水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒，其是根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子，對(duì)水貂細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后VP2基因的5′端直接與編碼部分多角體蛋白的核苷酸序列相連，然后克隆至轉(zhuǎn)移載體中，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒。利用該表達(dá)系統(tǒng)可安全、高效、大規(guī)模的生產(chǎn)水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒，且所得病毒樣顆粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可誘導(dǎo)水貂機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體，并可抵抗強(qiáng)毒的攻擊，對(duì)水貂提供很好的保護(hù)作用，為制備水貂病毒性腸炎疫苗奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域、基因工程領(lǐng)域及獸醫(yī)生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及水貂 細(xì)小病毒病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水紹病毒性腸炎是由水紹腸炎細(xì)小病毒（Mink enteritis viurs, MEV)引起的一 種烈性傳染病，又稱傳染性腸炎或稱為泛白細(xì)胞減少癥，貓科、鼬科、貂科和犬科動(dòng)物均易 感，是對(duì)水貂飼養(yǎng)業(yè)危害較大的三大病毒性傳染病之一。該病最早由Schofield于1949年 發(fā)現(xiàn)于加拿大威廉堡某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，1952年，Will提取了病原，命名為MEV。隨后，此病迅 速蔓延至美國(guó)、丹麥、挪威、瑞典、蘇聯(lián)、日本等許多國(guó)家。我國(guó)于1974年首次發(fā)現(xiàn)該病，此 后蔓延至全國(guó)，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] MEV屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae)細(xì)小病毒屬（Parovirus)，是目前發(fā)現(xiàn)的動(dòng) 物病毒中形態(tài)最小、結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類單鏈線狀病毒之一。病毒粒子有呈二十面體對(duì)稱結(jié) 構(gòu)的核衣殼，無囊膜，直徑大小為20-25nm?；蚪Y(jié)構(gòu)為單鏈DNA，含有兩個(gè)主要的開放閱讀 框（Open Reading FramesJRFshS'端 ORFs 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 NSl 和 NS2,3^ 端 ORFs 編碼 結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2, VP2是構(gòu)成病毒衣殼的主要蛋白。
[0004] 水貂病毒性腸炎傳染性強(qiáng)，病情惡化迅速，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉下痢、精神沉郁、 胃腸粘膜出血等病癥。斷奶仔貂、3-6月齡幼貂最易感染，死亡率高達(dá)60%-90%。不論品 種和年齡的水貂，均對(duì)MEV易感，只是發(fā)病率不同。成年貂對(duì)此病的抵抗能力較強(qiáng)，不表現(xiàn) 出特別強(qiáng)烈的臨床癥狀，一般為隱形感染或是慢性經(jīng)過，發(fā)病率較低，一旦確診，致死率也 會(huì)達(dá)到80%。發(fā)病的水貂作為主要的病毒傳染源向外輻射，進(jìn)而感染缺乏抵抗力的其他水 貂。
[0005] 對(duì)于此類疾病來說，防大于治。預(yù)防MEV最有效的手段是定時(shí)接種疫苗。目前國(guó)內(nèi) 外使用較多的是滅活苗和弱毒苗，預(yù)防效果較好，如MEV組織培養(yǎng)福爾馬林滅活疫苗，MEV 同源組織滅活苗，MEV同源組織滅活苗與肉毒梭菌類毒素二聯(lián)苗，犬瘟熱、病毒性腸炎、肉毒 梭菌類毒素、假單胞菌四聯(lián)苗等。缺點(diǎn)是滅活疫苗的免疫效力相對(duì)較低，弱毒疫苗存在毒力 返祖的潛在危險(xiǎn)性，還有不穩(wěn)定、不易于保存和運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn) 步，多種基因工程疫苗已被研發(fā)，如亞單位疫苗、表位疫苗及合成肽疫苗等，相對(duì)于傳統(tǒng)疫 苗具有安全、穩(wěn)定的特點(diǎn)。Langeveld J D等研制的合成肽疫苗和表位疫苗具有很好的保護(hù) 水貂抵抗MEV感染的效果。Dalsgaard K等應(yīng)用豇豆花葉病毒-植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表 達(dá)了 MEV VP2蛋白。
[0006] 多角體蛋白（Polyhedrin，polh)基因由245個(gè)氨基酸組成，是多角體的主要結(jié)構(gòu) 成分。多角體保護(hù)包埋其中的病毒粒子，使其免受物理和生化降解，保持病毒粒子在自然環(huán) 境中的感染能力。多角體蛋白在病毒感染細(xì)胞后極晚期才高效表達(dá)，當(dāng)其它病毒基因和宿 主基因關(guān)閉后，在病毒感染的極晚期，此基因能持續(xù)高水平表達(dá)，多角體蛋白在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn) 量可達(dá)細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的25% -50%。丁鑫鑫將家蠶桿狀病毒的polh融合于破骨細(xì)胞形 成抑制因子（Osteoprotegerin，OPG)中，分別在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞BmN內(nèi)表達(dá)。結(jié)果表 明，融合蛋白Polh-OPG在大腸桿菌中表達(dá)量明顯提高，但融合蛋白在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)差 異不明顯。郭愛芹構(gòu)建了一系列帶有多角體啟動(dòng)子和不同長(zhǎng)度polh基因片段的新型供體 質(zhì)粒，并以綠色熒光蛋白EGFP作為報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)在BmN細(xì)胞中，多角體蛋白融合表達(dá)策略 可顯著提高外源蛋白的表達(dá)水平。而將多角體蛋白的4個(gè)氨基酸序列融合表達(dá)于水貂細(xì)小 病毒VP2中，在草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞（Sf9細(xì)胞）中能否高水平表達(dá)外源蛋白，外源蛋白可 否正確包裝成病毒樣顆粒，且其免疫原性和反應(yīng)原性的高低等，目前尚無文獻(xiàn)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒、其制備方法及應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，由部分多角體蛋白序列融 合表達(dá)于水貂細(xì)小病毒VP2蛋白N端組成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或該序列經(jīng) 替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供編碼上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示，該基 因中編碼水貂細(xì)小病毒VP2蛋白的基因序列按照昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化。
[0010] 本發(fā)明還提供含有上述基因的載體、宿主細(xì)胞和工程菌。
[0011] 本發(fā)明還提供水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：（1)重組桿 狀病毒Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建：將如SEQ ID No. 2所示的基因克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)進(jìn)行重組，提取陽(yáng)性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid ; (2) 水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒的制備：用重組桿狀病毒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病 毒，將重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞后即可獲得水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒。
[0012] 本發(fā)明中使用的昆蟲細(xì)胞為草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞（Sf9細(xì)胞）等。
[0013] 本發(fā)明還提供由上述方法制備的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒。
[0014] 本發(fā)明還提供所述水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒在制備水貂病毒性腸炎抗體中的應(yīng) 用。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒在制備水貂病毒性腸炎診斷用抗 原試劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供所述水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒在制備水貂病毒性腸炎疫苗中的應(yīng) 用。
[0017] 本發(fā)明還提供一種水貂病毒性腸炎疫苗，其是將所述的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒 不輔以佐劑或任選輔以佐劑制備而成。
[0018] 本發(fā)明中使用的佐劑為氫氧化鋁，終濃度為5%。
[0019] 本發(fā)明提供的水貂病毒性腸炎疫苗為口服疫苗或肌肉注射疫苗。
[0020] 本發(fā)明提供的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒，其是根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子，對(duì)水貂 細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后VP2基因的5'端直接與編碼部分多角體蛋白的核苷 酸序列相連，然后克隆至轉(zhuǎn)移載體中，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)水貂細(xì)小 病毒病毒樣顆粒。利用該表達(dá)系統(tǒng)可安全、高效、大規(guī)模的生產(chǎn)水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒， 且所得病毒樣顆粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可誘導(dǎo)水貂機(jī)體產(chǎn)生高水 平的特異性抗體，并可抵抗強(qiáng)毒的攻擊，對(duì)水貂提供很好的保護(hù)作用，為制備水貂病毒性腸 炎疫苗奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中Pl代重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞圖片；其中，A為正常 Sf9貼壁細(xì)胞對(duì)照，B為Pl代重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞后細(xì)胞病變情況。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中血凝檢測(cè)結(jié)果。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果；其中，A為重組桿狀病毒感染的 陽(yáng)性孔，B為陰性細(xì)胞對(duì)照孔。
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中Western blot結(jié)果；其中，泳道1為P3代樣品，泳道2 為 Marker。
[0025] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中電鏡負(fù)染結(jié)果。
[0026] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中水紹肌肉免疫結(jié)果；其中，A為血減抑制抗體滴度，B為 強(qiáng)毒攻擊后水貂存活率。
[0027] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中水貂口服免疫結(jié)果；其中，A為血凝抑制抗體滴度，B為 強(qiáng)毒攻擊后水貂存活率。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0029] 實(shí)施例1水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒及其制備方法
[0030] 1 材料
[0031] 水貂細(xì)小病毒、菌種E. coli DHlOBac、Sf9細(xì)胞、胎牛血清由長(zhǎng)春西諾生物科技有 限公司提供，pEASY-Blunt Simple載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pFastBac Dual 載體、脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司，Phusion DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接 酶購(gòu)自NEB公司，IPTG、X-gal購(gòu)自大連寶生物公司，抗生素購(gòu)自Sigma公司，Grace昆蟲細(xì) 胞培養(yǎng)基、Sf-900II SFM無血清細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞搖瓶購(gòu)自 Corning公司，DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。
[0032] 2 方法
[0033] 2. 1病毒基因組的提取
[0034] 將水貂細(xì)小病毒同步接種至F81細(xì)胞中，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，細(xì)胞培養(yǎng) 物出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變后，反復(fù)凍融3次收毒。對(duì)收獲的病毒液進(jìn)行DNA的提取，步驟見 DNA提取試劑盒說明書。
[0035] 2. 2水貂細(xì)小病毒VP2序列的測(cè)定
[0036] 參考 GenBank 中公布的 MEV 的 VP2 序列（GenBank No. D00765. 1)，根 據(jù)序列兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物：VP2-F :5'-ATGAGTGATGGAGCAGT-3' ；VP2-R : 5' -TTAATATAATTTTCTAG-3'。以提取的貂細(xì)小病毒DNA為模板，利用擴(kuò)增引物獲得PCR產(chǎn)物 MEV-VP2。將 MEV-VP2 連入 pEASY-Blunt Simple 載體中，得到質(zhì)粒 MEV-VP2-pEASY。選取電 泳條帶大小正確的質(zhì)粒送公司測(cè)序，以得到精確的MEV VP2序列。
[0037] 2. 3 VP2序列優(yōu)化、分析及引物設(shè)計(jì)
[0038] 將MEV VP2序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)如下：保證編碼氨基酸不變前提下，根據(jù)昆蟲 細(xì)胞密碼子偏愛性、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，去除隱蔽剪切部位、不 成熟的PolyA位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA不穩(wěn)定基序、重復(fù)序列（同向重復(fù)、反向重復(fù)、 二連體重復(fù)）、干擾克隆的限制性酶切位點(diǎn)。
[0039] 根據(jù)優(yōu)化的序列MEV-VP2_opti，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別 可擴(kuò)增出的VP20RF區(qū)域1755bp長(zhǎng)度的產(chǎn)物，并在引物的5'端引入酶切位點(diǎn)，上游引物5' 端引入多角體蛋白的12個(gè)喊基序列（表1)。
[0040] 表1引物設(shè)計(jì)信息

【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，由部分多角體蛋白序列融合表達(dá)于水貂細(xì)小病毒VP2 蛋白N端組成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 /_J、i 〇
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4. 水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 重組桿狀病毒Bacmid的構(gòu)建：將權(quán)利要求2所述的基因克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)進(jìn)行重組，提取陽(yáng)性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒 Bacmid ； (2) 水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒的制備：用重組桿狀病毒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得重 組桿狀病毒，將重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞后即可獲得水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2)中使用的昆蟲細(xì)胞為Sf9細(xì)胞。
6. 由權(quán)利要求4或5所述的方法制備的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒。
7. 權(quán)利要求6所述的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒在制備水貂病毒性腸炎疫苗中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求6所述的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒在制備水貂病毒性腸炎抗體中的應(yīng)用。
9. 水貂病毒性腸炎疫苗，其特征在于，將權(quán)利要求6所述的水貂細(xì)小病毒病毒樣顆粒 不輔以佐劑或任選輔以佐劑制備而成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為口服疫苗或肌肉注射疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N7/04GK104403006SQ201410766006
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】金宏麗, 夏曉紅, 陳憲平, 付玉, 劉冰, 楊佳, 夏振強(qiáng), 石晶 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司