過添加bugbustermaster混合物(novagen)對(duì)1.4g細(xì)胞進(jìn)行裂解，通過離心收集裂解產(chǎn)物并新鮮使用。實(shí)施例28用ugtsl和ugtsl2將蛇菊苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷e的活性的測定根據(jù)實(shí)施例22制得了ugtsl，并根據(jù)實(shí)施例27制得了ugtsl2。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用600μl的裂解產(chǎn)物，用于蛇菊苷的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。hplc分析。按照實(shí)施例20中所述的進(jìn)行了hplc測試。以下提供了針對(duì)不同的酶的結(jié)果和相應(yīng)色譜并顯示于圖59a-b中。注釋：1基于蛇菊苷的初始濃度實(shí)施例29用ugtsl和ugtsl2將懸鉤子苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷e的活性的測定根據(jù)實(shí)施例22制得了ugtsl，并根據(jù)實(shí)施例27制得了ugtsl2。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用600μl的裂解產(chǎn)物，用于懸鉤子苷的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。按照實(shí)施例20中所述的進(jìn)行了hplc測試。以下提供了針對(duì)不同的酶的結(jié)果和相應(yīng)色譜并顯示于圖60a-b中。注釋：1基于懸鉤子苷的初始濃度實(shí)施例30用ugtsl2將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性的測定根據(jù)實(shí)施例27制得了ugtsl2。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用60μl的裂解產(chǎn)物，用于萊鮑迪苷a的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。按照實(shí)施例20中所述的進(jìn)行了hplc測試。以下提供了23小時(shí)反應(yīng)后的結(jié)果和相應(yīng)色譜并顯示于圖61中。注釋：1基于萊鮑迪苷a的初始濃度實(shí)施例31蛇菊苷的鑒定連同purecirclesdnbhd(馬來西亞)生產(chǎn)的甜菊葉提取物“mld1”，通過lc-ms分析了根據(jù)實(shí)施例30制備并孵育45小時(shí)的反應(yīng)混合物，來測定天然形成的糖苷的出現(xiàn)。使用了agilent1200系列hplc系統(tǒng)，其配備了雙泵(g1312b)、自動(dòng)取樣機(jī)(g1367d)、恒溫柱室(g1316b)、dad檢測儀(g1315c)，連接agilent6110amsd，并與“l(fā)c/msdchemstation”軟件配合。儀器條件移動(dòng)相梯度方案時(shí)間(分鐘)a(％)：甲酸0.1％b(％)：乙腈07525307525336832756832圖62中所示的測試表明了在11.77分鐘的lc-ms系統(tǒng)上觀察到的化合物與實(shí)施例23中3.5分鐘的化合物相同(c56h90o33；之后證實(shí)為rebm2)，在26.64分鐘觀察到的化合物與實(shí)施例23中7.6分鐘的化合物相同(c50h80o28；rebunk；之后證實(shí)為rebd2)。在13.96分鐘觀察到了rebx的其他異構(gòu)體，在25.06分鐘觀察到了rebd的另一種異構(gòu)體形式。所有觀察到的化合物都出現(xiàn)在甜菊提取物中。實(shí)施例32ugtlb的體內(nèi)制備和活性測定ugtlb(gi_209954733/bag80557.1)氨基酸序列mgtevtvhkntlrvlmfpwlayghispflnvakklvdrgfliylcstainlkstikkipekysdsiqlielhlpelpelpphyhttnglpphlnhtlqkalkmskpnfskilqnlkpdlviydllqqwaegvaneqnipavklltsgaavlsyffnlvkkpgvefpfpaiylrknelekmsellaqsakdkepdgvdpfadgnmqvmlmstsriieakyidyfsglsnwkvvpvgppvqdpiaddademelidwlgkkdenstvfvsfgseyflskedreeiafglelsnvnfiwvarfpkgeeqnledalpkgflerigdrgrvldkfapqprilnhpstggfishcgwnsvmesvdfgvpiiampihldqpmnarlivelgvaveivrddygkihreeiaeilkdviagksgenlkakmrdisknlksirdeemdtaaeeliqlcknspklk通過熱休克，將含有ugtlb基因的pet30a+載體引入大腸桿菌b121(de3)中。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中，并選擇合適的克隆，使其在液體lb培養(yǎng)基中(錐形燒瓶)生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將含有pet30a+_ugtlb質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30ml的lbgkp培養(yǎng)基中(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下振蕩8小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有60g/l過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基(novagen)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素。將預(yù)培養(yǎng)物加入200ml的這種培養(yǎng)基中，并使溶液在20℃下攪拌，同時(shí)取樣測量od和ph。培養(yǎng)物獲得顯著生長并且獲得了良好的od。40小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍，獲得5.7g細(xì)胞濕重。通過添加6mlbugbustermaster混合物(novagen)對(duì)1.2g細(xì)胞進(jìn)行裂解，通過離心收集裂解產(chǎn)物并新鮮使用。用ugtlb將蛇菊苷轉(zhuǎn)化成菜鮑迪苷e的活性的測定使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用600μl的裂解產(chǎn)物，用于蛇菊苷的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。相應(yīng)色譜描繪于圖63a中。注釋：1基于蛇菊苷的初始濃度用ugtlb將懸鉤子苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷e的活性的測定使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用600μl的裂解產(chǎn)物，用于懸鉤子苷的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。相應(yīng)色譜描繪于圖63b中。注釋：1基于懸鉤子苷的初始濃度用ugtlb將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性的測定使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用600μl的裂解產(chǎn)物，用于萊鮑迪苷a的轉(zhuǎn)化，以3ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。反應(yīng)23小時(shí)后的相應(yīng)色譜描繪于圖63c中。注釋：1基于萊鮑迪苷a的初始濃度實(shí)施例33用ugtsl、ugtsl2和ugtlb的懸鉤子苷和蛇菊苷轉(zhuǎn)化的反應(yīng)產(chǎn)物的測定以實(shí)施例28相似的方式進(jìn)行了用ugtsl和ugtsl2的蛇菊苷轉(zhuǎn)化，并以實(shí)施例29相似的方式進(jìn)行了用ugtsl和ugtsl2的懸鉤子苷轉(zhuǎn)化。以實(shí)施例32相似的方式進(jìn)行了用ugtlb的懸鉤子苷和蛇菊苷的轉(zhuǎn)化。通過lcms分析了反應(yīng)混合物來測定所有反應(yīng)產(chǎn)物。懸鉤子苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物蛇菊苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以看到在懸鉤子苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，除了蛇菊苷、rebe和rebd，存在至少3種另外的具有804分子量的化合物。這些化合物的停留時(shí)間與rebb不匹配，已知其與蛇菊苷具有相同的分子量。因?yàn)檫@些化合物與蛇菊苷具有相同的分子量，可以認(rèn)為這些新的甜菊醇糖苷是蛇菊苷的異構(gòu)體。另一方面，在蛇菊苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，除了rebe和rebd，存在至少3種另外的具有966分子量的化合物。這些化合物的停留時(shí)間與reba不匹配，已知其與rebe具有相同的分子量。因?yàn)檫@些化合物與reba和rebe具有相同的分子量，可以認(rèn)為這些新的甜菊醇糖苷是reba(rebe)的異構(gòu)體。實(shí)施例34釀酒酵母(s.cerevisiae)中ugt76g1的體內(nèi)產(chǎn)生ugt76g1[甜菊](gi_37993653/gb-aar06912.1)menktettvrrrrriilfpvpfqghinpilqlanvlyskgfsitifhtnfnkpktsnyphftfrfildndpqderisnlpthgplagmripiinehgadelrrelellmlaseedeevsclitdalwyfaqsvadslnlrrlvlmtsslfnfhahvslpqfdelgyldpddktrleeqasgfpmlkvkdiksaysnwqilkeilgkmikqtkassgviwnsfkeleeseletvireipapsfliplpkhltasssslldhdrtvfqwldqqppssvlyvsfgstsevdekdfleiarglvdskqsflwvvrpgfvkgstwveplpdgflgergrivkwvpqqevlahgaigafwthsgwnstlesvcegvpmifsdfgldqplnarymsdvlkvgvylengwergeianairrvmvdeegeyirqnarvlkqkadvslmkggssyesleslvsyissl上述氨基酸序列對(duì)于在釀酒酵母中的表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。此外，在atg起始密碼子前，添加酵母共有序列aacaca。使用hindiii和xbai限制位點(diǎn)，在pyes2載體中亞克隆合成基因。將pyes2_ugt76g1_sc載體用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)釀酒酵母invsc1細(xì)胞(invitrogen)。將細(xì)胞生長于含有2％葡萄糖缺少尿嘧啶的固體合成最小培養(yǎng)基上，并且挑選單個(gè)克隆并使其在缺少尿嘧啶的液體合成最小培養(yǎng)基(含有2％葡萄糖的sc-u)中生長。離心后，用sc-u(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水懸浮細(xì)胞。將等份試樣儲(chǔ)存在-80℃，并且將一個(gè)等份試樣用于起始在sc-u(含有2％葡萄糖)中的培養(yǎng)，在30℃下持續(xù)43小時(shí)。將這個(gè)培養(yǎng)物的一部分離心并懸浮于孵育培養(yǎng)基(含有2％半乳糖的sc-u)中，在30℃下持續(xù)19小時(shí)30分鐘。通過離心獲得細(xì)胞并用五體積的cellytictmy細(xì)胞裂解試劑(sigma)裂解。將裂解產(chǎn)物直接用于活性測試(ugt76g1_sc)。實(shí)施例35ugt76g1_sc用于將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m的活性的測定根據(jù)實(shí)施例34制得了ugt76g1_sc。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用200μl的裂解產(chǎn)物，用于萊鮑迪苷d的轉(zhuǎn)化，以2ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。相應(yīng)色譜描繪于圖64中。酶內(nèi)部參照萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化1(反應(yīng)時(shí)間)萊鮑迪苷m選擇性1ugt76g1_sc85％(21小時(shí))100％注釋：1基于萊鮑迪苷d的初始濃度實(shí)施例36釀酒酵母中ugtsl的體內(nèi)產(chǎn)生ugtsl[番茄](gi_460409128/xp_004249992.1)mspklhkelffhslykktrsnhtmatlkvlmfpflayghispylnvakkladrgfliyfcstpinlkstiekipekyadsihlielhlpelpqlpphyhttnglppnlnqvlqkalkmskpnfskilqnlkpdlviydilqrwakhvaneqnipavklltsgaavfsyffnvlkkpgvefpfpgiylrkieqvrlsemmsksdkekeledddddddllvdgnmqimlmstsrtieakyidfctaltnwkvvpvgppvqdlitndvddmelidwlgtkdenstvfvsfgseyflskedmeevafalelsnvnfiwvarfpkgeernledalpkgflerigergrvldkfapqprilnhpstggfishcgwnsamesidfgvpiiampmhldqpmnarlivelgvaveivrdddgkihrgeiaetlkgvitgktgeklrakvrdisknlktirdeemdaaaeeliqlcrngn上述氨基酸序列對(duì)于在釀酒酵母中的表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。此外，在atg起始密碼子前，添加酵母共有序列aacaca。使用hindiii和xbai限制位點(diǎn)，在pyes2載體中亞克隆合成基因。將pyes2_ugtsl_sc載體用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)釀酒酵母invsc1細(xì)胞(invitrogen)。將細(xì)胞生長于含有2％葡萄糖缺少尿嘧啶的固體合成最小培養(yǎng)基上，并且挑選單個(gè)克隆并使其在缺少尿嘧啶的液體合成最小培養(yǎng)基(含有2％葡萄糖的sc-u)中生長。離心后，用sc-u(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水懸浮細(xì)胞。將等份試樣儲(chǔ)存在-80℃，并且將一個(gè)等份試樣用于起始在sc-u(含有2％葡萄糖)中的培養(yǎng)，在30℃下持續(xù)43小時(shí)。將這個(gè)培養(yǎng)物的一部分離心并懸浮于孵育培養(yǎng)基(含有2％半乳糖的sc-u)中，在30℃下持續(xù)19小時(shí)30分鐘。通過離心獲得細(xì)胞并用五體積的cellytictmy細(xì)胞裂解試劑(sigma)裂解。將裂解產(chǎn)物直接用于活性測試(ugtsl_sc)。實(shí)施例37ugtsl_sc用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性的測定根據(jù)實(shí)施例36制得了ugtsl_sc。使用50mmph7.2的磷酸鈉緩沖液中的0.5mm底物、2.5mmudp-葡萄糖和3mmmgcl2，使用200μl的裂解產(chǎn)物，用于萊鮑迪苷a的轉(zhuǎn)化，以2ml規(guī)模進(jìn)行了活性測試。取樣并通過hplc分析。相應(yīng)色譜描繪于圖65中。酶內(nèi)部參照萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化1(反應(yīng)時(shí)間)萊鮑迪苷d選擇性1ugtsl_sc46％(4h.)42％注釋：1基于萊鮑迪苷a的初始濃度實(shí)施例38萊鮑迪苷m的分離實(shí)施例14的產(chǎn)物混合物的量不足以通過制備性hplc方法來分離。因此，使用一系列注入的分析性hplc來分離混合物的組分。根據(jù)以上實(shí)施例14中所述的方法進(jìn)行了分離，以提供對(duì)應(yīng)于圖5的hplc痕跡中的兩個(gè)主峰：級(jí)分a(停留時(shí)間24.165分鐘)和級(jí)分b(停留時(shí)間31.325分鐘)。級(jí)分a的停留時(shí)間與rebd一致，表明是來自生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的未反應(yīng)起始材料。純化的級(jí)分b的停留時(shí)間(圖6)與rebm一致，表明了從rebd的成功生物轉(zhuǎn)化。通過共同注入純化的級(jí)分b與rebm標(biāo)準(zhǔn)品(獲自purecircle，圖7中顯示的rebm標(biāo)準(zhǔn)品的hplc痕跡)來證實(shí)級(jí)分b中作為rebm收集的材料的性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)級(jí)分b和rebm標(biāo)準(zhǔn)品都在相同的停留時(shí)間洗脫(圖8)，表明級(jí)分b是rebm。通過nmr和hrms也分開證實(shí)了級(jí)分b作為rebm的性質(zhì)。為了取樣，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮級(jí)分b，冷凍干燥以及在40℃下干燥40小時(shí)。將nmr樣品溶解于氘代吡啶(c5d5n)中并使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖順序在varianunityplus600mhz儀器上獲取了質(zhì)譜。將級(jí)分b的nmr譜與rebm的nmr譜相比。兩個(gè)譜的重疊(圖9)顯示了級(jí)分b的峰與rebm的一致性。以下顯示了rebm的nmr分配表：c5d5na-c中萊鮑迪苷m的1h和13cnmr譜數(shù)據(jù)a基于cosy、hmqc和hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)行分配；b化學(xué)位移值以δ(ppm)計(jì)；c耦合常數(shù)以hz計(jì)。用配備了以正離子模式運(yùn)行的電噴霧電離源的waterspremier四極桿時(shí)間飛行(q-tof)質(zhì)譜儀產(chǎn)生了hrms(圖10)。將樣品溶解于甲醇中并在2:2:1的甲醇:乙腈:水中洗脫，并使用艙內(nèi)注射泵通過輸注引入。通過m/z1313.5265的[m+na]+加合物證實(shí)了rebm的存在，其對(duì)應(yīng)于c56h90o33的分子式。實(shí)施例39rebd2的分離和表征粗反應(yīng)樣品。根據(jù)實(shí)施例22，用ugtsl(gi#460409128)制備用于分離的批號(hào)cb-2977-106的樣品。hplc分析。使用waters2695alliance系統(tǒng)進(jìn)行了初步hplc分析，使用以下方法：phenomenexsynergihydro-rp，4.6×250mm，4μm(p/n00g-4375-e0)；柱溫：55℃；移動(dòng)相a：水中0.0284％醋酸銨(nh4oac)和0.0116％醋酸(hoac)；移動(dòng)相b：乙腈(mecn)；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過uv(210nm)和cad來檢測。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-8.5752510.0712916.5703018.5-24.5663426.5-29.0485231-373070387525用以下方法進(jìn)行了半制備性純化級(jí)分的分析：watersatlantisdc18，4.6×100mm，5μm(p/n186001340)；移動(dòng)相a：水中25％mecn；移動(dòng)相b：水中30％mecn；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過cad來檢測。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000lc-ms。使用以負(fù)離子模式運(yùn)行的waters3100質(zhì)量檢測儀，在watersautopurificationhplc/ms系統(tǒng)上進(jìn)行了半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用以下方法進(jìn)行了樣品的分析：phenomenexsynergihydro-rp，4.6×250mm，4μm(p/n00g-4375-e0)；柱溫：55℃；移動(dòng)相a：水中0.0284％nh4oac和0.0116％hoac；移動(dòng)相b：mecn；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過uv(210nm)和msd(-esim/z500-2000)來檢測。梯度條件如上所列。通過hplc的分離。以兩步進(jìn)行了純化。以下概述了用于半制備性純化的第一種方法。柱：watersatlantisdc18，30×100mm，5μm(p/n186001375)；移動(dòng)相a：水中25％mecn；移動(dòng)相b：水中30％mecn；流速：45ml/分鐘；注入載量：20ml水中溶解的160mg。通過uv來檢測(205nm)。時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000第二次純化使用了相同的柱和條件，但使用了等度移動(dòng)相：水中20％mecn。從天然提取物純化。以三步進(jìn)行了純化。以下概括了用于制備性純化的第一種方法。主要過程：waterssymmetryc18，50×250mm，7μm(p/nwat248000)；等度移動(dòng)相：水中50％甲醇(meoh)，含有0.05％hoac；流速：85ml/分鐘；注入載量：溶解于50ml移動(dòng)相中的6g粗提物。通過uv(210nm)來檢測。靶分析物洗脫后，用水中85％meoh沖洗柱。第二種方法：waterssymmetryshieldrp18，50×250mm，7μm(p/nwat248000)；等度移動(dòng)相：水中20％mecn；流速：100ml/分鐘；注入載量：溶解于30ml水中的0.5g第一級(jí)分。通過uv(210nm)來檢測。第三種方法：waterssymmetryshieldrp18，50×250mm，7μm(p/nwat248000)；等度移動(dòng)相：水中20％mecn；流速：100ml/分鐘；注入載量：溶解于30ml水中的0.5g第二級(jí)分。通過uv(210nm)來檢測。ms和ms/ms。用配備了電噴霧電離源的watersqtofpremier質(zhì)譜儀來產(chǎn)生ms和ms/ms數(shù)據(jù)。通過負(fù)esi分析樣品。用h2o:乙腈(1:1)稀釋樣品50倍并使用艙內(nèi)注射泵經(jīng)由輸注引入。將樣品稀釋，以產(chǎn)生良好的s/n，其出現(xiàn)在0.01mg/ml的合適濃度下。nmr。通過將1-2mg溶解于150μl吡啶-d5中制備了樣品并且在具有2.5mm逆檢測探頭的brukeravance500mhz儀器上獲取了nmr數(shù)據(jù)，使用。1hnmr譜參照殘余溶劑信號(hào)(對(duì)于吡啶-d5，δh8.74和δc150.35)。結(jié)果和討論分離和純化。對(duì)根據(jù)實(shí)施例22使用ugtsl(gi#460409128)制備的批號(hào)cb-2977-106的甜菊醇糖苷混合物進(jìn)行了分離。使用上述的方法，通過lc-ms分析了所述材料，并且結(jié)果提供于圖11中。感興趣的靶峰在tic色譜圖中的7.7分鐘。這個(gè)峰的質(zhì)譜提供了m/z1127.6的[m-h]-。所提供的樣品是使用以上提供的第一種方法條件以單次注入(160mg)初步制備的。這種方法將所述材料分成糖苷的“極性”和“非極性”混合物。然后使用以上的第二步條件再次處理“極性”混合物。半制備性hplc痕跡提供于圖12中。從這個(gè)半制備性集合，分離了具有純度>99％的化合物(cad，auc)。級(jí)分分析提供于圖13中。純化后，通過在35℃下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來濃縮合并的級(jí)分并凍干。獲得大約1-2mg，用于表征。質(zhì)譜。通過灌輸樣品獲得的esi-tof質(zhì)譜顯示了m/z1127.4709的[m-h]-。[m-h]-離子的質(zhì)量與分子式c50h80o28非常一致(計(jì)算為c50h79o28:1127.4758，誤差：-4.3ppm)。ms數(shù)據(jù)證實(shí)了具有分子式c50h80o28的1128道爾頓的名義質(zhì)量。ms/ms譜(選擇m/z1127.5的[m-h]-離子，用于分裂)表明了m/z641.3187、479.2655和317.2065處的兩個(gè)葡萄糖單體的丟失和三個(gè)葡萄糖部分的按序丟失。nmr光譜測定。進(jìn)行了一系列包括1hnmr(圖14)、13cnmr(圖15和16)、1h-1hcosy(圖17)、hsqc-dept(圖18)、hmbc(圖19和20)和1d-tocsy的nmr實(shí)驗(yàn)，以允許化合物的分配。1h、1h-1hcosy、1h-13chsqc-dept和1h-13chmbcnmr數(shù)據(jù)表明了糖苷的中心核是雙萜。在1h和1h-13chsqc-dept譜中觀察到的五個(gè)異頭質(zhì)子的存在證實(shí)了結(jié)構(gòu)中的五個(gè)糖單體。1h-13chsqc-dept譜中δc69.9處的亞甲基13c共振表明了結(jié)構(gòu)中1→6糖鍵的存在。使用1h-13chmbc和1d-tocsy關(guān)聯(lián)分配了糖單體的鍵。來自δh1.29的甲基質(zhì)子與δc177.7的羰基的hmbc關(guān)聯(lián)允許分配叔甲基基團(tuán)之一(c-18)以及c-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始點(diǎn)。來自甲基質(zhì)子(h-18)與δc38.9、45.0和57.8的碳的其他hmbc關(guān)聯(lián)允許c-3、c-4和c-5的分配。1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)的分析表明δc38.9的碳是亞甲基基團(tuán)，而δc57.8的碳是次甲基，其分別被分配為c-3和c-5。剩下的δc45.0的碳，其在hsqc-dept譜中沒有顯示出關(guān)聯(lián)，被分配為季碳，c-4。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配c-3(δh0.98和2j.36)和c-5(δh1.04)的1h化學(xué)位移。h-3質(zhì)子之一(δh0.98)和δh1.43的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-2質(zhì)子中的一個(gè)，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為c-1的δh0.75的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后基于其他的cosy和hsqc-dept關(guān)聯(lián)來分配針對(duì)c-1和c-2的剩余1h和13c化學(xué)位移并概括于下表中。1h和13cnmr(500和125mhz，吡啶-d5)，rebd2的分配在δh1.30觀察到的其他叔甲基單峰顯示出與c-1和c-5的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為c-20。甲基質(zhì)子顯示出與季碳(δc40.3)和次甲基碳(δc54.5)(其分別被分配為c-10和c-9)另外的hmbc關(guān)聯(lián)。h-5(δh1.04)與δh1.92和2.43之間的cosy關(guān)聯(lián)隨后允許分配h-6質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為c-7的δh1.22和1.30的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后從hsqc-dept數(shù)據(jù)測定了針對(duì)c-6(δc22.7)和c-7(δc42.2)的13c化學(xué)位移。h-9(δh0.88)與δh1.65和1.69的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-11質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為h-12質(zhì)子的δh1.99和2.25的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。隨后將hsqc-dept數(shù)據(jù)用于分配c-11(δc21.1)和c-12(δc37.5)。來自h-12質(zhì)子(δh2.25)與δc87.1和154.7的碳的hmbc關(guān)聯(lián)分別允許分配c-13和c-16。在δh5.01和5.64觀察到的烯烴質(zhì)子顯示出與c-13的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為c-17(經(jīng)由hsqc-dept，δc105.2)。烯烴質(zhì)子h-17和次甲基質(zhì)子h-9顯示出與分配為c-15的δc48.3的碳的hmbc關(guān)聯(lián)。來自h-9與δc44.5的亞甲基碳的另外的hmbc關(guān)聯(lián)隨后允許c-14的分配。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了c-14(δh1.80和2.65)和c-15(δh1.31和2.04)的1h化學(xué)位移。以下提供了用于分配糖苷配基區(qū)域的關(guān)鍵hmbc和cosy關(guān)聯(lián)：1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了五個(gè)異頭質(zhì)子的存在。三個(gè)異頭質(zhì)子在1hnmr譜中的δh6.02(δc96.1)、5.57(δc105.3)和5.34(δc105.3)處得到了充分的分辨。通過1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)鑒定了在δh5.04(δc105.6)和5.07(δc98.7)觀察到的剩余的兩個(gè)異頭質(zhì)子，其在1h譜中被溶劑(hod)共振遮掩了。在δh6.02觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與c-19的hmbc關(guān)聯(lián)，這表明了其對(duì)應(yīng)于glci的異頭質(zhì)子。相似地，在δh5.07觀察到異頭質(zhì)子顯示出與c-13的hmbc關(guān)聯(lián)，允許其被分配為glcii的異頭質(zhì)子。glci異頭質(zhì)子(δh6.02)顯示出與被分配為glcih-2的δh4.07的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcih-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh4.22(glcih-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcih-3顯示出與δh4.12(glcih-4)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許h-5或h-6質(zhì)子的分配。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glci異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)了針對(duì)glcih-2至h-4的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示出分配為glcih-5的δh4.04的質(zhì)子和分配為glcih-6質(zhì)子之一的δh4.68的質(zhì)子。后一個(gè)質(zhì)子也用于1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。使用幾個(gè)不同混合時(shí)間的h-6的選擇性照射也證實(shí)了glcih-1至h-5的分配以及h-6(δh4.30)的剩余亞甲基質(zhì)子。使用1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)測定了針對(duì)glcic-2(δc74.2)、c-3(δc79.1)、c-4(δc72.1)、c-5(δc78.5)和c-6(δc69.9)的13c化學(xué)位移的分配，以完成glci的分配。此外，1h-13chsqc-dept譜中δc69.9的亞甲基13c共振的存在表明了結(jié)構(gòu)中g(shù)lci的1→6糖鍵。四個(gè)剩余的未分配葡萄糖部分中，一個(gè)基于1h-13chsqc-dept、hmbc和1d-tocsy關(guān)聯(lián)被分配為glci的c-6的取代基。hsqc-dept譜中δc69.9的亞甲基13c共振的相對(duì)低場位移表明了glci的1→6糖鍵。δh5.04觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glcic-6的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為glcv的異頭質(zhì)子。相似地，glci的亞甲基質(zhì)子表明了與glcv的異頭碳的hmbc關(guān)聯(lián)，證實(shí)了glci和glcv之間1→6糖鍵的存在。glcv異頭質(zhì)子顯示出與分配為glcvh-2的δh4.00的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcvh-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh4.22(glcvh-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許基于glcvh-3的cosy關(guān)聯(lián)來分配glcvh-4。然而，在hmbc譜中，glcvh-3顯示出與glcvc-5(δc78.9)的關(guān)聯(lián)。在hsqc-dept中，glcvc-5顯示出與δh3.89(glcvh-5)的關(guān)聯(lián)。glcvh-5顯示出與δh4.21，4.37和4.48的cosy關(guān)聯(lián)。在hsqc-dept譜中，δh4.21顯示出與δc71.4(glcvh-4)的關(guān)聯(lián)，而δh4.37和4.48顯示出與δc63.1的關(guān)聯(lián)并分別被分配為glcvh-6a和h-6b。使用1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glcvc-2(δc75.7)和c-3(δc79.1)的13c化學(xué)位移的分配，以完成glcv的分配。針對(duì)c-19的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述顯示于下表中：1h和13cnmr(500和125mhz，吡啶-d5)，rebd2c-19糖苷的分配*異頭質(zhì)子被溶劑(hdo)共振遮掩。因此，沒能測定耦合常數(shù)值。#1h和13c值在位置glc1-3、glcv-3和glciv-3之間可以交換。以下提供了用于分配c-19糖苷的關(guān)鍵hmbc、cosy和1d-tocsy關(guān)聯(lián)的概述。以相似的方式進(jìn)行了glcii的分配。glcii異頭質(zhì)子(δh5.07)顯示出與分配為glciih-2的δh4.37的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glciih-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh4.18(glciih-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。這后一質(zhì)子顯示出與δh3.88(glciih-4)的質(zhì)子的其他關(guān)聯(lián)，其也顯示出與δh3.79(glciih-5)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。glciih-5還顯示出與glciih-6質(zhì)子(δh4.08和4.46)的cosy關(guān)聯(lián)。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)測定了針對(duì)glciic-2(δc81.3)、c-3(δc88.4)、c-4(δc71.1)、c-5(δc77.9)和c-6(δc63.2)的13c化學(xué)位移的分配。來自glciih-3至c-2和c-4以及還來自glciih-4至c-2和c-5的hmbc關(guān)聯(lián)證實(shí)了以上進(jìn)行的分配。glciih-4至glciic-6的其他hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)一步支持完成glcii的分配?；趆mbc關(guān)聯(lián)，將剩余兩個(gè)未分配的葡萄糖部分分配為glcii的c-2和c-3的取代基。在δh5.57觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-2的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciii的異頭質(zhì)子。在δh5.34觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-3的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciv的異頭質(zhì)子。還觀察到了來自glciih-2與glciii的異頭碳以及來自glciih-3與glciv的異頭碳的相互hmbc關(guān)聯(lián)。glciii的異頭質(zhì)子(δh5.57)顯示出與分配為glciiih-2的δh4.19的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許h-3至h-6質(zhì)子的分配。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glciii異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)針對(duì)glciiih-2的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示δh4.24(glciiih-3)、δh4.27(glciiih-4)和δh3.94(glciiih-5)的質(zhì)子。一旦使用1d-tocsy數(shù)據(jù)分配h-4，將來自h-4與h-5以及轉(zhuǎn)而與h-6的cosy關(guān)聯(lián)用于分配h-6。在cosy譜中，glciiih-4顯示出與glciiih-5的關(guān)聯(lián)，其轉(zhuǎn)而顯示出分別與glciiih-6a和h-6b的δh4.41和4.50的cosy關(guān)聯(lián)。然后使用1h-13chsqc-dept關(guān)聯(lián)確定針對(duì)glciiic-2(δc76.8)、c-3(δc78.9)、c-4(δc72.4)、c-5(δc78.8)和c-6(δc63.5)的13c化學(xué)位移，以完成glciii的分配。glciv(δh5.34)的異頭質(zhì)子顯示出與分配為glcivh-2的δh4.06的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許h-3至h-6質(zhì)子的分配。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glciv異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)針對(duì)glcivh-2的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示δh4.22(glcivh-3)、δh4.18(glcivh-4)和δh4.10(glcivh-5)的質(zhì)子。一旦使用1d-tocsy數(shù)據(jù)分配h-4，將來自h-4與h-5以及轉(zhuǎn)而與h-6的cosy關(guān)聯(lián)用于分配h-6。在cosy譜中，glcivh-4顯示出與glcivh-5的關(guān)聯(lián)，其轉(zhuǎn)而顯示出分別與glcivh-6a和h-6b的δh4.32和4.58的cosy關(guān)聯(lián)。然后使用1h-13chsqc-dept關(guān)聯(lián)確定針對(duì)glcivc-2(δc75.8)、c-3(δc78.9)、c-4(δc72.0)、c-5(δc79.3)和c-6(δc62.9)的13c化學(xué)位移，以完成glciv的分配。針對(duì)c-13的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述顯示于下表中：1h和13cnmr(500和125mhz，吡啶-d5)，rebd2c-13糖苷的分配以下提供了用于分配c-13糖苷的關(guān)鍵hmbc、cosy和1d-tocsy關(guān)聯(lián)的概述：nmr和ms分析允許以下所示結(jié)構(gòu)的全部分配?；衔锏幕瘜W(xué)名稱是13-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-3-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)氧]等效-16-貝殼杉烯-19-酸-[(6-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)酯](萊鮑迪苷d2或rebd2)。所述化合物是萊鮑迪苷d的異構(gòu)體。實(shí)施例40rebm2的分離和表征粗反應(yīng)樣品。根據(jù)實(shí)施例22，用ugtsl(gi#460409128)制備用于分離的批號(hào)cb-2977-106的樣品。hplc分析。使用waters2695alliance系統(tǒng)進(jìn)行了初步hplc分析，使用以下方法：phenomenexsynergihydro-rp，4.6×250mm，4μm(p/n00g-4375-e0)；柱溫：55℃；移動(dòng)相a：水中0.0284％醋酸銨(nh4oac)和0.0116％醋酸(hoac)；移動(dòng)相b：乙腈(mecn)；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過uv(210nm)和cad來檢測。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000用以下方法進(jìn)行了半制備性純化級(jí)分的分析：watersatlantisdc18，4.6×100mm，5μm(p/n186001340)；移動(dòng)相a：水中25％mecn；移動(dòng)相b：水中30％mecn；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過cad來檢測。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-8.5752510.0712916.5703018.5-24.5663426.5-29.0485231-373070387525lc-ms。使用以負(fù)離子模式運(yùn)行的waters3100質(zhì)量檢測儀，在watersautopurificationhplc/ms系統(tǒng)上進(jìn)行了半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用以下方法進(jìn)行了樣品的分析：phenomenexsynergihydro-rp，4.6×250mm，4μm(p/n00g-4375-e0)；柱溫：55℃；移動(dòng)相a：水中0.0284％nh4oac和0.0116％hoac；移動(dòng)相b：mecn；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過uv(210nm)和msd(-esim/z500-2000)來檢測。梯度條件如上所列。通過hplc的分離。以兩步進(jìn)行了純化。以下概述了用于半制備性純化的第一種方法。柱：watersatlantisdc18，30×100mm，5μm(p/n186001375)；移動(dòng)相a：水中25％mecn；移動(dòng)相b：水中30％mecn；流速：45ml/分鐘；注入載量：20ml水中溶解的160mg。通過uv來檢測(205nm)。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-5.01000202080252080301000第二次純化使用了相同的柱和條件，但使用了等度移動(dòng)相：水中20％mecn。ms和ms/ms。用配備了電噴霧電離源的watersqtofpremier質(zhì)譜儀來產(chǎn)生ms和ms/ms數(shù)據(jù)。通過負(fù)esi分析樣品。用h2o∶mecn(1∶1)稀釋樣品50倍并使用艙內(nèi)注射泵經(jīng)由輸注引入。將樣品稀釋，以產(chǎn)生良好的s/n，其出現(xiàn)在0.01mg/ml的合適濃度下。nmr。通過將～1.0mg溶解于150μld2o中制備了樣品并且在具有2.5mm逆檢測探頭的brukeravance500mhz儀器上獲取了nmr數(shù)據(jù)。1hnmr和13cnmr譜分別參照殘余溶劑信號(hào)hdo(δh4.79ppm)和tsp(δc0.00ppm)。結(jié)果和討論分離和純化。對(duì)根據(jù)實(shí)施例22使用ugtsl(gi#460409128)制備的批號(hào)cb-2977-106的甜菊醇糖苷混合物進(jìn)行了分離。使用上述的方法(圖11)，通過lc-ms分析了所述材料。感興趣的靶峰在tic色譜圖中的4.1分鐘。這個(gè)峰的質(zhì)譜提供了m/z1289.7的[m-h]-。所提供的樣品是使用以上提供的第一種方法條件以單次注入(160mg)初步制備的。這種方法將所述材料分成糖苷的“極性”和“非極性”混合物。然后使用以上的第二步條件再次處理“極性”混合物。半制備性hplc痕跡顯示于圖12中。從這個(gè)半制備性集合，分離了具有純度>99％的峰(cad，auc)。級(jí)分分析提供于圖13中。純化后，通過在35℃下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來濃縮合并的級(jí)分并凍干。獲得大約1mg。質(zhì)譜。通過灌輸樣品cc-00300獲得的esi-tof質(zhì)譜顯示了m/z1289.5266的[m-h]-。[m-h]-離子的質(zhì)量與預(yù)期為rebm2的分子式c56h90o33非常一致(計(jì)算為c56h89o33:1289.5286，誤差：-1.6ppm)。ms數(shù)據(jù)證實(shí)了cc-00300具有分子式c56h90o33的1290道爾頓的名義質(zhì)量。ms/ms譜(選擇m/z1289.5的[m-h]-離子，用于分裂)表明了m/z803.3688的三個(gè)葡萄糖單體的丟失以及m/z641.3165、479.2633和317.2082的三個(gè)葡萄糖部分的按序丟失。nmr光譜測定。進(jìn)行了一系列包括1hnmr(圖21)、13cnmr(圖22和23)、1h-1hcosy(圖24)、hsqc-dept(圖25)、hmbc(圖26和27)和1d-tocsy的nmr實(shí)驗(yàn)，以允許rebm2的分配。1h、1h-1hcosy、1h-13chsqc-dept和1h-13chmbcnmr數(shù)據(jù)表明了糖苷的中心核是雙萜。在1h和1h-13chsqc-dept譜中觀察到的六個(gè)異頭質(zhì)子的存在證實(shí)了結(jié)構(gòu)中的六個(gè)糖單體。1h-13chsqc-dept譜中δc70.9處的亞甲基13c共振表明了結(jié)構(gòu)中1→6糖鍵的存在。使用1h-13chmbc和1d-tocsy關(guān)聯(lián)分配了糖單體的鍵。來自δh1.29的甲基質(zhì)子與δc181.5的羰基的hmbc關(guān)聯(lián)允許分配叔甲基基團(tuán)之一(c-18)以及c-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始點(diǎn)。來自甲基質(zhì)子(h-18)與δc39.8、43.7和59.2的碳的其他hmbc關(guān)聯(lián)允許c-3、c-4和c-5的分配。1h和1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)的分析表明δc39.8的碳是亞甲基基團(tuán)，而δc59.2的碳是次甲基，其分別被分配為c-3和c-5。剩下的δc43.7的碳，其在hsqc-dept譜中沒有顯示出關(guān)聯(lián)，被分配為季碳，c-4。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配c-3(δh1.16和2.28)和c-5(δh1.24)的1h化學(xué)位移。h-3質(zhì)子之一(δh1.16)和δh1.49的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-2質(zhì)子中的一個(gè)，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為c-1的δh0.92的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后基于其他的cosy和hsqc-dept關(guān)聯(lián)來分配針對(duì)c-1和c-2的剩余1h和13c化學(xué)位移并概括于下表中。1hnmr(500mhz，d2o)和13cnmr(125mhz，d2o/tsp)，rebm2糖苷配基的分配在δh0.92觀察到的其他叔甲基單峰顯示出與c-1和c-5的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為c-20。甲基質(zhì)子顯示出與季碳(δc42.4)和次甲基(δc55.5)(其分別被分配為c-10和c-9)另外的hmbc關(guān)聯(lián)。h-5(δh1.24)與δh1.73和1.94之間的cosy關(guān)聯(lián)隨后允許分配h-6質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為c-7的δh1.49和1.56的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后從hsqc-dept數(shù)據(jù)測定了針對(duì)c-6(δc24.4)和c-7(δc44.2)的13c化學(xué)位移。h-9(δh1.09)與δh1.66和1.70的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-11質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為h-12質(zhì)子的δh1.60和2.00的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。隨后將hsqc-dept數(shù)據(jù)用于分配c-11(δc22.6)和c-12(δc39.9)。在δh4.98和5.16觀察到的烯烴質(zhì)子顯示出與c-13(δc90.9)的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為c-17(經(jīng)由hsqc-dept，δc107.0)。烯烴質(zhì)子h-17顯示出與分配為c-15的δc49.4的碳的hmbc關(guān)聯(lián)。來自h-9與δc46.9的亞甲基碳的另外的hmbc關(guān)聯(lián)隨后允許c-14的分配。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了c-14(δh1.53和2.21)和c-15(δh2.15和2.18)的1h化學(xué)位移。以下提供了用于分配糖苷配基區(qū)域的關(guān)鍵hmbc和cosy關(guān)聯(lián)的概述：1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)的分析證實(shí)了六個(gè)異頭質(zhì)子的存在。三個(gè)異頭質(zhì)子在1hnmr譜中的δh5.65(δc95.5)、4.92(δc104.9)和4.50(δc105.7)處得到了充分的分辨。在δh4.85(δc98.4)、4.84(δc105.0)和4.83(δc105.3)觀察到的剩余的三個(gè)異頭質(zhì)子被1h譜中的殘余溶劑共振重疊了。在δh5.65觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與c-19的hmbc關(guān)聯(lián)，這表明了其對(duì)應(yīng)于glci的異頭質(zhì)子。相似地，在δh4.85觀察到異頭質(zhì)子顯示出與c-13的hmbc關(guān)聯(lián)，允許其被分配為glcii的異頭質(zhì)子。glci異頭質(zhì)子(δh5.65)顯示出與分配為glcih-2的δh3.96的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcih-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh3.89(glcih-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcih-3顯示出與δh3.71(glcih-4)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許h-5或h-6質(zhì)子的分配。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glci異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)了針對(duì)glcih-2至h-4的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示出分配為glcih-5的δh3.73的質(zhì)子和分配為glcih-6質(zhì)子之一的δh4.15的質(zhì)子。后一個(gè)質(zhì)子也用于1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。使用幾個(gè)不同混合時(shí)間的h-6的選擇性照射也證實(shí)了glcih-1至h-5的分配以及h-6(δh4.00)的剩余亞甲基質(zhì)子。使用1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glcic-2(δc80.5)、c-3(δc79.0)、c-4(δc71.5)、c-5(δc79.0)和c-6(δc70.9)的13c化學(xué)位移的分配，以完成glci的分配。此外，1h-13chsqc-dept譜中δc70.9的亞甲基13c共振的存在表明了結(jié)構(gòu)中g(shù)lci的1→6糖鍵。兩個(gè)未分配的葡萄糖部分基于hmbc關(guān)聯(lián)被分配為glci的c-2和c-6的取代基。δh4.83觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glcic-2的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為glcv的異頭質(zhì)子。δh4.50觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glcic-6的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為glcvi的異頭質(zhì)子。還觀察到了來自glcih-2與glcv的異頭質(zhì)子和來自glcih-6與glcvi的異頭質(zhì)子的相互hmbc關(guān)聯(lián)。glcv的異頭質(zhì)子(δh4.83)顯示出與分配為glcvh-2的δh3.32的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。glcvh-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh3.51(glcvh-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。這后一質(zhì)子顯示出與δh3.38(glcvh-4)的質(zhì)子的其他關(guān)聯(lián)。h-4也顯示出與δh3.55(glcvh-5)的cosy關(guān)聯(lián)，而glcvh-5轉(zhuǎn)而顯示出與glcvh-6質(zhì)子(δh3.76和3.97)的cosy關(guān)聯(lián)。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glcvc-2(δc78.5)、c-3(δc78.7)、c-4(δc72.9)、c-5(δc78.8)和c-6(δc63.6)的13c化學(xué)位移的分配。來自glcvh-3與c-2和c-4以及還來自glcvh-4與c-3和c-6的hmbc關(guān)聯(lián)證實(shí)了以上進(jìn)行的分配，以完成glcv的分配?；?h-13chsqc-dept和hmbc關(guān)聯(lián)，將另一個(gè)葡萄糖部分分配為glci的c-6的取代基。hsqc-dept譜中δc70.9的glci的亞甲基13c共振的相對(duì)低場位移表明glci的1→6糖鍵。在δh4.50觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glcic-6的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glcvi的異頭質(zhì)子。相似地，glci的亞甲基質(zhì)子顯示出與glcvi的異頭碳的hmbc關(guān)聯(lián)，并且這證實(shí)了glci與glcvi之間的1→6糖鍵的存在。glcvi異頭質(zhì)子顯示出與分配為glcvih-2的δh3.33的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glcvih-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh3.49的質(zhì)子(glcvih-3)的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許基于cosy關(guān)聯(lián)分配glcvh-4至h-6。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glcvi異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)了針對(duì)glcvih-2至h-3的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示了δh3.45(glcvih-4)和δh3.48(glcvih-5)的質(zhì)子以及分配為glcvih-6質(zhì)子的δh3.92和3.94的質(zhì)子。使用1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glcvic-2(δc78.1)、c-3(δc78.6)、c-4(δc72.3)、c-5(δc78.8)和c-6(δc64.1)的13c化學(xué)位移的分配，以完成glcvi的分配。針對(duì)c-19的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述顯示于下表中：rebm2糖苷的hnmr(500mhz，d2o)和13cnmr(125mhz，d2o/tsp)分配*1h和13c值可以與下表的glciv-1交換。以下提供了用于分配c-19糖苷區(qū)域的關(guān)鍵hmbc、cosy和1d-tocsy關(guān)聯(lián)的概述：rebm2糖苷的1hnmr(500mhz，d2o)和13cnmr(125mhz，d2o/tsp)分配以相似的方式進(jìn)行了glcii的分配。glcii異頭質(zhì)子(δh4.85)顯示了與分配為glciih-2的δh3.75的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glciih-2轉(zhuǎn)而顯示出與δh3.98的質(zhì)子(glciih-3)的cosy關(guān)聯(lián)。這后一質(zhì)子顯示出與δh3.54的質(zhì)子(glciih-4)的其他關(guān)聯(lián)。h-4還顯示出與δh3.96的質(zhì)子(glciih-5)的cosy關(guān)聯(lián)。glciih-5還顯示出與glciih-6質(zhì)子(δh3.77和3.45)的cosy關(guān)聯(lián)。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glciic-2(δc81.7)、c-3(δc88.0)、c-4(δc71.3)、c-5(δc80.5)和c-6(δc63.6)的13c化學(xué)位移的分配。來自glciih-3與c-2和c-4以及還來自glciih-4與c-3和c-6的hmbc關(guān)聯(lián)證實(shí)了以上進(jìn)行的分配，以完成glcii的分配。剩余的兩個(gè)未分配葡萄糖部分基于hmbc關(guān)聯(lián)被分配為glcii的c-2和c-3的取代基。在δh4.92觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-2的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciii的異頭質(zhì)子。在δh4.84觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-3的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciv的異頭質(zhì)子。還觀察到了glciih-2與glciii異頭碳之間以及glciih-3與glciv的異頭碳之間的相互hmbc關(guān)聯(lián)。glciii的異頭質(zhì)子(δh4.92)顯示出與分配為glciiih-2的δh3.32的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許h-3至h-6質(zhì)子的分配。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glciii異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1d-tocsy實(shí)驗(yàn)。除了證實(shí)了針對(duì)glciiih-2的分配，1d-tocsy數(shù)據(jù)顯示了δh3.51(glciiih-3)、δh3.26(glciiih-4)和δh3.44(glciiih-5)的質(zhì)子。一旦使用1d-tocsy數(shù)據(jù)分配了h-4，將來自h-4與h-5并且轉(zhuǎn)而與h-6的cosy關(guān)聯(lián)用于分配h-6。在cosy譜中，glciiih-4顯示出與glciiih-5的關(guān)聯(lián)，glciiih-5轉(zhuǎn)而顯示出分別與δh3.94和3.75的glciiih-6a和glciiih-6b的cosy關(guān)聯(lián)。使用1h-13chsqc-dept關(guān)聯(lián)確定了針對(duì)glciiic-2(δc76.3)、c-3(δc78.8)、c-4(δc73.3)、c-5(δc78.8)和c-6(δc64.4)的13c化學(xué)位移，以完成glciii的分配。顯示出與δh3.41的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)的glciv(δh4.84)的異頭質(zhì)子被分配為glcivh-2，其轉(zhuǎn)而顯示出與δh3.46的質(zhì)子(glcivh-3)的cosy關(guān)聯(lián)。這后一質(zhì)子顯示出與δh3.45的質(zhì)子(glcivh-4)的其他關(guān)聯(lián)，glcivh-4還顯示出與δh3.75的質(zhì)子(glcivh-5)的cosy關(guān)聯(lián)。glcivh-5還顯示出與glcivh-6質(zhì)子(δh3.55和3.78)的cosy關(guān)聯(lián)。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)確定了針對(duì)glcivc-2(δc76.1)、c-3(δc78.8)、c4(δc72.5)、c-5(δc81.7)和c-6(δc65.8)的13c化學(xué)位移的分配。來自glcivh-3與c-4和c-5以及還來自glcivh-4與c-3和c-6的hmbc關(guān)聯(lián)證實(shí)了以上進(jìn)行的分配，以完成glciv的分配。針對(duì)c-13的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述顯示于下表中：rebm2糖苷的1hnmr(500mhz，d2o)和13cnmr(125mhz，d2o/tsp)分配以下提供了用于分配c-13糖苷區(qū)域的關(guān)鍵hmbc、cosy和1d-tocsy關(guān)聯(lián)的概述：nmr和ms分析允許以下所示結(jié)構(gòu)的全部分配?；衔锏幕瘜W(xué)名稱是13-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-3-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)氧]等效-16-貝殼杉烯-19-酸-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-6-o-β-d-吡喃葡糖基-β-d-吡喃葡糖基)酯](萊鮑迪苷m2或rebm2)。所述化合物是萊鮑迪苷m的異構(gòu)體。實(shí)施例41ugt76g1用于將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x的定向進(jìn)化(第2輪)選擇來自第一輪ugt76g1定向進(jìn)化的最有活性克隆(參見實(shí)施例26含有突變q266e_p272a_r334k_g348p_l379g的ugt76g1var94)作為用于第2輪的基線克隆。建立了含有來自第一輪不同鑒定的正突變和通過dna2.0proteingpstm策略獲得的新突變的53個(gè)突變列表。隨后將這個(gè)突變列表用于設(shè)計(jì)各自含有3個(gè)不同突變的92個(gè)變體基因。針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_utg76g1var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。用加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中的100μl新鮮裂解產(chǎn)物來進(jìn)行活性測試。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、7和24小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x所述的分析方法，通過hplc(cad檢測)來測定轉(zhuǎn)化和初始速率。平行地，用基線克隆第1輪-var94進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的22小時(shí)后的轉(zhuǎn)化和初始速率限定為100％并且針對(duì)第2輪克隆的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化和初始速率描繪于下表中：*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于來自第一輪ugt76g1定向進(jìn)化的變體94，位置33的丙氨酸突變成甘氨酸注釋為round1-var94(a33g)。這些結(jié)果的建模允許獲得每個(gè)突變的作用的分級(jí)。確定以下突變對(duì)于活性是有益的：s42a、f46i、i190l、s274g、i295m、k303g、f314s、k316r、k393r、v394i、i407v、n409k、n409r、q425e、q432e、s447a、s456l。實(shí)施例42atsus的體內(nèi)生產(chǎn)atsus>gi|79328294|ref|np_001031915.1|蔗糖合成酶1[擬南芥]manaermitrvhsqrerlnetlvsernevlallsrveakgkgilqqnqiiaefealpeqtrkkleggpffdllkstqeaivlppwvalavrprpgvweylrvnlhalvveelqpaeflhfkeelvdgvkngnftleldfepfnasiprptlhkyigngvdflnrhlsaklfhdkesllpllkflrlhshqgknlmlsekiqnlntlqhtlrkaeeylaelksetlyeefeakfeeiglergwgdnaervldmirllldlleapdpctletflgrvpmvfnvvilsphgyfaqdnvlgypdtggqvvyildqvraleiemlqrikqqglnikprililtrllpdavgttcgerlervydseycdilrvpfrtekgivrkwisrfevwpyletytedaavelskelngkpdliignysdgnlvasllahklgvtqctiahalektkypdsdiywkklddkyhfscqftadifamnhtdfiitstfqeiagsketvgqyeshtaftlpglyrvvhgidvfdpkfnivspgadmsiyfpyteekrrltkfhseieellysdvenkehlcvlkdkkkpilftmarldrvknlsglvewygkntrlrelanlvvvggdrrkeskdneekaemkkmydlieeyklngqfrwissqmdrvrngelyryicdtkgafvqpalyeafgltvveamtcglptfatckggpaeiivhgksgfhidpyhgdqaadtladfftkckedpshwdeiskgglqrieekytwqiysqrlltltgvygfwkhvsnldrlearrylemfyalkyrplaqavplaqdd將atsus的合成基因針對(duì)大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化并使用ndei和xhoi限制位點(diǎn)在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆。將含有atsus的pet30a+載體用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌b121(de3)細(xì)胞。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞生長于皮氏培養(yǎng)皿中，并選擇合適的克隆，使其在液體lb培養(yǎng)基中生長(錐形燒瓶)。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下將含有pet30a+_atsus質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入30mllbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)。使這個(gè)培養(yǎng)物在135rpm和30℃下振蕩8小時(shí)。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有60g/l過夜表達(dá)已配制好的tb培養(yǎng)基(novagen)、10g/l甘油和50mg/l卡那霉素。將預(yù)培養(yǎng)物加入800ml這個(gè)培養(yǎng)基中，并且使溶液在20℃下攪拌，同時(shí)取樣來測量od和ph。培養(yǎng)物獲得了良好的生長并獲得了良好的od。40h后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍，以獲得30.1g的細(xì)胞濕重。用1.0ml的50mmtris緩沖液ph7.5中的200mg細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，通過fastprep(mpbiomedicals，裂解基質(zhì)b，速度6.0，3×40秒鐘)進(jìn)行了裂解。通過離心收集裂解產(chǎn)物并新鮮使用。實(shí)施例43使用ugtsl2、ugt76g1-r1-f12和atsus，用原位制備的udp-葡萄糖，將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x使用磷酸鉀緩沖液(50mm終濃度，ph7.5)中的100mm蔗糖、3mm的mgcl2、0.25mmudp和0.5mm萊鮑迪苷a，以1ml規(guī)模進(jìn)行了反應(yīng)。通過添加15μlugtsl2(參見實(shí)施例27)裂解產(chǎn)物(2u/ml)、150μlugt76g1var94(參見實(shí)施例26)(2.5u/ml)和15μlatsus(參見實(shí)施例42)(400u/ml)，來啟動(dòng)反應(yīng)。用10μl2nh2so4和115μl60％甲醇驟冷125μl樣品后，反應(yīng)接著是hplc。21小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，獲得了68％萊鮑迪苷x和26％萊鮑迪苷m2，如圖66中所示。實(shí)施例44ugt76g1用于將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x的定向進(jìn)化(第3輪)選擇來自第二輪的ugt76g1定向進(jìn)化的最有活性克隆(參見實(shí)施例41含有突變s42a_f46i_i407v的第2輪_ugt76g1var66)作為用于第3輪的基線克隆。建立了含有從第二輪不同鑒定的正突變和通過dna2.0proteingpstm策略獲得的30個(gè)新突變的56個(gè)突變列表。將這個(gè)突變列表隨后用于設(shè)計(jì)各自含有3或4個(gè)不同突變的92個(gè)變體基因。針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_ugt76g1var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。用加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中的100μl新鮮裂解產(chǎn)物來進(jìn)行活性測試。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在1、2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x所述的分析方法，通過hplc(cad檢測)來測定轉(zhuǎn)化和初始速率。平行地，用基線克隆第2輪-var66進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的22小時(shí)后的轉(zhuǎn)化和初始速率限定為100％并且針對(duì)第3輪克隆的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化和初始速率描繪于下表中：*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于來自第二輪ugt76g1定向進(jìn)化的變體66，位置190的異亮氨酸突變成亮氨酸注釋為第2輪-var66(i190l)。這些結(jié)果的建模允許獲得每個(gè)突變的作用的分級(jí)。確定以下突變對(duì)于活性是有益的：i46l、i295m、s119a、s274g、k334r、f314s、k303g、k316r、k393r、i190l、q425e、q432e、n138g、v394i、f182l、v407i、a272p、v264c、e449d、a352g。實(shí)施例45ugtsl2用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的定向進(jìn)化(第1輪)從天然酶ugtsl2(gi_460410132)開始，建立了含有從第一輪不同鑒定的正突變和通過dna2.0proteingpstm策略獲得的新突變的60個(gè)突變列表。將這個(gè)突變列表隨后用于設(shè)計(jì)各自含有3個(gè)不同突變的92個(gè)變體基因。針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_ugtsl2var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。用加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中的100μl新鮮裂解產(chǎn)物來進(jìn)行活性測試。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d所述的分析方法，通過hplc(cad檢測)來測定轉(zhuǎn)化和初始速率。平行地，用基線克隆ugtsl2進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的初始速率限定為100％。作為克隆特異性的指示，在100％udp-葡萄糖轉(zhuǎn)化下測定了萊鮑迪苷m2含量，并且在50％udp-葡萄糖轉(zhuǎn)化下測定了萊鮑迪苷d2含量。其中將udp葡萄糖轉(zhuǎn)化限定為：([rebd]/[reba]0)+([rebd2]/[reba]0)+2*([rebm2]/[reba]0)。下表中描述了100％udp-葡萄糖轉(zhuǎn)化下的標(biāo)準(zhǔn)化初始速率、萊鮑迪苷m2含量和50％udp-葡萄糖轉(zhuǎn)化下的萊鮑迪苷d2含量。*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于ugtsl2，位置240的異亮氨酸突變成亮氨酸，注釋為ugtsl2(i240l)這些結(jié)果的建模允許獲得每個(gè)突變的作用的分級(jí)。確定以下突變對(duì)于活性是有益的：l276a、t392a、q27r、n278g、t329v、a341v、i333l、g387e、h247p、m354l、a285v、v270i、n325s、i240l、f253y、a285l、i352v。確定以下突變對(duì)于較低的萊鮑迪苷m2形成是有益的：q27r、n325s、g387e、i333l、h247p、t329i、r312l、t199s、e259g、s334t、i131v、a285l、i389l、l393v、v254l、n339s、i345l、t245r。實(shí)施例46使用ugt76g1將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷i使用ugt76g1-r1-f12(也稱為ugt76g1var94)進(jìn)行了反應(yīng)(參見實(shí)施例26))。反應(yīng)總體積為40ml，具有以下組成：50mm磷酸鈉緩沖液ph7.5，3mmmgcl2，2.5mmudp-葡萄糖，0.5mm萊鮑迪苷a和4mlugt76g1-1-f12裂解產(chǎn)物(2.5u/ml)。在135rpm的軌道振蕩器上在30℃下運(yùn)行反應(yīng)。為了取樣，用10μl2nh2so4和115μl甲醇/水(7/3)驟冷125μl反應(yīng)混合物。立即將樣品離心并且在通過lc-ms分析前保持在10℃。使用了agilent1200系列hplc系統(tǒng)，其配備了雙泵(g1312b)、自動(dòng)取樣機(jī)(g1367d)、恒溫柱室(g1316b)、dad檢測儀(c1315c)，連接agilent6110amsd，并與“l(fā)c/msdchemstation”軟件配合。儀器條件移動(dòng)相梯度方案時(shí)間(分鐘)a(％)：甲酸0.1％b(％)：乙腈076248.5762410.0712916.57030獲得了圖67a中顯示的反應(yīng)特征：42小時(shí)反應(yīng)后，用20ml乙醇驟冷20ml的反應(yīng)混合物并用于結(jié)構(gòu)說明。以相似的方式，針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷i，測試了ugt76g1定向進(jìn)化第2輪(ugt76g1-r2-b9，以上鑒定為“第2輪-var66”，參見實(shí)施例41)和第3輪(ugt76g1-r3-g3，以上鑒定為“第3輪-var21”，參見實(shí)施例44)的最佳克隆以及天然ugt76g1(參見實(shí)施例26)，并且測定了圖67b中顯示的活性。實(shí)施例47rebi的分離和表征粗反應(yīng)樣品。根據(jù)實(shí)施例46，用ugt76g1制備用于分離的批號(hào)cb-2977-198的樣品。hplc分析。使用waters2695alliance系統(tǒng)進(jìn)行了初步hplc分析，使用以下方法：phenomenexsynergihydro-rp，4.6×250mm，4μm(p/n00g-4375-e0)；柱溫：55℃；移動(dòng)相a：水中0.0284％nh4oac和0.0116％醋酸；移動(dòng)相b：乙腈(mecn)；流速：1.0ml/分鐘；注入體積：10μl。通過uv(210nm)和cad來檢測。梯度：時(shí)間(分鐘)％a％b0.0-8.5752510.0712916.5703018.5-24.5663426.5-29.0485231-373070387525通過hplc分離。使用watersatlantisdc18(30×100mm，5μm，p/n186001375)柱進(jìn)行了純化，使用80:20水/mecn的等度移動(dòng)相條件。將流速保持在45ml/分鐘并且注入載量為180mg。將檢測儀波長設(shè)定在210nm。使用watersatlantisdc18(4.6×150mm，5μm，p/n186001342)柱，進(jìn)行了級(jí)分的分析；移動(dòng)相a：水；移動(dòng)相b：mecn；流速：1ml/分鐘；等度移動(dòng)相條件：75:25a/b，持續(xù)30分鐘。ms和ms/ms。用配備了電噴霧電離源的micro質(zhì)譜儀的watersqt產(chǎn)生了ms和ms/ms。通過負(fù)esi分離了樣品。用h2o:mecn(1:1)將樣品稀釋至0.25mg/ml的濃度并且經(jīng)由流動(dòng)注入引入，用于ms數(shù)據(jù)獲取。將樣品進(jìn)一步稀釋至0.01mg/ml，產(chǎn)生良好的s/n，以針對(duì)ms/ms調(diào)整，并通過直接輸注來獲取。將碰撞能量設(shè)定為60v，以獲取ms/ms數(shù)據(jù)，其由于分子的性質(zhì)，具有提高的碎片離子峰。nmr。通過將～1.0mg溶解于180μl吡啶-d5+tms中來制備樣品，并且在brukeravance500mhz儀器上獲取nmr數(shù)據(jù)，使用2.5mm反向探頭或5mm寬頻帶探頭。在rensselaerpolytechnicinstitute，分別使用其具有5mm冷凍探頭的brukeravance600mhz和800mhz儀器，獲取了13c和hmbcnmr數(shù)據(jù)。將1h和13cnmr譜參照tms共振(δh0.00ppm和δc0.0ppm)。使用批號(hào)cb-2977-198的半合成甜菊醇糖苷混合物，進(jìn)行了rebi的分離。按照以上所述的，通過hplc分析了所述材料。在大約17min的停留時(shí)間(tr)，觀察到了rebi峰，如圖28中所示。結(jié)果和討論按照以上所述的，從反應(yīng)粗制物分離了rebi峰，并顯示于圖29中。將分離的級(jí)分合并并凍干。如使用上述方法的lc-cad證實(shí)的，終產(chǎn)物的純度為91％(圖30)。提供了大約1mg的rebi，用于分光鏡和光譜分析。質(zhì)譜。通過灌輸rebi的樣品獲取的esi-tof質(zhì)譜顯示出m/z1127.4741的[m-h]-(圖31)。[m-h]-離子的質(zhì)量與預(yù)期為rebi的分子式c50h79o28非常一致(計(jì)算為c50h79o28:1127.4758，誤差：-1.5ppm)(圖32)。ms數(shù)據(jù)證實(shí)了rebi具有分子式c50h80o28的1128道爾頓的名義質(zhì)量。rebi的ms/ms譜(選擇m/z1127.4的[m-h]-離子，用于分裂)表明了m/z803.5301的兩個(gè)糖單體的丟失，然而使用30v碰撞能量沒有顯示出其他分裂(圖33)。應(yīng)用較高的碰撞能量時(shí)(60v)(圖34)，沒有觀察到親本離子，但從m/z803.5301觀察到m/z641.4488、479.3897和317.3023的三個(gè)糖單體的按序丟失。nmr光譜測定。進(jìn)行了一系列包括1hnmr(圖35-37)、13cnmr(圖38-39)、1h-1hcosy(圖40)、hsqc-dept(圖41)、hmbc(圖42-43)、noesy(圖44-45)和1d-tocsy(圖46-50)的nmr實(shí)驗(yàn)，以允許rebi的分配。在300k獲取的rebi的1hnmr譜中(圖35)，異頭質(zhì)子之一被水共振完全遮掩。因此，在較低溫度(292k)下獲取了樣品的1hnmr譜，以移出水共振，并且在該溫度下，足以分辯異頭質(zhì)子(圖36-37)。因此，在292k下獲取了rebi的所有其他nmr數(shù)據(jù)。1d和2dnmr數(shù)據(jù)表明了糖苷的中心核是雙萜。來自δh1.22的甲基質(zhì)子與δc176.9的羰基的hmbc關(guān)聯(lián)允許分配叔甲基基團(tuán)之一(c-18)以及c-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始點(diǎn)。來自甲基質(zhì)子(h-18)與δc38.5、44.0和57.2的碳的其他hmbc關(guān)聯(lián)允許c-3、c-4和c-5的分配。1h-13chsqc-dept數(shù)據(jù)的分析表明δc38.5的碳是亞甲基基團(tuán)，而δc57.2的碳是次甲基，其分別被分配為c-3和c-5。剩下的δc44.0的碳，其在hsqc-dept譜中沒有顯示出關(guān)聯(lián)，被分配為季碳，c-4。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配c-3(δh1.02和2.35)和c-5(δh1.03)的1h化學(xué)位移。h-3質(zhì)子之一(δh1.02)和δh1.44的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-2質(zhì)子中的一個(gè)，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為h-1的δh0.74的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后基于其他的cosy和hsqc-dept關(guān)聯(lián)來分配針對(duì)c-1和c-2的剩余1h和13c化學(xué)位移并概括于下表中。1h和13cnmr(500和150mhz，吡啶-d5)，萊鮑迪苷i糖苷配基的分配在δh1.26觀察到的其他叔甲基單峰顯示出與c-1和c-5的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為h-20。甲基質(zhì)子顯示出與季碳(δc39.8)和次甲基碳(δc54.1)(其分別被分配為c-10和c-9)另外的hmbc關(guān)聯(lián)。h-5(δh1.03)與δh1.90和2.33之間的cosy關(guān)聯(lián)隨后允許分配h-6質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為h-7的δh1.29和1.31的質(zhì)子的關(guān)聯(lián)。隨后從hsqc-dept數(shù)據(jù)測定了針對(duì)c-6(δc22.2)和c-7(δc41.7)的13c化學(xué)位移。h-9(δh0.88)與δh1.67和1.70的質(zhì)子之間的cosy關(guān)聯(lián)允許分配h-11質(zhì)子，其轉(zhuǎn)而顯示出與分配為h-12質(zhì)子的δh1.98和2.28的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。隨后將hsqc-dept數(shù)據(jù)用于分配c-11(δc20.5)和c-12(δc37.3)。在δh5.02和5.67觀察到的烯烴質(zhì)子顯示出與δc86.7(c-13)的季碳的hmbc關(guān)聯(lián)并被分配為h-17(經(jīng)由hsqc-dept，δc104.8)。次甲基質(zhì)子h-9顯示出分別與分配為c-8、c-14和c-15的δc42.3、44.3和47.6的碳的hmbc關(guān)聯(lián)。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了c-14(δh1.78和2.59)和c-15(δh2.04)的1h化學(xué)位移。來自h-9與c-11和h-12與c-9的其他hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)一步證實(shí)了以上進(jìn)行的分配。從h-14與δc154.0的季碳觀察到的hmbc關(guān)聯(lián)允許c-16的分配，以完成中心核的分配。將noesy譜中觀察到的關(guān)聯(lián)用于分配中心雙萜核的相對(duì)立體化學(xué)。在noesy譜中，在h-14和h-20之間觀察到了noe關(guān)聯(lián)，表明h-14和h-20位于環(huán)的同一面上。相似地，在h-9和h-5以及h-5和h-18之間觀察到了noe關(guān)聯(lián)。沒有觀察到h-9和h-14之間的noe關(guān)聯(lián)。因此noesy數(shù)據(jù)表明h-5、h-9和h-18與h-14和h-20比較在環(huán)的相對(duì)面上，如下圖中呈現(xiàn)的。這些數(shù)據(jù)因此表明在糖基化步驟過程中保留了中心核中的相對(duì)立體化學(xué)。針對(duì)rebi的1h-13chsqc-dept的分析證實(shí)了五個(gè)異頭質(zhì)子的存在。所有五個(gè)異頭質(zhì)子在292k下獲取的譜中在δh6.14(δc95.3)、5.57(δc104.6)、5.38(δc104.7)、5.29(δc105.0)和5.06(δc98.0)都能分辨。另外，所有五個(gè)異頭質(zhì)子具有大的耦合(7.7hz-8.2hz)，表明它們具有β-構(gòu)造。在δh6.14觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與c-19的hmbc關(guān)聯(lián)，這表明了其對(duì)應(yīng)于glci的異頭質(zhì)子。相似地，在δh5.06觀察到的異頭質(zhì)子顯示了與c-13的hmbc關(guān)聯(lián)，允許其分配為glcii的異頭質(zhì)子。glci異頭質(zhì)子(δh6.14)顯示出與分配為glcih-2的δh4.18的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許分配h-3或h-4。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glci異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1dtocsy實(shí)驗(yàn)(圖46)。除了證實(shí)了針對(duì)glcih-2的分配，tocsy數(shù)據(jù)顯示出分別分配為h-3、h-4和h-5的δh4.27、4.25和3.93的質(zhì)子。在tocsy譜中δh4.37觀察到的質(zhì)子被分配為glcih-6質(zhì)子之一。基于來自h-5與δh4.27的cosy關(guān)聯(lián)，分配了δh4.27的其他h-6亞甲基質(zhì)子。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了針對(duì)glcic-2(δc72.5)、c-3(δc89.4)、c-4(δc69.2)、c-5(δc78.2-78.8)和c-6(δc61.7)的13c化學(xué)位移。來自h-1與c-3和h-4與c-6的hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)一步證實(shí)了以上進(jìn)行的分配，以完成glci的分配。在四個(gè)剩余未分配的葡萄糖部分中，基于hmbc關(guān)聯(lián)，將一個(gè)分配為glci的c-3的取代基。在δh5.29觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glcic-3的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glcv的異頭質(zhì)子。還觀察到了來自glcih-3與glcv的異頭碳的相互hmbc關(guān)聯(lián)。下表顯示了針對(duì)c-19的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述：萊鮑迪苷ic-19糖苷的1h和13cnmr(500和150mhz，吡啶-d5)分配78.2-78.8范圍中的五個(gè)碳共振(78.16、78.47、78.50、78.55和78.77)，因此化學(xué)位移不能明確地分配。以下提供了用于分配c-19糖苷區(qū)的關(guān)鍵hmbc和cosy關(guān)聯(lián)的概述。glcv的異頭質(zhì)子(δh5.29)顯示出與分配為glcvh-2的δh4.04的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。隨后使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配glcvc-2(δc75.3或75.5)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許分配剩余的質(zhì)子。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glcv異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1dtocsy實(shí)驗(yàn)(圖47)。除了證實(shí)了針對(duì)glcvh-2的分配，tocsy數(shù)據(jù)允許分配glcvh-3(δh4.27)、h-4(δh4.12)和h-5(δh4.05)。在tocsy譜中δh4.56觀察到的質(zhì)子被分配為glcvh-6質(zhì)子之一?；趤碜詇-5與δh4.26的cosy關(guān)聯(lián)，分配了δh4.26的其他h-6亞甲基質(zhì)子。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了針對(duì)glcvc-3(δc78.2-78.6)、c-4(δc71.5或71.6)、c-5(δc78.5或78.6)和c-6(δc62.3或62.4)的13c化學(xué)位移，以完成glcv的分配。以相似的方式進(jìn)行了glcii的分配。glcii異頭質(zhì)子(δh5.06)顯示出與分配為glciih-2的δh4.34的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，其轉(zhuǎn)而顯示出與δh4.20(glciih-3)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)，glciih-3顯示出與δh3.97(glciih-4)的質(zhì)子的其他關(guān)聯(lián)，glciih-4還顯示出與δh3.80(glciih-5)的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。h-5顯示出與分配為h-6的δh4.18和4.49的質(zhì)子的其他cosy關(guān)聯(lián)。還使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glcii異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1dtocsy實(shí)驗(yàn)(圖48)。tocsy數(shù)據(jù)證實(shí)了以上的質(zhì)子分配。針對(duì)glciic-2(δc80.2)、c-3(δc87.5)、c-4(δc70.1)、c-5(δc77.6)和c-6(δc62.5)的13c化學(xué)位移的分配是基于hsqc-dept數(shù)據(jù)。來自glciih-3與c-2和c-4以及還來自glciih-4與c-3、c-5和c-6的hmbc關(guān)聯(lián)證實(shí)了以上進(jìn)行的分配，以完成glcii的分配。基于hmbc關(guān)聯(lián)，將剩余的兩個(gè)未分配的葡萄糖部分分配為glcii的c-2和c-3的取代基。在δh5.57觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-2的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciii的異頭質(zhì)子。在δh5.38觀察到的異頭質(zhì)子顯示出與glciic-3的hmbc關(guān)聯(lián)并且被分配為glciv的異頭質(zhì)子。還觀察到了來自glciih-2與glciii的異頭碳以及來自glciih-3與glciv的異頭碳的相互hmbc關(guān)聯(lián)。glciii的異頭質(zhì)子(δh5.57)顯示出與分配為glciiih-2的δh4.21的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。然后使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配glciiic-2(δc76.3)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許分配剩余的質(zhì)子。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glciii異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1dtocsy實(shí)驗(yàn)(圖49)。除了證實(shí)了針對(duì)glciiih-2的分配，tocsy數(shù)據(jù)允許分配glciiih-3(δh4.27)、h-4(δh4.25)和h-5(δh3.94)。在tocsy譜中δh4.41和δh4.53觀察到的質(zhì)子被分配為glciiih-6質(zhì)子。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了針對(duì)c-3(δc78.2-78.6)、c-4(δc72.1)、c-5(δc78.2-78.8)和c-6(δc63.1)的13c化學(xué)位移。來自h-5與δc63.1的碳的hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)一步證實(shí)了glciiic-6的分配，以完成glciii的分配。glciv的異頭質(zhì)子(δh5.38)顯示出與分配為glcivh-2的δh4.01的質(zhì)子的cosy關(guān)聯(lián)。然后使用hsqc-dept數(shù)據(jù)來分配glcivc-2(δc75.3或75.5)。由于數(shù)據(jù)重疊，cosy譜沒有允許分配剩余的質(zhì)子。因此，使用幾個(gè)不同的混合時(shí)間，使用glciv異頭質(zhì)子的選擇性照射，進(jìn)行了一系列的1dtocsy實(shí)驗(yàn)(圖50)。除了證實(shí)了針對(duì)glcivh-2的分配，1dtocsy數(shù)據(jù)允許分配h-3(δh4.28)、h-4(δh4.11)、h-5(δh4.13)和h-6(δh4.25和4.58)。δh4.25的質(zhì)子還顯示出與δh4.58的cosy關(guān)聯(lián)，證實(shí)了這些質(zhì)子術(shù)語h-6。使用hsqc-dept數(shù)據(jù)分配了針對(duì)c-3(δc78.2-78.6)、c-4(δc72.1)、c-5(δc78.2-78.6)和c-6(δc62.3或62.4)的13c化學(xué)位移。來自h-4與c-6和h-5與c-1的hmbc關(guān)聯(lián)進(jìn)一步證實(shí)了glcivc-6的分配，以完成glciv的分配。以下顯示了發(fā)現(xiàn)的針對(duì)c-13的糖苷的1h和13c化學(xué)位移的概述：萊鮑迪苷ic-13糖苷的1h和13cnmr(500和150mhz，吡啶-d5)分配78.2-78.8范圍中的五個(gè)碳共振(78.16、78.47、78.50、78.55和78.77)，因此化學(xué)位移不能明確地分配。以下提供了用于分配c-13糖苷區(qū)的關(guān)鍵hmbc和cosy關(guān)聯(lián)的概述。萊鮑迪苷i，rebi的nmr和ms分析允許結(jié)構(gòu)的全部分配，如以下所示?；衔锏拿Q是13-[(2-o-β-d-吡喃葡糖基-3-o-β-d-吡喃葡糖基)-β-d-吡喃葡糖基)氧]等效-16-貝殼杉烯-19-酸[(3-o-β-d-吡喃葡糖基)-β-d-吡喃葡糖基)酯]。實(shí)施例48ugtsl2用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的定向進(jìn)化(第2輪)取天然酶ugtsl2(gi_460410132)作為基線，建立了23個(gè)突變的列表，其含有來自第一輪的針對(duì)活性不同鑒定的正突變(實(shí)施例45)和通過dna2.0proteingpstm策略獲得的新突變。將這個(gè)突變列表隨后用于設(shè)計(jì)各自含有3個(gè)不同突變的46個(gè)變體基因。針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_ugtsl2var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。為了測量變體將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性，將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷a(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d所述的分析方法，在hplc分析(cad)后，測定初始速率。平行地，對(duì)于最有活性的克隆，將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化，在hplc分析(cad檢測)后，測定初始速率。除了新變體，還使用基線克隆ugtsl2進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的萊鮑迪苷a或萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率限定為100％。將每個(gè)克隆的活性與基線克隆ugtsl2相比限定為標(biāo)準(zhǔn)化活性，而每個(gè)克隆的特異性表述為針對(duì)萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例。萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)化速率以及萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例描述于下表中。*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于ugtsl2，位置240的異亮氨酸突變成亮氨酸注釋為ugtsl2(i240l)。nd表示未測定。這些結(jié)果的建模允許獲得每個(gè)突變的作用的分級(jí)。確定以下突變對(duì)于活性是有益的：n325s、g387e、a285v、i333l、v270i、q27r、n278g、l393v、s258t、a341v、h247p和t392a。確定以下突變對(duì)于提高萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例是有益的：v270i、t392a、t329v、l276a、l393v、a341v和s255c。實(shí)施例49β-葡糖苷酶用于將萊鮑迪苷m2轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的用途針對(duì)萊鮑迪苷m2的水解，測試了不同的β-葡糖苷酶。靶是選擇性地水解(1→6)糖苷鍵，以獲得萊鮑迪苷d。所需的一般反應(yīng)方案如下：首先，對(duì)參照底物4-硝基苯基-β-d-吡喃葡糖苷測試了選定的β-葡糖苷酶，以測定活性?；跍y定的活性，將使用的酶量計(jì)算為萊鮑迪苷m2水解中使用的單位。測試的β-葡糖苷酶描述于下表中：*isolase(011410；nationalenzymecompany，usa)；aromase(gly0151441；amanoenzyme，日本)；柚皮苷酶(nah0550102；amanoenzyme，日本)，來自里氏木霉(trichodermareesei)atcc26921的纖維素酶(sigmac2730)；來自黑曲霉(aspergillusniger)的纖維二糖酶(sigmac6105)；viscozymel(sigmav2010)測試條件如下：在含有15mm醋酸鈉緩沖液(ph4.5)和1mm萊鮑迪苷m2的10ml總體積下，在30℃下進(jìn)行了反應(yīng)。通過添加酶啟動(dòng)反應(yīng)。在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.3小時(shí)后，獲取625μl的反應(yīng)混合物樣品并且用575μl80％甲醇和50μl2nh2so4的混合物驟冷。使用上述的分析方法，通過hplc分析(cad檢測)，分析了樣品。使用不同β-葡糖苷酶的這些反應(yīng)的反應(yīng)特征顯示于圖68a-f中?？梢酝茢喑绕ぼ彰负蚦wd催化了萊鮑迪苷d2和萊鮑迪苷a的形成，這分別表明了(1→2)鍵糖解和(1→6)鍵糖解?？梢哉J(rèn)為這些酶對(duì)于萊鮑迪苷m2的轉(zhuǎn)化是非選擇性的。isolase、纖維素酶tr和纖維二糖酶as對(duì)于萊鮑迪苷m2轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d((1→6)糖苷鍵的水解)具有明確的選擇性，而aromase對(duì)于萊鮑迪苷m2的轉(zhuǎn)化具有低的整體活性。實(shí)施例50在isolase、纖維素酶tr和纖維二糖酶as的存在下，萊鮑迪苷的穩(wěn)定性為了評(píng)價(jià)isolase、纖維素tr和纖維二糖酶as對(duì)萊鮑迪苷m2的選擇性，在以下條件下，測試了作為底物的萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷d和萊鮑迪苷m：在含有15mm醋酸鈉緩沖液(ph4.5)和1mm萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷d或萊鮑迪苷m的10ml總體積下，在30℃下，將反應(yīng)進(jìn)行了超過24小時(shí)。通過添加酶啟動(dòng)了反應(yīng)。在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.3小時(shí)后，獲取625μl的反應(yīng)混合物樣品并且用575μl80％甲醇和50μl2nh2so4的混合物驟冷。通過hplc分析了樣品。獲得了圖69a-c中顯示的結(jié)果?？梢杂^察到在isolase、纖維素tr和纖維二糖酶as的存在下，沒有觀察到萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷d和萊鮑迪苷m的顯著轉(zhuǎn)化。實(shí)施例51用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m的四種酶反應(yīng)研究了將isolase、纖維素tr或纖維二糖酶as引入使用ugtsl2、ugt76g1-1r-f12和atsus的萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷m的一罐反應(yīng)中的影響。使用了以下反應(yīng)條件：沒有使用和使用添加的β-葡糖苷酶的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖70a-d中?？梢钥吹教砑永w維二糖酶as阻斷了反應(yīng)并且纖維素酶tr的添加對(duì)反應(yīng)特征沒有影響。然而，將isolase加入反應(yīng)混合物中對(duì)反應(yīng)中形成的萊鮑迪苷m的質(zhì)量具有積極作用。加入isolase時(shí)，觀察到了差不多20％的增加。與沒有添加β-葡糖苷酶的反應(yīng)相比，將isolase加入反應(yīng)中時(shí)，萊鮑迪苷m2含量大約低10％和萊鮑迪苷i含量大約低15％。通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)和isolase的含量，可以實(shí)現(xiàn)rebm產(chǎn)量的進(jìn)一步改善以及rebm2和rebi含量的降低。實(shí)施例52β-葡糖苷酶用于將萊鮑迪苷i轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷a的用途對(duì)于將萊鮑迪苷i水解成萊鮑迪苷a，測試了三種β-葡糖苷酶。靶是選擇性地水解(1→6)糖苷鍵，以獲得萊鮑迪苷d。所需的一般反應(yīng)方案如下：對(duì)參照底物4-硝基苯基-β-d-吡喃葡糖苷測試了選定的β-葡糖苷酶，以測定活性?；跍y定的活性，將使用的酶量計(jì)算為萊鮑迪苷i水解中使用的單位。測試的β-葡糖苷酶描述于下表中：*isolase(011410；nationalenzymecompany，usa)；來自里氏木霉(trichodermareesei)atcc26921的纖維素酶(sigmac2730)；來自黑曲霉(aspergillusniger)的纖維二糖酶(sigmac6105)測試條件如下。在含有15mm醋酸鈉緩沖液(ph4.5)和1mm萊鮑迪苷i的2ml總體積下，在30℃下進(jìn)行了反應(yīng)。通過添加酶啟動(dòng)反應(yīng)。在0、1.5、2.5和18小時(shí)后，獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并且用115μl80％甲醇和10μl2nh2so4的混合物驟冷。使用上述的分析方法，通過hplc分析(cad檢測)分析了樣品。使用萊鮑迪苷i的不同β-葡糖苷酶的反應(yīng)特征描繪于圖71中所示的圖中?？梢杂^察到所有三種測試的β-葡糖苷酶都轉(zhuǎn)化了萊鮑迪苷i。唯一的產(chǎn)物是萊鮑迪苷a。實(shí)施例53ugtsl2用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的定向進(jìn)化(第3輪)取天然酶ugtsl2(gi_460410132)作為基線，制備了在第2輪過程中鑒定了13個(gè)突變的列表(實(shí)施例48)和通過dna2.0proteingpstm策略獲得的12個(gè)新突變的列表。將這個(gè)突變列表隨后用于設(shè)計(jì)各自含有1至8個(gè)不同突變的46個(gè)變體基因。針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_ugtsl2var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。為了測量變體將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性，將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷a(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d所述的分析方法，在hplc分析(cad檢測)后，測定初始速率。平行地，將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，在hplc分析(cad檢測)后，針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化，測定初始速率。除了用于這一輪的新變體，還使用基線克隆ugtsl2進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的萊鮑迪苷a或萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率限定為100％。將每個(gè)克隆的活性與基線克隆ugtsl2相比限定為標(biāo)準(zhǔn)化活性，而每個(gè)克隆的特異性表述為針對(duì)萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例。萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)化速率以及萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例描述于下表中。*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于ugtsl2，位置240的異亮氨酸突變成亮氨酸注釋為ugtsl2(i240l)。nd表示未測定。這些結(jié)果的建模允許獲得每個(gè)突變的作用的分級(jí)。確定以下突變對(duì)于活性是有益的：n130g、h247p、f253y、v270i、l276a、a285i、a285v、k301e、a341v、t392a、k408r、i412l。確定以下突變對(duì)于提高萊鮑迪苷a和萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化的初始速率之間的比例是有益的：i203l、s255c、i333l、a341v、h357y、l393v、k408r、i412l。實(shí)施例54萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷m的一罐式、四種酶轉(zhuǎn)化將10ml含有5.0mm萊鮑迪苷a、0.25mmudp、2mmmgcl2、100mm蔗糖、50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5、2.5u的ugtsl2-r3-d2(ugtsl2-第3輪-var12，參見實(shí)施例53)、25u的ugt76g1-r3-g3(ugt76g1-第3輪-var21，參見實(shí)施例44)、25u的atsus和5u的的反應(yīng)混合物通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中。將所得到的反應(yīng)混合物在30℃下溫和振蕩65小時(shí)。在無菌條件下以規(guī)律的間隔獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并用10μl2nh2so4和765μl50％甲醇驟冷。離心后，通過hplc分析了200μl上清液。獲得了圖72a中所示的反應(yīng)特征。48小時(shí)反應(yīng)后的hplc分析顯示于圖72b中。實(shí)施例55萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷m的一罐式、四種酶轉(zhuǎn)化將10ml含有10.0mm萊鮑迪苷a、0.50mmudp、3mmmgcl2、100mm蔗糖、50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5、5.0u的ugtsl2-r3-d2(ugtsl2-第3輪-var12，參見實(shí)施例53)、50u的ugt76g1-r3-g3(ugt76g1-第3輪-var21，參見實(shí)施例44)、50u的atsus和10u的的反應(yīng)混合物通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中。將所得到的反應(yīng)混合物在30℃下溫和振蕩66小時(shí)。在無菌條件下以規(guī)律的間隔獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并用10μl2nh2so4和765μl50％甲醇驟冷。離心后，通過hplc分析了200μl上清液。獲得了圖73a中所示的反應(yīng)特征。48小時(shí)反應(yīng)后的hplc分析顯示于圖73b中。實(shí)施例56萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷m的一罐式、四種酶轉(zhuǎn)化將50ml含有10.0mm萊鮑迪苷a、0.5mmudp、4mmmgcl2、100mm蔗糖、50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5、25u的ugtsl2-r3-d2(ugtsl2-第3輪-var12，參見實(shí)施例53)、250u的ugt76g1-r3-g3(ugt76g1-第3輪-var21，參見實(shí)施例44)、250u的atsus和50u的的反應(yīng)混合物通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中。將所得到的反應(yīng)混合物在35℃下溫和振蕩95小時(shí)。在無菌條件下以規(guī)律的間隔獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并用10μl2nh2so4和765μl50％甲醇驟冷。離心后，通過hplc分析了200μl上清液。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)混合物變成了細(xì)懸液。懸浮液的過濾以及殘余物和濾液的hplc分析表明濾液中的rebm含量為79％并且固體中的rebm含量為97％。獲得了圖74a中所示的反應(yīng)特征。95小時(shí)后反應(yīng)混合物的hplc顯示于圖74b中。實(shí)施例57萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷m的一罐式、四種酶轉(zhuǎn)化(6.5小時(shí)后添加ugt76g1和isolase)將含有萊鮑迪苷a、udp、mgcl2、蔗糖、磷酸鉀緩沖液ph7.5、ugtsl2-r3-d2(ugtsl2-第3輪-var12，參見實(shí)施例53)和atsus通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中。將所得到的反應(yīng)混合物在35℃下溫和振蕩6.5小時(shí)。加入ugt76g1-r3-g3(ugt76g1-第3輪-var21，參見實(shí)施例44)和將反應(yīng)混合物通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中并在35℃下溫和振蕩89小時(shí)。反應(yīng)混合物的終體積為50ml并且試劑和酶的終濃度如下：10.0mm萊鮑迪苷a、0.5mmudp、4mmmgcl2、100mm蔗糖、50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5、25u的ugtsl2-r3-d2、250u的ugt76g1-r3-g3、250u的atsus和50u的在無菌條件下以規(guī)律的間隔獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并用10μl2nh2so4和765μl50％甲醇驟冷。離心后，通過hplc分析了200μl上清液。獲得了圖75a中所示的反應(yīng)特征。95小時(shí)后反應(yīng)混合物的hplc顯示于圖75b中。實(shí)施例58萊鮑迪苷a至萊鮑迪苷m的一罐式、四種酶轉(zhuǎn)化(6.5小時(shí)后添加ugt76g1和isolase)將含有萊鮑迪苷a、udp、mgcl2、蔗糖、磷酸鉀緩沖液ph7.5、ugtsl2-r3-d2(ugtsl2-第3輪-var12，參見實(shí)施例53)和atsus通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中。將所得到的反應(yīng)混合物在35℃下溫和振蕩6.5小時(shí)。加入ugt76g1-r3-g3(ugt76g1-第3輪-var21，參見實(shí)施例44)和將反應(yīng)混合物通過0.2μm濾器過濾至無菌燒瓶中并在35℃下溫和振蕩89小時(shí)。反應(yīng)混合物的終體積為50ml并且試劑和酶的終濃度如下：10.0mm萊鮑迪苷a、0.5mmudp、4mmmgcl2、100mm蔗糖、50mm磷酸鉀緩沖液ph7.5、25u的ugtsl2-r3-d2、250u的ugt76g1-r3-g3、250u的atsus和25u的在無菌條件下以規(guī)律的間隔獲取125μl的反應(yīng)混合物樣品并用10μl2nh2so4和765μl50％甲醇驟冷。離心后，通過hplc分析了200μl上清液。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)混合物變成了細(xì)懸液。懸浮液的過濾以及殘余物和濾液的hplc分析表明濾液中的rebm含量為81％并且固體中的rebm含量為98％獲得了圖76a中所示的反應(yīng)特征。95小時(shí)后反應(yīng)混合物的hplc顯示于圖76b中。實(shí)施例59ugtsl2用于將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的定向進(jìn)化(第4輪)將來自第三輪(參見實(shí)施例53)的最有活性酶ugtsl2_第3輪-var45用作起始點(diǎn)。將來自第3輪的對(duì)于活性的五個(gè)最佳突變用于形成一組10個(gè)變體，其各自含有這些突變中的兩個(gè)。對(duì)于在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_ugtsl2var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。在活性測試前，用水將裂解產(chǎn)物稀釋五倍。為了測量變體將萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d的活性，將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷a(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷a轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷d所述的分析方法，在hplc分析(cad檢測)后，測定活性。通過測量在100％udp-glc轉(zhuǎn)化下形成的萊鮑迪苷m2的量來測定每個(gè)克隆的選擇性(限定為(2*[rebm2]+[rebd])/([reba]+[rebd]+[rebm2])。平行地，用基線克隆ugtsl2-第3輪-var45進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的初始速率限定為100％。針對(duì)第4輪克隆的相對(duì)初始速率以及在100％udp-glc轉(zhuǎn)化下形成的萊鮑迪苷m2的含量描述于下表中：*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于ugtsl2，位置240的異亮氨酸突變成亮氨酸注釋為ugtsl2(i240l)。實(shí)施例60ugt76g1用于將萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x的定向進(jìn)化(第4輪)選擇來自第三輪的ugt76g1的定向進(jìn)化(參見實(shí)施例44第3輪_ugt76g1var21，含有突變：i46l_k303g_k393r))的最有活性克隆作為用于第4輪的基線克隆。將來自第3輪的最佳鑒定的突變(s119a、274g、i295m、f314s和k334r)用于形成一組10個(gè)變體，其各自含有這些突變中的2個(gè)。對(duì)于在大腸桿菌中的表達(dá)密碼子優(yōu)化后，合成基因，在pet30a+質(zhì)粒中亞克隆并用于大腸桿菌bl21(de3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在卡那霉素的存在下，將獲得的細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿的固體lb培養(yǎng)基上生長。選擇合適的克隆并使其在試管中的液體lb培養(yǎng)基中生長。將作為冷凍保護(hù)劑的甘油加入懸浮液中并將400μl等份試樣儲(chǔ)存在-20℃和-80℃下。將這些含有pet30a+_utg76g1var質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的儲(chǔ)存等份試樣融化并且加入lbgkp培養(yǎng)基(20g/lluria肉湯lennox；50mmpipes緩沖液ph7.00；50mm磷酸鹽緩沖液ph7.00；2.5g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素)中。使這個(gè)培養(yǎng)物在30℃下在96微量滴定平板中振蕩8小時(shí)。用50μl上述培養(yǎng)物接種3.95ml含有60g/lovernightexpresstm已配制好的tb培養(yǎng)基10g/l甘油和50mg/l卡那霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基。在48深孔平板中，使所得到的培養(yǎng)物在20℃下攪拌。培養(yǎng)物獲得了顯著生長并且獲得了良好的od(600nm)。44小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞并冷凍。通過將master混合物加入融化的細(xì)胞中來進(jìn)行裂解，并通過離心收集裂解產(chǎn)物。將100μl新鮮裂解產(chǎn)物加入50mm磷酸鹽緩沖液ph7.2中的萊鮑迪苷d(終濃度0.5mm)、mgcl2(終濃度3mm)和udp-葡萄糖(終濃度2.5mm)的溶液中，來進(jìn)行活性測試。使反應(yīng)在30℃下運(yùn)行并且在1、2、4、6和22小時(shí)后取樣，使用以上針對(duì)萊鮑迪苷d轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷x所述的分析方法，通過hplc分析(cad檢測)，來測定轉(zhuǎn)化和初始速率。平行地，用基線克隆第3輪-var21進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將針對(duì)這個(gè)基線克隆的22小時(shí)后的轉(zhuǎn)化和初始速率限定為100％，并且針對(duì)第4輪克隆的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化和初始速率描述于下表中：*突變?nèi)缦伦⑨專簠⒄栈?初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，對(duì)于來自u(píng)gt76g1的第四輪定向進(jìn)化的變體1，位置119的絲氨酸突變成丙氨酸，注釋為第3輪-var21(s119a)。應(yīng)當(dāng)理解之前的描述和特定的實(shí)施方案已經(jīng)完全公開、說明和提供了本發(fā)明的最佳方式及其原理，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行改變和添加，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，其只受所附權(quán)利要求的范圍的限制。序列表<110>purecirclesdnbhd<120>高純度甜菊醇糖苷<130>39227-52wo<160>13<170>patentinversion3.5<210>1<211>1397<212>dna<213>甜菊<400>1ccatggcccatatggaaaacaaaaccgaaaccaccgttcgtcgtcgtcgccgtattattc60tgtttccggttccgtttcagggtcatattaatccgattctgcagctggcaaatgtgctgt120atagcaaaggttttagcattaccatttttcataccaattttaacaaaccgaaaaccagca180attatccgcattttacctttcgctttattctggataatgatccgcaggatgaacgcatta240gcaatctgccgacacatggtccgctggcaggtatgcgtattccgattattaacgaacatg300gtgcagatgaactgcgtcgtgaactggaactgctgatgctggcaagcgaagaagatgaag360aagttagctgtctgattaccgatgcactgtggtattttgcacagagcgttgcagatagcc420tgaatctgcgtcgtctggttctgatgaccagcagcctgtttaactttcatgcacatgtta480gcctgccgcagtttgatgaactgggttatctggatccggatgataaaacccgtctggaag540aacaggcaagcggttttccgatgctgaaagtgaaagatatcaaaagcgcctatagcaatt600ggcagattctgaaagaaattctgggcaaaatgattaaacagaccaaagcaagcagcggtg660ttatttggaatagctttaaagaactggaagaaagcgaactggaaaccgtgattcgtgaaa720ttccggcaccgagctttctgattccgctgccgaaacatctgaccgcaagcagcagcagcc780tgctggatcatgatcgtaccgtttttcagtggctggatcagcagcctccgagcagcgttc840tgtatgttagctttggtagcaccagcgaagttgatgaaaaagattttctggaaattgccc900gtggtctggttgatagcaaacagagctttctgtgggttgttcgtccgggttttgttaaag960gtagcacctgggttgaaccgctgccggatggttttctgggtgaacgtggtcgtattgtta1020aatgggttccgcagcaagaagttctggcacacggcgcaattggtgcattttggacccata1080gcggttggaatagcaccctggaaagcgtttgtgaaggtgttccgatgatttttagcgatt1140ttggtctggatcagccgctgaatgcacgttatatgagtgatgttctgaaagtgggtgtgt1200atctggaaaatggttgggaacgtggtgaaattgcaaatgcaattcgtcgtgttatggtgg1260atgaagaaggtgaatatattcgtcagaatgcccgtgttctgaaacagaaagcagatgtta1320gcctgatgaaaggtggtagcagctatgaaagcctggaaagtctggttagctatattagca1380gcctgtaataactcgag1397<210>2<211>1442<212>dna<213>甜菊<400>2ccatggcacatatggcaaccagcgatagcattgttgatgatcgtaaacagctgcatgttg60caacctttccgtggctggcatttggtcatattctgccgtatctgcagctgagcaaactga120ttgcagaaaaaggt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