大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工程疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工程疫苗及其的制備方法，可有效防治大菱鲆病毒性紅體病的發(fā)生和死亡流行性疾病的發(fā)生，為TRBIV的預(yù)防和治療提供產(chǎn)品和使用方法。本發(fā)明還提供一種紅體病虹彩病毒基因工程疫苗，為攜帶有序列為SEQ ID NO:4的核苷酸的真核表達載體重組質(zhì)粒。本發(fā)明制備的具有預(yù)防大菱鲆病毒性紅體和死亡疾病的基因工程疫苗，產(chǎn)量穩(wěn)定，成本低，可具有較高的抑制大菱鲆紅體病虹彩病毒的抗性，并且該基因工程疫苗且具有安全、環(huán)保的特點，不會產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染。
【專利說明】大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工程疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工 程疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002] 大菱鲆（Scophthalmas maximus)是歐洲名貴海水魚種，是當(dāng)前歐洲的重要海水 養(yǎng)殖魚類之一，自1992年被引種到我國進行人工繁殖，現(xiàn)已達到一定的規(guī)模，逐漸成為 我國北方優(yōu)秀的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種和工廠化養(yǎng)殖的主要對象，年創(chuàng)產(chǎn)值超過15億元。但是， 近年來在其幼魚、成魚和親魚中均出現(xiàn)了一種感染率很高并引起大規(guī)模死亡的紅體病，使 大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失慘重，而且很難防治。自2001年在山東半島沿海地區(qū)養(yǎng)殖大菱 鲆中出現(xiàn)以來，其流行地域迅速擴大，已嚴(yán)重影響了我國大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。該 病的癥狀是：鰓絲貧血、鰭基部肌肉組織和脊椎骨沿線彌散性出血，嚴(yán)重者整個身體呈現(xiàn) 皮下彌散性出血，腸內(nèi)有黃白色膿液。研究發(fā)現(xiàn)了一種大小為120nm左右的球形病毒是 引起上述疾病的病原，這種球形病毒稱為大菱鲆紅體病虹彩病毒（Turbot reddish body iridovirus, TRBIV)，該病毒是一種大型二十面體狀、細(xì)胞質(zhì)型DNA病毒，分類地位屬于虹 彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬（Megalocytivirus)，該病毒可感染苗期、養(yǎng)成期和親魚期的大 菱鲆，尤其對養(yǎng)成期大菱鲆的危害最大。病理學(xué)研究表明，TRBIV對病魚的鰓、腸、脾、腎等 多種組織和器官造成了嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染。由于傳統(tǒng)的抗生素等化學(xué)藥物防治容易引起 細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果逐年下降，同時化學(xué)藥物的使用容易導(dǎo)致藥物殘留、污染環(huán) 境，造成了巨大的經(jīng)濟損失，影響人類健康。因此，為了大菱鲆養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展，研制安 全、高效的疫苗是預(yù)防和控制TRBIV的首要的解決途徑。目前，疫苗在海水養(yǎng)殖魚中的使用 極少，僅在少數(shù)地區(qū)有實驗性的使用、或購買國外的疫苗少量使用。因此，有待開發(fā)的市場 是非常廣闊的。目前尚未見有有效抑制大菱鲆紅體病虹彩病毒的藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工程疫苗及其的制備方法，可有 效防治大菱鲆病毒性紅體病的發(fā)生和死亡流行性疾病的發(fā)生，為TRBIV的預(yù)防和治療提供 產(chǎn)品和使用方法。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種多肽，該多肽的氨基酸序列為RIHFKLRRWE(SEQ ID N0:1)和 / 或 VSDNAKKTAA(SEQ ID NO:2)。
[0005] 上述的多肽作為大菱鲆紅體病虹彩病毒疫苗抗原的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明另一方面提供包含有上述多肽的氨基酸片段；
[0007] 上述的氨基酸片段，作為實施例的優(yōu)選，其一種序列為SEQ ID NO:3 ;
[0008] 編碼上述序列為SEQ ID N0:3的氨基酸片段的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:4。
[0009] 本發(fā)明還提供一種大菱鲆紅體病虹彩病毒疫苗，包含有序列為SEQ ID NO: 1-3中 任一個或幾個的多肽。
[0010] 本發(fā)明還提供一種紅體病虹彩病毒基因工程疫苗，為攜帶有序列為SEQ ID N0:4 的核苷酸的真核表達載體重組質(zhì)粒。
[0011] 本發(fā)明制備的具有預(yù)防大菱鲆病毒性紅體和死亡疾病的基因工程疫苗，產(chǎn)量穩(wěn) 定，成本低，可具有較高的抑制大菱鲆紅體病虹彩病毒的抗性，并且該基因工程疫苗且具有 安全、環(huán)保的特點，不會產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :模擬表位的競爭性抑制ELISA檢驗圖。

【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明首先通過對TRBIV進行BLAST分析和蛋白質(zhì)功能鑒定，獲得了能 作為TRBIV的抗原表位，其編碼的多肽的為0RF216:RIHFKLRRWE(SEQ ID NO: 1)和 0RF424:VSDNAKKTAA(SEQ ID N0:2)〇
[0014] 然后PCR方法從患有紅體病的大菱鲆組織中獲得含有2個具有抗原 決定簇的654bp的基因片段（SEQ ID N0:4)，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:3。所用引物為：上游引物：5' -CGCATATGCGCATCCACTTCAAGC-3';下游引物： 5/ _TTCTCGAGCGCTGCTGTTTTCTTG_3/ 。
[0015] 再通過基因克隆方法將該654bp的基因片段經(jīng)過酶切、連接、抗性篩選克隆進真 核表達載體PVAXl中，得到真核表達載體重組質(zhì)粒pVAXl-TRBIVO. 65kb，將該重組質(zhì)粒經(jīng) 氯化鈣轉(zhuǎn)化發(fā)轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，抗性選擇后，陽性克隆在含有卡那霉素的LB培養(yǎng) 基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。將真核表達載體重組質(zhì)粒 pVAXl-TRBIVO. 65kb的質(zhì)粒DNA，用ρΗ7· 4的IOmM的PBS配制為濃度50ng/ μ 1，該劑量的 重組質(zhì)粒pVAXl-TRBIVO. 65kbPBS溶液可以預(yù)防大菱鲆病毒性紅體和死亡流行性疾病的發(fā) 生。
[0016] 該基因工程疫苗的使用如下：對于體重250g以下的大菱鲆每尾肌肉注射質(zhì)粒DNA 濃度為50ng/ μ 1的PBS溶液100 μ 1，體重250g以上的大菱鲆每尾肌肉注射質(zhì)粒DNA濃度 為50ng/μ 1的PBS溶液200 μ 1，注射21天后大菱鲆可產(chǎn)生特異性抗體，免疫保護可持續(xù)產(chǎn) 生6個月。
[0017] 下面對本發(fā)明的制備和使用方式進行詳細(xì)的描述。
[0018] 為了進一步的免疫學(xué)驗證，特地分別從216ΑΑ ORF和424ΑΑ ORF兩個基因/ORF中 反向推測各一個非模擬表位，見表1。
[0019] 表1 :生物信息學(xué)推導(dǎo)的模擬表位與對照序列
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2。
2. 權(quán)利要求2所述的多肽在制備大菱鲆紅體病虹彩病毒疫苗中的應(yīng)用。
3. -種氨基酸片段，其特征在于，所述的氨基酸片段包含有權(quán)利要求1所述的多肽。
4. 如權(quán)利要求3所述的氨基酸片段，其特征在于，所述的氨基酸片段的序列為SEQ ID N0:3。
5. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求3所述的氨基酸片段。
6. 如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:4。
7. -種大菱鲆紅體病虹彩病毒疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含有序列為SEQ ID NO: 1-3中任一個或幾個的多肽。
8. -種大菱鲆紅體病虹彩病毒基因工程疫苗，其特征在于，所述的基因工程疫苗為攜 帶有序列為SEQ ID N0:4的核苷酸的真核表達載體重組質(zhì)粒。
【文檔編號】C12N15/11GK104371004SQ201410548974
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】鄭風(fēng)榮, 王波, 覃曉萍, 吳謖琦 申請人:國家海洋局第一海洋研究所