專利名稱：含有磷脂混合物并具有抗細胞程序死亡活性的組合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及了對細胞程序死亡具有抑制作用的物質(zhì)的組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及了具有抗細胞程序死亡活性的磷脂(PA、PI、LPA、LPI和LPC)混合物的組合物。發(fā)明背景細胞程序死亡是一種導致個體細胞死亡的正常生理過程。這種細胞程序死亡的過程涉及到多種正常的或病原性的生物作用，并且該過程可以由許多不相關(guān)的刺激所引發(fā)。在衰老過程中也會出現(xiàn)細胞程序死亡的生物調(diào)節(jié)的變化，并且會引起許多與衰老有關(guān)的病癥和疾病。
細胞程序死亡的最新研究揭示出，誘發(fā)細胞程序死亡的正常代謝途徑能夠被很多種信號啟動，這些信號包括激素，血清生長因子的缺失，化學治療劑，電離輻射，和因人體免疫缺損病毒(HIV)造成的感染。Wyllie(1980)Nature 284555-556；Kanter等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun 118392-399；Duke和Cohen(1986)Lymphokine Res.5289-299；Tomei等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.155324-331；Kruman等人(1991)J.Cell.Physiol.148267-173；Ameisen和Capron(1991)Immunol.Today12102-105；及Sheppard和Ascher(1992)J.AIDS 5143-147。那些影響細胞程序死亡的生物控制的試劑對大量臨床病癥都具有治療功效。
編程性細胞死亡的特點表現(xiàn)為細胞收縮、染色質(zhì)凝聚、細胞質(zhì)水泡狀生長、膜通透性增大和核小體間DNA裂解。Gerschenson等人(1992)FASEB J. 62450-2455；及Cohen和Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10267-293。
含有部分的、經(jīng)一定程度加工的植物提取物的多種食品補充劑已被用于改善化療、輻射和艾滋病(AIDS)中伴隨的腸胃紊亂。這些補充劑通常含有碳水化合物、脂肪和植物性蛋白水解物。例如，可以參見Tomei和Coe等人的in Apoptosis The Molecular Basis of Cell Death(1991)ColdSpring Harbor Laboratory Press。
一些由植物提取物中得到的一些蛋白酶抑制劑具有抗癌活性。Troll等人(1987)Adv.Canner Res.49265-283。Bowman-Birk抑制劑是這些抑制劑中最好的。Birk(1985)Int.J.Pep.pro.Res.25113-131。Bowman-Birk抑制劑被描述成一類能抑制細胞轉(zhuǎn)化且分子量約是8KD的二硫化物鍵合蛋白。Chou等人(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA711748-1752；Yavelow等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA825395-5399；及Yavelow等人(1983)Cancer Res.(Suppl.)432454s-2459s。對含有Bowman-Birk抑制劑的大豆粗提物進行了具體的描述。Kennedy等人的美國專利4,793,3996；PCT公開號WO94/20121；和Kennedy，A.R.(1994)Canner Res.(Suppl)541999s-2005s。還有關(guān)于Bowman-Birk抑制劑免疫性的描述。WO90/03574；和美國專利4,959,310；和5,053,327。Bowman-Birk抑制劑還被發(fā)現(xiàn)有巨噬細胞脫粒的活性。日本特許公報63051335。
磷脂是一類親水親油性的含磷脂類，它們是生物膜的重要組成。不同的磷脂制品可以應用于烹飪、藥物轉(zhuǎn)運(脂質(zhì)體)、緩釋傳遞體系、疏水性藥物的載體介質(zhì)、基因轉(zhuǎn)移和基因替代治療、防曬劑、乳劑、消泡劑、缺損肺表面活性劑的替代、去污劑和膜穩(wěn)定劑。
在許多植物和動物產(chǎn)品中都發(fā)現(xiàn)含有磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂酰肌醇(LPI)、和溶血性磷脂酰膽堿(LPC)。很多植物和動物產(chǎn)品中含有LPA，據(jù)報導它具有許多包括致有絲分裂、生長因子作用在內(nèi)的生理活性，并且可以作為一種抗皺劑。美國專利4,263,286；4,746,652；5,326,690；和5,340,568。下列文獻對LPA有詳細的評述，Moolenaar(1994)TICB4213-219；和Eichholtz等人(1990)Biochem.J.291677-680；和Moolenaar(1995)J.Biol.Chem.27012949-12952。
PCT專利公開號WO95/15173描述了植物來源的脫脂(delipidated)提取物可以產(chǎn)生抗細胞程序死亡的作用?，F(xiàn)在認為，這些提取物中含有重量比是2∶1∶2∶20∶20的LPA、LPC、LPI、PA和PI，提取物還含有許多蛋白質(zhì)和碳水化合物組分在內(nèi)。
在本發(fā)明中引用的所有參考文獻都作為參考文獻以其全部內(nèi)容并入本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明涉及抑制細胞程序死亡的組合物和制備這些組合物的方法。本發(fā)明還涉及這些組合物制備和應用的方法。
因此，本發(fā)明一方面涉及了含有磷脂的組合物，這些磷脂是磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂酰肌醇(LPI)、和溶血性磷脂酰膽堿(LPC)，它們之間的配比是能產(chǎn)生抗細胞程序死亡作用的比例。
另一方面，本發(fā)明提供了制備這些組合物的方法。這些方法包括將有效量的上述磷脂以它們各自相應的比例進行結(jié)合，并且將這些磷脂進行聲處理直至所得溶液具有光學透明度。
又一方面，本發(fā)明提供了這些組合物的應用方法。這些方法包括將這些組合物用于治療細胞程序死亡，治療是通過給予需要這類治療的患者以有效治療量的含有上述組合物的可藥用治療劑來實現(xiàn)的。該方法包括用組合物來治療與細胞程序死亡有關(guān)的病癥。使用這些組合物的其他方法包括防止培養(yǎng)的細胞發(fā)生細胞程序死亡，改善連續(xù)性器官移植中的器官保藏和分流術(shù)中的器官原位保藏，例如，心臟、肝臟、肺、腦等，以及治療牽涉有細胞程序死亡的皮膚病病癥的方法。對附圖的簡單描述附

圖1(A)和1(B)是ElirexTM(以前稱為“ROM”)在不同溫度條件下儲存一周后的穩(wěn)定性棒圖。棒的陰影部分代表了活的粘附性細胞(ADH)。棒的空白部分代表了程序死亡的無血清的釋放性細胞(SDR)。穩(wěn)定性是以細胞密度(附圖1(A))和百分率(附圖1(B))來表示的。在附圖1(A)中，空心環(huán)代表粘附性細胞的具有統(tǒng)計學意義的顯著性增加；實心環(huán)代表了程序死亡細胞的具有統(tǒng)計意義的顯著性減少。附圖1(B)，空心方塊代表了具有統(tǒng)計學意義的存活細胞的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的具有統(tǒng)計學意義的百分率。
附圖2(A)和2(B)是NM和RNM在10T 1/2細胞中的抗細胞程序死亡活性的對比棒圖。棒的陰影部分代表了活細胞(ADH)。棒的空白部分代表了程序死亡的無血清釋放細胞。NM是一種具有抗細胞程序死亡活性的大豆來源的提取物。RNM是具有10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)比例的重組脂混合物。加有牛血清白蛋白(BSA)并且最終濃度為0.01％的RNM被表示為RNM+?？辜毎绦蛩劳龌钚允且约毎芏?附圖2(A))和百分率(附圖2(B))來表示。附圖2(A)中，空心環(huán)代表了活細胞的具有統(tǒng)計意義的顯著性增加；實心環(huán)代表了程序死亡細胞的具有統(tǒng)計學意義的顯著性減少。附圖2(B)，空心方塊代表了存活細胞的統(tǒng)計學意義的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的統(tǒng)計學意義的百分率。
附圖3(A)和3(B)是含有植物來源磷脂的RNM和含有動物來源磷脂的RNM分別所具有的抗細胞程序死亡活性的對比棒圖。劑量濃度是100μg/ml。溶液不論含有或不含BSA其最終濃度都是0.01％。棒圖的陰影部分表示細胞(ADH)。棒圖的空白部分代表程序死亡細胞(SDR)?？辜毎绦蛩劳龌钚允且约毎芏?附圖3(A))和百分率(附圖3(B))來表示。在各附圖中，第二和第三個棒代表大豆來源的磷脂；第四和第五棒代表了動物來源的磷脂。附圖3(A)中，空心環(huán)代表了活細胞(ADH)的具有統(tǒng)計意義的顯著性增加；實心環(huán)代表了程序死亡細胞(SDR)的具有統(tǒng)計學意義的顯著性減少。附圖3(B)，空心方塊代表了存活細胞的有統(tǒng)計學意義的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的有統(tǒng)計學意義的百分率。
附圖4(A)是以PI為具體實例(采用Avanti Polar Lipids1994的目錄)，將含有大豆來源磷脂的脂肪酸[A]和含有牛肝臟來源磷脂的脂肪酸[B]進行比較?？瞻撞糠值陌舯硎撅柡椭舅幔魂幱安糠值陌舯硎静伙柡椭舅?。各脂肪酸的種類是以X∶Y來劃分，其中X代表了鏈的長度，Y代表了雙鍵的數(shù)目?！癝/U”是指飽和脂肪酸相對于不飽和脂肪酸的比例。
附圖5(A)至(E)是一系列圖示，用來表示RNM中的PA(附圖5(A))、PI(附圖5(B))、LPA(附圖5(C))、LPI(附圖5(D))、和LPC(附圖5(E))在不同濃度下的抗細胞程序死亡活性。所含磷脂的比例分別保持在常數(shù)10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)，但所研究磷脂的濃度(μg/ml)是不同的。箭頭代表磷脂在100μg/ml的劑量下當比例為10∶10∶2∶2∶1時的起始濃度。
附圖6是附圖5所述各磷脂在不同濃度下的抗細胞程序死亡活性試驗的總圖示。所含磷脂的比例保持在常數(shù)10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)，但這些磷脂在100μg/ml當量劑量下的濃度(μg/ml)是不同的。附圖中的磷脂表示如下LPA(由實線連接的方塊)、LPI(由實線連接的環(huán))、LPA(由實線連接的三角)、PA(由虛線連接的方塊)、PI(由虛線連接的環(huán))。
附圖7是重組RNM和ElirexTM在不同劑量時的抗細胞程序死亡活性對比圖示。ElirexTM是由實線連接的空心方塊表示，并且ElirexTM的磷脂比例是由附圖5和6中優(yōu)選出的?？辜毎绦蛩劳鍪且源婊罴毎陌俜致时硎?。
附圖8表示在不同pH條件下用Eagel基礎培養(yǎng)基稀釋(BME)得到的ElirexTM的抗細胞程序死亡活性。由虛線連接的實心三角代表了BME中的ElirexTM在不同濃度(μg/ml)下的抗細胞程序死亡活性。實心方塊代表ElirexTM在pH為8(碳酸氫銨緩沖液)時的活性。實心三角代表ElirexTM在pH為5.0(醋酸鈉緩沖液)時的活性。實心環(huán)代表ElirexTM在pH為6.5(磷酸鈉緩沖液)時的活性。在用細胞培養(yǎng)介質(zhì)稀釋前，都必須先在含有100-200mMNaCl的測試緩沖液中進行聲處理，使之重新混懸。本發(fā)明實施方法現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，含有特定比例五種磷脂的組合物比含天然比例的這些磷脂具有更高的抗細胞程序死亡活性，其中的五種磷脂可以來源于植物、動物或合成。這些組合物很容易從各種渠道得到，包括來源于植物和動物。組合物還可以采用脂合成領域的已知方法來合成。組合物將因為來源和植物生長條件的不同而使化學組成略有差異。組合物在此被稱為ElirexTM。
我們以前對植物來源的、可產(chǎn)生抗細胞程序死亡作用的提取物進行過描述，提取物活性測定采用體外細胞試驗來完成，該體外細胞試驗是能夠?qū)毎绦蛩劳鲂盘柈a(chǎn)生應答的試驗。如PCT WO95/15173所述。現(xiàn)在，我們發(fā)現(xiàn)活性組分是磷脂磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂酰肌醇(LPI)、和溶血性磷脂酰膽堿(LPC)。天然提取物分別含有這些磷脂并且它們的比例是約20∶20∶2∶1∶2。在此它被稱為“天然混合物”(NM)。這些磷脂可以這種比例重新進行結(jié)合，以得到重組天然混合物(RNM)，該RNM中不含有天然混合物所含的雜質(zhì)。RNM是ElirexTM的一個具體實例。雖然這個比例是最常見的標準含量比例，但是它可以因各種原因而在很小的范圍內(nèi)變化，改變的原因包括季節(jié)、生長條件、生長區(qū)域、收獲條件、儲存、種子(育種)類型和種子的基因技術(shù)，但是不僅僅局限于此。本發(fā)明中，這些磷脂的比例不同于發(fā)現(xiàn)的天然來源比例，但卻更有效。
本發(fā)明所述組合物含有活性成分磷脂PA、PI、LPA、LPI、和LPC。所含各磷脂的比例范圍分別是0-20∶5-20∶2-16∶0-4∶0-8。優(yōu)選各磷脂的比例范圍大約分別是2-15∶8-15∶6-10∶2-4∶2-8。更優(yōu)選這些磷脂的比例分別是近10∶10∶8∶2∶4的比例。雖然這些磷脂的結(jié)構(gòu)是確定的，但由于脂鏈長度和飽和程度的不同而使它們各不相同。通常，這些磷脂具有下列結(jié)構(gòu)式，也包括本領域已知的其他結(jié)構(gòu)的磷脂，但這些磷脂必須能夠在任一標準細胞程序死亡試驗中產(chǎn)生抗細胞程序死亡應答。
PA的結(jié)構(gòu)式是
PI的結(jié)構(gòu)式是
LPA結(jié)構(gòu)式是
其中R是一個非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、含有11-23個碳原子的烷基。
并且，在此所采用的LPA含有多種不同的分子，包括結(jié)構(gòu)式如下的2-脫氧-或2-脫氧-2-鹵素-溶血性磷脂酸化合物，但是不僅僅局限于此
或LPA的可藥用鹽，其中R是一個非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、含有11-23個碳原子的烷基；X分別是O或S；Y是O或(CH)n，其中n＝0-2；并且Z是H、鹵素、NH2、SH、OH、或OPO3H2。
還包括RC(O)O基，例如，它可以是月桂酰基、肉豆蔻?；⒆貦磅；⒂仓；?、棕櫚油?；?、油酰基、亞油?；?；優(yōu)選油?；?、棕櫚油酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚?；?、或月桂?；?。最優(yōu)選16碳鏈的棕櫚?；妥貦坝王；?，和18碳鏈的硬脂?；?、油酰基和亞油?；遣慌懦渌兼滈L度的脂肪酸，包括C12、C14、C20和C22，但不局限于此。適當磷脂的具體例子可以參見任何磷脂商品目錄，如(1994)Avanticatalog，具體是其中的第14和21頁。
其中R是非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、帶有大約11-23個碳原子的烷基。
LPC的結(jié)構(gòu)式為
其中R是非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、帶有大約11-23個碳原子的烷基。
磷脂的可藥用鹽包括游離酸形式、堿金屬鹽，例如鈉和鉀；堿土金屬鹽，例如鈣和鎂；無毒重金屬鹽；銨鹽；三烷基銨鹽，如三甲基銨和三乙基銨；以及三烷氧基銨鹽，例如三乙醇銨、三(2-羥乙基)銨、和Tromethamine(三(羥甲基)氨基甲烷)，但是不僅限于此。尤其優(yōu)選鈉鹽和銨鹽。
組合物中的磷脂可以由市場上買到，或從多種植物(包括植物的某些部分)和動物中分離到。優(yōu)選的植物是豆類，但是磷脂也可以從其他植物中分離得到，其他植物可包括豆科植物(扁豆和豌豆等)，但不僅限于此。磷脂還可以由純化的植物提取物中分離出來，純植物提取物包括了大豆糖漿、卵磷脂、部分提純的蛋白濃縮物、部分提純的蛋白水解物、和其他可從中提取脂的大豆成分，但不僅局限于此。本領域所屬技術(shù)人員能夠按照在此描述的方法來判斷，是否可以從特定種類的植物、植物提取物和植物的某些部分中分離出本發(fā)明所述磷脂。美國專利3,365,440中描述了可從豆類中提取到磷脂。
任何可以產(chǎn)生組合物磷脂的植物提取物或其某些部分都適用于本發(fā)明?？梢岳玫闹参锲鞴侔饲o、葉、根、花、根狀莖、和尤其是植物的儲存器官，如種子、塊莖和球莖，但不僅限于此。所用植物組成部分優(yōu)選的是儲存器官。最優(yōu)選使用的是干燥的大豆種子。雖然在此使用了術(shù)語“種子”和“種子類”，但應該理解成任何可以產(chǎn)生至少一種本發(fā)明所述磷脂的植物組成部分。
可以采用所屬技術(shù)領域中任何已知的方法從植物中獲得磷脂，只要這些方法能夠純化得到至少一種本發(fā)明所述磷脂。所屬技術(shù)領域中，有許多已知的方法是用于純化和分析植物來源磷脂的。例如，參見Bligh和Dyer(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37911-917；Patton等人(1982)J.Lipid Res.23190-196；Jungalwala(1985)Recent Developments inTechniques for Phospholipid Analysis，in Phospholipids in Nervous Tissues(編輯Eichberg)Jphn Wiley和Sons，第1-44頁；Hamilton等人(1992)的系列文獻，A Practical Approach(Rickwood等人編輯)IRLPress at Oxford Unicersity Press；和Kates(1986)Techniques ofLipidologyIsolation，Analysis and Identification in LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(Burdon等人編輯)Elsevier。
磷脂還可以來自于動物。優(yōu)選的動物是哺乳動物，最優(yōu)選的是來源于肝臟細胞的磷脂。這種磷脂可以從市場上買到或采用所屬領域的已知方法從動物組織中純化得到。例如從動物和蛋的卵磷脂，或從WO95/15173所述的組合物中得到。
本發(fā)明所述的磷脂還可以采用所屬技術(shù)領域的已知方法來合成。適宜的半合成磷脂及它們的合成在Kates的Techniques of Lipidology(1972)中進行了描述。
可以使用不同純度的磷脂。純度可以采用任何已知的技術(shù)方法來進行分析，例如二維的TLC和HPLC，同時也對全脂、磷脂或磷酸酯進行分析。Kates概括了許多適當?shù)姆椒?。尤其是，磷脂必須達到足夠的純度，當它們被混合且總濃度大約是10mg/ml時，混合物可以經(jīng)下述方法的聲處理得到相對透明的溶液。理想的情況是，磷脂至少達到90％的純度，更優(yōu)選至少達到95％純度，最優(yōu)選至少達到99％純度。
在應用中，磷脂可以結(jié)合也可不結(jié)合蛋白質(zhì)。在此，“結(jié)合蛋白”是指任何能夠保護LPA使之保持其活性的蛋白。結(jié)合蛋白的實例包括白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白，但是不局限于此。
能夠影響ElirexTM組合物活性的其他因素是磷脂的鏈長、不飽和度、是否含有膽甾醇、是否存在微團、脂質(zhì)體、洗滌劑和乳化劑、及LPA中鏈的位置，即鏈是位于甘油的第一還是第二個碳原子上。毋庸置疑，聲處理可以導致脂質(zhì)體和/或微團或其他多層脂質(zhì)體的形成，引起ElirexTM活性的提高。短鏈LPA不如C16和C18鏈的LPA更有效。
不容懷疑的是，PA、PI、LPI、和LPC的存在被推斷為能夠保護LPA，使其不發(fā)生降解，并且可以提高LPA的生理作用。
本發(fā)明進一步涉及了制備ElirexTM組合物的方法。各磷脂的比例范圍分別地是(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)0-20∶5-20∶2-16∶0-4∶0-8。優(yōu)選各磷脂的比例分別地大約是2-15∶8-15∶6-10∶2-4∶2-8。優(yōu)選的組合物是其所含磷脂以大約10∶10∶8∶2∶4的重量比例混合。比例值的“大約”是指磷脂比例可以在接近多至15％的范圍內(nèi)變化，但優(yōu)選其變化不超過5％的范圍，更優(yōu)選比例在±0.5％之間變化。
磷脂可以在任何緩沖溶液中混懸，優(yōu)選pH值為5-8的含游離二價陽離子的溶液。例如D-PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，游離的鈣和鎂鹽，GibcoBRL)或濃度是50mM的含有等滲氯化鈉的碳酸氫銨溶液。在用于治療的組合物中，優(yōu)選那些可生理用緩沖溶液。很寬范圍的pH值都是有效的。優(yōu)選pH介于5.5-8，即使任何使ElirexTM活性減小的pH值也可以被采用。我們發(fā)現(xiàn)混合物在pH為8時具有最高活性。優(yōu)選的是，磷脂在濃度為50mM且用0.154M氯化鈉溶液配制的碳酸氫銨溶液中混懸，溶液pH值為7.7-8.0。
特別是，為了獲得最大活性可以將磷脂混合物破裂?？梢圆捎萌魏尾灰鹱冃曰虿划a(chǎn)生磷脂化學修飾的破裂方法，其包括了微流化、擠壓、和聲處理，但不限于此。通常將混合物進行聲處理直至產(chǎn)生光學透明度，只要不使混合物過熱聲處理就可以持續(xù)進行。本文具體例舉了優(yōu)選的聲處理參數(shù)。此處的“光學透明度”是指混合物由不透明變成透明。該變化可以很容易地通過肉眼觀察到，而不需要更多地測定。然而，“透明”可以規(guī)定為混合物在600O.D.(光密度)的條件下吸收度小于0.2AU。
混合物濃度可以制成近50mg/ml。優(yōu)選采用的濃度是10mg/ml。通常，間隔5分鐘進行一次聲處理循環(huán)，即5分鐘的聲處理，隨后5分鐘平衡化作用。然而，該過程可以根據(jù)所處理混合物的體積和聲處理產(chǎn)生熱量的多少而改變。
需要進行聲處理的混合物的濃度和體積、以及聲處理器的輸出功率決定了聲處理所需的總時間。聲處理必須持續(xù)直至混合物變?yōu)橥该?。通常，混合物需?-90分鐘長的聲處理。優(yōu)選的是，聲處理分成數(shù)個持續(xù)5分鐘的階段，共進行6-12次這樣的階段，每個階段間間隔1-5分鐘，以使混合物達到平衡及散熱。水浴溫度不超過約60℃；然而，混合物能夠經(jīng)高壓熱處理但不損失活性。優(yōu)選水浴的溫度不超過37℃。還優(yōu)選經(jīng)聲處理過的混合物在使用前應該進行無菌過濾。
ElirexTM的活性可以通過已知的多種抗細胞程序死亡試驗來測定。這些方法包括除去血清的C3H/10T1/2細胞試驗，該試驗通?？蓞⒁奝CT公開號WO94/25621中的詳細描述，此試驗是優(yōu)選的試驗方法，優(yōu)選方法還包括該參考專利文獻實施例3中所述方法，但不僅僅局限于此。另外，體內(nèi)細胞程序死亡抑制作用可以通過任何已知的方法進行測定。
本發(fā)明還涉及了含有已基本純化ElirexTM的治療用組合物。組合物所需的純度可以通過實驗來測定，所屬技術(shù)領域的技術(shù)人員是已知的。組合物適用于如下所述的多種疾病，并且同時適于人用和獸用。
通常，ElirexTM組合物是可藥用的，這是因為它們在治療劑量范圍內(nèi)具備了低毒性、穩(wěn)定性、及能夠和很多種載體進行混合以滿足多種途徑給藥的性能。ElirexTM可以單獨或與其他有效藥用試劑結(jié)合使用，其中有效藥用劑包括抗生素、創(chuàng)傷愈合劑、抗氧化劑和其他治療劑，但不僅僅局限于此。適宜的抗生素包括，氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素和青霉素，但不只是這些。適宜的創(chuàng)傷愈合劑包括轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-βs)、表皮生長因子(EGFs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)和血小板來源生長因子(PDGFs)，但不局限于此。適宜的抗氧化劑包括維生素C和E，但不局限于此。
組合物含有至少有效治療量的一種ElirexTM，并且可以含有至少一種生理用載體。所用的可生理用載體應該是使用后不會對身體產(chǎn)生副作用，而且能夠使ElirexTM充分溶解以運送有效治療量的化合物。ElirexTM的有效治療量要部分地根據(jù)進藥的方式、需治療的病癥、和本領域普通技術(shù)人員所熟知的其他依據(jù)來判斷。通常，有效治療量是指足夠緩解所治療病癥中的細胞程序死亡、以及顯示出癥狀改善跡象的用量。盡管由于病癥的不同導致有效量范圍較寬，并且該有效量可以根據(jù)實驗來測定，但治序有效量通常是不低于0.0001％重量或1μg/ml。特殊病癥的給藥途徑將在下面進行討論，對于本領域技術(shù)人員而言是易于理解的。
給藥途徑包括局部、透皮、腸胃外、經(jīng)腸胃的、經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡的。局部給藥是通過局部涂敷含有有效治療量ElirexTM的膏霜、凝膠、漂洗劑等來完成的。局部給藥是通過局部施用膏霜、凝膠、漂洗劑等含有效治療量的ElirexTM的物質(zhì)完成的。透皮給藥是通過涂敷膏霜、漂洗劑、凝膠等物質(zhì)，以使ElirexTM能夠透過皮膚進入血流。腸胃外途徑的給藥包括直接注射，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射，但不只局限于此。腸胃內(nèi)途徑給藥包括食入和直腸給藥，但不局限于此。經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡途徑給藥包括經(jīng)口腔或經(jīng)鼻腔的吸入，及直接注射到氣道中，如通過氣管造口術(shù)，但是不局限于這些。
當ElirexTM單獨局部涂敷時，可以根據(jù)需要將它們與可局部藥用或化妝品用載體共同制成混合物來給藥。此處的“局部可藥用載體”是指任何基本無毒的、局部給藥的常規(guī)用載體，載體中的ElirexTM能夠在直接應用于皮膚或粘膜表面時保持其穩(wěn)定性和生物作用。例如，ElirexTM可以以常規(guī)方式溶解在液體中，或在介質(zhì)中分散或乳化以形成液體制劑，或與半固體(凝膠)或固體載體混合以形成糊劑、粉劑、軟膏劑、膏霜、洗劑等等，但不局限于此。
適宜的可局部藥用載體包括水、石油膏(凡士林)、礦脂、礦物油、植物油、動物油、有機和無機蠟，例如微晶、石蠟和地蠟，天然聚合物，例如黃原膠、明膠、纖維素、膠原蛋白、淀粉、或阿拉伯樹膠，合成聚合物，例如在下面將討論的物質(zhì)、醇、多羥基化合物等等。載體可以是水溶性載體組合物，它基本溶于水。這些水溶性的、可局部藥用的載體組合物不僅可以包括一種或多種上述適當?shù)慕M分，還可以包括持續(xù)或緩慢釋放用載體，載體包括含水性、水分散性或水溶性組合物，例如脂質(zhì)體、微綿體、微球或微囊、含水基質(zhì)軟膏、油包水或水包油乳化劑、凝膠或類似物。
本發(fā)明的一個具體方案中，可局部藥用載體包括了長釋或緩釋用載體。載體是任何能夠長釋或緩釋ElirexTM以達到更有效給藥效果的物質(zhì)，應用它們可以達到減少一次或數(shù)次ElirexTM的給藥次數(shù)和/或減少ElirexTM給藥劑量、易于使用、及延長或延緩對皮膚病癥作用的效果。載體在任何油性、脂肪、蠟、或潮濕環(huán)境條件中，都能夠通過擴散或釋放作用將ElirexTM釋放于需治療的患處，這就要根據(jù)載體對ElirexTM的負載水平來決定，以便達到ElirexTM被釋放的效果。這類載體的非局限實例包括天然或合成的脂質(zhì)體、微綿體、微球、或微囊等等。適于在潮濕環(huán)境中持續(xù)或緩慢釋放的載體實例包括明膠、阿拉伯膠、黃原烷聚合物；有ElirexTM負載水平的物質(zhì)有木質(zhì)素聚合物及其類似物；油性、脂肪或蠟質(zhì)環(huán)境包括了熱塑性樹脂或軟質(zhì)熱固性樹脂或高彈體，其中的熱塑性樹脂，例如聚鹵乙烯、聚乙烯酯、聚偏鹵乙烯和鹵代聚烯烴，高彈體例如是brasiliensis、聚二烯、和鹵代天然或合成橡膠；及軟質(zhì)熱固性樹脂，例如聚氨基甲酸乙酯、環(huán)氧樹脂及其類似物。長釋或緩釋載體優(yōu)選脂質(zhì)體、微綿體、微球或凝膠。
本發(fā)明的皮膚病病癥治療方法中，將所用的組合物直接涂敷在需治療的患處。若無特殊需要，局部用組合物將在所需部位維持大約24-48小時以釋放ElirexTM。
如果需要，可以將一種或多種的、在局部藥用或化妝品組合物的常規(guī)用附加成分與載體結(jié)合，例如增濕劑、濕潤劑、矯味劑、緩沖劑、顏料、防腐劑、維生素如A、C和E、乳化劑、分散劑、浸潤劑、氣味調(diào)節(jié)劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑、推進劑、抗微生物劑、防曬劑、酶等等。局部藥物制劑領域的技術(shù)人員能很容易地選擇出適當?shù)奶囟ǜ郊映煞趾退鼈兊挠昧?。適當?shù)母郊映煞值姆窍薅ㄐ詫嵗ǔ趸缁?、十八烷醇、肉豆蔻酸異丙酯、山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、丙二醇、水、十二烷基硫酸堿金屬或堿土金屬鹽、羥苯甲酸甲酯、辛基二甲基-對-氨基苯甲酸(Padimate O)、尿酸、網(wǎng)硬蛋白、粘多糖、羥乙基淀粉(例如，DuPontPentafraction)、透明質(zhì)酸、蘆薈、卵磷脂、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯。聚乙二醇、維生素A或C、生育酚(維生素E)、α-羥基或α酮基的酸如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，或任何在美國專利4,340,586，4,695,590，4,959,353，或5,130,298和5,140,043中公開的局部用成分。
由于需治療的皮膚病病癥是肉眼可見的，局部用載體還可以是局部化妝品用載體。此處的“局部化妝品用載體”表示任何基本無毒的、局部用化妝品的常規(guī)用載體，這些載體中的ElirexTM在直接涂敷在皮膚表面時仍然保持其穩(wěn)定性和生物有效性。適當?shù)幕瘖y用載體是所屬領域技術(shù)人員熟知的，可以包括化妝用的液體、膏霜、油、洗劑、軟膏劑、凝膠、或固體，例如化妝晚霜、粉底霜、曬黑洗劑、防曬劑、手部洗劑、化妝品和化妝品基質(zhì)、面膜等等，但是不局限于此。因此，局部化妝品用載體基本與可藥用載體相似，但常不相同；事實上，對于可藥用載體的早期探討也適于化妝品用載體。組合物可以含有其他化妝品常規(guī)組分，包括香料、雌激素、維生素A、C或E、α-羥基或α-酮基酸，例如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，羊毛脂、凡士林、蘆薈、羥苯甲酸甲酯或丙酯、顏料及其類似物。
組合物中，治療皮膚病病癥或疾病所需的ElirexTM有效量可以根據(jù)下列因素而改變，即皮膚癥狀、皮膚老化程度、磷脂的特定比例或所用磷脂的純度、制劑和所用載體的類型、給藥頻率、被治療個體的整體健康狀況，及類似因素。所屬領域技術(shù)人員可以根據(jù)這些因素和本文內(nèi)容來決定任何特定患者所需的準確用量。優(yōu)選組合物在1天內(nèi)至少給藥兩次但不超過六次，或者，當使用長釋或緩釋劑型時減少給藥次數(shù)。
局部、口服和腸胃外給藥的組合物通常含有占組合物總重量約0.001％-10％重量的ElirexTM，優(yōu)選含有約占組合物0.01％-2％重量的ElirexTM，特別優(yōu)選ElirexTM約占組合物總重量的0.1％-1.5％。
局部用組合物的給藥是將其在需治療皮膚或粘膜的患處涂敷成覆蓋層或膜層。為了簡便，只將涂敷用物質(zhì)擦抹在患處。涂敷是不需要將藥抹入皮膚內(nèi)，形成的膜層或覆蓋層可在皮膚上保持過夜。
本發(fā)明所述組合物適用于透皮給藥，包括但不限于可藥用洗劑、混懸劑、油、膏霜、軟膏劑、漂洗劑、凝膠、以及脂質(zhì)體載體，該脂質(zhì)體載體是混懸于適當賦形劑中的，其中含有有效治療量ElirexTM。這些組合物直接涂敷在皮膚上，或與保護性載體混合，例如透皮制劑(稱為“貼劑”)。適當?shù)母嗨?、軟膏劑等實例，例如可以在Physician’s Desk Refernce中查到。適合的透皮制劑有具體的描述，如美國專利4,818,540(Chien等人)。
本發(fā)明涉及了適于腸胃外給藥的ElirexTM組合物，不只包括可藥用的無菌等滲溶液。這些溶液包括ElirexTM在靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射時所需的生理鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水。
本發(fā)明涉及了適于經(jīng)胃腸給藥的ElirexTM組合物，包括可藥用的、口服給藥的粉劑、丸或液體，及直腸給藥的栓劑，但不局限于此。
本發(fā)明涉及了適于經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡給藥的ElirexTM組合物，包括各種可藥用的、吸入用的氣霧劑，但是不僅是這些。以氣霧劑劑型給藥的具體藥物是五脒，該藥物是通過吸入給予AIDS病患者以預防由卡氏肺囊蟲誘發(fā)的肺炎。
本發(fā)明進一步涉及了適于經(jīng)支氣管和經(jīng)肺泡給予ElirexTM的裝置。該裝置包括但不限于霧化器和汽化器。本發(fā)明還涉及了電子注射和直接注射的裝置。電子注射，或稱離子電滲療法，是一種采用很小的電流使帶電荷的元素、化合物和藥物透過皮膚以使治療藥物轉(zhuǎn)運到局部組織或全身的方法，該方法不對皮膚造成破壞。
本發(fā)明涉及了適于移植前器官儲存的溶液。Chien等人(1993)在“Hibernation Induction Trigger for Organ Preservation”in MedicalIntelligence Unit，R.g.Landes Co.Ausin，TX.對適用的溶液進行了描述。ElirexTM可以用來，例如，代替和改進通常使用的極其不純的大豆制品。
上述組合物是為了說明適于本發(fā)明ElirexTM給藥的組合物，但不局限于此。生產(chǎn)不同種類組合物的方法是所屬領域技術(shù)人員所能夠了解的，在此不詳細描述。
生產(chǎn)適當注射用、局部涂敷用裝置，如霧化器和汽化器，的方法也是所屬領域技術(shù)人員所能夠了解的，在此不詳細描述。
本發(fā)明還提供了與細胞程序死亡相關(guān)的病癥的治療方法，該方法包括給予一定量ElirexTM以有效地抑制細胞程序死亡。在這些方法中需給予有效治療量的、包括上述組合物在內(nèi)的可藥用組合物?！坝行е委熈俊笔侵改軌蜻_到有效作用或所需臨床效果的量。有效治療量可以一次或多次給予。許多與細胞程序死亡相關(guān)的但能夠治療的疾病包括皮膚老化作用、局部缺血后的再灌注作用、免疫抑制、胃腸紊亂癥、心血管紊亂、組織移植排異、創(chuàng)傷愈合、和阿爾茨海默氏病癥，但不局限于此。
與免疫抑制有關(guān)的病癥是由于多種刺激引起的，這些刺激包括病毒，包括但不限于HIV病毒，化療劑、和輻射。這些刺激引發(fā)了許多病癥中的細胞程序死亡，不僅僅包括消化道組織和相關(guān)胃腸性的紊亂。
胃腸紊亂包括但不限于腸內(nèi)膜損傷、嚴重的慢性潰瘍、結(jié)腸炎、輻射誘發(fā)的損傷、化療引發(fā)性損傷、寄生蟲導致的胃腸道紊亂癥、和由任何其他原因造成的腹瀉。許多病毒性和細菌性感染會導致胃腸紊亂；ElirexTM還適合治療這些感染伴隨的副作用。ElirexTM特別適于用來改善化療引發(fā)的胃腸紊亂癥?，F(xiàn)已知道，用氨甲蝶呤和磷脂處理的大鼠與空白對照動物相比，遭受較小的喂食困擾且沒有腹瀉。如下所示，優(yōu)選的ElirexTM實施方案比天然來源的、不純的磷脂混合物，有超過200％的抗細胞程序死亡活性。因此，ElirexTM不僅適用于預防化療誘發(fā)的腹瀉還可以預防惡心。
ElirexTM尤其適于治療動物的各種胃腸疾病，特別是家畜。這些病癥，尤其是腹瀉，造成許多幼仔損失。胃腸疾病的治療優(yōu)選以胃腸方式給藥。對于家畜，有效量的ElirexTM通常是與飼料混合在一起。對于人，可以通過任何所屬領域所熟知的胃腸給藥方法來給予。優(yōu)選口服。
另外，可以將ElirexTM給予免疫缺損患者，尤其是HIV-陽性患者，以達到預防或至少是緩解那些與疾病有關(guān)的T細胞的程序死亡，該細胞程序死亡會導致免疫缺損癥惡化，正如所看到的那樣，病人體內(nèi)會患上惡性膨脹的AIDS。優(yōu)選通過腸胃外方式給予這類患者以ElirexTM，但也可以是透皮或經(jīng)胃腸給藥。
ElirexTM還可以用來治療與再灌注損傷相關(guān)的細胞程序死亡，該再灌注損傷涉及多種疾病，包括但不限于冠狀動脈梗阻、大腦梗塞、脊柱/頭部創(chuàng)傷和伴隨性的嚴重麻痹、其他損害造成的再灌注損傷，例如凍傷，以及任何以往認為可以用超氧化物歧化酶(SOD)治療的病癥。氧自由基在心臟疾病中的作用的綜述可以參見Singal(1988)“Oxygen Radicals in thePathophysiology of Heart Disease”Kluwer Academic Publishers，MA，USA.。
心肌梗塞和腦梗塞通常是由突發(fā)性動脈或靜脈血供應不足造成的，這種供血不足是由氣栓、血栓、或壓力引起并造成微小區(qū)域的壞死；心臟、腦、脾、腎、腸、肺和睪丸都容易受到影響。血液再灌注造成梗塞，而細胞程序死亡則出現(xiàn)在梗塞區(qū)域的周圍組織中；因此，須在剛形成梗塞在再灌注過程中或梗塞形成后很短時間內(nèi)就給予ElirexTM，這樣才能達到治療效果。
因此，本發(fā)明涉及與再灌注相關(guān)的細胞程序死亡的治療方法，該方法包括給予需要這種治療的患者以有效治療量ElirexTM。
本發(fā)明進一步涉及減輕與心肌和大腦梗塞有關(guān)的細胞程序死亡和再灌注損傷的方法，患者在梗塞時會有心臟病發(fā)作和心臟搏動的危險，該方法是給予需要這種治療的患者以有效治療量的ElirexTM。
優(yōu)選腸胃外給予本發(fā)明所述組合物來治療再灌注損傷。任何其他適合的方法也可使用，例如心肌梗塞時直心臟注射。這種注射的裝置是所屬領域技術(shù)人員熟知的，例如，Aboject心肌注射器。
本發(fā)明還涉及了在哺乳動物器官、組織、和細胞培養(yǎng)與保藏過程中抑制和預防細胞發(fā)生程序死亡的方法。該方法是將有效量的ElirexTM加入到任何種的介質(zhì)或溶液中，該介質(zhì)和溶液是所屬領域中常用于培養(yǎng)或保藏哺乳動物器官、組織、和細胞的。
本發(fā)明又涉及了技術(shù)人員所熟知的、用于培養(yǎng)和保藏哺乳動物器官、組織和細胞的介質(zhì)和溶液，該介質(zhì)和溶液中含有一定量的ElirexTM，以有效地抑制或預防培養(yǎng)細胞發(fā)生的程序死亡。
本發(fā)明上述方面涉及了哺乳動物細胞培養(yǎng)用介質(zhì)，該介質(zhì)包括至少一種有效量的ElirexTM，及應用該介質(zhì)來抑制或預防哺乳動物細胞培養(yǎng)中的細胞程序死亡。有效量是指能夠降低細胞程序死亡速率的量。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，ElirexTM能夠抑制或預防細胞在受到輕度損傷情況下發(fā)生的細胞程序死亡，這種損傷通常會誘發(fā)細胞程序死亡。這種損傷包括但不限于低度輻射、冷凍細胞貯存物的解凍、溫度、pH、滲透性、或培養(yǎng)介質(zhì)離子濃度的快速改變、長期在不適溫度、pH、滲透性、或培養(yǎng)介質(zhì)離子濃度下暴露、與細胞毒素接觸、原始細胞培養(yǎng)制備中細胞從完整組織解離下來、無血清生長(或無血清介質(zhì)中的生長)。
本發(fā)明涉及了含有組織培養(yǎng)介質(zhì)和有效量ElirexTM的組合物。將ElirexTM作為抗細胞程序死亡介質(zhì)添加劑加入到無血清介質(zhì)中，無血清介質(zhì)包括但不限于AIM V介質(zhì)、Neuman和Tytell’s無血清介質(zhì)、Trowell’s T8介質(zhì)、Waymouth’s MB752/1和705/1介質(zhì)、和Williams’介質(zhì)E。除了無血清介質(zhì)以外，還有其他適當?shù)牟溉閯游锛毎囵B(yǎng)介質(zhì)，該培養(yǎng)介質(zhì)也能夠與作為抗細胞程序死亡介質(zhì)添加劑的ElirexTM混合，包括Eagel基礎培養(yǎng)基、Fisher’s介質(zhì)、McCoy’s介質(zhì)、介質(zhì)199、RPMI介質(zhì)1630和1640、以F-10&F-12營養(yǎng)混合物為基礎的介質(zhì)、Leibovitz’sL-15介質(zhì)、Glasgow極限必需介質(zhì)、和Dulbecco改進的Eagle介質(zhì)，但是不僅限于此?？珊蠩lirexTM的哺乳動物細胞培養(yǎng)介質(zhì)還可以進一步是任何所屬領域技術(shù)人員已知的介質(zhì)添加劑，包括蔗糖、維生素、激素、金屬蛋白質(zhì)、抗生素、抗真菌素、生長因子、脂蛋白和血清，但不限于此。
本發(fā)明還涉及哺乳動物移植前用的器官保藏溶液，以及這種溶液應用于抑制或預防哺乳動物器官在移植前的手術(shù)摘除和外科處理中的細胞程序死亡，其中該溶液包括有效量的ElirexTM。就所有情況而言，抑制和預防細胞程序死亡所需的ElirexTM濃度可以通過所屬領域技術(shù)人員按照例如本發(fā)明下列實施例所描述的方法，以及本領域其他已知的方法進行實驗性測定。
ElirexTM被認為可以局部涂敷在皮膚上以治療多種皮膚病病癥。這些病癥包括但不限于衰老造成的皺縮或松弛和/或失去光澤或鱗皮病。從而本發(fā)明涉及了皮膚病治療方法。另外，禿發(fā)是由毛囊細胞程序死亡造成的。因此，適合采用ElirexTM的皮膚局部治療方式來防止連續(xù)脫發(fā)。Stenn等人(1994)J.Invest.Dermatol.103107-111。
如上所述，優(yōu)選采用含有效量ElirexTM的組合物的局部涂敷方式來治療這些病癥。有效量的ElirexTM是指可以改善或減輕皮膚病癥狀的用量。尤其是，能夠達到消除皮膚病病癥或恢復正常皮膚功能的治療效果；然而，本發(fā)明也包括所有對疾病癥狀的改善或緩解。
下來的實施例是用來說明本發(fā)明，但不局限于此。實施例1最佳重組混合物的合成將從市場購買到的純化大豆磷脂PA、PI、LPA、LPI、LPC(例如，得自AvantiPolar Lipids，Inc.)懸浮在pH為8.0且含有154mM NaCl的50mM碳酸氫銨溶液中，或含有游離二價陽離子的pH在5-8范圍內(nèi)的緩沖水溶液中?？梢允褂每倽舛却笥?0mg/ml的磷脂溶液，但需經(jīng)聲處理后達到透明。所用磷脂的最高總濃度大約是50mg/ml。
通常，磷脂混合物混懸在緩沖液中，混合物放置在一次性的硼硅酸鹽玻璃杯中，優(yōu)選使用2-3ml的16×100mm的試管或1.2ml的13×100mm試管，或1ml的12×75mm試管。然后將混合的磷脂進行聲處理。優(yōu)選采用小型浴式聲處理器，例如帶有大小為9×19cm橢圓型浴槽的Branson200型聲處理器，聲處理頻率是40kHz并且耗電率是24W。水浴溫度在21-40℃范圍內(nèi)。優(yōu)選在25-37℃之間。水位高度調(diào)至接近于試管內(nèi)磷脂混合物的高度。另外，還可以采用探針式聲處理器(Fisher Scientific SonicDismenbrator model 550)進行處理，但是要防止混合物過熱。
混合物進行聲處理的時間是在3-90分鐘內(nèi)，該聲處理過程中，先進行5分鐘聲處理，隨后放置5分鐘以使混合物達到平衡，將聲處理過程和平衡過程交替進行直至混合物變成透明溶液，并且該混合物能很容易地通過濾器而被吸入到孔徑是0.22μm的5ml注射器內(nèi)。
ElirexTM在不同溫度下的穩(wěn)定性如附圖1所示。ElirexTM是在4℃、室溫、和65℃下儲存一周。所得結(jié)果表明，ElirexTM在65℃條件下儲存會造成活性損失，但在4℃或室溫下沒有發(fā)生顯著的活性損失。
各磷脂組分的最佳比例可以通過將各純化磷脂以不同比例混合、并且每次改變一種磷脂組分的方法來測定。實施例2中對各種混合物抗細胞程序死亡活性進行了分析。當確定最佳相對配比后，可以通過改變最有效磷脂組分的比例來發(fā)現(xiàn)最佳絕對活性。下表表示最終測試的配比。
所得結(jié)果如附圖5-6所示。LPA的濃度隨鏈長度進行改變，以測定這些參數(shù)對活性的作用。ElirexTM在不向溫度下的穩(wěn)定性如附圖1所示。實施例2采用C3H/10T1/2細胞進行的細胞程序死亡分析試驗為了測定ElirexTM的抗細胞程序死亡活性，采用下面所述試驗。PCT公開號WO94/25621和WO95/15173中描述了細胞分析試驗。簡單地說，將C3H/10T1/2克隆8細胞在50-58％融合的條件下和呈指數(shù)生長期下進行分析試驗，該細胞指數(shù)生長期是隨機分布的細胞周期位置，沒有處于G0期和靜止狀態(tài)的細胞。在試驗開始前，將2000個細胞/ml(5ml，在60mm培養(yǎng)平板中)育種5天，以使細胞呈指數(shù)生長狀態(tài)。當T＝0時，將作為細胞程序死亡刺激因素的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無血清介質(zhì)中，將種子提取物加入其中?？瞻讓φ瘴锖?0-7和5×10-1M的12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，以保證細胞培養(yǎng)的反應性。將ElirexTM樣品加入無血清介質(zhì)中，并且當加入到培養(yǎng)基之前將其無菌過濾。分析試驗以一式三份或四份的平行試驗進行。細胞應答試驗是在含有或不含有ElirexTM的無血清物中在18-28小時間進行。在各自含有不同細胞數(shù)量的細胞培養(yǎng)平板中進行兩種分析試驗。
1.將所有非粘附性或松散粘附細胞從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移出來并采用適當?shù)募夹g(shù)來計數(shù)，通常是使用電子顆粒計數(shù)器。這些是程序死亡性細胞，即無血清釋放細胞(SDR)，是在無血清介質(zhì)培養(yǎng)的作用中釋放出來的。通過紫外結(jié)構(gòu)分析和DNA片段分析法看出，這些釋放細胞中的近95％是程序死亡細胞。
2.將保留的粘附性細胞與緩沖液接觸，常采用的緩沖液是平衡鹽溶液，例如pH為7.3、不含有鈣和鎂鹽的、含有0.05％胰蛋白酶和0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)的Hanks平衡鹽溶液。在室溫或37℃條件下將各培養(yǎng)物溫育，該溫育是在振搖平臺上進行，這樣可以保證胰蛋白酶試劑能均勻分布在培養(yǎng)物表面。當達到標準時間階段后，通常是10分鐘，將釋放細胞從各培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移出來，并且按照上述的方法測定，通常采用電子顆粒計數(shù)法。該ADH細胞計數(shù)包括了胰蛋白酶耐受性細胞和胰蛋白酶敏感細胞，如PCT WO94/25621所述。
抗細胞程序死亡活性是以計算出來的材料濃度(μg/ml的介質(zhì))來表示，該濃度是指能夠使50％經(jīng)無血清處理釋放的細胞存活的濃度。
由程序死亡細胞試驗中得到的結(jié)果如附圖7-8所示。在附圖中，發(fā)生程序死亡的細胞(SDR)和粘附性細胞(ADH)的百分率是分別表示的。附圖所示數(shù)據(jù)證明，ElirexTM組合物有效地減少了融合細胞的程序死亡，該結(jié)果是相比于Eagle基礎培養(yǎng)基(BME)的無血清空白對照而言的。實施例3pH和鹽濃度對ElirexTM的抗細胞程序死亡活性的影響在不同的pH和鹽濃度條件下測定ElirexTM組合物的抗細胞程序死亡活性。
ElirexTM活性測定是按照實施例1中所述，將磷脂重新混懸在pH為8.0的碳酸氫銨、或pH為6.5的磷酸鈉、或pH為6.5的HEPES、或pH為5.0的醋酸鈉溶液中，上述溶液的濃度都是50mM并且含有154mM(等滲)氯化鈉。附圖1表示所得的結(jié)果，其中pH為8時活性最高。
為了測定溶液所含鹽濃度對活性的影響，將pH.為8的溶液在氯化鈉濃度分別為0、100、500和1000mM的條件下進行測定。為了處理細胞，所有樣品都先制備成濃溶液，然后用BME稀釋。最佳鹽濃度是在100-200mM之間，但結(jié)果并沒用圖表示。
還做了不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性試驗。所有溶液在4、37和69℃下儲存一周然后測定它們的活性。所得結(jié)果在附圖1中表示。
最佳的溶液是含有105mM氯化鈉的50mM溶液碳酸氫氨溶液，該溶液pH值為8，并且儲存在4℃條件下。
雖然本發(fā)明通過一些具體的說明和實施例來使本發(fā)明發(fā)明目的易于理解，但很顯然地是，所屬領域的技術(shù)人員一定能夠在實際工作中作出進一步的改進和修飾。因此，本發(fā)明的說明和實施例不能作為本發(fā)明保護范圍的限定，本發(fā)明將在權(quán)利要求書中另有規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種具有抗細胞程序死亡活性的組合物，該組合物包括(a)磷脂酸(PA)；(b)磷脂酰肌醇(PI)；(c)溶血性磷脂酸(LPA)(d)溶血性磷脂酰肌醇(LPI)；和(e)溶血性磷脂酰膽堿(LPC)；其中各磷脂基本上是純的磷脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，各磷脂的含量比例是在約分別0∶5∶2∶0∶0-20∶20∶16∶4∶8的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中各磷脂的含量比例是在約2∶8∶6∶2∶2-15∶15∶10∶4∶8的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中各磷脂含量比例是在大約4∶16∶12∶4∶4-7.5∶7.5∶5∶2∶4的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中各磷脂含量比例約是分別10∶10∶8∶2∶4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中的磷脂是來源于植物、動物或經(jīng)合成得到，但其中LPA是非動物性來源的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，動物來源的磷脂是從肝臟中提取的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物已經(jīng)聲處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中，進行的聲處理直至使組合物呈透明狀。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中，聲處理所持續(xù)的時間大約是3-90分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中聲處理過程是將聲處理過程和平衡過程交替進行，各過程分別持續(xù)5分鐘。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中，聲處理時使組合物溫度不得高于60℃。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包括可生理用緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中的緩沖液pH值約在5.5-8.0之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中的緩沖液的pH值是約8.0。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所含磷脂的總濃度大約為10mg/ml。
17.一種制備具有抗細胞程序死亡活性組合物的方法，該方法包括的步驟是(a)將一定量的下列物質(zhì)，以能夠產(chǎn)生抗細胞程序死亡活性的比例混合，并且溶于可生理用的緩沖液中，這些物質(zhì)是(i)磷脂酸(PA)；(ii)磷脂酰肌醇(PI)；(iii)溶血性磷脂酸(LPA)(iv)溶血性磷脂酰肌醇(LPI)；和(v)溶血性磷脂酰膽堿(LPC)。(b)將磷脂/緩沖液混合物進行聲處理。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中磷脂可以是來自植物、動物或合成來源的，但其中LPA是非動物來源的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中動物來源的磷脂是從肝臟提取的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所含磷脂的總濃度大約為10mg/ml。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，持續(xù)進行聲處理直至磷脂組合物呈透明狀。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中聲處理所持續(xù)的時間大約是3-90分鐘。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中的聲處理是將聲處理過程和平衡過程交替進行，各過程分別持續(xù)5分鐘。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中聲處理時組合物溫度不得高于60℃。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中緩沖液的pH值是約8.0。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，緩沖液是選自含碳酸氫鹽的一系列溶液。
27.根據(jù)權(quán)利要求1、7、19或21所述方法制得的組合物。
28.一種細胞程序死亡的治療方法，包括給予需要這種治療的患者以有效治療量的可藥用組合物，該可藥用組合物含有權(quán)利要求27所述的組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中患者患有胃腸性紊亂。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中，胃腸性紊亂是由刺激因素引起，這些刺激是選自人體免疫缺陷病毒、化療劑和輻射和那些有關(guān)的傳染性疾病。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，胃腸性紊亂是由于炎性腸疾病。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中的傳染性疾病選自由致腹瀉性生物引發(fā)的一系列疾病。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該治療能夠減輕與免疫抑制病毒、化療劑、或輻射和免疫抑制藥物有關(guān)的病癥。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中的病毒是人體免疫缺陷病毒。
35.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中患者患有與局部缺血和/或在局部缺血后再灌注有關(guān)的細胞程序死亡疾病。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中的再灌注與冠狀動脈梗阻；腦梗塞；脊柱/頭部創(chuàng)傷和嚴重的并發(fā)性麻痹和凍傷有關(guān)。
37.一種組合物，該組合物含有組織培養(yǎng)介質(zhì)和有效量的、如權(quán)利要求27所述的組合物。
38.一種預防培養(yǎng)細胞中發(fā)生細胞程序死亡的方法，該方法包括用權(quán)利要求27所述的組合物處理細胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中的細胞是哺乳動物細胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中細胞是人體細胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中的細胞是昆蟲細胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中的細胞來源于組織或器官的某部分。
43.一種器官保藏的方法，該方法包括在儲存器官的溶液內(nèi)加入有效量的、如權(quán)利要求27所述的組合物。
44.一種器官保藏的方法，該方法包括給予受體動物至少一個靜脈內(nèi)型藥物團，該靜脈內(nèi)藥物含有有效量的如權(quán)利要求27所述組合物。
45.一種治療皮膚病的方法，該皮膚病與細胞程序死亡有關(guān)，該治療方法包括采用局部給予方式，給予需要這種治療的患者以有效治療量的可藥用組合物，該組合物包括了權(quán)利要求27所述的組合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中的皮膚病是指皮膚的皺縮、松弛、鱗皮病、禿發(fā)或脫發(fā)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中權(quán)利要求27所述組合物是膏霜劑或軟膏劑或凝膠劑。
48.一種治療創(chuàng)傷的方法，該方法包括給予有效量的含有權(quán)利要求27所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種具有抗細胞程序死亡活性的組合物,該組合物包括磷脂酸、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰肌醇和溶血性磷脂酰膽堿。
文檔編號A61K41/00GK1200036SQ96197739
公開日1998年11月25日 申請日期1996年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月14日
發(fā)明者I·C·巴特斯特, M·W·弗爾, J·G·古達德, L·D·托美爾 申請人:Lxr生物技術(shù)有限公司