本發(fā)明涉及食品和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種提高蜂王漿性能的方法。

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背景技術(shù)：

蜜蜂是典型的社會性昆蟲，由2種性別、3種類型的個體組成，即雄蜂、工蜂和蜂王。蜜蜂的級型分化主要是指遺傳組成完全一致的蜜蜂雌性幼蟲在不同的條件下發(fā)育成生殖個體蜂王和非生殖個體工蜂。蜂王終生以蜂王漿為食，而工蜂前3天以蜂王漿為食物，從3日齡后改用由蜂蜜和蜂花粉制成的蜂糧進(jìn)行飼喂。

蜂王漿(Royal Jelly，RJ)則是一種哺育工蜂咽下腺和上顎腺分泌的，主要用以飼喂蜂王和蜜蜂幼蟲的乳白色、淡黃色漿狀物。蜂王漿中的蛋白質(zhì)含量占干物質(zhì)的50％左右，生物學(xué)功能大部分應(yīng)歸因于其中的蜂王漿主要蛋白家族(Major Royal Jelly Proteins,MRJP)，其含量占總蛋白質(zhì)的82％～90％。到目前為止，MRJP家族已發(fā)現(xiàn)9個家庭成員，即，MRJP1-9。MRJP1含量最豐富，約占蜂王漿水溶性蛋白的48％。Simuth等報道MRJP1在蜂王漿中以三種形式存在：單體、低聚體以及和脂肪酸交互作用后形成的水不溶性的聚合體(J.Some properties of the main protein of honeybee(Apis mellifera)royal jelly Apidologie 32(1),69-80(2001))。

MRJP1單體是一個分子量約為49kDa～60kDa的弱酸性糖蛋白，而目前通過超速離心法與凝膠過濾層析法對MRJP1低聚體進(jìn)行的分子量的測定，出現(xiàn)了280kDa、290kDa、350kDa、420kDa、450kDa等多種結(jié)果。據(jù)文獻(xiàn)報道MRJP1低聚體是五聚體或六聚體。MRJP1低聚體在2-D blue native/SDS-PAGE上可被分解成2個亞基，分子量分別為55kDa(MRJP1)和5kDa(apisimin)，認(rèn)為其比例為5:1，其中apisimin是一種在蜜蜂的整個生命周期中都有著高水平表達(dá)的富含絲氨酸和纈氨酸的由54個氨基酸組成的多肽。MRJP低聚體為熱穩(wěn) 定性蛋白，其結(jié)構(gòu)在56℃保持30min的情況下仍是穩(wěn)定的。

2011年，Kamakura在Nature上發(fā)表論文認(rèn)為蜂王漿主要蛋白MRJP1對蜜蜂的級型分化起到關(guān)鍵作用，并證實(shí)MRJP1單體是蜂王漿中誘導(dǎo)蜜蜂發(fā)生級型分化的主要功能因子，而MRJP1低聚體則不具此功能(Kamakura M.Royalactin induces queen differentiation in honeybees.Nature 473(7348),478-483(2011))。

盡管目前對MRJP1的研究取得了一些進(jìn)展，但是對MRJP1低聚體的研究還不深入，如何改進(jìn)MRJP1低聚體的生物學(xué)功能，從而提高蜂王漿和MRJP1低聚體的性能還有待研究。

因此，需要克服蜂王漿和MRJP1低聚體的生物學(xué)功能的缺陷，從而提高蜂王漿的性能以促進(jìn)蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一方面提供了一種提高蜂王漿性能的方法，其包括在蜂王漿中直接添加蛋白酶。

本發(fā)明的第二方面提供了一種提高蜂王漿性能的方法，其包括：

(1)從蜂王漿中分離純化MRJP1低聚體蛋白；

(2)使用蛋白酶對經(jīng)分離純化的MRJP1低聚體蛋白進(jìn)行酶切處理；

(3)將處理后的MRJP1低聚體蛋白加入蜂王漿中；

其中所述MRJP1低聚體蛋白為由MRJP1單體、多肽apisimin小分子和24-亞甲基膽固醇組成的異質(zhì)三元復(fù)合物(下文簡稱P-MRJP1)。

本發(fā)明的第三方面提供了一種性能提高的蜂王漿，其中含有蛋白酶，所述蛋白酶在使用前0～5年添加到蜂王漿中。

本發(fā)明的第四方面提供了一種性能提高的蜂王漿，其中含有經(jīng)過蛋白酶酶切處理的MRJP1低聚體蛋白，所述MRJP1低聚體蛋白為由MRJP1單體、多肽apisimin小分子和24-亞甲基膽固醇組成的異質(zhì)三元復(fù)合物。

本發(fā)明的方法提高了蜂王漿的性能，有助于促進(jìn)蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育。

·附圖說明

根據(jù)以下參照附圖進(jìn)行的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)會變得更加清楚。

圖1示出了蜂王漿蛋白粗提液經(jīng)過Q-瓊脂糖柱分離后SDS-PAGE電泳檢測的結(jié)果。其中，泳道1：40mM NaCl洗脫液；泳道2：60mM NaCl洗脫液；泳道3：80mM NaCl洗脫液；泳道4：100mM NaCl洗脫液；泳道5：120mM NaCl洗脫液；泳道6：140mM NaCl洗脫液；泳道7：160mM NaCl洗脫液；泳道8：200mM NaCl洗脫液；泳道9：300mM NaCl洗脫液。M表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白，*表示目標(biāo)蛋白。

圖2示出了天然提取的MRJP1蛋白經(jīng)過分子篩純化的結(jié)果。

圖3示出了經(jīng)過胰蛋白酶酶切后的MRJP1蛋白的質(zhì)譜圖，A)為MRJP1總離子流圖與荷質(zhì)比為1631.2-1632.2提取粒子流圖，B)為MRJP1肽質(zhì)量指紋圖譜。

圖4示出了MRJP1低聚體蛋白分析超速離心實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。主峰對應(yīng)的分子量約為254kDa。

圖5示出了SDS-PAGE檢測MRJP1低聚體蛋白中多肽apisimin存在的結(jié)果。A.12％SDS-PAGE電泳圖；B.Tricine-SDS-PAGE電泳圖。

圖6示出了MRJP1低聚體蛋白中24-亞甲基膽固醇的質(zhì)譜圖。

圖7示出了蛋白酶處理對幼蟲六日齡體重的影響。

圖8示出了不同條件下飼養(yǎng)六日齡幼蟲的結(jié)果，A：40-30d RJ；B：40-30d RJ+10％P；C：40-30d RJ+1％P；D：40-30d RJ+0.1％P；E：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 1小時37℃)；F：RJ。P表示胃蛋白酶，RJ表示蜂王漿，40-30d RJ表示在40℃放置30天的蜂王漿，P-MRJP1表示MRJP1低聚體。

圖9示出了不同條件下飼養(yǎng)六日齡幼蟲的放大示意圖，A：40-30d RJ；B：RJ；C：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 1小時37℃)。

·具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明的第一方面提供了一種提高蜂王漿性能的方 法，其包括在蜂王漿中直接添加蛋白酶。

本發(fā)明方法中的蛋白酶可以是，例如，酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶等。所述酸性蛋白酶包含胃蛋白酶、某些金屬基質(zhì)蛋白酶和組織酶、以及由各種動植物、微生物產(chǎn)生的蛋白酶。所述絲氨酸蛋白酶包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血蛋白酶。所述巰基蛋白酶包含木瓜酶、無花果酶、某些鏈球菌蛋白酶。本發(fā)明方法中的蛋白酶可以是發(fā)酵的粗產(chǎn)品和經(jīng)過精制提煉的等。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或巰基蛋白酶，優(yōu)選為酸性蛋白酶。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶的工作濃度為0.01％～20％。

在一個實(shí)施方案中，所述方法包括在蜂王漿中添加蛋白酶于-100～45℃酶切0～5年。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括在蜂王漿中添加蛋白酶于-86～-20℃酶切0～3年或于0～37℃酶切0～30天。

在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括在蜂王漿中添加蛋白酶于-86～-20℃酶切0～2年或于0～37℃酶切0～3小時。

本發(fā)明的第二方面提供了一種提高蜂王漿性能的方法，其包括：

(1)從蜂王漿中分離純化MRJP1低聚體蛋白；

(2)使用蛋白酶對經(jīng)分離純化的MRJP1低聚體蛋白進(jìn)行酶切處理；

(3)將處理后的MRJP1低聚體蛋白加入蜂王漿中；

其中所述MRJP1低聚體蛋白為由MRJP1單體、多肽apisimin小分子和24-亞甲基膽固醇組成的異質(zhì)三元復(fù)合物。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或巰基蛋白酶，優(yōu)選為酸性蛋白酶。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶的工作濃度為0.01％～20％。

在一個實(shí)施方案中，所述酶切處理的條件為-100～45℃、0～5年。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶切處理的條件為-86～-20℃酶切 0～3年或于0～37℃酶切0～30天。

在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶切處理的條件為-86～-20℃酶切0～2年或?yàn)?～37℃酶切0～3小時。

本發(fā)明的第三方面提供了一種性能提高的蜂王漿，其中含有蛋白酶，所述蛋白酶在使用前0～5年添加到蜂王漿中。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或巰基蛋白酶，優(yōu)選為酸性蛋白酶。

本發(fā)明的第四方面提供了一種性能提高的蜂王漿，其中含有經(jīng)過蛋白酶酶切處理的MRJP1低聚體蛋白，所述MRJP1低聚體蛋白為由MRJP1單體、多肽apisimin小分子和24-亞甲基膽固醇組成的異質(zhì)三元復(fù)合物。

在一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或巰基蛋白酶，優(yōu)選為酸性蛋白酶。

以下通過具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)理解，所述具體實(shí)施例僅為說明目的，并不意味著本發(fā)明的內(nèi)容僅限于具體實(shí)施例。實(shí)施例中使用的化合物或試劑可通過商業(yè)途徑購得，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備得到；所使用的實(shí)驗(yàn)儀器可通過商業(yè)途徑購得。

實(shí)施例1：天然蜂王漿MRJP1蛋白的分離純化

將1g蜂王漿與10mL 40mM磷酸鹽緩沖液pH 8.0混合，用靜音混勻器(購自其林貝爾公司)混勻1小時后，在高速離心機(jī)(購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)中以20,000rpm離心15分鐘，上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液即為蜂王漿蛋白粗提液，然后再通過以下步驟進(jìn)一步純化：

1.1陰離子交換層析

MRJP1的陰離子交換層析使用的是北京韋氏博慧色譜有限公司的Q-瓊脂糖凝膠快速分離填料，在4℃中進(jìn)行。

1.用緩沖液A(20mM Tris-HCl pH 8.0)平衡柱子2個柱體積。

2.向5mL蜂王漿蛋白粗提取液中加入5mL緩沖液A，混勻后過柱上樣。

3.用緩沖液A漂洗2個柱體積。

4.配置緩沖液A與緩沖液B(20mM Tris-HCl pH 8.0，1M NaCl)的不同梯度的洗脫液洗脫蛋白，收集80-300mM NaCl洗脫液，通過SDS-PAGE蛋白膠來檢驗(yàn)蛋白的純度(如圖1所示)。

1.2凝膠過濾層析

使用Superdex 200HR10/300GL(GE Healthcare)凝膠過濾柱進(jìn)行分子篩純化，整個純化過程在4℃中進(jìn)行。

1.用分子篩緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT)平衡凝膠過濾柱2個柱體積。

2.將上述洗脫液濃縮至1mL上樣，柱子流速為0.3mL/min。

3.收集MRJP1的聚體峰(如圖2所示)并濃縮。向濃縮后的蛋白加入10％的甘油，液氮快速冷凍后于-80℃保存。

實(shí)施例2：MRJP1低聚體蛋白的表征

1.MRJP1蛋白的質(zhì)譜驗(yàn)證

本發(fā)明首先采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的方法對實(shí)施例1中經(jīng)純化的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

將圖2中分子篩后收集的純度很高的蛋白除鹽，用胰蛋白酶酶切過夜后，進(jìn)行質(zhì)譜上樣，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)譜的結(jié)果得到分子量較大的多個多肽片段，通過Swissprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)檢索，與已知蛋白序列進(jìn)行匹配，多肽片段匹配情況如表1所示，序列覆蓋率為84％，匹配得分為12755，序列與MRJP1的匹配度非常高，且為唯一及格蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)比對結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)經(jīng)分子篩后收集蛋白的主峰為蜂王漿主蛋白MRJP1(見表1)。

表1：數(shù)據(jù)庫比對MRJP1的主要性質(zhì)

2.MRJP1低聚體蛋白的聚集形式

為了檢測MRJP1低聚體蛋白的聚集狀態(tài)，本發(fā)明采用分析超速離心的方法進(jìn)行鑒定。

在本實(shí)施例中，將實(shí)施例1中經(jīng)分子篩純化得到的MRJP1低聚體蛋白在Beckman/Coulter/XL-I分析超速離心機(jī)中以42000rpm于20℃下進(jìn)行超速離心，采用干擾法檢測。double-sector cells上樣量分別為0.1mM和0.2mM。數(shù)據(jù)分析采用SEDFIT和SEDPHAT軟件，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，主峰對應(yīng)的分子量約為254kDa，故本發(fā)明純化得到的MRJP1低聚體蛋白主要以四聚體形式存在。

3.MRJP1低聚體蛋白中多肽apisimin的存在

本發(fā)明采用兩種不同的SDS-PAGE分析方法以驗(yàn)證MRJP1低聚體蛋白中多肽apisimin的存在。從圖5中可以看出，在12％的SDS-PAGE膠(圖5A)和Tricine-SDS-PAGE膠(圖5B)的最底部均有分子量比較小，大小約為5kDa的多肽存在。通過對SAS-PAGE進(jìn)行積分，計(jì)算表明MRJP1低聚體蛋白中MRJP1單體分子與apisimin的比例接近1：1。

4.MRJP1低聚體蛋白中24-亞甲基膽固醇的驗(yàn)證。

向100μL 10mg/mL的MRJP1低聚體蛋白溶液中加入50mg尿素，反復(fù)震蕩幾次，放置半小時。再加入0.4mg NaOH固體至終濃度為1M(pH 14)，反復(fù)震蕩幾次，放置半小時。用500-600μL的正己烷萃取3-6次，收集正己烷層。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正己烷，即可分離出24-亞甲基膽固醇，并經(jīng)過質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示。

實(shí)施例3：蛋白酶處理蜂王漿和MRJP1低聚體蛋白對蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育的影響

根據(jù)Kamakura等的研究結(jié)果，MRJP1單體可誘導(dǎo)蜜蜂的級型分化，而MRJP1低聚體則不具有此功能。因此，在該實(shí)施例中，對蜂王漿和經(jīng)純化的MRJP1低聚體蛋白進(jìn)行多種蛋白酶處理，然后分 別用經(jīng)處理的蜂王漿和MRJP1低聚體蛋白配制飼糧配方對意蜂幼蟲進(jìn)行離群飼養(yǎng)。

本實(shí)施例使用多種蛋白酶對蜂王漿以及上述實(shí)施例中經(jīng)純化的MRJP1低聚體蛋白進(jìn)行處理，共配制了34種飼糧配方(表2和表3)對蜜蜂(意蜂)幼蟲進(jìn)行飼喂，在六日齡時觀察幼蟲的大小或稱量幼蟲的體重(圖7到圖9)。從圖7A(對應(yīng)于表2中的配方)中可以看出，與配方1(新鮮蜂王漿RJ)相比，配方2-4顯著促進(jìn)幼蟲的生長發(fā)育(p<0.01)，說明在鮮蜂王漿中添加0.01～20％胃蛋白酶(P)顯著提高鮮蜂王漿的效果(p<0.01)。配方5-17也顯著促進(jìn)幼蟲的生長發(fā)育(p<0.01)，說明在-100～45℃使用多種不同濃度的蛋白酶對蜂王漿進(jìn)行酶切處理0～5年都可顯著提高鮮蜂王漿的效果。從圖7B(對應(yīng)于表3中的配方)中可以看出，與配方1(40-30d RJ)相比，配方2-4顯著促進(jìn)幼蟲的生長發(fā)育(p<0.01)，說明在40℃貯存30天的蜂王漿中添加胃蛋白酶可顯著促進(jìn)幼蟲的生長發(fā)育，并且胃蛋白酶的濃度越高效果越好。與配方5(40-30d RJ+P-MRJP1)相比，配方6-17都能顯著促進(jìn)幼蟲的生長發(fā)育(p<0.01)。但配方7-8、11-12、14-15的效果要優(yōu)于配方9-10、13和16-17的效果，推測MRJP1低聚體蛋白在37℃用酸性蛋白酶處理之后，活性部位得以暴露，具有MRJP1單體的效果，而且飼養(yǎng)幼蟲的溫度為34℃，在這個溫度下酸性蛋白酶可以繼續(xù)對MRJP1低聚體酶切，起到緩釋的效果。而過高溫度(如45℃)會使蛋白酶的活性降低，因此對MRJP1低聚體蛋白處理的效果降低，另外，由于蜂王漿中pH是酸性，中性蛋白酶或堿性蛋白酶在飼養(yǎng)過程中不能起到緩釋作用，故與酸性蛋白酶相比對幼蟲生長發(fā)育的促進(jìn)作用降低。

表2：在新鮮的蜂王漿中添加蛋白酶的蜜蜂幼蟲飼糧配方

注：表中數(shù)據(jù)為質(zhì)量百分比(％)。金霉素都是加0.0025。

與表2飼糧配方對照：1：RJ(新鮮的蜂王漿)；2：RJ+0.01％P，添加0.01％胃蛋白酶(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)；3：RJ+0.1％P，添加0.1％胃蛋白酶；4：RJ+20％P，添加20％胃蛋白酶；5：RJ+0.1％P 1小時37℃，添加0.1％胃蛋白酶在37℃酶切1小時；6：RJ+0.1％P2月37℃，添加0.1％胃蛋白酶在37℃放置兩個月后再按比例添加；7：RJ+0.1％P 2月45℃，添加0.1％胃蛋白酶在45℃放置兩個月后再按比例添加；8：RJ+0.1％P 1年4℃，添加0.1％胃蛋白酶在4℃放置一年后再按比例添加；9：RJ+0.1％P 3年4℃，添加0.1％胃蛋白酶在4℃放置三年后再按比例添加；10：RJ+0.1％P 3年-20℃，添加0.1％胃蛋白酶在-20℃放置三年后再按比例添加；11：RJ+0.1％P 5年-80℃，添加0.1％胃蛋白酶在-80℃放置五年后再按比例添加；12：RJ+0.1％P 5年-100℃，添加0.1％胃蛋白酶在-100℃放置五年后再按比例添加；13：RJ+0.1％S15年-100℃，添加0.1％來自黑曲霉的酸性蛋白酶(購自濟(jì)寧和信生物技術(shù)有限公司，也是一種金屬蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；14：RJ+0.1％S2 5年-100℃，添加0.1％凝乳酶(購自安徽中旭生物科技有限公司)在-100℃放置五年后再按比例添加；15：RJ+0.1％N 5年-100℃，添加0.1％中性蛋白酶(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的中性蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；16：RJ+0.2％M 5年-100℃，添加0.2％蛋白酶混合物(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的粗提的蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；17：RJ+0.2％F 5年-100℃，添加0.2％復(fù)合酶(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的啤酒復(fù)合酶)在-100℃放置五年后再按比例添加。P：胃蛋白酶；S1:來自黑曲霉的酸性蛋白酶；S2:凝乳酶；N：中性蛋白酶；M：蛋白酶混合物；F：復(fù)合酶。

表3：在40-30d的蜂王漿中添加蛋白酶的蜜蜂幼蟲飼糧配方

注：表中數(shù)據(jù)為質(zhì)量百分比(％)。40-30d RJ：鮮蜂王漿于密封管中，在40℃恒溫箱中放置30天，金霉素都是加0.0025。

與表3飼糧配方對照：1：40-30d RJ，鮮蜂王漿于密封管中，在40℃恒溫箱中放置30天后再按比例添加；2：40-30d RJ+0.01％P，添加0.01％胃蛋白酶；3：40-30d RJ+0.1％P，添加0.1％胃蛋白酶；4：40-30d RJ+20％P，添加20％胃蛋白酶；5：40-30d RJ+P-MRJP1，添加2％MRJP1低聚體；6：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 0.1小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％胃蛋白酶在37℃酶切0.1小時后再按比例添加；7：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％胃蛋白酶在37℃酶切3小時后再按比例添加；8：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3天37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％胃蛋白酶在37℃酶切3天后再按比例添加；9：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3天45℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％胃蛋白酶在45℃酶切3天后再按比例添加；10：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.02％T 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.02％胰蛋白酶(生工生物工程(上海)股份有限公司,絲氨酸蛋白酶的一種)在37℃酶切3小時后再按比例添加；11：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％S1 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％來自黑曲霉的酸性蛋白酶(購自濟(jì)寧和信生物技術(shù)有限公司，也是一種金屬蛋白酶)在37℃酶切3小時后再按比例添加；12：40-30d RJ +(P-MRJP1+0.1％S2 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％來自美曲霉的酸性蛋白酶在37℃酶切3小時后再按比例添加；13：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％N 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％中性蛋白酶(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的中性蛋白酶)在37℃酶切3小時后再按比例添加；14：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.2％M 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.2％蛋白酶混合物(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的蛋白酶粗酶)在37℃酶切3小時后再按比例添加；15：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.2％F 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.2％復(fù)合酶(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的啤酒復(fù)合酶)在37℃酶切3小時后再按比例添加；16：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％L 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％木瓜蛋白酶(巰基蛋白酶的一種，購自生工生物工程(上海)股份有限公司)在37℃酶切3小時后再按比例添加；17：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％A 3小時37℃)，MRJP1低聚體經(jīng)0.1％堿性蛋白酶(購自東恒華道生物科技有限責(zé)任公司的堿性蛋白酶)在37℃酶切3小時后再按比例添加。P-MRJP1：MRJP1低聚體。P：胃蛋白酶；T：胰蛋白酶；S1:來自黑曲霉的酸性蛋白酶；S2:凝乳酶；N：中性蛋白酶；M：蛋白酶混合物；F：復(fù)合酶；L:木瓜蛋白酶；A:堿性蛋白酶。

上述結(jié)果表明，使用蛋白酶對蜂王漿和MRJP1低聚體蛋白進(jìn)行處理可提高蜂王漿的性能，從而顯著促進(jìn)蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育。