專利名稱：：霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測方法及其檢測試劑盒，確切講本發(fā)明是一種用于檢測霍亂滅活口服疫苗效力指標(biāo)的檢測方法，和這種檢測方法所使用的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：由于人們越來越認(rèn)識到腸道局部的粘膜免疫應(yīng)答在預(yù)防霍亂感染中的重要性。霍亂口服滅活疫苗的研究也逐漸受到重視。二十世紀(jì)八十年代初人們正式開始了對口服霍亂疫苗的研究，先后研制出了單純?nèi)w死疫苗(WCV)和全菌體加霍亂毒素B亞單位疫苗(WC/BS)。為確?；魜y疫苗的質(zhì)量和安全性，在疫苗制備出后必須進(jìn)行檢測，以確定其效力?，F(xiàn)階段采用的霍亂口服滅活疫苗效力檢測的方式是通過非腸道給藥的家兔免疫原性試驗，測定疫苗免疫動物后的抗體效價水平，以及采用小鼠免疫后的半數(shù)有效劑量(ED5tl)方法，上述方法均受動物自身條件的影響，無法正確反應(yīng)出一次劑量后的免疫應(yīng)答，試驗結(jié)果無一致性和重復(fù)性。此外這種方法還存在試驗成本大、試驗時間周期長的不足。世界衛(wèi)生組織(WHO)于2002年發(fā)布了《口服霍亂滅活疫苗的生產(chǎn)及檢定準(zhǔn)則》一文，文中指出，對霍亂疫苗保護(hù)力的評價目前尚無國際公認(rèn)的直接方法，同時也沒有能衡量和預(yù)測疫苗對人群的作用的動物模型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的，其效果能與現(xiàn)采用的試驗方法效果一致的檢測霍亂滅活口服疫苗效力指標(biāo)的方法，本發(fā)明的另一個目的是提供這種方法使用的檢測裝置。本發(fā)明的方法是分別從霍亂弧菌01群菌株和0139型菌株提取脂多糖(LPS)，以01群和0139型菌株的LPS為抗原，或者以抗01LPS、0139LPS的兔抗體為抗體，采用間接酶聯(lián)吸附試驗半定量測定霍亂滅活口服疫苗中霍亂01群和0139型的LPS含量，根據(jù)所測得的霍亂滅活口服疫苗中01群和0139型的LPS含量范圍來確定疫苗的效力。本發(fā)明優(yōu)選的測定方法是以霍亂弧菌01群和0139型菌株的LPS為抗原，采用間接ELISA法測定霍亂滅活口服疫苗的效力指標(biāo)。本發(fā)明具體的一個測定方法是a.從霍亂弧菌中分離出霍亂01群菌株和非01群0139型菌株，再分別從所得到的01群菌株和0139型菌株中提取01群霍亂弧菌LPS和0139型霍亂弧菌LPS，標(biāo)化后將所得到的01群霍亂弧菌LPS和0139型LPS分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，將霍亂01LPS參比品稀釋為10μg/ml,0139LPS稀釋為2.5μg/ml，再將稀釋后的OlLPS和0139LPS分別包被于固相載體上，每孔0.lml，01脂多糖和0139脂多糖各加一行。酶標(biāo)板可以為聚苯乙烯或聚乙烯酶標(biāo)板。b.將被檢疫苗用PBS稀釋為5XIO7菌/ml，每孔包被0.Iml，以上述霍亂OlLPS和0139LPS的包被孔為參照，，再在其中加入經(jīng)稀釋的兔抗鼠IgG-HRP，即按常規(guī)間接ELISA法進(jìn)行操作，最后加入顯色底物，37°C放置5-7分鐘，加入2M硫酸終止反應(yīng)，測定OD45tl的吸光值，根據(jù)LPS參照孔和疫苗試驗孔的OD45tl數(shù)值進(jìn)行對比，得以判斷被檢疫苗的效力。以前述的方法進(jìn)行霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法使用的檢測試劑盒以下內(nèi)容組成a.孔酶標(biāo)板，最好采用96孔酶標(biāo)板b.霍亂弧菌01群菌株LPS和0139型菌株LPSc.酶標(biāo)抗抗體d.底物Ae.底物Bf.酶標(biāo)洗液g.終止液。本發(fā)明的試劑盒中優(yōu)選采用96孔聚苯乙烯或聚乙烯酶標(biāo)板，底物A優(yōu)選采用四甲級聯(lián)苯二胺(TMB)；底物B優(yōu)選采用過氧化氫(H2O2)；終止液優(yōu)選采用2M的硫酸。在具體使用中應(yīng)將酶標(biāo)洗液按IOX稀釋。由于本發(fā)明不使用動物進(jìn)行試驗，因此不存在受動物自身條件的影響，結(jié)果具有一致性，其次，采用本發(fā)明試驗成本較低，其試驗所需時間較短。附圖1為間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線與01菌群檢測曲線，附圖2為間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線與0139菌群檢測曲線.具體實施例方式以下為本發(fā)明的實施例。一、材料1.脂多糖(LPS)的制備Ll01LPS采用熱酚法用Vibriocholera0118001、569B提取純化所得。1.20139LPS為熱酚法用Vibriocholera0139提取純化所得。2.血清2.1抗01LPS小鼠血清一用純化的01LPS免疫NIH小鼠，將免疫血清效價標(biāo)化為11280待用。2.2抗0139LPS小鼠血清一用純化的0139LPS免疫NIH小鼠，將免疫血清效價標(biāo)化為11280待用。3.三乙胺水溶液一每IOOOml無熱源水加入5g或6.81ml三乙胺。4.ELISA試劑4.1封閉液一1%BSA小牛血清白蛋白。4.2洗滌液一pH8.0的0.Imol·L^1Tris-HCl緩沖液(0.15mol·L-1NaCl,加入0.Iml·L_1Tween80)。4.3抗體稀釋液一PH8.0的0.Imol·L^1Tris-HCl緩沖液，0.5mol·L-1NaCl,加入Iml·L-1TweenSO04.4辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體一HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Sigma公司4.5酶稀釋液一pH8.0的0.Imol·Γ1Tris-HCl緩沖液，1.5mMMgSO4,1%BSA4.6底物一底物A為TMB，底物B為H2O2。4.7終止液一2mol·L-1H2SO4二、檢測方法1.樣品的處理1.1霍亂弧菌01LPS的處理準(zhǔn)確稱取純化的01LPS，溶解于三乙胺水溶液中，使之濃度達(dá)到lmg/ml。將該溶液于100W超聲波處理10分鐘后用于ELISA包板。1.2霍亂弧菌0139LPS的處理準(zhǔn)確稱取純化的0139LPS，溶解于三乙胺水溶液中，使之濃度達(dá)到lmg/ml。將該溶液于100W超聲波處理10分鐘后備用。1.3待測樣品的處理將蘭州生物制品所生產(chǎn)的霍亂雙價滅活口服疫苗成品膠囊中的內(nèi)容物放入Eppendorf管中，加適量無熱源蒸餾水溶解，SOOOrpm離心5分鐘棄上清，重復(fù)上述步驟1次。沉淀加入適量的無熱源蒸餾水，使得濃度達(dá)到IXIOltl菌/ml。將該溶液于100W超聲波處理20分鐘后備用。2.間接ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立2.1.微量反應(yīng)板的處理將要包被的微量反應(yīng)板放在支架上，使板與40W紫外燈管的距離為10cm，照射20分鐘后備用。2.2LPS的稀釋與包被將超聲波處理后的01和0139LPS用包被液稀釋為10μg/ml，分別在不同的微量反應(yīng)板上用包被液在110列進(jìn)行倍比稀釋，共作5組(AE行)，第11列只加入包被液作為空白對照，第12列加入與第1列濃度相同的LPS溶液，上述溶液每孔均為100μ1。37°C放置1小時后于4°C過夜。2.3封閉用Bio-RADModel1250Immunowash洗板3次，每次間隔1分鐘。在干凈濾紙上拍干，每孔加入150μ1的封閉液，37°C放置1小時。2.4加入抗體血清用抗體稀釋液分別將抗01和0139LPS的小鼠血清稀釋100倍備用，將正常小鼠血清用抗體稀釋液稀釋100倍作為陰性對照血清備用。重復(fù)前述方法，再每孔加入上述稀釋的抗01和0139LPS小鼠血清，第12列只加入陰性對照血清，每孔均為100μ1，37°C放置1小時。2.5加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體重復(fù)前述方法，再根據(jù)試劑說明書將HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG稀釋至其工作濃度，每孔加入100μ1，37°C放置1小時。2.6顯色反應(yīng)洗板，將底物A和底物B等體積混勻，用多道微量加樣器按列加入，每孔100μ1，37°C放置1015分鐘顯色后，用用多道微量加樣器按列加入終止液，每孔100μ1。2.7繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用Bio-RADModel550MICROPLATEREADER在450nm波長讀取各孔的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.8兩種LPS免疫小鼠制備標(biāo)準(zhǔn)血清免疫NIH品系小鼠，每只全程免疫20μgLPS，腹腔注射0.3ml，同時皮下注射0.Iml0第一針加完全佐劑，間隔14天后進(jìn)行第二針免疫，加不完全佐劑免疫；第三、四、五針均不加佐劑免疫，間隔7天，未次免疫后7天采血。用間接酶標(biāo)法測定血清效價。用相應(yīng)菌株的LPSlOyg包板，檢測血清倍比稀釋，要求小鼠血清效價大于11280為合格。將兩種LPS免疫血清標(biāo)化將11280的18001和569B株免疫的血清按各50%體積稀釋100倍后備用；同樣，將11280的0139型霍亂93_3株LPS免疫血清稀釋100倍后備用。3.霍亂滅活口服疫苗成品的LPS含量檢測3.1樣品的稀釋與包被將按前述步驟處理的待測霍亂滅活口服疫苗成品樣品用包被液稀釋至5XIO7菌/ml，分別在AB兩行包被，10μg/ml01LPS包被C行，2.5μg/ml包被D行，第11列只加包被液，第12列加入5XIO7菌/ml的樣品，每孔均為100μ1。37°C放置1小時后于4°C過夜。3.2封閉一方法與2.3步驟相同3.3加入抗體血清一方法與2.4步驟相同3.4加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體一加入抗體血清一方法與2.5步驟相同3.5顯色反應(yīng)一加入抗體血清一方法與2.6步驟相同實際結(jié)果是以01或0139LPS標(biāo)準(zhǔn)作為對照，所測的口服疫苗菌苗中01LPS含量大于10μg,0139LPS含量大于2.5μg。與前述方法相近的另一種方法為用100倍稀釋標(biāo)化的抗01LPS、0139LPS兔抗體包被，標(biāo)化兔免血清需經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀，鹽析后加PBS溶解，4°C透析過夜，用280nm波長測定OD值及濃度，測得濃度霍亂01為1.724ug/ml，霍亂0139為1.764ug/ml；抗原分別加LPS和檢測疫苗，LPS的濃度分別為lOOug，分別系列稀釋和10倍稀釋至12個稀釋度，疫苗的濃度為1000億系列稀釋至12個稀釋度，第三層加200倍稀釋的鼠抗01LPS、0139LPS血清，再加入兔抗鼠IgG_HRP，3000倍稀釋；每孔加入IOOul的TMB底物，37°C放置5_7分鐘，加入2M硫酸終止反應(yīng)，測定OD450的吸光值。4動物實驗4.1疫苗免疫小鼠及家兔用1個膠囊的霍亂滅活口服疫苗溶解于生理鹽水中，使?jié)舛葹?.2XIO1Vml0將小鼠分為4組，分別為口服免疫組和口服乳糖對照組，將小鼠提前停食1天，每只小鼠口服0.3ml，0、7、14天共口服3劑，末次免疫后10天于尾靜脈采血供檢測。同法免疫家兔，每次口服1XIO10/只，0、7、14天共口服3劑，末次免疫1014天耳靜脈采血供檢測。4.2免疫小鼠的保護(hù)力試驗將末次免疫14天后的小鼠用IOOXLD5q菌量的0139(93-3株)和569B強毒菌液進(jìn)行攻毒試驗，計算其保護(hù)力。4.3兔腸袢試驗檢測疫苗保護(hù)力試驗將口服免疫01/0139型霍亂疫苗3次后，效價為1320的家兔開腹行腸袢結(jié)扎試驗，將4cm結(jié)腸結(jié)扎，間隔2cm，共3段，分別注入0.5ml01群霍亂弧菌強毒株菌液(IOOXLD50)jO.5ml0139型霍亂弧菌強毒株菌液(100XLD5tl)，取健康家兔1只作對照，注入0.5ml磷酸緩沖生理鹽水，做法同上。5小時后開腹檢查結(jié)果，根據(jù)腸積液產(chǎn)生強度判定保護(hù)力情況。具體檢測結(jié)果101/0139霍亂口服疫苗中LPS含量的檢測將lOOOOng/ml濃度的01LPS在酶標(biāo)板上進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋，共4組，將2XIO8菌/ml的處理后的疫苗在同一酶標(biāo)板上進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋，共4組，用間接ELISA法，力口入抗01LPS的小鼠血清，測得A值見表1。表1間接ELISA法檢測不同濃度01LPS及疫苗的A值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用上述結(jié)果的A值與01LPS和口服疫苗相應(yīng)的濃度作圖見圖1。圖1中曲線為01LPS標(biāo)準(zhǔn)曲線■為疫苗中的01菌A值。OlLPS的濃度為0-10000ng/ml，2倍稀釋；疫苗的濃度為0-2XIO82倍稀釋。將lOOOOng/ml濃度的0139LPS在酶標(biāo)板上進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋，共4組，將2XIO8菌/ml的處理后的疫苗在同一酶標(biāo)板上進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋，共4組，用間接ELISA法，加入抗0139LPS的小鼠血清，測得A值見表2。表2間接ELISA法檢測不同濃度0139LPS及疫苗的A值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用上述結(jié)果的A值與0139LPS和口服疫苗相應(yīng)的濃度作圖見圖2，圖中0139LPS標(biāo)準(zhǔn)曲線；■為疫苗的0139菌A值，其中0139LPS的濃度為O-lOOOOng/ml，2倍稀釋；疫苗的濃度為0-2X1082倍稀釋。上述結(jié)果表明用間接ELISA法檢測不同稀釋度的LPS，其結(jié)果也呈現(xiàn)出一定的線性，同樣用該方法檢測不同濃度的疫苗中LPS的含量，其A值隨濃度的增加而增加。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對疫苗中的LPS含量進(jìn)行定量。但由于各種可變因素，這種定量是不精確的。在檢測疫苗中01LPS含量時，該試劑的靈敏度較低，只能檢測到濃度為2.5X107的疫苗中LPS含量，這可能與免疫的抗01LPS血清效價有關(guān)。從圖2中看到兩條曲線出現(xiàn)了交叉，這表明標(biāo)準(zhǔn)曲線并不能對疫苗中的LPS進(jìn)行精確定量，但能提供一定范圍內(nèi)的參考值。因此，要確立疫苗中LPS含量的指標(biāo)，可選擇在曲線中接近直線的區(qū)間作為參考標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)圖1，01LPS濃度在1562500ng之間的A值線性關(guān)系較好；根據(jù)圖2，0139LPS濃度也在在1562500ng之間的A值線性關(guān)系較好。疫苗濃度低于5X107菌/ml時，其中01LPS含量用上述試劑和方法無法檢測到，因此還需一定的改進(jìn)；疫苗濃度在3.12X1065X107之間，用該法檢測到的LPS含量與疫苗濃度的線性關(guān)系明顯，因此未來檢測樣品的濃度可選在這一范圍內(nèi)。綜上所述，間接ELISA法可用于疫苗中LPS含量的檢測，考慮到各種可變因素，LPS標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與待檢樣品在同一酶標(biāo)板上進(jìn)行ELISA試驗。在各條件都穩(wěn)定的情況下LPS標(biāo)準(zhǔn)品可以不作標(biāo)準(zhǔn)曲線，但必須有幾個稀釋度；樣品的濃度應(yīng)在其線性較好的范圍內(nèi)進(jìn)行試驗。2抗體效價與保護(hù)力之間的關(guān)系2.1口服免疫01/0139型霍亂疫苗后的抗體反應(yīng)從表3中可以看出小鼠口服免疫01/0139型霍亂疫苗三劑后，口服免疫組血清抗IgG效價為18，小腸分泌性IgA效價能達(dá)到14，01/0139型霍亂疫苗口服免疫家兔三劑后，血清效價可13201640，腸液分泌性IgA抗體效價為18。表3口服免疫01/0139型霍亂疫苗后的抗體反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.2免疫小鼠的保護(hù)力試驗試驗結(jié)果證明用01/0139霍亂疫苗口服免疫小鼠三次，每次40億/只，末次免疫后7天分別用100XLD5(101群和0139型霍亂強毒菌攻擊，分別可產(chǎn)生56%和67%的保護(hù)率(見表4)。表4免疫小鼠的保護(hù)力試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.3兔腸袢試驗檢測疫苗保護(hù)力試驗結(jié)果(口服免疫/腸段攻擊評價結(jié)果)試驗結(jié)果見表5。結(jié)果顯示口服免疫01/0139霍亂疫苗三劑，每劑疫苗100億菌，血清效價為1320的兔子能夠抵抗100XLD5Q的01群和0139型強毒菌的攻擊。表5家兔口服免疫/腸段攻擊評價結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根據(jù)試驗方法的驗證，表明霍亂LPS含量與傳統(tǒng)動物試驗方法具有一定的相關(guān)性，將霍亂LPS明確定量后，與家兔腸攀試驗、小鼠保護(hù)力試驗以及小鼠抗體產(chǎn)生試驗進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，霍亂LPS的含量在一定范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，這種針對霍亂LPS半定量的方法，可以替代傳統(tǒng)動物試驗的方法，進(jìn)行疫苗半定量的間接ELISA方法，具有聯(lián)合的重復(fù)性和穩(wěn)定性?？蛇M(jìn)行疫苗效力試驗的檢測。權(quán)利要求霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法，其特征是分別從霍亂弧菌O1群菌株和O139型菌株提取脂多糖，以霍亂O1群和O139型的脂多糖為抗原，或者以抗O1LPS、O139LPS的兔抗體為抗體，采用間接酶聯(lián)吸附試驗半定量測定霍亂滅活口服疫苗中霍亂弧菌O1群和O139型的脂多糖含量，根據(jù)所測得的霍亂滅活口服疫苗中O1群和O139型的脂多糖含量確定疫苗的效力。2.權(quán)利要求1所述的霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法，其特征是以霍亂01群和0139型的脂多糖為抗原，采用間接ELISA法測定霍亂滅活口服疫苗的效力指標(biāo)。3.權(quán)利要求1所述的霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法，其特征是a.從霍亂弧菌中分離出霍亂弧菌01群菌株和非01群0139型菌株，再分別從所得到的01群菌株和0139型菌株中提取01群霍亂弧菌的脂多糖和0139型霍亂弧菌脂多糖，標(biāo)化后將所得到的01群霍亂弧菌脂多糖和0139型脂多糖分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，將霍亂01LPS參比品稀釋為10μg/ml、0139LPS稀釋為2.5μg/ml，再將稀釋后的01脂多糖和0139脂多糖分別包被于固相載體上，每孔0.lml,01脂多糖和0139脂多糖各加一行。酶標(biāo)板可以為聚苯乙烯或聚乙烯酶標(biāo)板。b.將被檢疫苗用PBS稀釋為5XIO7菌/ml，每孔包被0.Iml,以上述01脂多糖和0139脂多糖的包被孔為參照，，再在其中加入經(jīng)稀釋的兔抗鼠IgG-HRP，即按常規(guī)間接ELISA法進(jìn)行操作，最后加入顯色底物，37°C放置5-7分鐘，加入2M硫酸終止反應(yīng)，測定OD45tl的吸光值，根據(jù)LPS參照孔和疫苗試驗孔的OD45tl數(shù)值進(jìn)行對比，得以判斷被檢疫苗的效力。4.用于進(jìn)行權(quán)利要求2或3所述的方法進(jìn)行霍亂滅活口服疫苗效力的測定方法的檢測試劑盒，其檢測試劑盒是由以下內(nèi)容組成a.孔酶標(biāo)板b.霍亂弧菌01群菌株和0139型菌株脂多糖c.酶標(biāo)抗抗體d.底物Ae.底物Bf.酶標(biāo)洗液g.終止液。全文摘要本發(fā)明公開一種用于檢測霍亂滅活口服疫苗效力的檢測方法，和這種檢測方法使用的檢測試劑盒。本發(fā)明的方法是分別從霍亂弧菌O1菌群和O139菌型提取脂多糖，以O(shè)1菌群和O139菌群的脂多糖為抗原，或者以抗O1LPS、O139LPS的兔抗體為抗體，采用間接酶聯(lián)吸附試驗半定量測定霍亂滅活口服疫苗中細(xì)菌O1菌群和O139菌群的脂多糖含量，根據(jù)所測得的霍亂滅活口服疫苗中O1菌群和O139菌型的脂多糖含量確定疫苗的效力。文檔編號G01N21/31GK101825577SQ20101014336公開日2010年9月8日申請日期2010年3月10日優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日發(fā)明者宣俊文,朱衛(wèi)華,李生迪,王永謙,陳翠萍申請人:蘭州生物制品研究所