一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，采用分段溫度控制法利用以麩皮為主的固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵后無需烘干，直接收集粉碎過篩，即得枯草芽孢桿菌固體成品。本發(fā)明所得菌劑成品中有效枯草芽孢桿菌達(dá)到1.0×1010CFU/g以上，芽孢率在95％以上，具有極好的耐酸、耐膽鹽及耐高溫性能。作為飼料添加劑，本產(chǎn)品能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，同時(shí)有利于菌劑通過動(dòng)物胃部苛刻的強(qiáng)酸環(huán)境，在腸道內(nèi)部發(fā)揮有利作用。
【專利說明】一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及飼用微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種高芽孢率高抗逆性的飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002]抗生素在中國具有較高的使用率，其中一半主要應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，另一半則應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。自20世紀(jì)50年代人們發(fā)現(xiàn)飼料中添加低濃度的抗生素可以預(yù)防動(dòng)物細(xì)菌性疾病的發(fā)生并可促進(jìn)動(dòng)物生長后，抗生素的應(yīng)用日益泛濫，繼而導(dǎo)致了諸多食品安全及生物安全問題，如藥物殘留、耐藥細(xì)菌產(chǎn)生等。
[0003]鑒于抗生素濫用引發(fā)的一系列問題，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移至微生態(tài)制劑。我國動(dòng)物微生態(tài)制劑的研究起步相對較晚，但發(fā)展較快。目前國內(nèi)已有一些科研單位、企業(yè)研發(fā)并生產(chǎn)出相關(guān)飼用微生物，并應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中。
[0004]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種產(chǎn)芽孢的G+細(xì)菌，其菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，對致病菌或內(nèi)源性感染的條件性致病菌有明顯的抑制作用；能夠迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)厭氧菌的生長，繼而降低腸道pH值，抑制病原微生物的生長；另外枯草芽孢桿菌能夠合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。我國農(nóng)業(yè)部將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種?？莶菅挎邨U菌在一定條件下，會(huì)生成芽孢。以芽孢狀態(tài)存在的菌體，具有極強(qiáng)的抗逆性，如耐高溫、耐酸堿、耐擠壓。芽孢形態(tài)能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，有利于儲(chǔ)存，同時(shí)有利于菌劑通過動(dòng)物胃部苛刻的強(qiáng)酸環(huán)境，在腸道內(nèi)發(fā)揮自身益生功效。
[0005]國內(nèi)目前對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在菌種的篩選、抑菌效果和成分分析中，缺乏對枯草芽孢桿菌實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)方面的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)和技術(shù)積累?，F(xiàn)有的培養(yǎng)方法發(fā)酵枯草芽孢桿菌，芽孢率在80%左右，發(fā)酵完畢之后需要烘干或風(fēng)干，生產(chǎn)效果也不盡理想，如何在保證有效菌數(shù)的同時(shí)，盡可能提高芽孢率，同時(shí)兼顧生產(chǎn)成本，成為困擾枯草芽孢桿菌實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的瓶頸問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種高芽孢率高抗逆性的飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，能夠有效解決目前枯草芽孢桿菌菌劑制備過程中芽孢不足的問題，使其具有極好的耐酸、耐膽鹽及耐高溫性能，能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，同時(shí)有利于菌劑通過動(dòng)物胃部苛刻的強(qiáng)酸環(huán)境，在腸道內(nèi)部發(fā)揮有利作用。
[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法。具體步驟是:
[0008](1)菌株:選用枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis CICC 10453 ；
[0009](2)種子培養(yǎng):將步驟(1)所述菌株，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液；將所述一級(jí)種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)得到二級(jí)種子液；
[0010](3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):將所述二級(jí)種子液與營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，充分混合后將其平鋪于淺盤中發(fā)酵，發(fā)酵完畢直接收集，粉碎過40目篩，即得枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品。
[0011]其中，所述枯草芽孢桿菌是Bacillus subtilis CICC 10453，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0012]其中，所述步驟⑵中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5 %，瓊脂2.0%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4。
[0013]其中，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，蒸餾水配制，pH 7.2 ?7.4。
[0014]其中，所述步驟(2)中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化培養(yǎng)條件為37°C倒置培養(yǎng)16?24h ；一級(jí)種子培養(yǎng)條件為37°C，160?180rpm振蕩培養(yǎng)4?8h ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為接種量I ?5%，37°C，160 ?180rpm 振蕩培養(yǎng) 3 ?6h。
[0015]其中，所述步驟(2)中一級(jí)種子液的濃度為lX109CFU/mL ;二級(jí)種子液的濃度為2X109CFU/mL。
[0016]其中，所述步驟(3)中固態(tài)培養(yǎng)基制備方法:以質(zhì)量計(jì)，70?90%麥麩，10?30%稻殼，121°C滅菌30min。
[0017]其中，所述步驟(3)中營養(yǎng)鹽溶液的配制:0.5?1.0%葡萄糖、0.5?1.0%蛋白胨、0.2?0.8%硫酸銨、0.5?1.5%磷酸二氫鉀、0.01?0.04%硫酸錳，自來水配制，調(diào)節(jié)pH 值至 6 ?8,115°C滅菌 20min。
[0018]其中，所述步驟(3)中二級(jí)種子液、營養(yǎng)鹽與固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)量比為0.05?0.2:0.4 ?0.7:1。
[0019]其中，所述步驟(3)中淺盤發(fā)酵高度為2cm?4cm。
[0020]其中，所述步驟(3)中發(fā)酵分為兩個(gè)階段，菌體生長階段與芽孢生成階段；菌體生長階段培養(yǎng)條件為:32?37°C發(fā)酵24?36h ;芽孢生成階段培養(yǎng)條件為:37?40°C發(fā)酵12 ?24h。
[0021]其中，所述步驟(3)中枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品水分不高于14%。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)越性為:
[0023]本發(fā)明采用分階段溫度控制法在保證菌體密度的同時(shí)，極大的提高了菌體的芽孢產(chǎn)率,通過本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)出的產(chǎn)品具有良好的耐酸、耐膽鹽及耐高溫性，由此可以確保產(chǎn)品在經(jīng)制粒及動(dòng)物胃環(huán)境后仍然具有較高的存活率，從而在動(dòng)物腸道中發(fā)揮其益生功能。
[0024]本發(fā)明提供的淺盤發(fā)酵工藝，解決了芽孢率低及熱量積聚導(dǎo)致的菌體生長代謝停滯問題，種子培養(yǎng)周期短，發(fā)酵結(jié)束可直接收集粉碎，無須烘干，大大縮短了生產(chǎn)周期及發(fā)酵后烘干所需能耗。
[0025]本發(fā)明中用于枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵的原料主要為麩皮、稻殼粉，原料成本低廉，同時(shí)生產(chǎn)過程中無有毒物質(zhì)殘留，能夠變廢為寶，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。
[0027]實(shí)施例1，
[0028](I)菌株:選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
[0029](2)將步驟(I)中所述菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)24h ；
[0030]在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、ISOrpm振蕩培養(yǎng)5h獲得一級(jí)種子液；
[0031]以5%接種量,將一級(jí)種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)4h，得到二級(jí)種子液；
[0032]上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;
[0033](3)將二級(jí)種子液、營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，三者的比例為0.05:0.7:1，充分混合后將其平鋪于不銹鋼托盤中，料層厚度為2cm，32°C發(fā)酵36h后改變發(fā)酵條件為37°C發(fā)酵24h ；
[0034]上述固態(tài)培養(yǎng)基制備方法:以質(zhì)量計(jì)，80%麥麩，20%稻殼，121°C滅菌30min ;營養(yǎng)鹽溶液的配制:1.0%葡萄糖、1.0%蛋白胨、0.5% (NH4)2SO4U.0% ΚΗ2Ρ04、0.02% MnSO4,自來水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.2，115°C滅菌20min。
[0035](4)將步驟(3)的發(fā)酵產(chǎn)物直接收集粉碎過40目篩，真空包裝。
[0036](5)菌落計(jì)數(shù)。
[0037]成品菌落計(jì)數(shù)方法參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測。
[0038]產(chǎn)品測定結(jié)果如下:有效活菌數(shù)為1.7xl010cfu/克發(fā)酵干料，芽孢率100%，水分13.04%。
[0039]實(shí)施例2，
[0040](I)菌株:選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
[0041](2)將步驟(I)中所述菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)24h ；
[0042]在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、ISOrpm振蕩培養(yǎng)6h獲得一級(jí)種子液；
[0043]以1%接種量,將一級(jí)種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)6h，得到二級(jí)種子液；
[0044]上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3 %、蛋白胨1.0 %、氯化鈉0.5 %，瓊脂2.0%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;
[0045](3)將二級(jí)種子液、營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，三者的比例為0.2: 0.4: 1，充分混合后將其平鋪于不銹鋼托盤中，料層厚度為4cm，35°C發(fā)酵30h后改變發(fā)酵條件為40°C發(fā)酵12h。
[0046]上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法:以質(zhì)量計(jì)，80%麥麩，20%稻殼，121°C滅菌30min。營養(yǎng)鹽溶液的配制:1.0%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.4% (NH4) 2S04、0.5 % ΚΗ2Ρ04、0.02% MnS04,自來水配制，調(diào)節(jié)pH值至6.5，115°C滅菌20min。
[0047](4)將步驟(3)中的發(fā)酵產(chǎn)物直接收集粉碎過40目篩，真空包裝。
[0048](5)菌落計(jì)數(shù)。產(chǎn)品測定結(jié)果如下:有效活菌數(shù)為1.4xl010cfu/克發(fā)酵干料，芽孢率 100%，水分 8.02%。
[0049]實(shí)施例3，
[0050](1)菌株:選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；
[0051](2)將步驟(1)中所述菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)24h ；
[0052]在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)8h獲得一級(jí)種子液；
[0053]以2%接種量，將一級(jí)種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)4h，得到二級(jí)種子液；
[0054]上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3 %、蛋白胨1.0 %、氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，蒸餾水配制，pH 7.2?7.4 ;
[0055](3)將二級(jí)種子液、營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，三者的比例為0.15: 0.65: 1，充分混合后將其平鋪于不銹鋼托盤中，料層厚度為2cm，32°C發(fā)酵36h后改變發(fā)酵條件為38°C發(fā)酵24h。
[0056]上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法:以質(zhì)量計(jì)，90%麥麩，10%稻殼，121°C滅菌30min ;營養(yǎng)鹽溶液的配制:0.5%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.5% (NH4) 2S04,0.5 % ΚΗ2Ρ04、0.02% MnS04,自來水配制，調(diào)節(jié)pH值至8.0，115°C滅菌20min。
[0057](4)將步驟(3)中的發(fā)酵產(chǎn)物直接收集粉碎過40目篩，真空包裝。
[0058](5)菌落計(jì)數(shù)。
[0059]產(chǎn)品測定結(jié)果如下:有效活菌數(shù)為1.5X101(I/克發(fā)酵干料，芽孢率96%，水分12.63%。
[0060]實(shí)施例4，抗逆性能測定
[0061]⑴耐高溫性
[0062]對照組:無菌稱取10g樣品，加入到含有90mL生理鹽水的三角瓶中，20°C 200r/min振蕩搖勻0.5h。十倍梯度稀釋法傾注平板測定活菌數(shù)。
[0063]試驗(yàn)組:將含有90mL無菌生理鹽水的三角瓶分別置于90°C水浴鍋中預(yù)熱20?30min,使瓶內(nèi)溫度與水浴鍋溫度一致，稱取10g樣品加至相應(yīng)的三角瓶中，處理5分鐘后迅速在冰浴中冷卻，20°C 200r/min振蕩0.5小時(shí)后通過梯度稀釋法傾注平板測定活菌數(shù)。
[0064]測定結(jié)果:經(jīng)過90°C處理5min后，樣品中菌株存活率為92%。
[0065](2)耐酸性
[0066]對照組:無菌稱取10g樣品，加入到含有90mL生理鹽水的三角瓶中，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，20°C 200r/min振蕩搖勻0.5h通過十倍梯度稀釋法傾注平板測定活菌數(shù)。
[0067]試驗(yàn)組:取一定量的生理鹽水，加入lmol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，三角瓶分裝為90mL/瓶，121°C滅菌15min。冷卻后每瓶中加入Ig胃蛋白酶(模擬胃環(huán)境)。無菌環(huán)境下取1g樣品，加入人工制備的酸液中，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，將pH回調(diào)至正常生理鹽水pH，20°C 200r/min振蕩搖勻0.5h通過十倍梯度稀釋法測定活菌數(shù)。
[0068]測定結(jié)果:經(jīng)胃液環(huán)境處理2h后，樣品中菌株存活率為98.15%。
[0069](3)耐膽鹽性
[0070]對照組:無菌稱取1g樣品，加入到含有90mL生理鹽水的三角瓶中，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后取出20°C 200r/min振蕩搖勻0.5h。十倍梯度稀釋法測定活菌數(shù)。
[0071]試驗(yàn)組:取90mL生理鹽水加入到三角瓶中，加入0.3g豬膽鹽，搖勻，121 °C滅菌15min，冷卻，備用。無菌環(huán)境下取1g樣品，加入至膽鹽溶液中，振蕩搖勻，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后取出20°C 200r/min振蕩搖勻0.5h，十倍梯度稀釋法測定活菌數(shù)。
[0072]測定結(jié)果:經(jīng)0.3%膽鹽環(huán)境處理2.5h后，樣品中菌株存活率為97.55%。
[0073]本發(fā)明采用分段溫度控制法，利用以麩皮為主的固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵后無需烘干，直接收集粉碎過40目篩，即得枯草芽孢桿菌固體成品。本發(fā)明所得菌劑成品中有效枯草芽孢桿菌達(dá)到1.0X 101(lCFU/g以上，芽孢率在95%以上，具有極好的耐酸、耐膽鹽及耐高溫性能。作為飼料添加劑，本產(chǎn)品能夠很大程度上避免飼料加工過程中所造成的不必要損失，同時(shí)有利于菌劑通過動(dòng)物胃部苛刻的強(qiáng)酸環(huán)境，在腸道內(nèi)部發(fā)揮有利作用。
[0074]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，具體步驟是: (1)菌株:選用枯草芽抱桿菌Bacillussubtilis CICC10453 ； (2)種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；之后在無菌條件下挑取單菌落接種至20mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液；將所述一級(jí)種子液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)得到二級(jí)種子液； (3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):將所述二級(jí)種子液與營養(yǎng)鹽溶液共同接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，充分混合后將其平鋪于淺盤中發(fā)酵，發(fā)酵完畢直接收集，粉碎過40目篩，即得枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，瓊脂2.0 %，蒸餾水配制，pH7.2?7.4 ; 所述步驟(2)中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，組成為牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5 %，蒸餾水配制，pH7.2?7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化培養(yǎng)條件為37°C倒置培養(yǎng)16?24h 級(jí)種子培養(yǎng)條件為37°C，160?180rpm振蕩培養(yǎng)4?8h ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為接種量I?5%，370C，160?180rpm振蕩培養(yǎng)3?6h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中一級(jí)種子液的濃度為I X 109CFU/mL ;二級(jí)種子液的濃度為2 X 19CFU/mLo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中固態(tài)培養(yǎng)基制備方法:以質(zhì)量計(jì)，70?90%麥麩，10?30%稻殼，121°C 滅菌 30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中營養(yǎng)鹽溶液的配制:0.5?1.0%葡萄糖、0.5?1.0%蛋白胨、0.2?0.8%硫酸銨、0.5?1.5%磷酸二氫鉀、0.01?0.04%硫酸錳，自來水配制，調(diào)節(jié)pH值至6 ?8,115°C滅菌 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中，二級(jí)種子液、營養(yǎng)鹽與固態(tài)培養(yǎng)基的質(zhì)量比為0.05?0.2: 0.4?0.7: I。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中淺盤發(fā)酵高度為2cm?4cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中發(fā)酵分為兩個(gè)階段，菌體生長階段與芽孢生成階段；菌體生長階段培養(yǎng)條件為:32?37°C發(fā)酵24?36h ;芽孢生成階段培養(yǎng)條件為:37?40°C發(fā)酵12?24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一所述的高芽孢率高抗逆性飼用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在，步驟(3)中枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵成品水分不高于14%。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104388347SQ201410660108
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】李衛(wèi)娟, 王計(jì)偉, 王宇霄 申請人:安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司