一種生產(chǎn)柚苷酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)柚苷酶的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的生產(chǎn)柚苷酶的方法，是將保藏號(hào)為CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢桿菌11568進(jìn)行斜面培養(yǎng)，得斜面菌種；再在40.9℃、180rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)48h，得液體發(fā)酵液；離心分離液體發(fā)酵液，取上清液；上清液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、SephacrylS-200凝膠過濾層析，得到柚苷酶。本發(fā)明制備柚苷酶的方法，具有產(chǎn)酶水平高、發(fā)酵時(shí)間短、易于控制生長條件、易于分離、純度高、操作簡單、條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)，完全適合工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。以粉碎過60目的橘子皮作為柚苷酶發(fā)酵底物，充分利用了生活垃圾廢棄物，節(jié)約成本。CGMCCNo992820141104
【專利說明】一種生產(chǎn)柚苷酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)柚苷酶的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。 技術(shù)背景
[0002] 柚苷酶是一種重要的用于果汁里苦味物質(zhì)水解的酶，是由Ci-L-鼠李糖苷 酶（α-L-;rhamnosidase，EC3·2·l·40)與β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase, EC3. 2. 1. 21)組成的一種糖苷水解復(fù)合酶系，同時(shí)具有a -L-鼠李糖苷酶和β -D-葡萄糖 苷酶兩種酶的活性，柚苷酶可以作用于有苦味的柚皮苷并將其水解產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)，過程 是柚皮苷先在a-L-鼠李糖苷酶作用下生成鼠李糖及普魯寧（Prunin，又譯作櫻桃苷)，普 魯寧的苦味約為柚皮苷的三分之一，因此苦味有所減輕，然后普魯寧可在β-D-葡萄糖苷 酶的作用下被分解為無苦味的柚皮黃酮物質(zhì)(主要為柚皮苷)。柚苷酶的微生物來源方面主 要集中在霉菌(黑曲霉和青霉等)，細(xì)菌產(chǎn)柚苷酶的相關(guān)報(bào)道較少。
[0003] 我國是柑橘生產(chǎn)大國，但是目前在柑橘果汁的加工行業(yè)主要問題就是果皮的深加 工利用問題。在被當(dāng)作垃圾大量處理掉到的柑橘皮含有豐富的柚皮黃酮（主要為柚皮 苷），果膠，膳食纖維等，如能將其充分利用，不僅能夠減輕環(huán)境壓力，還可以造福于人類。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，柚皮黃酮具有多種生理活性：可調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的脆性與滲透性，保護(hù) 心臟，有抗?jié)?、解毒、利尿、抗菌、消炎清熱等功效，也是一種高效的天然抗氧化劑，是 一種天然的保健產(chǎn)品。因此柚皮的深加工將大幅提高果農(nóng)的收入，提高柚子的附加值等。
[0004] 雖然對(duì)柚苷酶的研究越來越深入，但目前僅有少數(shù)柚苷酶的生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化， 目前限制柚苷酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用方面存在兩個(gè)問題：第一個(gè)主要問題是我國缺乏適 合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)酶菌株，這就極大限制了應(yīng)用，高產(chǎn)柚苷酶菌株的培育困難之處在于 如何在大量的誘變后代中將優(yōu)秀突變株高效率的選出，到目前為止尚無較好的辦法，菌株 的選育進(jìn)展緩慢，發(fā)展出新的高效的篩選方法很有必要，因此對(duì)高產(chǎn)菌株的培育是目前的 當(dāng)務(wù)之急。第二個(gè)問題是柚苷酶的固定化技術(shù)在國內(nèi)還存在著很多的缺陷，在固定化中使 用的試劑或載體存在成本偏高、固定化效率低下、穩(wěn)定性較差、連續(xù)操作使用的設(shè)備較復(fù)雜 等，這就需要我們國家進(jìn)一步開發(fā)出更簡便同時(shí)更適用的固定化方法，柚苷酶應(yīng)用于柑桔 及其他制品的脫苦與加工國外已有相關(guān)報(bào)道，但在我國柚苷酶并沒有大規(guī)模的在生產(chǎn)中應(yīng) 用，主要原因是國內(nèi)尚無規(guī)模制備的商品柚苷酶出售，今后我們應(yīng)加強(qiáng)關(guān)于選育高產(chǎn)柚苷 酶菌株的方法，并制備出低成本的柚苷酶純酶，具有重要的實(shí)際意義。
[0005] 與霉菌(黑曲霉和青霉等）液體發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶相比，細(xì)菌液體發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶具有 生長周期短、生產(chǎn)成本低、易于控制生長條件等諸多優(yōu)點(diǎn)，近幾年得到研究者更多的關(guān)注。 但是，細(xì)菌生產(chǎn)的柚苷酶活性和霉菌相比，還具有一定的差距；目前所報(bào)道細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酶水 平不超過1000 U單位每毫升發(fā)酵液；細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶最適作用溫度偏中性環(huán)境可能限 制其在酸性環(huán)境中的部分應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過創(chuàng)造性勞動(dòng)，培養(yǎng)出了一種能夠產(chǎn)柚苷酶的解淀粉芽孢桿菌；進(jìn)而提 供了一種用解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)柚苷酶的方法。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)的柚苷酶，分 子量為32.5 kDa，最適宜作用溫度、pH分別為45°C、7. 5。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)的柚 苷酶與本發(fā)明之前的由細(xì)菌和霉菌生產(chǎn)的柚苷酶相比，存在以下特殊之處：從解淀粉芽孢 桿菌11568中產(chǎn)柚苷酶的部分酶學(xué)性質(zhì)(最適pH和pH值穩(wěn)定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性)等 研究，表明其在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的果汁脫苦等領(lǐng)域有極大應(yīng)用前景，在提高葡萄酒的風(fēng)味、 改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑中也起到重要作用，對(duì)柚苷酶的分離純化及性質(zhì)的 研究為制備出更好的在工業(yè)上應(yīng)用的商品酶提供重要依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案 本發(fā)明提供了一種新的生產(chǎn)柚苷酶的方法。
[0008] -種生產(chǎn)柚苷酶的方法，包括以下步驟： (1) 將保藏號(hào)為CGMCCNo. 9928的解淀粉芽孢桿菌11568進(jìn)行斜面培養(yǎng)，得斜面菌種； (2) 取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在40. 9°C、180rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng) 48h，得液體發(fā)酵液； (3) 離心分離液體發(fā)酵液，取上清液； (4) 上清液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析，得到 柚苷酶。
[0009] 所述保藏號(hào)為CGMCCNo. 9928的解淀粉芽孢桿菌11568，即為解淀粉芽孢桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens) 11568，分類命名為解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens);其保藏日期為2014年11月4日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC )。
[0010] 上述步驟（1)中，所述斜面培養(yǎng)基，每IL中含有以下成分：MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4)2S04 1.5g、KCl 0.5g、KN03 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉 15g、瓊脂 20g， pH 為 6. 0,1 X IO5 Pa 滅菌 20 min。
[0011] 上述步驟（2)中，所述種子培養(yǎng)基，每IL中含有以下成分： 麥芽糖15.18、胰蛋白胨1(^、（順4)2冊(cè)04 2(^、恥(：11(^、酵母提取物58，？!1為7.51; 或者，柚皮苷l〇g、胰蛋白胨l〇g、（NH4)2HP04 20g、NaCl 10g、酵母提取物5g，pH為 7. 51 ； 或者，MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.5g、CaCl2 O.lg、（NH4) 2S04 1.5g、KCl 0.5g、KN03 1.5g、 酵母膏2、桔皮粉7. 5g，pH為6. 0。
[0012] 上述步驟（3)中，液體發(fā)酵液經(jīng)超聲波破壁后離心分離；超聲波頻率為25-30HZ， 超聲時(shí)間為l〇min，超聲2. 5s，停2. 5s ;離心的轉(zhuǎn)速為5000 - 6000rpm，離心時(shí)間為10 - 15min〇
[0013] 上述步驟（4)中，在離子交換層析之后、凝膠過濾層析之前，用0.01-0. 5mol/L NaCl進(jìn)行洗脫。
[0014] 所述步驟（4)中硫酸銨分級(jí)沉淀的具體步驟為：向上清液中加入硫酸銨，使其質(zhì) 量體積濃度為〇. 01 % - 40 %，過濾除去產(chǎn)生的沉淀，然后繼續(xù)加入硫酸銨，至其質(zhì)量體積 濃度為40% -80%為止，過濾得到含柚苷酶沉淀。所述的質(zhì)量體積濃度是指：每mL上清液 中含有硫酸銨的質(zhì)量（g)。
[0015] 所述步驟（4)中離子交換層析，是指Q Sepharose Fast Flow離子交換層析；其 具體步驟為：首先利用緩沖體系為20mmol/L，pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液平衡柱料；基線平 衡后加入目的蛋白液體量500微升，吸附時(shí)間為30min ;吸附過后用0. 01-0. 5mol/L的NaCl 溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速設(shè)置為lmL/min，檢測(cè)每管洗脫液中柚苷酶活力和蛋白質(zhì)含量。其 中，梯度洗脫的具體操作為：設(shè)置洗脫程序用〇. 01-0. 5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流 速設(shè)置為lmL/min，收集液體。
[0016] 所述步驟（4)中凝膠過濾層析的具體操作為：填好SephacrylS-200柱料；用 50mmol/LNaCl溶液（50mmol/L，pH 7. 2磷酸緩沖液為溶劑)，流速0. lmL/min，平衡柱料；平 衡后以相同緩沖液洗脫，流速保持在〇. lmL/min，設(shè)置每管收集ImL ;檢測(cè)每管中柚苷酶活 力和蛋白質(zhì)含量。其中，SephacrylS-200是層析柱的型號(hào)，不可用其他型號(hào)的層析柱代替。
[0017] 可采用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的 pH。
[0018] 斜面培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的接種量可以通過現(xiàn)有技術(shù)得到，不需付出創(chuàng)造性的勞動(dòng)。 斜面培養(yǎng)的接種量能夠達(dá)到發(fā)酵培養(yǎng)所需接種量的種子液即可，發(fā)酵培養(yǎng)的接種量一般為 0· 2% (v/V)即可。
[0019] 上述方法獲得的柚苷酶為純化倍數(shù)為38. 27的電泳純柚苷酶；總酶活力可以達(dá)到 l〇556U，比酶活力達(dá) l56〇9U/mg。
[0020] 所以，本發(fā)明還提供了 一種柚苷酶。
[0021] 一種柚苷酶，由上述制備方法獲得；其分子量為32. 5 kDa，最適作用溫度、pH分別 為 45°C、7. 5。
[0022] 本發(fā)明中，對(duì)于某個(gè)成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比 (w/w)〇
[0023] 本發(fā)明所用專業(yè)術(shù)語說明： IU是指每分鐘分解1 μ g柚皮苷底物所需要的柚苷酶量稱為一個(gè)柚苷酶酶活。
[0024] 有益效果 本發(fā)明的解淀粉酶芽孢桿菌11568的液體發(fā)酵液中柚苷酶活力可以高達(dá)201. 12 U/ HlLo
[0025] 本發(fā)明的柚苷酶，與本發(fā)明之前的柚苷酶相比，具備以下優(yōu)勢(shì)：最適pH和pH值穩(wěn) 定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性等性能好，在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的果汁脫苦等領(lǐng)域有極大應(yīng)用 前景，在提高葡萄酒的風(fēng)味、改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑中也起到重要作用，對(duì) 柚苷酶的分離純化及性質(zhì)的研究為制備出更好的在工業(yè)上應(yīng)用的商品酶提供重要依據(jù)。
[0026] 本發(fā)明制備柚苷酶的方法，與本發(fā)明之前細(xì)菌、真菌制備柚苷酶的方法相比，具有 產(chǎn)酶水平高、發(fā)酵時(shí)間短、易于控制生長條件、易于分離、純度高、操作簡單、條件溫和等諸 多優(yōu)點(diǎn)，完全適合工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。以粉碎過60目的橘子皮作為柚苷酶發(fā)酵底物，充分 利用了生活垃圾廢棄物,節(jié)約成本。
[0027] 保藏說明 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所 保藏日期：2014年11月4日 保藏編號(hào)：CGMCCNo. 9928 分類命名解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例2所獲得的液體發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果； 圖1中，2. 609峰代表柚皮苷；6. 582峰為柚皮素； 圖2為菌株11568所產(chǎn)柚苷酶純化電泳圖； 圖2中：M-蛋白標(biāo)樣；1-粗酶液的蛋白帶；2-40~80%硫酸銨鹽析濃縮所得的蛋白帶； 3-經(jīng)Q Sepharose Fast Flow離子交換層析得到的蛋白帶；4-經(jīng)Sephacryl S-200凝膠過 濾層析得到的蛋白帶。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 在下面所述的所有具體實(shí)施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常用方法。實(shí)施例中 未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(參考Puri等人的相 關(guān)文獻(xiàn))或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購 獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0030] 實(shí)施例1解淀粉芽孢桿菌11568篩選分離與鑒定 一、解淀粉芽抱桿菌 JNU002 (Bacillus amyloliquefacines ) 11568 篩選分離 稱取2g采集自全國各地的土樣或發(fā)霉的桔皮或/和柚皮，于裝有滅菌處理的ISmL生 理鹽水的IOOmL錐形瓶中振蕩30min，錐形瓶中最好放少許玻璃珠。然后用無菌水分別稀釋 成體積濃度為IX 1〇_3、IX 1〇_4兩個(gè)梯度的稀釋液，分別用滅菌的槍頭吸取100 μ L稀釋液涂 布于預(yù)先配制并且滅菌的選擇性平板培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)48-96h。從選擇性平板培養(yǎng)基 上劃線分離單菌落，將挑取的單菌落中的部分制片鏡檢判斷菌株純度(顯微鏡觀察菌體為 同一形態(tài)特征)。如果不是純菌落，應(yīng)反復(fù)多次劃線分離單菌落，直至獲得純菌落為止。將 獲得的純菌落用斜面培養(yǎng)基保存，得到菌株純培養(yǎng)體；同時(shí)，在分離出的純菌落的選擇性平 板培養(yǎng)基上滴加一縮二乙二醇（DES)試劑，觀察是否有透明圈現(xiàn)象，將有透明圈的菌株挑選 出來，作為后續(xù)復(fù)篩的基礎(chǔ)。所述選擇性平板培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分為（g/L):MgS0 4 0. 5，KH2P04 I. 5, CaCl2 0.1，（MM)2SO4 I. 5，KCl 0.5, KNO3 I. 5,酵母膏 2,桔皮粉 7.5,瓊脂 20。
[0031] 后續(xù)復(fù)篩：將有透明圈的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，選取透明圈大的菌株作為目標(biāo)菌株， 命名為：解淀粉芽孢桿菌11568 ;所用搖瓶培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分為（g/L) =MgSO4 0. 5，KH2PO4 1.5，CaCl2 0.1，（MM)2SO4 1.5，KCl 0.5, KNO3 1.5,酵母膏 2,桔皮粉 7. 5, pH 為 6.0。
[0032] 二、解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefacines ) 11568 鑒定 1.形態(tài)特征 40°C下在LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)48小時(shí)，菌落表面光滑、濕潤，邊緣不整齊，革蘭氏染色陽 性，菌落直徑2~15_，可擴(kuò)散生長，菌落透明，無伴孢晶體，菌落無凸起。在LB培養(yǎng)基平板 上培養(yǎng)菌體呈短桿狀。所述LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的營養(yǎng)成分為（g/L):酵母提取物5, NaCl 10,胰蛋白胨10。
[0033] 2. 1防rDNA序列分析： 寡序核苷酸引物為真菌PCR擴(kuò)增通用引物： 上游引物 ITSl :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 下游引物 ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC -3' ；如 SEQ ID NO. 3 所示； 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增該菌的16S rDNA ; PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體操作如下(未具體說明的操作為常規(guī)操作）： 將反應(yīng)體系依次加入PE小管；打開PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增；完成反應(yīng)后關(guān)閉儀器；取出反應(yīng) 液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增DNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系所涉及各種試劑及用量：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：0. 5 μ L模板DNA，I. 0 yLdNTP，0.5 yLTaq 酶，引物各 1.0 yL，補(bǔ)水至 50yL。
[0034] PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94°C預(yù)熱4 min，每個(gè)循環(huán)包括：94°C變性30s，56°C退火30 s， 72°C延伸6min，30個(gè)循環(huán)，最后再用72 °C，10 min。
[0035] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京奧科鼎盛公司完成測(cè)序工作。
[0036] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后測(cè)序，DNA序列表為：SEQ ID NO. 1。
[0037] 3.生理生化特征 根據(jù)《伯杰氏手冊(cè)》（R.E.布坎南，N.E.基本斯等編，科學(xué)出版社，1984)對(duì)菌株進(jìn)行 生理生化鑒定(見表1 )，其生理生化特征與解淀粉芽孢桿菌相吻合。
[0038] 表1 :生理生化反應(yīng)表

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)柚苷酶的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將保藏號(hào)為CGMCCNo. 9928的解淀粉芽孢桿菌11568進(jìn)行斜面培養(yǎng)，得斜面菌種； (2) 取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在40. 9°C、180rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng) 48h，得液體發(fā)酵液； (3) 離心分離液體發(fā)酵液，取上清液； (4) 上清液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析，得到 柚苷酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 上述步驟（1)中，所述斜面培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：MgS04 0 . 5g、KH2P04 1.5g、 CaCl2 0.1g、（NH4)2S04 1.5g、KCl 0.5g、KN03 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉 15g、瓊脂 20g，pH 為 6. 0,1 X 105 Pa 滅菌 20 min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 上述步驟（2)中，所述種子培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分： 麥芽糖15.1§、胰蛋白胨1(^、（順4)2冊(cè)04 2(^、恥(：11(^、酵母提取物5§，？11為7.51;或者，柚皮苷l〇g、胰蛋白胨l〇g、（NH4)2HP04 20g、NaCl 10g、酵母提取物5g，pH為 7. 51 ； 或者，MgS04 0.5g、KH2P04 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4)2S04 1.5g、KC1 0.5g、KN03 1.5g、 酵母膏2、桔皮粉7. 5g，pH為6. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于， 上述步驟（3)中，液體發(fā)酵液經(jīng)超聲波破壁后離心分離；超聲波頻率為25-30HZ，超聲 時(shí)間為lOmin，超聲2. 5s，停2. 5s ;離心的轉(zhuǎn)速為5000 - 6000rpm，離心時(shí)間為10 - 15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于， 上述步驟（4)中，在離子交換層析之后、凝膠過濾層析之前，用0. 01-0. 5mol/L NaCl進(jìn) 行洗脫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于， 所述步驟（4)中硫酸銨分級(jí)沉淀的具體步驟為：向上清液中加入硫酸銨，使其質(zhì)量體 積濃度為〇. 01 % - 40 %，過濾除去產(chǎn)生的沉淀，然后繼續(xù)加入硫酸銨，至其質(zhì)量體積濃度 為40% -80%為止，過濾得到含柚苷酶沉淀。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于， 所述步驟（4)中離子交換層析，其具體步驟為：首先利用緩沖體系為20mmol/L，pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液平衡柱料；基線平衡后加入目的蛋白液體量500微升，吸附時(shí)間為 30min ;吸附過后用0. 01-0. 5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速設(shè)置為lmL/min，檢測(cè) 每管洗脫液中柚苷酶活力和蛋白質(zhì)含量。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于， 所述步驟（4)中凝膠過濾層析的具體操作為：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/ LNaCl溶液，流速0. lmL/min，平衡柱料；平衡后以相同緩沖液洗脫，流速保持在0. lmL/min， 設(shè)置每管收集lmL ;檢測(cè)每管中柚苷酶活力和蛋白質(zhì)含量。
9. 一種采用權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述方法獲得的柚苷酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的柚苷酶，其特征在于，分子量為32.5 kDa，最適作用溫度、pH 分別為45°C、7. 5 ;總酶活力為10556U，比酶活力達(dá)15609U/mg。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104404016SQ201410779845
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】李秀婷, 朱運(yùn)平, 楊然, 伍少明 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)