一種結(jié)合霍亂腸毒素b亞單位的核酸適配子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能特異結(jié)合霍亂腸毒素B亞單位的寡核苷酸適配子及應(yīng)用。所述適配子是一條81個堿基長的單鏈DNA分子，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。該適配子采用系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)篩選獲得，可用于制備霍亂腸毒素的檢測試劑，具有穩(wěn)定、簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點。
【專利說明】-種結(jié)合霍亂腸毒素 B亞單位的核酸適配子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種能特異性高親和力結(jié)合霍亂腸毒素 B亞 單位的核酸適配子，及其在霍亂腸毒素檢測中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 霍亂（Cholera)是由01群和0139群霍亂弧菌感染引起的一種烈性腸道傳染病， 是以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣，能引起大流行為特征的國際檢疫傳染病之一。我國把霍 亂列為甲類法定傳染病，是國境口岸重點檢疫的傳染病。霍亂弧菌主要通過其分泌的毒素 引起感染者劇烈腹瀉和嘔吐等臨床癥狀。霍亂腸毒素 （cholera enterotoxin, CT)是霍亂 弧菌外毒素中最主要的一種，也是引起霍亂的主要致病因子。它由一個A亞單位（cholera enterotoxin subunitA, CT-A)和 5 個 B 亞單位（cholera enterotoxin subunit B, CT-B) 組成。B亞單位為非毒素蛋白，是毒素與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的部分,介導(dǎo)CT-A進(jìn)入細(xì)胞?；?亂腸毒素的檢出對確定霍亂弧菌是否引起流行具有重要的臨床和流行病學(xué)意義。
[0003] 傳統(tǒng)的霍亂弧菌方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用經(jīng)典的方法鑒定，耗時、不靈敏是 這些方法普遍存在的問題。免疫學(xué)方法簡單、方便、迅速、特異性較好，但是仍有交叉反應(yīng)比 較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、 快速的特點，但其在檢測數(shù)目較多的樣品時操作比較繁雜，因此在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)，如多重PCR技術(shù)，然而多重 PCR雖簡化了 PCR實驗的操作，但是由于該技術(shù)需數(shù)對引物同時進(jìn)行擴(kuò)增，很容易產(chǎn)生非特 異性條帶或假陽性，影響檢測結(jié)果。而目前尚未有專門針對霍亂腸毒素檢測的報道。
[0004] 核酸適配子（aptamer)指能與祀分子以高親和力結(jié)合的配基，是通過一種組 合化學(xué)技術(shù)一指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，從人工合成的大容量的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫中通過 反復(fù)"與靶分子作用-篩選、富集"過程，篩選出的對靶分子結(jié)合具有高特異性和高結(jié)合性 的寡核苷酸分子，又可稱為適配體。由于核酸適配子在功能上與傳統(tǒng)抗體類似，與靶物質(zhì)結(jié) 合的特異性和親和力甚至優(yōu)于抗體，加上其靶分子廣、穩(wěn)定性高、攻擊靶分子的效率高、易 改造修飾等特點，已成為分子識別的有力工具，可在基礎(chǔ)研究、臨床快速診斷、藥物研發(fā)等 方面得以廣泛開發(fā)應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明以霍亂腸毒素的B亞單位為靶蛋白，利用SELEX技術(shù)篩選獲得能與靶蛋白 特異結(jié)合的適配子，可用于檢測霍亂腸毒素。由于以單鏈DNA形式存的核酸適配子可采用 化學(xué)方法在體外合成，成本低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，與靶蛋白親和力高，可以在檢測方法中直接應(yīng) 用，具有操作簡便快速等優(yōu)點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡便快速特異的霍亂腸毒素 檢測方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的內(nèi)容包括：
[0008] -種特異結(jié)合霍亂腸毒素 B亞單位的單鏈寡核苷酸適配子，其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No. 1所述。
[0009] 進(jìn)一步的，本
【發(fā)明內(nèi)容】
還包括所述核酸適配子在制備霍亂腸毒素檢測試劑中的應(yīng) 用。
[0010] 與現(xiàn)有有技術(shù)相比，本發(fā)明的適配子為單鏈DNA分子，比蛋白類的抗體更加穩(wěn)定； 該適配子能夠特異的結(jié)合霍亂腸毒素 B亞單位，可利用自動化的機(jī)器進(jìn)行體外人工合成和 標(biāo)記，相對抗體的獲得更為簡便快速、價格低廉，具有良好的應(yīng)用前景。
[0011] 為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為不對稱PCR擴(kuò)增第12輪SELEX篩選獲得ssDNA的電泳圖。其中，M為20bp DNA分子量標(biāo)記。81nt處為單鏈DNA產(chǎn)物。泳道1 一泳道5為平行擴(kuò)增5管。
[0013] 圖2為所述適配子的二級結(jié)構(gòu)。
[0014] 圖3為檢測適配子與霍亂腸毒素 B亞單位親和性的膜雜交試驗圖。1號格為BSA的 陰性對照，2號格為空白對照；第3、4、5、6號格霍亂腸毒素 B亞單位的點樣量分別是：0. 05、 0. 1、0. 2、0. 5 μ g。

【具體實施方式】
[0015] 實施例1 一種能結(jié)合霍亂腸毒素 B亞單位的單鏈DNA適配子的篩選
[0016] 米用SELEX技術(shù)，按下列步驟進(jìn)行：
[0017] 1、ssDNA隨機(jī)文庫和引物的合成
[0018] 用于SELEX篩選的ssDNA文庫總長度是8Int，其中兩端為引物結(jié)合的固定序列，中 間35個核苷酸為隨機(jī)序列。
[0019] 文庫序列為：
[0020] 5 ' -CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-(N35)-AGATAGCTGAATGTCCGCCTA-3 '。
[0021] 擴(kuò)增文庫的引物序列分別為：
[0022] 上游引物：5' -CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-3' ；
[0023] 下游引物：5, -TAGGCGGACATTCAGCTATCT-3' ；
[0024] 生物素標(biāo)上游引物：5' -Biotin-CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-3'
[0025] 隨機(jī)ssDNA文庫和引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，PAGE純化。
[0026] 2、霍亂腸毒素 B亞單位適配子的SELEX篩選過程
[0027] (1)包被與封閉：將霍亂腸毒素 B亞單位（購自美國Sigma公司）用包被緩沖液 (0.05mol/L NaHCO3, pH9.6)溶解后，取一定量加入酶聯(lián)微孔板的實驗孔，4°C包被過夜，用 PBS-T緩沖液洗滌后，再用3%的BSA于37°C封閉2h。
[0028] (2) ssDNA隨機(jī)文庫的處理：在微孔板上平行設(shè)置空白對照孔，先用3%的BSA于 37°C封閉處理 2h。用結(jié)合緩沖液（20mmol/L Hepes，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCL，lmmol/ LMgCl2, lmmol/L CaCl2, PH7. 35)溶解隨機(jī)ssDNA庫，加入到已用3% BSA封閉處理的空白 對照孔，37°C結(jié)合lh，目的是反篩去除與BSA結(jié)合的ssDNA。
[0029] (3) ssDNA結(jié)合：將經(jīng)過反篩后的ssDNA加入到霍亂腸毒素蛋白包被的篩選孔,讓 ssDNA與毒素蛋白在37°C孵育結(jié)合lh，同時也加入酵母tRNA (終濃度為10mg/ml)進(jìn)行競爭 反應(yīng)以提商特異性。
[0030] (4)洗滌：用沖洗緩沖液（結(jié)合緩沖液+0· 05% Tween20)洗3次，洗去未結(jié)合的 ssDNA〇
[0031] (5)洗脫和純化：加入200 μ 1洗脫緩沖液（20mmol/L TrisHCl，4mol/L異硫氰酸 胍，lmmol/L DTT，pH8. 3)于80°C作用IOmin,洗脫下與霍亂腸毒素蛋白結(jié)合的ssDNA,經(jīng)酚、 氯仿抽提，乙醇沉淀，將ssDNA溶解于TE緩沖液中。
[0032] (6)直接不對稱PCR擴(kuò)增篩選獲得的陽性ssDNA :上游和下游引物的之間的 比例是 100 : 1。采用 25μ1 反應(yīng)體系，其中 ddH2015.25yl，10XPCRBuffer2.5yl， dNTP(2.5mM)2.0y 1，上游引物（ΙΟΟμΜ)Ι.Ομ 1，下游引物（1μΜ)1·0μ 1，Taq DNA 聚合酶 (5υ/μ1)0·125μ1，ssDNA 3μ1。PCR 循環(huán)參數(shù)是：94°C 3min;(94°C 30S，60°C 30S，72°C 30S) X40 個循環(huán)；72°C 7min。
[0033] (7)PCR產(chǎn)物電泳切膠純化：將所有PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，切下 單鏈ssDNA的擴(kuò)增條帶，用柱式DNA膠回收試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品） 進(jìn)行回收。回收獲得的ssDNA用紫外分光光度計測定濃度，-20°C保存，留待下一輪篩選用。
[0034] (8)重復(fù)步驟（1)-(7)，篩選12輪，第12輪SELEX篩選獲得ssDNA的電泳圖如所 示。第 1 一 12 輪的毒素蛋白包被量（pmol)分別是：200、180、150、120、100、80、70、50、40、 30、20、10 ;ssDNA 文庫的量（pmol)分別是：2000、1800、1500、1200、1000、1000、800、800、 500、500、500、500。通過逐漸提高篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性，即減少毒素蛋白的使用量，增加文庫與蛋 白的相對比例，以利于高親和力的適配子從文庫中篩選出來。測定每輪篩選獲得的ssDNA 與霍亂腸毒素 B亞單位的結(jié)合率（采用實施例2所述方法）。當(dāng)結(jié)合率無明顯變化時停止篩 選，通過對稱PCR擴(kuò)增獲得dsDNA，回收純化后連接T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑選30個克 隆交英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。序列測定結(jié)果用分子生物學(xué)軟件DNAMAN6. 0 分析ssDNA寡核苷酸適配子的同源性及二級結(jié)構(gòu)。
[0035] (9)根據(jù)親和力高低及二級結(jié)構(gòu)的能級，從克隆篩選獲得的適配子中選出1條序 列做進(jìn)一步的應(yīng)用。其核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 1所示，其二級結(jié)構(gòu)圖見圖2。
[0036] 實施例2篩選的ssDNA文庫與目的蛋白結(jié)合率的測定
[0037] (1)采用生物素標(biāo)記的上游引物和普通下游引物進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增獲得5'端標(biāo) 記了生物素的ssDNA文庫，電泳后切膠純化，調(diào)節(jié)濃度至I. 5pmol/μ 1。
[0038] (2)用霍亂腸毒素 B亞單位蛋白包被96孔酶標(biāo)板，每孔200ng，同時平行設(shè)置空白 對照孔。
[0039] (3) 95°C高溫變性5min后，加入每輪的標(biāo)記ssDNA文庫到反應(yīng)孔與毒素蛋白進(jìn)行 結(jié)合反應(yīng)，37 °C孵育2h，棄孔內(nèi)液體。
[0040] (4)用洗滌緩沖液（PBS+0. 05 % Tween20, PBS-T，ρΗ7· 4)洗滌 3 次，每 次3min，然后加入新鮮配制的鏈霉親合素-辣根過氧化物酶結(jié)合物（HRP-Iabeled Str印tavidin，l : 1000 稀釋）200yl，37°C孵育 30min，PBS-T 洗滌 3 次，
[0041] (5)加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺）顯色液100 μ L室溫避光顯色15min，再加入50 μ L 的0. 5Μ H2SCM終止反應(yīng)，在15min內(nèi)于酶標(biāo)儀中測定450nm波長下的OD值。
[0042] (6)每輪篩選后ssDNA文庫與目的蛋白霍亂腸毒素 B亞單位的結(jié)合率結(jié)果見表1。 表1
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種特異結(jié)合霍亂腸毒素B亞單位的單鏈寡核苷酸適配子，其核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID No. 1 所述。
2. 權(quán)利要求1所述核酸適配子在制備霍亂腸毒素檢測試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/115GK104388434SQ201410588833
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】莫秋華, 譚華, 汪海波, 馮子力, 楊澤, 林繼燦 申請人:珠海國際旅行衛(wèi)生保健中心