專利名稱：基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的霍亂毒素的生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種定量分析霍亂毒素的生物傳感方法，具體是指磷脂雙層膜獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，納米顆粒表面的功能化修飾，表面增強(qiáng)拉曼共振(SERS)和紫外可見光吸收分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
霍亂毒素是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，是導(dǎo)致感染者嚴(yán)重腹瀉的病原菌。對于水和食物，是一種常見的污染源。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)有動物實驗法、細(xì)胞培養(yǎng)法、放射免疫方法(RIA)，酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)，這些方法需要進(jìn)行標(biāo)記，操作復(fù)雜、費(fèi)時， 靈敏度低、穩(wěn)定性不好；還發(fā)展了流式細(xì)胞儀法，實時定量PCR方法等，操作過程對技術(shù)人員要求較高，需要昂貴的儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的生物傳感方法，操作步驟簡單、快速，不需要對底物進(jìn)行任何標(biāo)記，成本低，靈敏度高，特異性好。金屬納米顆粒存在表面等離子體共振現(xiàn)象，當(dāng)表面等離子體受到激發(fā)，在顆粒表面產(chǎn)生電磁場，顯著增強(qiáng)了表面吸附分子的拉曼信號，而當(dāng)納米顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚時，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了更強(qiáng)的電磁場，對表面吸附分子的拉曼信號能達(dá)到 IO12倍的增強(qiáng)作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是制備拉曼染料修飾的磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，選用了功能化磷脂，即頭端修飾有巰基的磷脂，它能共價結(jié)合在金納米顆粒表面，使金納米顆粒探針的穩(wěn)定性得到了提高。磷脂雙分子層膜由GM1分子與磷脂分子共同形成，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1具有與磷脂相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即親水頭和疏水尾，GM1分子與磷脂分子的親水端相互靠近，疏水端相互靠近，形成了雙分子層膜結(jié)構(gòu)?；魜y毒素B亞單元(CTB)是一個多聚體，能與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致包裹有GM1分子的金納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實現(xiàn)SERS檢測。同時，該方法會產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測。所述基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的CTB的定量分析可以通過兩種技術(shù)手段來實現(xiàn)本發(fā)明的一種技術(shù)方案中，基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的霍亂毒素的生物傳感方法,包括如下步驟(I)制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的的納米顆粒探針，其中，所述的磷脂雙分子層膜由GM1分子與磷脂分子共同形成，磷脂雙分子層膜的構(gòu)成成份中包含一種頭端修飾疏基的憐脂；(2) CTB與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致包裹有GM1分子的金納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實現(xiàn)SERS檢測；(3)利用SERS分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。本發(fā)明的另一種技術(shù)方案中，基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的霍亂毒素的生物傳感方法，包括如下步驟(I)制備磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針，其中，所述的磷脂雙分子層膜由GM1分子與磷脂分子共同形成，磷脂雙分子層膜的構(gòu)成成份中包含一種頭端修飾巰基的磷脂；(2) CTB與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致表包裹有GM1分子的金納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生光吸收的變化；(3)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。以下對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。對于采用拉曼技術(shù)手段來實現(xiàn)對霍亂毒素的定量分析，操作過程是取拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的金納米顆粒探針儲備液以及緩沖溶液于微量管中，加入包含有待測物的樣品溶液，室溫反應(yīng)30分鐘后，取一定體積的樣品對其進(jìn)行SERS檢測。本發(fā)明中，制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的金納米顆粒探針，具體步驟是取O. 3nM納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL,邊攪拌邊加入 500 μ M DTNB (5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室溫放置2小時。稱取2mgl，2_di myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg I,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phos pho-thioethanol和0. Img GM1于5mL圓底燒瓶，加入氯仿/甲醇(v/v 6 : l)2mL,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)，溫度設(shè)定為45 ,蒸干后繼續(xù)蒸發(fā)20min。將上述制好的2. 3mL DTNB/ AuNPs溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩一段時間，至瓶壁上的磷脂完全進(jìn)入到溶液中，再放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時，得到的產(chǎn)品溶液在 12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。本發(fā)明中，所述基于拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的霍亂毒素定量分析，檢測步驟是20μ L反應(yīng)體系中，加入5μ L 4 X Tris緩沖溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH7. 5)和5μ L上述合成的金納米顆粒探針溶液于微量管中，再加入包含有待測物的樣品溶液，充分混勻后，室溫反應(yīng)30分鐘，取反應(yīng)后的樣品溶液10 μ L滴在硅片上,使用激光共聚焦拉曼光譜儀對樣品進(jìn)行掃描，得到樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)。所述基于納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生光吸收變化的霍亂毒素的比色檢測，操作過程中不需要對金納米顆粒進(jìn)行拉曼染料標(biāo)記，其它步驟完全一致，最后得到的產(chǎn)物溶液用滅菌水稀釋至60μ L，移入微量石英比色皿中，通過紫外可見光吸收分光光度計進(jìn)行檢測。注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改變比例或試劑加入順序可使信號的變化程度在1% 100%內(nèi)變化。本發(fā)明制備了拉曼染料修飾的磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，選用功能化磷脂，即頭端修飾巰基的磷脂，它能共價結(jié)合在金納米顆粒表面，使金納米顆粒探針的穩(wěn)定性得到了提高?；魜y毒素B亞單元(CTB)與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致包裹有GM1 分子的金納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了巨大的電磁場，顯著增強(qiáng)了顆粒表面吸附分子的拉曼信號，實現(xiàn)了高靈敏的SERS檢測。同時，該方法會產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測。操作步驟簡單、快速，不需要對底物進(jìn)行任何標(biāo)記，成本低，靈敏度高，特異性好，有望成為有用的檢測與鑒定霍亂毒素的技術(shù)手段，對于食品安全監(jiān)測以及控制和預(yù)防食源性疾病具有重要的意義。
具體實施例方式實施例I :霍亂毒素標(biāo)準(zhǔn)品的含量分析(I)制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針稱取I. 58mg 5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用滅菌水稀釋為500 μ Μ(避光,備用)。取O. 3ηΜ納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL，邊攪拌邊加入500 μ M DTNB (5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室溫放置 2 小時。稱取 2mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg 1,2-Di palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphothioethanol 和 0. Img GM1 于 5mL 圓底燒瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)2mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)，溫度設(shè)定為45°C，蒸干后繼續(xù)蒸發(fā)20min。 將2. 5mLDTNB/AuNPs溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩一段時間，至瓶壁上的磷脂完全進(jìn)入到溶液中，放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時，得到的產(chǎn)品溶液在12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。⑵CTB與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚取濃度為lmg/ml 的 CTB 標(biāo)準(zhǔn)品，用 Tris-HCl 緩沖溶液(50mM Tris,200mM NaCl, PH7. 5)分別稀釋到 10 μ g/ml, I μ g/ml, lOOng/ml, lOng/ml, lng/ml, lOOpg/ml, lOpg/ml, lpg/ml020μ L 反應(yīng)體系中，加入 5μ L 4 X Tris 緩沖溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH 7.5)和5μ L上述合成的金納米顆粒探針于微量管中，再加入包含有待測物的樣品溶液，充分混勻后，室溫反應(yīng)30分鐘。(3)利用SERS分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測取10 μ L產(chǎn)物溶液滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光譜儀對溶液進(jìn)行掃描，選用632nmHeNe激發(fā)器，曝光時間10秒，掃描圈數(shù)I圈，掃描范圍200nm-2000nm。實驗結(jié)果待測物CTB的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是10fg/mL 10ng/mL， 能達(dá)到6個數(shù)量級，檢測下限是3fg/mL。實施例2 :注射用霍亂疫苗樣品中霍亂毒素的含量檢測(I)制備拉曼染料修飾的磷脂雙層膜包裹的納米顆粒探針稱取I. 58mg 5，5' - 二硫雙(2_硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用滅菌水稀釋為500 μ Μ(避光,備用)。取0. 3ηΜ納米金溶液2mL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為2mL，邊攪拌邊加入500 μ M DTNB (5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸))300 μ L， 室溫放置 2 小時。稱取 2mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg I, 2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phospho-thioethanol 和 0. Img GM1 于 5mL 圓底燒瓶，加入氯仿/甲醇(v/v 6 I) 2mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)，溫度設(shè)定為45°C，蒸干后繼續(xù)蒸發(fā) 20min。將2. 5mLDTNB/AuNPs溶液在50°C恒溫水浴中預(yù)熱后，加入到圓底燒瓶中，在混勻器上振蕩一段時間，至瓶壁上的磷脂膜完全進(jìn)入到溶液中，放入50°C恒溫水浴中溶脹I小時， 得到的產(chǎn)品溶液在12000r/min離心15min，用滅菌水定容為lmL，置于4°C冰箱備用。⑵CTB與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚
20μ L 反應(yīng)體系中，加入 5μ L 4 X Tris 緩沖溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH 7.5)和5yL上述合成的金納米顆粒探針于微量管中，再加入注射用霍亂疫苗樣品，充分混勻后，室溫反應(yīng)30分鐘。(3)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測取20 μ L產(chǎn)物溶液用蒸餾水稀釋至60 μ L，移入微量石英比色皿，利用紫外可見分光光度計對其進(jìn)行定量分析，掃描范圍800nm-400nm。實驗結(jié)果待測物CTB的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是100fg/mL 10ng/mL， 能達(dá)到5個數(shù)量級，檢測下限是45fg/mL。
權(quán)利要求
1.一種基于磷脂雙分子層膜包裹的納米顆粒團(tuán)聚的霍亂毒素的生物傳感方法，包括以下步驟(1)制備磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，其中，磷脂雙分子層膜由GM1分子與磷脂分子共同形成；(2)CTB與受體GM1特異性結(jié)合反應(yīng)；(3)產(chǎn)物溶液的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的磷脂雙分子層膜的構(gòu)成成份中包含頭端修飾巰基的磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(3)所述的檢測方法是利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的納米顆粒探針是修飾有拉曼染料的納米顆粒探針；步驟(3)所述的檢測方法是利用SERS分析技術(shù)對產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量分析霍亂毒素的生物傳感方法，制備了拉曼染料修飾的磷脂雙分子層膜包裹的金納米顆粒探針，選用功能化磷脂，即頭端修飾巰基的磷脂，它能共價結(jié)合在金納米顆粒表面，使金納米顆粒探針的穩(wěn)定性得到了提高?；魜y毒素B亞單元(CTB)與多個受體GM1分子特異性結(jié)合，導(dǎo)致包裹有GM1分子的金納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，實現(xiàn)了高靈敏的SERS檢測。同時，該方法會產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測。操作步驟簡單、快速，不需要對底物進(jìn)行任何標(biāo)記，成本低，靈敏度高，特異性好，有望成為有用的檢測與鑒定霍亂毒素的技術(shù)手段，對于食品安全監(jiān)測以及控制和預(yù)防食源性疾病具有重要的意義。
文檔編號G01N21/65GK102608311SQ20121011643
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 王玉, 蔣健暉 申請人:湖南大學(xué)