專利名稱：：雞白細胞介素－15及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分離的編碼鳥類白細胞介素-15的基因及純化的白細胞介素-15多肽。
背景技術：
：在發(fā)展中國家生產(chǎn)的大多數(shù)用于消費及產(chǎn)蛋的雞(每年至少100億)要進行疫苗接種以保護它們免患Marek氏病。所有的產(chǎn)蛋雞及育種雞還要用新城疫病毒、傳染性囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽痘病毒及球蟲的疫苗進行接種。為獲得最理想的保護，在孵卵時或孵卵后進行Marek氏疫苗接種。有效的孵化前及孵化時接種發(fā)展的一個障礙是胚胎的和剛孵化的鳥的免疫系統(tǒng)不是發(fā)育完全的且不能對免疫原達到孵化后2-3周那樣的免疫反應。這樣，本領域內(nèi)就需要能增強孵化前及孵化后鳥類疫苗效果的制劑及組合物。白細胞介素-2和白細胞介素-15是刺激哺乳動物T細胞活性及增殖的相關的細胞因子。雖然IL-2和IL-15都與IL-2受體的β鏈和γ鏈相互作用，且可能共有一些三級結(jié)構(gòu)的成分，這兩種多肽不是同源的且代表不同的基因產(chǎn)物。不同哺乳動物來源的編碼IL-15的基因享有高度的同源性。例如，人和猿猴的IL-15有97％氨基酸同源。相反，本發(fā)明的主題，雞的IL-15與哺乳動物的IL-15僅有25％氨基酸一致。雞IL-15的另一個區(qū)別特性是它(而不是哺乳動物形式)產(chǎn)生于促分裂原激活的脾細胞。因此，雞IL-15及其具有T細胞刺激活性的發(fā)現(xiàn)提供了一種用于增強鳥類疫苗接種的新試劑。不希望受理論的束縛，哺乳動物IL-15刺激骨骼肌發(fā)育的生物活性提示鳥類的IL-15在刺激鳥類生長中也有作用。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離并純化的編碼鳥白細胞介素-15(IL-15)的DNA及含有IL-15DNA的載體的克隆和表達，以及用編碼IL-15的載體轉(zhuǎn)化的細胞。IL-15的來源鳥類包括但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉及野雞。本發(fā)明還提供了分離并純化的鳥IL-15多肽，這種天然分泌的或成熟的形式有約14kDa的分子量、等電點約6.57、凈電荷-2、親水性指數(shù)0.278，并具有刺激促分裂原激活的鳥類T細胞及促進其它類型細胞生長的活性。本發(fā)明的IL-15可從天然的或重組的來源中獲得。本發(fā)明還包括序列保守及功能保守的鳥IL-15DNA及IL-15多肽的變異體，包括，如一段有生物活性的IL-15序列或與一段純化序列同框融合的亞片段。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于增強禽類對一種免疫原的免疫應答的方法，這是通過在給予增強此免疫應答有效量的鳥IL-15之前、之后或同時給予這種免疫原來獲得的。還有一方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導禽類對一種免疫原的免疫應答的疫苗，包括這種免疫原及增強免疫應答有效量的鳥IL-15。此免疫原可來源于如，Marek氏病病毒、新城疫病毒、傳染性囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒等鳥類病原體。附圖的簡單描述圖1圖解說明一段包括編碼雞IL-15的747ntcDNA的845nt的序列。圖2圖解說明一段與雞IL-15前體多肽一致的143氨基酸序列。本發(fā)明的詳細描述本說明中引用的所有的專利申請、專利及參考文獻都作為整體引入本文。如遇沖突，本說明書(包括定義)將控制。本發(fā)明包括來自鳥類的IL-15。本發(fā)明提供了分離并純化的編碼鳥類IL-15的核酸以及從天然或重組來源提純的IL-15多肽。按照本發(fā)明生產(chǎn)的鳥類IL-15可用于商業(yè)化禽類養(yǎng)殖以促進其生長并增強鳥類疫苗的效力。核酸、載體、轉(zhuǎn)化圖1顯示了編碼雞IL-15的cDNA序列(序列號1)，圖2顯示了預期的雞IL-15的氨基酸序列(序列號2)。將這種鳥類多肽稱作IL-15是基于它的部分氨基酸序列與哺乳動物IL-15同源及這種多肽具有刺激促分裂原激活的T細胞的能力(見下面)。此外，不希望被理論束縛，鳥類IL-15多肽還預期表現(xiàn)出下面的一種或多種生物活性激活NK細胞(自然殺傷細胞)、刺激B細胞成熟、肥大細胞的增殖及與IL-2受體的β及γ亞單位相互作用。由于遺傳密碼的簡單性(即多個密碼子編碼某個氨基酸)，除了圖1所示的以外的DNA序列也可編碼圖2中所示的雞IL-15氨基酸序列。這些其它的DNA包括那些含有“保守序列”的變體，在這些變體中給定的密碼子中的一個或多個核苷酸的改變不會導致那個位置編碼氨基酸的改變。此外，常能改變多肽中的一個給定的氨基酸殘基而不改變這種天然多肽的整體構(gòu)象和功能。這種“功能保守”的變體包括但不限于，用一個具有相似理化性質(zhì)，例如，酸性的、堿性的、疏水的等等氨基酸代替一個氨基酸(如，用精氨酸代替賴氨酸，用谷氨酸代替天冬氨酸，或用丙氨酸代替甘氨酸)。此外，可在不破壞此分子的生物活性的條件下，增加或刪除氨基酸序列。例如，可在氨基末端或羧基末端加上一段氨基酸序列以作為純化標記(即以便允許蛋白質(zhì)的一步純化，之后可將它們用化學的或酶的方法去除)?；蛘?，此附加的序列可賦予一個附加的細胞表面結(jié)合位點或改變IL-15的靶細胞特異性。本發(fā)明范圍之內(nèi)的這種雞IL-15cDNA是圖1中的那些、序列保守性變異DNA、編碼功能保守的變異多肽的DNA序列及其組合。本發(fā)明包括鳥類IL-15的片段，不論單獨的，還是與其它序列或成分組合，它表現(xiàn)出一種有用程度的生物活性。如下面所解釋的，在本領域的普通技能之內(nèi)，能夠可預期地操作IL-15序列并證實一個給定的IL-15變異體是否對一個給定的應用具有合適的穩(wěn)定性及生物活性。這可能通過在一個重組系統(tǒng)中表達和純化這種變異IL-15多肽，測定它的T細胞刺激活性和/或在細胞培養(yǎng)及動物中的促進生長活性，然后在應用中檢驗的過程來達到。本發(fā)明還包括來源于包括但不限于鴨子、火雞、野雞、鵪鶉及鵝的其它鳥類的IL-15DNA(及多肽)。通過篩選cDNA或基因組文庫以鑒定與含有圖1序列的全部或部分的探針雜交的克隆，容易確定圖1所示的雞序列的鳥IL-15同系物。或者，可利用識別雞IL-15的抗體來篩選表達文庫。不希望被理論束縛，預期來自其它鳥類的IL-15將與雞IL-15基因享有至少約70％的同源性。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有編碼IL-15雞同系物的DNA，它被定義為編碼與雞IL-15享有至少大約25％氨基酸一致性的多肽的DNA。總的來說，本發(fā)明的核酸操作應用本領域眾所周知的方法進行，象那些公開的，例如《分子克隆，實驗室手冊》(MolecularCloning，ALaboratoryManual)(第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編，ColdSpringHarbor)或《分子生物學現(xiàn)行方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Aufubel，Brent，Kingston，More，F(xiàn)eidman，Smith及Stuhl編。GreenePubl.Assoc.，Wiley-Interscience，NY，NY，1992)。本發(fā)明包括cDNA及RNA序列及正義和反義序列。本發(fā)明還包括基因組鳥IL-15多肽DNA序列及側(cè)翼序列，包括但不限于調(diào)節(jié)序列。編碼鳥IL-15多肽的核酸序列還可與異源序列聯(lián)系，包括啟動子、增強子、效應元件、信號序列、多腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5’及3’非編碼區(qū)等等?？刹僮鞯嘏c鳥IL-多肽DNA序列相聯(lián)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包括但不限于那些具有引導源于原核細胞、真核細胞、原核細胞的病毒、真核細胞的病毒及其任意組合的基因的表達的能力的元件。其它有用的異源序列本領域中的技術人員都知道。本發(fā)明中的核酸能用本領域技術人員所知的方法進行修改以改變它們的穩(wěn)定性、溶解度、結(jié)合親和力及特異性。例如，能選擇性地將序列甲基化。本發(fā)明中的核酸序列還可用能直接或間接地提供一個可檢測信號的標記進行修飾。典型的標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等等。本發(fā)明還提供了包括編碼鳥IL-15多肽的核酸的載體。這樣的載體包括，例如用于在一系列真核及原核宿主中表達的質(zhì)核載體，優(yōu)選地，載體還包括一個可操作地聯(lián)接在鳥IL-15多肽編碼部分的啟動子。這個被編碼的鳥IL-15多肽可通過利用任何這里解釋的合適的載體及宿主細胞或其它的本領域技術人員所知的方法進行表達。載體常常包括一個或多個用于克隆或表達的復制系統(tǒng)，一個或多個用于在宿主中篩選的標志例如象抗生素抗性及一個或多個表達盒。插入的編碼序列可以是合成的、從天然來源中分離的、以雜交方式制備的等等。編碼序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的連接可通過本領域技術人員所知的方法獲得，合適的宿主細胞可利用任何包括電穿孔、氯化鈣或脂質(zhì)體介導的DNA滲入、真菌感染、微注射、微粒轟擊等合適方法進行轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)染/感染。用于實施本發(fā)明的合適的載體包括但不限于YEp352、pcDNAI(InVitrogen，SanDiego，CA)，pRc/CMV(InVitrogen)及pSFV1(GIBCO/BRL，Gaithrsburg，MD)。用于本發(fā)明中的一個優(yōu)選的載體是pSFV1。合適的宿主細胞包括大腸桿菌、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、GH4Cl細胞、BHK-21細胞及兩棲動物黑色素細胞。BHK-21細胞是用于實施本發(fā)明的一種優(yōu)選的宿主細胞系。還可通過重組事件將編碼鳥類IL-15多肽的核酸引入到細胞內(nèi)。例如，可將這樣一種序列微注射到細胞中，在編碼此多肽的內(nèi)源基因、其類似物或假基因或與編碼鳥IL-15多肽基因基本相同的序列的位點上進行有效的同源重組。還可應用其它重組方法如非同源重組以及利用同源重組將內(nèi)源基因刪除，特別是在多潛能細胞中。IL-15多肽雞IL-15基因(圖1中顯示的cDNA)編碼一段143氨基酸的多肽(圖2)。不希望被理論束縛，通過與猿猴IL-15對比以及利用已被接受的方法來預測信號肽酶切割位點(VonHeijne《核酸研究》(Nuc.AcidsRes.)144683，1986)，可預期一段氨基端的約22氨基酸的引導序列(分泌信號肽)從初級翻譯產(chǎn)物上切割下來以產(chǎn)生成熟的IL-15。這種推測的121氨基酸的成熟序列進一步的特征為預計13971道爾頓的分子量，等電點6.57；4個半胱氨酸殘基(在圖2所示的前體IL-15的氨基酸號63，70，116及119處)與共存于人、鼠及猴中的被認為是參與分子間的二硫健的四個半胱氨基酸一致；還有一個與人IL-15中相似位點一致的保守的N-聯(lián)接的糖基化位點(在圖2所示序列的天氨酰胺110處)。從天然或重組的來源中對IL-5的純化可通過本領域內(nèi)熟知的方法獲得，包括但不限于離子交換層析，C4柱上的反相層析，凝膠過濾，等電聚焦，親和層析，免疫親和層析等等。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，按如下方法獲得大量生物活性IL-15，可通過在pSFV1復制子(GIBCO/BRL)中構(gòu)建一個含有IL-15編碼區(qū)的重組DNA序列，其中IL-15編碼區(qū)與編碼6C-末端組氨酸殘基的序列同框架融合。應用本領域中技術人員所熟知的技術合成此質(zhì)粒編碼的mRNA并通過電穿孔技術將其引入到BHK-21細胞中，這種細胞合成并分泌成熟的糖基化的含有6-C末端組氨酸的IL-15多肽。這種修飾過的IL-15多肽可通過用組氨酸結(jié)合樹脂(His-bind，Novagen，Madison，WI)的親和層析容易地從細胞上清中純化。從任何來源分離出的鳥IL-15多肽都可以用本領域中熟悉的方法進行修飾，例如，鳥IL-15可被磷酸化或去磷酸化，糖基化或去糖基化等等。改變鳥IL-15溶解度、穩(wěn)定性、及結(jié)合特異性和親和力的修飾特別有用。抗IL-15抗體本發(fā)明包括對上述鳥IL-15多肽特異的抗體，這些抗體可以是多克隆的或單克隆的，并且可以區(qū)分來自不同種類的鳥IL-15，鑒別功能區(qū)域，等等。利用Harlow和Lane《抗體，實驗室操作手冊》((Antibodies，ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory，1988)及這里引用的其他參考文獻中公開的方法及成分，以及本領域中所知的免疫學及雜交瘤技術來方便地制備這些抗體。用來自天然的或合成的鳥IL-15肽來誘導一種鳥IL-15特異的免疫應答的時候，可將這種多肽方便地連接到一種如KLH的合適載體上，并在一種合適的如弗氏佐劑中給藥。優(yōu)選地，基本按照Tam的方法(1988，《美國國家科學院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，855409-5413)將所選的肽偶聯(lián)到一種賴氨酸核心載體上。這樣產(chǎn)生的抗體可改造成一價的形式，如Fab，F(xiàn)AB’或FV。還可用所知的方法制備抗獨特型抗體，特別是內(nèi)部的影像抗獨特型抗體。在一種具體實施方案中，純化的鳥IL-15被用于免疫小鼠，之后取出它們的脾臟，按照本領域中的標準技術將脾細胞與骨髓瘤細胞雜交以獲得分泌抗體細胞的克隆。針對下述功能對由這種細胞分泌的單克隆抗體利用體外檢測進行篩選與鳥IL-15結(jié)合、抑制IL-15的受體結(jié)合活性及抑制IL-15的T細胞刺激活性。利用如ELISA、RIA等免疫測定法，抗鳥IL-15抗體可用于鳥類IL-15的鑒定及定量?？锅BIL-15抗體還可用于免疫消耗鳥類IL-15的提取液。此外，這些抗體還可用于鑒定、分離及純化不同來源的鳥類IL-15，并進行亞細胞及組織化學的定位研究。應用按本發(fā)明生產(chǎn)的鳥類IL-15能有益地用于同源的或異源的鳥類中，例如，刺激激活的T細胞(Grabstein等，《科學》(Science)，264965，1994)及B細胞(Armitage等，《免疫學雜志》(J.Immunol.，154483，1995)和/或促進比如象肌肉細胞的非免疫細胞的生長(Quinn等，內(nèi)分泌學(Endocrinol.)1363669，1995)。疫苗本發(fā)明包括用于增強鳥類免疫應答效力的方法及組合物。在這個具體實施方案中，鳥類IL-15與一種期望對其誘出免疫應答的免疫原聯(lián)合使用。例如，在鳥類疫苗諸如那些抗Marek氏病、新城疫病毒及其他如傳染性囊病病毒和傳染性支氣管炎病毒病原體的疫苗中，期望在疫苗中包含禽類IL-15以增加免疫應答的數(shù)量和質(zhì)量。為達到這個目標，上面描述的純化于天然或重組來源的IL-15在疫苗配制品中的濃度范圍為每只雞每劑疫苗約0.01μg～1.0μg。IL-15可與一種活疫苗(即復制性)或一種非復制性疫苗聯(lián)合使用。復制性疫苗的例子不限于包括天然的或重組的病毒或細菌如修飾的火雞皰疹病毒或修飾的禽痘病毒的那些。非復制性疫苗的例子不限于包括殺滅的或滅活的病毒或其他微生物，或者是粗制或純化的來自天然的、重組的或合成的原料的抗原的那些，諸如球蟲疫苗。禽疫苗的商業(yè)來源包括但不限于RhoneMerieuxLaboratoire-IFFA(里昂，法國)；IntervetInternationalBV(Bonmeer，荷蘭)；MallinckrodtVeterinary；SolvayAnimalHealth(MendotaHeights，MN)；Hoechst-Roussel(Knoxville，TN)及NipponZeonCo，Ltd.(Kawasaki-Kiu，日本)。在一個具體實施方案中，將編碼IL-15的基因結(jié)合到一種重組病毒中，然后將它配制成一種活疫苗。將IL-15基因結(jié)合到這種病毒中以便用一種合適的啟動子控制它的表達。這種疫苗的使用使得生物活性的IL-15的表達在時間上及空間上與期望的免疫應答相近，從而增強疫苗的功效。IL-15可在孵化前及孵化后作為疫苗制劑的一部分給予鳥。優(yōu)選在孵化前，利用本領域內(nèi)已知的方法，例如美國專利號5,034,513及5,028,421所描述的那些。促進生長本發(fā)明提供了用于醫(yī)學和/或商業(yè)目的的增強鳥類生長的方法和組合物。在本具體實施方案中，利用任何合適的給藥方式給予鳥IL-15。用于促進生長，IL-15的給藥量為約0.25μg/kg/天到約25μg/kg/天。IL-15的量能通過本領域內(nèi)熟知的常規(guī)實驗確定，如通過建立一個劑量和頻率的矩陣并與一組此矩陣中的每個點相對的實驗單位或主體相比較。按照本發(fā)明，天然或重組的禽IL-15可用一種生理可接受的載體配制，比如象磷酸鹽緩沖鹽水或去離子水。此配制品還可含有賦形劑，包括本領域所熟知的潤滑劑、增塑劑、著色劑、吸附增強劑、殺細菌劑等等。本發(fā)明中的IL-15多肽可通過任何有效的手段進行給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下的、肌肉內(nèi)、跨粘膜、局部的或口腔途徑。例如，對于皮下給藥方式，劑型可由滅菌生理鹽水中的IL-15組成。對于口腔給藥方式，帶有或不帶有賦形劑的IL-15可包裹在微小的或大的(如)脂質(zhì)體和微球體中。還可利用皮膜片(小塊)或其它緩慢釋放的劑型。下面的實施例用于進一步闡述本發(fā)明而不限制它的范圍。實施例1雞IL-15基因的克隆利用來自伴刀豆凝集素A激活的脾細胞的一種雞脾細胞cDNA文庫來克隆雞IL-15(Kaplan，《免疫學雜志》(J.Immunol)，151628，1993)。在含有30μg/ml氨芐青霉素及10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂平皿上5000個菌落在25℃生長過夜。挑取15-20個菌落并轉(zhuǎn)到10mlTerrific培養(yǎng)液(含有同樣的抗生素)中并生長過夜。然后用已發(fā)表的步驟(Maniatis，Section1.28)分離來自每個組的質(zhì)粒DNA，用RNA酶(10μg/ml)處理，并貯存在TE緩沖液中。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到COS-7細胞(ATCC)中。每組的1μg質(zhì)粒與3μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺在100μlOpti-MeM培養(yǎng)液(GIBCO/BRL)中混合，孵育30分鐘，然后加到在12孔板中已生長到匯合度約80-90％并在無血清培養(yǎng)液中清洗過的COS-7細胞上。將細胞與DNA用不含血清和抗生素的Dulbecco’sMEM在37℃孵育5小時，然后用含有10％胎牛血清的相同的培養(yǎng)液補充，并在37℃孵育過夜。第二天用含10％胎牛血清、青霉素及鏈霉素的Dulbecco’sMEM更換培養(yǎng)液。再孵育另外24小時后，收集培養(yǎng)液并貯存于-20℃。按下面的實施例2中所描述的方法檢測細胞上清的IL-15活性。具有最高刺激指數(shù)(1.6-2.1)的5個組顯示出比其余278組的均值高2倍標準差的活性水平。這5組中的3組在第二次篩選中仍為陽性，并再分為6個組。從次級組中提取的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)染COS-7細胞，上清用于IL-2樣活性檢測。象在下面實施例2中所描述的，鑒定了3個陽性組并進行細分以獲得單獨的克隆，從每個組中至少分離出了一個陽性克隆。利用自動化的AppliedBiosystemsModel373A測序系統(tǒng)對所有3個陽性克隆的完整的cDNA插入物進行測序。利用包含于pcDNA1載體中的側(cè)翼T7及Sp6引物來啟動測序反應。其中的兩個克隆B2.16.2及M2.12.1相同并編碼圖1所示的cDNA序列。F19.84克隆與那兩個克隆相似，但在5’末端丟失了20nt(即開始于此編碼區(qū)的第一個ATG)并且在3’末端含有一個至少100nt的多聚T尾。利用BLAST檢索(它可進入所有主要的國際核酸數(shù)據(jù)庫)分析這種完整的747nt序列，沒有檢測出與其他任何已知的序列有有意義的同源性。還在一臺MacIIci計算機上利用MacVector軟件程序(MacVector4.0；國際生物技術公司，NewHaven，CT)分析了這個序列。這種分析揭示了一個在它的5’末端側(cè)翼有一段用于翻譯啟始的Kozak保守序列的開放閱讀框架。這個開放閱讀框架的預期的氨基酸序列在圖2中顯示(序列號2)。利用BLASTP檢索(它可進入所有主要的國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)分析這種氨基酸序列，顯示與猴及人前體IL-15具有有意義的同源性。這種雞IL-15的預期的氨基酸序列由一段143氨基酸的多肽組成，它有一個預期的16,305的分子量及6.37的等電點?；谒陌被┒说氖杷约芭c已知的信號肽切割位點(VonHeijine，《核酸研究》144683，1986)的比較，預期位于甘氨酸22及丙氨酸23之間的切割位點導致了一段約22氨基酸的氨基端引導序列從初級產(chǎn)物中去除以產(chǎn)生成熟的IL-15。預期的121氨基酸的成熟IL-15有預期的13,971的分子量及6.57的等電點和一個可能的N-連接的糖基化位點(圖2中的天冬酰胺110)。預期的來自猴、人、小鼠和雞的IL-15的氨基酸序列的比較及對猴IL-15三級結(jié)構(gòu)的分析(Grabstein，科學，264965，1994)提示，雞IL-15中的4個半胱氨酸(圖2中前體IL-15的63，70，116及119的位置)是保守的并形成鏈內(nèi)二硫鍵。實施例2雞IL-15的生物活性的測定IL-15的生物活性測定按下面進行通過用伴刀豆凝集素A(ConA)(10μg/ml)(Sigma公司，圣路易斯，MO)在含有2mg/mlBSA、抗生素及谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液(Sigma)中與雞脾細胞(107/ml)在40℃孵育24小時來準備ConA激活的脾T細胞。然后將培養(yǎng)液換成含2％正常雞血清(Sigma)及0.05Mα-甲基吡喃糖苷(Sigma)的Iscoves氏培養(yǎng)液(Sigma)，再孵育2-4天，需要時另加培養(yǎng)液稀釋細胞。能過將它們輕輕地鋪在一種Histopaque密度梯度(Sigma)上，按制造商的操作指導離心來該這混合物中純化母細胞。然后將細胞洗滌3次并最終懸浮在測定液中(含2％正常雞血清的Iscoves氏液(Sigma))。為了這種檢測，將2×104母細胞在含IL-15(例如，來自轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的上清的稀釋液)的測定液或合適的對照液中接種于圓底的96孔板中。在40℃孵育過夜后，細胞用3H-胸腺嘧啶(0.5μCi)(NewEnglandNuclear，Boston，MA)+氟脫氧尿苷(10-6M)(Sigma)脈沖6小時，然后將細胞收獲到玻璃纖維濾器上(Whatman，Clifton，NJ)，并在液閃計數(shù)器上測定放射活性。IL-15以刺激指數(shù)表示，它是實驗樣品的放射活性-對照(非轉(zhuǎn)染的COS-7細胞上清)的放射活性。一個典型的結(jié)果列于表1表1a首次篩選在1/10稀釋度。b用5個陽性及3個陰性組重復轉(zhuǎn)染。實施例3IL-15的純化及表達為了在哺乳動物細胞中獲得雞IL-15的高表達，應用pSFV1真核表達載體(它包括SemlikiForest病毒復制子)(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)。這種載體的應用允許信號肽的切割、糖基化及成熟的活性蛋白的分泌。在一個具體實施方案中，這種重組的載體在天然IL-15序列的羧基端編碼另外的6個組氨酸殘基，允許在一種鎳柱(Novagen，Madison，WI)上有效地一步純化分泌蛋白。構(gòu)建了包括IL-15cDNA編碼區(qū)側(cè)面的5’及3’序列的引物。3’引物還包括編碼6個組氨酸的核苷酸。這些引物被用于聚合酶鏈式反應(PCR)。用作模板的完整的IL-2cDNA包含于pcDNA1質(zhì)粒中。將擴增的cDNA，包括編碼組氨酸的序列，連接到pSFV1質(zhì)粒(GIBCO/BRL)中。通過純化DH5大腸桿菌(GIBCO/BRL)及在含氨芐青霉素的瓊脂平皿及培養(yǎng)液中挑選轉(zhuǎn)化子來獲得這種質(zhì)粒。利用制造商提供的程序以這種質(zhì)粒為模板在體外產(chǎn)生mRNA。通過電穿孔法將這種mRNA轉(zhuǎn)移到BHK-21細胞中，每107細胞用10μgRNA，然后將細胞孵育1-3天。收獲細胞上清，利用一個合適的緩沖系統(tǒng)(組氨酸結(jié)合緩沖試劑盒，Novagen)將上清通過一個樹脂基質(zhì)(組氨酸結(jié)合樹脂；Novagen，Madison，WI)。2.5ml的單一柱能純化多達20mg的標記蛋白質(zhì)。用試劑盒中提供的洗脫緩沖液將IL-15從柱中洗脫出來。估計在50ml培養(yǎng)液中生長的BHK-21細胞合成大約25mg總蛋白質(zhì)，其中高達5％含有重組表達并分泌的蛋白質(zhì)，這近似相當于1.25mgcIL-15。實施例4鳥類IL-15在疫苗中的應用進行下面的實驗以評估雞IL-15在雞疫苗中的免疫增強活性。將雞IL-15cDNA插入到用于雞重組蛋白表達的兩種病毒載體中(分別源于火雞皰疹病毒和禽痘病毒)(Morgan等，鳥類疾病，36858，1992；Yanagida等，病毒學雜志，661402，1992；Nazerian等，病毒學雜志，661409，1992)。這些IL-15修飾的活病毒載體與現(xiàn)有的各種各樣的疫苗同時用于新孵化的小雞，6天后，用相應的有毒力的病毒進行攻擊，觀察8周疾病的進展。這些雞的發(fā)病率與沒有接受IL-15修飾的活病毒載體的對照相比。一個示范方案(包括預期的結(jié)果)列于表2表2組別第1天的處理第6天的攻擊預期疾病的百分比</tables>a表達IL-15的火雞皰疹病毒在一種替代方法中，利用UlmerJB《科學》，2591745-1749，1993中描述的方法，用100μg含雞IL-15cDNA的質(zhì)粒給剛孵化的小雞肌肉注射。這些小雞及的接受了一種缺乏IL-15cDNA對照載體的對照小雞，在第2天用雞疫苗接種，然后在第7天用相應的有毒力的病毒攻擊。觀察8周它們的疾病征象。預期用含IL-15cDNA的pcDNA1載體注射的小雞將比對照組表現(xiàn)出較低的發(fā)病率。最后，由實施例3中描述的方法純化的IL-15蛋白質(zhì)通過肌內(nèi)給予剛孵出的小雞，然后在接下來的4天中每天給藥一次。將小雞分成3組，每天每次注射0.01、0.1或1.0μg。第4組注射安慰劑。孵出時，所有的小雞用雞疫苗進行接種，然后在第7天用相應的有毒力的病毒進行攻擊，然后觀察8周它們的疾病征象。預期用IL-15注射的小雞相對于對照組顯示較低的發(fā)病率。實施例5鳥類IL-15用于促進生長哺乳動物IL-15刺激肌肉生長(Quinn，LS.內(nèi)分泌學.，1363669，1995)，半純的雞IL-2刺激雞體重并提高飼料轉(zhuǎn)化(美國專利流水號5,028,421)。為了評估鳥類IL-15的生長促進活性，可用實施例4中描述的方法給予在病毒載體或質(zhì)粒載體中的IL-15cDNA或重組IL-15蛋白。在6周的時間內(nèi)監(jiān)控試驗及對照組的雞的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化。預期這些實驗中的一個或多個與對照組相比加速雞的生長。權利要求1.一種分離并純化的編碼鳥類白細胞介素-15的DNA。2.權利要求1的DNA，它來自選自雞、火雞、鴨子、鵝、鵪鶉及野雞的一種鳥類。3.一種分離并純化的DNA，其具有圖1中序列號1中所列出的核苷酸序列。4.一種分離并純化的DNA，其具有選自圖1中序列號1中所列出的序列、它的序列保守的變體及它的功能保守的變體的序列。5.一種分離并純化的編碼圖2序列號2中所列出的氨基酸序列的DNA。6.一種分離并純化的編碼一種鳥類白細胞介素-15的DNA，其中所說的多肽具有約14000道爾頓的分子量并具有刺激促分裂原激活的鳥類T細胞的能力。7.一種分離并純化的編碼雞白細胞介素-15的DNA。8.一種分離并純化的包含鳥類白細胞介素-15的多肽。9.權利要求8的多肽，它來自選自雞、火雞、鴨子、鵝、鵪鶉及野雞的一種鳥類。10.一種分離并純化的包含圖2中序列號2中所列出的氨基酸序列的多肽。11.一種增強禽類對一種免疫原的免疫應答的方法，它包括在給予所說的免疫原之前、之后或基本上同時給予增強所說的免疫應答有效量的鳥類IL-15。12.權利要求11的方法，其中所說的白細胞介素-15來自選自雞、火雞、鴨子、鵝、鵪鶉及野雞的一種鳥類。13.權利要求11的方法，其中所說的白細胞介素-15具有選自圖2中序列號2中所列出的序列、它的序列保守的變體及它的功能保守的變體的序列。14.權利要求11的方法，其中所說的給予的白細胞介素-15的有效量是在每次給藥約0.01μg～1.0μg的范圍內(nèi)。15.權利要求11的方法，其中所說的免疫原包括非復制性疫苗。16.權利要求11的方法，其中所說的免疫原包括復制性疫苗。17.一種用于誘導禽類對一種免疫原的免疫應答的增強型疫苗，它包含所說的免疫原及增強所說的免疫應答有效的量的鳥類白細胞介素-15。18.權利要求17的疫苗，其中所說的白細胞介素-15存在量的范圍為每劑所說的疫苗約0.01μg-1.0μg。19.權利要求17的疫苗，其中所說的免疫原來自一種選自Marek氏病病毒、新城疫病毒、傳染性囊病病毒及傳染性支氣管炎病毒的病原體。全文摘要本發(fā)明提供了分離并純化的編碼鳥類白細胞介素－15(IL－15)的DNA,以及包含IL－15DNA的克隆及表達載體和用編碼IL－15載體轉(zhuǎn)化的細胞。本發(fā)明還提供了分離并純化的具有刺激促分裂原激活的鳥類T細胞能力的鳥類IL－15多肽。本發(fā)明還提供了一種用于增強禽類對一種免疫原的免疫應答的方法,它通過給予鳥類IL－15之前、之后或同時給予這種免疫原。最后,本發(fā)明提供了一種用于誘導禽類對一種免疫原的免疫應答的疫苗,它包括這種免疫原及有效量的鳥類IL－15。文檔編號A61P31/12GK1200037SQ9619768公開日1998年11月25日申請日期1996年10月10日優(yōu)先權日1995年10月17日發(fā)明者R·S·桑迪克,L·A·瓊斯,D·I·史密斯申請人:韋恩州立大學