一種多糖多酚植物組織總rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，其特征在于：配制100mlRNA提取液；往1.5ml RNase-free離心管中加入400μl-1ml的RNA提取液，加入終濃度為1％-10％的巰基乙醇，混勻；取約100mg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混勻；10000-12000r/min，冷凍離心10-15min；取上清液，加入700μl-1ml TRIzol試劑，混勻，立即加入200μl氯仿或氯仿和異戊醇的混合物，劇烈混勻，室溫放置幾分鐘；10000-12000r/min，冷凍離心10-15min；取上清，加入等體積的異丙醇或2-2.5倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置10-20min；10000-12000r/min,冷凍離心10min；加入0.5-1ml70％-75％的乙醇溶液，上下顛倒，室溫放置2-15分鐘；7500-12000r/min，冷凍離心；重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇；加入適量RNase-free水溶解，得到葡萄葉片總RNA。
【專利說明】一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，主要涉及一種總RNA提取方法，具體來說就是一種 應(yīng)用改良的TRIzoI法提取多糖多酚植物總RNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] RNA是基因表達(dá)過程中非常重要的生物分子，對(duì)其分離純化是研究基因功能的重 要基礎(chǔ)之一（Tong ZG et al.，2012)。高質(zhì)量的RNA對(duì)于后續(xù)文庫構(gòu)建、RNA-seq以及其他的 分子生物學(xué)分析極其重要。而對(duì)于大多數(shù)植物組織來說，抽提高質(zhì)量的RNA顯得尤為重要， 因?yàn)榻^大多數(shù)植物材料富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物。多酚類物質(zhì)在研磨過程 中很容易被氧化，并能結(jié)合蛋白質(zhì)和核酸形成大分子物質(zhì)；在提取過程中，多糖和多酚類物 質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致RNA降解，干擾后續(xù)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用（Salzman et al.，1999 ;Asif et al.，2000)。
[0003] 許多植物組織（如蘋果、櫻桃、李子和葡萄等）以及樹木類植物中富含酚類化合 物。植物材料在經(jīng)過前期的破碎處理后，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來，氧化后處理液會(huì)變?yōu)楹稚?呈現(xiàn)褐化效應(yīng)，被氧化的酚類物質(zhì)能與RNA不可逆的結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失，而在用苯酚、 氯仿抽提時(shí)RNA可能會(huì)丟失或者形成不溶性復(fù)合物，從而影響RNA的分離純化。
[0004] 而多糖的干擾也是RNA提取過程中遇到的另一個(gè)常見問題，多糖的理化性質(zhì)與 RNA很相似，很難將二者分開。如果去除多糖，RNA也會(huì)隨機(jī)被帶走，造成RNA得率降低；而 在沉淀RNA時(shí)，也往往會(huì)產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀 的溶液，很難將其與RNA分開，且多糖可以抑制許多酶的活性，影響后續(xù)的反應(yīng)。在常規(guī)的 方法中，通過SDS-鹽酸胍鹽或高濃度的鹽離子環(huán)境下、Licl沉淀可以去除部分多糖，但仍 不能去除干凈，還需要更有效的方法來解決此問題


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了提供一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，以解決現(xiàn)有技 術(shù)的上述問題。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，其步驟為：
[0008] 1)配制IOOmlRNA提取液：其中包含：50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯化 鈉（NaCl) ;10mM 乙二胺四乙酸（EDTA) ;1· 5% -2% (m/v)十二烷基硫酸鈉（SDS) ;2% -4% (m/v)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0· Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力攪 拌器上攪拌過夜，高壓滅菌；
[0009] 2)往I. 5ml RNase-free離心管中加入400 μ I-Iml的RNA提取液，加入終濃度為 1% -10%的巰基乙醇，混勻；
[0010] 3)取約IOOmg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混 勻；
[0011] 4) 10000-12000r/min，冷凍離心 10-15min ;
[0012] 5)取上清液，加入700 μ 1-lml TRIzol試劑，混勻，立即加入200 μ 1氯仿或氯仿和 異戊醇的混合物，劇烈混勻，室溫放置幾分鐘；
[0013] 6) 10000-12000r/min，冷凍離心 10-15min ;
[0014] 7)取上清，加入等體積的異丙醇或2-2. 5倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻后，室 溫靜置10_20min ;
[0015] 8) 10000-12000r/min，冷凍離心 IOmin ;
[0016] 9)加入0. 5-lml 70% -75%的乙醇溶液，上下顛倒，室溫放置2-15分鐘；
[0017] 10) 7500-12000r/min，冷凍離心；
[0018] 11)重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇；
[0019] 12)加入適量RNase-free水溶解，得到葡萄葉片總RNA。
[0020] 步驟5)中，氯仿和異戊醇的質(zhì)量比為24:1。
[0021] 步驟7)中，無水乙醇沉淀可選擇在_20°C冰箱中靜置半小時(shí)。
[0022] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有以下有益效果：
[0023] 1、省去了 Licl沉淀的步驟，在抽提過程中先去除多糖和多酚和部分蛋白質(zhì)，隨后 使用Trizol再去除蛋白質(zhì)，整個(gè)流程在一個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成，所得RNA質(zhì)量較高，大大提高 了 RNA提取的時(shí)間和效率；
[0024] 2、使用Licl沉淀法沉淀核酸會(huì)去除5sRNA和小RNA，對(duì)于小RNA建庫會(huì)造成干擾， 而本方法會(huì)抽提出5sRNA，降解較少，能滿足小RNA建庫的要求。
[0025] 3、現(xiàn)在市面上有許多抽提多糖多酚植物的RNA提取試劑盒，但價(jià)格相對(duì)較昂貴， 本方法價(jià)格低廉，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為葡萄葉片RNA瓊脂糖電泳圖；
[0027] 圖中，上樣量均為200-300ng，Marker(DL2000)上樣量為3μ 1 ;1、2、3、4泳道為改 良的Trizol法提??；5、6泳道為Trizol法提?。?-8為試劑盒過柱法提取

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。
[0029] 實(shí)施例1 :制備RNA提取液
[0030] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化鈉（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;1. 5% (m/v)十二烷基硫酸鈉（SDS) ;2% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力攪拌器上攪 拌過夜，高壓滅菌；得到RNA提取液待用。
[0031] 實(shí)施例2 :制備RNA提取液
[0032] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化鈉（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;2% (m/v)十二烷基硫酸鈉（SDS) ;3% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力攪拌器上攪 拌過夜，高壓滅菌；得到RNA提取液待用。
[0033] 實(shí)施例3 :制備RNA提取液
[0034] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化鈉（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;2% (m/v)十二烷基硫酸鈉（SDS) ;4% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力攪拌器上攪 拌過夜，高壓滅菌；得到RNA提取液待用。
[0035] 實(shí)施例4 :提取葡萄葉片總RNA
[0036] 1)往I. 5ml RNase-free離心管中加入600 μ 1的實(shí)施例1制備的RNA提取液，力口 入30 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0037] 2)取約IOOmg葡萄葉片于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混 勻。
[0038] 3) 4°C，12000r/min，離心 15min
[0039] 4)取上清液（約500 μ I)，加入800 μ I TRIzol試劑，混勻，立即加入200 μ 1氯仿， 劇烈混勻，室溫放置2-3min
[0040] 5) 4°C，12000r/min，離心 IOmin
[0041] 6)取上清，加入800 μ 1異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置IOmin
[0042] 7) 12000r/min，4?,離心 IOmin
[0043] 8)加入約Iml 75%乙醇，上下顛倒，室溫放置2min
[0044] 9) 4°C, 12000r/min，離心 5min
[0045] 10) 75%乙醇再重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇
[0046] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄葉片總RNA。
[0047] 實(shí)施例5 :提取葡萄葉片總RNA
[0048] 1)往I. 5ml RNase-free離心管中加入400 μ 1的實(shí)施例1制備的RNA提取液，力口 入30 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0049] 2)取約IOOmg葡萄葉片于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混 勻。
[0050] 3) 4°C，10000r/min，離心 12min
[0051] 4)取上清液（約500 μ I)，加入700 μ I TRIzol試劑，混勻，立即加入200 μ 1氯仿， 劇烈混勻，室溫放置2-3min
[0052] 5) 4°C，12000r/min，離心 15min ;
[0053] 6)取上清，加入700 μ 1異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置8min ;
[0054] 7) 11000r/min，4°C,離心 IOmin ;
[0055] 8)加入約Iml 75%乙醇，上下顛倒，室溫放置5min ;
[0056] 9) 4。。，12000r/min，離心 5min ;
[0057] 10) 75%乙醇再重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇；
[0058] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄葉片總RNA。
[0059] 實(shí)施例6 :提取葡萄葉片總RNA
[0060] 1)往I. 5ml RNase-free離心管中加入800 μ 1的實(shí)施例1制備的RNA提取液，力口 入50 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0061] 2)取約IOOmg葡萄葉片于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混 勻。
[0062] 3) 4°C，12000r/min，離心 15min ;
[0063] 4)取上清液（約500 μ I)，加入700 μ I TRIzol試劑，混勻，立即加入200 μ I氯仿， 劇烈混勻，室溫放置2-3min ;
[0064] 5) 4°C，12000r/min，離心 15min ;
[0065] 6)取上清，加入2倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置8min ;
[0066] 7) 11000r/min，4。〇，離心 IOmin ;
[0067] 8)加入約Iml 75%乙醇，上下顛倒，室溫放置5min ;
[0068] 9) 4°C，12000r/min，離心 5min ;
[0069] 10) 75%乙醇再重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇；
[0070] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄葉片總RNA。
[0071] 將實(shí)施例4所得的產(chǎn)物利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度（表1)，然后取 200-300ng RNA進(jìn)行1. 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性（圖1)
[0072] 表1紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，其特征在于：其步驟為： 1) 配制IOOmlRNA提取液：其中包含：50mM三羥甲基氨基甲烷；200mM氯化鈉；IOmM乙 二胺四乙酸；1.5%-2%十二烷基硫酸鈉；2%-4%聚乙烯吡咯烷酮，溶液pH = 8.0 ;再加入 〇. Iml焦碳酸二乙酯，磁力攪拌器上攪拌過夜，高壓滅菌； 2) 往I. 5mlRNase-free離心管中加入400ii I-Iml的RNA提取液，加入終濃度為 1% -10%的巰基乙醇，混勻； 3) 取約IOOmg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至上述離心管中，震蕩混勻； 4) 10000-12000r/min，冷凍離心 10-15min ; 5) 取上清液，加入700 iil-lml TRIzol試劑，混勻，立即加入200 ill氯仿或氯仿和異戊 醇的混合物，劇烈混勻，室溫放置幾分鐘； 6) 10000-12000r/min，冷凍離心 10-15min ; 7) 取上清，加入等體積的異丙醇或2-2. 5倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜 置 10-20min ; 8) 10000-12000r/min,冷凍離心 IOmin ; 9) 加入0. 5-lml 70% -75%的乙醇溶液，上下顛倒，室溫放置2-15分鐘； 10) 7500-12000r/min，冷凍離心； 11) 重復(fù)清洗一次，棄上清后，短暫離心，吸出剩余乙醇； 12) 加入適量RNase-free水溶解，得到葡萄葉片總RNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，其特征在于：步驟 5)中，氯仿和異戊醇的質(zhì)量比為24:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多糖多酚植物組織總RNA提取方法，其特征在于：步驟 7)中，無水乙醇沉淀選擇在_20°C冰箱中靜置半小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104313015SQ201410549077
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】孫子奎, 高文學(xué), 丁方美, 王 鋒, 劉艷艷 申請(qǐng)人:上海派森諾生物科技有限公司