一種利用熱榨花生粕制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用熱榨花生粕制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，包括以下步驟：花生粕粉碎、脫脂、加入蒸餾水，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值，加入復(fù)合植物水解酶ViscozymeL酶解，得到酶解液；調(diào)節(jié)酶解液pH值，加入復(fù)合蛋白酶酶解，滅酶，離心；上清液1加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，靜置，離心，上清液2真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，超濾膜分離濃縮，透過(guò)液冷凍干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。以本發(fā)明制得的葡萄糖苷酶抑制活性肽產(chǎn)品分子量小于5kDa，純度大于90%，具有抗氧化、降血糖的功能活性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用熱榨花生粕制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，屬于食品天然活性產(chǎn)物加工領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]I^J^XArachishypogaea L )又稱(chēng)香果、地果、落花生,為豆科植物花生的種子,是世界上主要的油料資源之一。花生的蛋白質(zhì)含量為25?36%，花生蛋白含有人體必需的八種氨基酸，精氨酸含量高于其它堅(jiān)果，生物學(xué)效價(jià)高于大豆。目前，中國(guó)對(duì)花生的利用多在食用油脂方面，花生果提取油脂后產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物花生柏，每年產(chǎn)量達(dá)400萬(wàn)噸，是一種大宗蛋白質(zhì)資源?；ㄉ刂械牡鞍踪|(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后可得到活性短肽，具有清除自由基、金屬離子螯合、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等抗氧化作用，以及抑制α -葡萄糖苷酶活性和降血糖作用。
[0003]葡萄糖苷酶抑制活性肽是一種淡黃色或乳白色、略帶花生香氣的粉末狀固體，易溶于水。該產(chǎn)品具有較好的清除自由基、抑制α-葡萄糖苷酶活性以及降血糖作用。葡萄糖苷酶抑制活性肽競(jìng)爭(zhēng)性抑制位于小腸的各種α -葡萄糖苷酶，使淀粉類(lèi)分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。α -葡萄糖苷酶抑制活性肽不刺激β細(xì)胞分泌胰島素，但可降低餐后胰島素水平，說(shuō)明可增加胰島素的敏感性。葡萄糖苷酶抑制活性肽可以作為延緩腸道碳水化合物吸收而達(dá)到治療糖尿病的輔助降糖藥物；也可添加到飲料、面制品、肉制品中作為天然抗氧化劑，防止脂肪氧化，改善食品品質(zhì)以及減少合成食品添加劑使用量。
[0004]目前，獲得生物活性蛋白肽途徑有三種:(1)從天然生物體提取，提取成本高，不能大規(guī)模生產(chǎn)。(2)水解蛋白產(chǎn)生，酸法水解蛋白，氨基酸受損嚴(yán)重，水解難控制而較少應(yīng)用；酶解法可大量生產(chǎn)生物活性肽，水解條件溫和，若結(jié)合微波、超聲輔助酶解法可大大縮短反應(yīng)時(shí)間，降低生物活性肽的生產(chǎn)成本，具有廣闊的發(fā)展前景。(3)化學(xué)合成、酶法合成或重組DNA技術(shù)合成，化學(xué)合成法成本高、副反應(yīng)物及殘留化合物對(duì)人體有害，其發(fā)展受到制約；酶法合成反應(yīng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)率低不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求；重組DNA技術(shù)合成法剛剛起步，存在技術(shù)不成熟，產(chǎn)物生物活性肽的結(jié)構(gòu)和生物活性不穩(wěn)定等問(wèn)題。由此看來(lái)，將花生柏中蛋白制備成花生葡萄糖苷酶抑制活性肽的最好方法是蛋白酶酶解法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于為解決上述技術(shù)中存在的技術(shù)難題，提供一種利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法。該方法集微波萃取浸提技術(shù)與復(fù)合植物水解酶和復(fù)合蛋白酶分步酶解技術(shù)于一體，在復(fù)合植物水解酶水解花生柏的細(xì)胞壁組分和微波將多糖、蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)容物充分浸提到溶劑中的基礎(chǔ)上，復(fù)合蛋白酶的酶切位點(diǎn)很好的與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合，肽鍵被切斷，肽鏈縮短生成大量的小分子蛋白肽。由于在微波中進(jìn)行酶解反應(yīng)，使得反應(yīng)時(shí)間大為縮短，酶解效率和蛋白肽得率大大提高；再進(jìn)行二級(jí)超濾處理，蛋白肽的純度也大為提高，真正實(shí)現(xiàn)了溫和條件下快速制備花生葡萄糖苷酶抑制活性肽的目的。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其步驟包括:
一、花生柏粉碎過(guò)150目篩，篩下物加入石油醚脫脂，干燥得到脫脂的花生柏粉，加入蒸懼水，微波加熱混合均勻，調(diào)節(jié)pH值,加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶在內(nèi)的復(fù)合多糖酶)，微波輔助酶解，得到Viscozyme L酶解液；
二、調(diào)節(jié)ViscozymeL酶解液pH值,加入復(fù)合蛋白酶,微波輔助酶解,滅酶,離心；
三、上清液I加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，冰箱中靜置過(guò)夜，離心，上清液2真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，超濾膜分離濃縮，透過(guò)液冷凍干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。
[0007]優(yōu)選地，步驟一所述的花生柏粉碎篩下物與石油醚的質(zhì)量與體積比為1:8.3-10.2(g/ml)，石油醚沸程為30-60°C，脫脂的條件為51°C恒溫水浴振蕩器中，以325r/min轉(zhuǎn)速往復(fù)式振蕩脫脂16h，通風(fēng)櫥中揮發(fā)干燥，脫脂的花生柏粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為1:9.7-10.7(g/ml)，微波功率800w、加熱溫度47.5°C、加熱時(shí)間3.2min條件下混合均勻，pH值調(diào)節(jié)至4.8-5.8, Viscozyme L加入量為每克花生柏粉17.5-20.5FBG (FBG為ViscozymeL的酶活單位)，微波功率800w、加熱溫度45.5-52.5°C、加熱時(shí)間8.5-10.5min條件下酶解。
[0008]優(yōu)選地,步驟二所述的pH值調(diào)節(jié)至7.2-8.2,復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶Neutral Protease、無(wú)花果蛋白酶以2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的復(fù)合蛋白酶，加入量為每克花生柏粉5000-7000U (U為復(fù)合蛋白酶的酶活單位)，酶解的條件為微波功率800w、加熱溫度50-60°C、加熱時(shí)間4.5-12.5min, 100°C滅酶5min，7200r/min 離心 18min。
[0009]優(yōu)選地，步驟三所述的離心條件為7200r/min離心18min,在水浴加熱溫度73°C、真空度0.1MPa條件下，以224r/min轉(zhuǎn)速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)中以3.45bar壓力、25°C、34ml/min進(jìn)料流速、1kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行一級(jí)超濾，再以4.25bar壓力、25°C、24ml/min進(jìn)料流速、5kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行二級(jí)超濾分離濃縮，冷凍干燥條件為_(kāi)55°C、真空度0.1MPa，干燥48h。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:根據(jù)本發(fā)明，能夠提供分子量小于5kDa，純度大于90%，具有抗氧化、降血糖功能活性的花生葡萄糖苷酶抑制活性肽產(chǎn)品，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0011]采用福林酚比色法(Lowery法)測(cè)定本發(fā)明實(shí)施例中提取的葡萄糖苷酶抑制活性肽的純度，HPLC測(cè)定本發(fā)明實(shí)施例中提取的葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布。
[0012]實(shí)施例1
花生柏粉碎過(guò)150目篩，取篩下物以花生柏粉碎篩下物與石油醚的質(zhì)量與體積比為1:9.6(g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C )，在51 °C恒溫水浴振蕩器中，以325r/min轉(zhuǎn)速往復(fù)式振蕩脫脂16h，通風(fēng)櫥中揮發(fā)石油醚，得到干燥脫脂的花生柏粉，以脫脂的花生柏粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為1:10.1 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸餾水，在微波功率800w、加熱溫度47.5°C、加熱時(shí)間3.2min條件下，微波加熱混合均勻，得到花生柏懸浮液，調(diào)節(jié)花生柏懸浮液pH值至5.1，加入每克花生柏粉19.6FBG (FBG為復(fù)合植物水解酶ViscozymeL的酶活單位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶在內(nèi)的復(fù)合多糖酶)，在微波功率800w、加熱溫度48.5°C、加熱時(shí)間8.5min條件下微波輔助酶解，得到Viscozyme L酶解液；調(diào)節(jié)Viscozyme L酶解液pH值至7.6,加入以堿性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:無(wú)花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的復(fù)合蛋白酶，加入量為每克花生柏粉5758U(U為復(fù)合蛋白酶的酶活單位)，在微波功率800w、加熱溫度53.5°C、加熱時(shí)間5.8min條件下微波輔助酶解，100°C沸水浴中滅酶5min, 7200r/min離心18min ;上清液I加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，冰箱中靜置過(guò)夜，7200r/min離心18min，上清液2在水浴加熱溫度73°C、真空度0.1MPa條件下，以224r/min轉(zhuǎn)速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,取濃縮液在Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)中以3.45bar壓力、25°C、34ml/min進(jìn)料流速、1kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行一級(jí)超濾，取透過(guò)液I再以4.25bar壓力、25°C、24ml/min進(jìn)料流速、5kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行二級(jí)超濾分離濃縮，取透過(guò)液2在_55°C、真空度0.1MPa條件下，冷凍干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范圍為3kDa_5kDa分子量段的活性肽占10.48%，3kDa-lkDa分子量段的活性肽占80.57%，分子量在IkDa以下的活性肽占8.95% ;純度為92.45% ;抗氧化作用包括:體外清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和 ABTS 自由基的 IC5tl 值分別為 0.56mg/mL、0.88mg/mL、0.69mg/mL 和 0.34mg/mL。降血糖功能活性包括:體外對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值為56.32mg/L，對(duì)鏈脲佐菌素、鹽酸腎上腺素和四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用，飼喂花生非淀粉多糖治療實(shí)驗(yàn)后的空腹血糖值比實(shí)驗(yàn)前分別降低了 80.35%,85.12%和87.29%。
[0013]實(shí)施例2
花生柏粉碎過(guò)150目篩，取篩下物以花生柏粉碎篩下物與石油醚的質(zhì)量與體積比為1:8.8(g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C )，在51 °C恒溫水浴振蕩器中，以325r/min轉(zhuǎn)速往復(fù)式振蕩脫脂16h，通風(fēng)櫥中揮發(fā)石油醚，得到干燥脫脂的花生柏粉，以脫脂的花生柏粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為1:10.7 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸餾水，在微波功率800w、加熱溫度47.5°C、加熱時(shí)間3.2min條件下，微波加熱混合均勻，得到花生柏懸浮液，調(diào)節(jié)花生柏懸浮液PH值至5.4，加入每克花生柏粉20.5FBG (FBG為復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的酶活單位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶在內(nèi)的復(fù)合多糖酶)，在微波功率800w、加熱溫度50.6°C、加熱時(shí)間10.2min條件下微波輔助酶解，得到Viscozyme L酶解液；調(diào)節(jié)Viscozyme L酶解液pH值至8.0,加入以堿性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:無(wú)花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的復(fù)合蛋白酶，加入量為每克花生柏粉6391U(U為復(fù)合蛋白酶的酶活單位)，在微波功率800w、加熱溫度58.2°C、加熱時(shí)間10.6min條件下微波輔助酶解，100°C沸水浴中滅酶5min, 7200r/min離心18min ;上清液I加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，冰箱中靜置過(guò)夜，7200r/min離心18min，上清液2在水浴加熱溫度73°C、真空度0.1MPa條件下，以224r/min轉(zhuǎn)速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,取濃縮液在Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)中以
3.45bar壓力、25°C、34ml/min進(jìn)料流速、1kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行一級(jí)超濾，取透過(guò)液I再以4.25bar壓力、25°C、24ml/min進(jìn)料流速、5kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行二級(jí)超濾分離濃縮，取透過(guò)液2在_55°C、真空度0.1MPa條件下，冷凍干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范圍為3kDa_5kDa分子量段的活性肽占8.37%，3kDa-lkDa分子量段的活性肽占81.04%,分子量在IkDa以下的活性肽占10.59% ;純度為94.08% ;抗氧化作用包括:體外清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和 ABTS 自由基的 IC5。值分別為 0.75mg/mL、0.92mg/mL、0.71mg/mL 和 0.52mg/mL。降血糖功能活性包括:體外對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值為58.98mg/L，對(duì)鏈脲佐菌素、鹽酸腎上腺素和四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用，飼喂花生非淀粉多糖治療實(shí)驗(yàn)后的空腹血糖值比實(shí)驗(yàn)前分別降低了 78.68%,83.42%和85.33%。
[0014]實(shí)施例3
花生柏粉碎過(guò)150目篩，取篩下物以花生柏粉碎篩下物與石油醚的質(zhì)量與體積比為1:10.2 (g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C)，在51°C恒溫水浴振蕩器中，以325"min轉(zhuǎn)速往復(fù)式振蕩脫脂16h，通風(fēng)櫥中揮發(fā)石油醚，得到干燥脫脂的花生柏粉，以脫脂的花生柏粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為1:9.7 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸餾水，在微波功率800w、加熱溫度47.5°C、加熱時(shí)間3.2min條件下，微波加熱混合均勻，得到花生柏懸浮液，調(diào)節(jié)花生柏懸浮液pH值至5.8，加入每克花生柏粉18.2FBG (FBG為復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的酶活單位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、β _葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶在內(nèi)的復(fù)合多糖酶)，在微波功率800w、加熱溫度52.5°C、加熱時(shí)間9.4min條件下微波輔助酶解,得到Viscozyme L酶解液JMfViscozyme L酶解液pH值至7.2,加入以堿性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:無(wú)花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的復(fù)合蛋白酶，加入量為每克花生柏粉6805U (U為復(fù)合蛋白酶的酶活單位)，在微波功率800w、加熱溫度55.6°C、加熱時(shí)間12.3min條件下微波輔助酶解，100°c沸水浴中滅酶5min, 7200r/min離心18min ;上清液I加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，冰箱中靜置過(guò)夜，7200r/min離心18min，上清液2在水浴加熱溫度73°C、真空度0.1MPa條件下，以224r/min轉(zhuǎn)速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,取濃縮液在Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)中以3.45bar壓力、25°C、34ml/min進(jìn)料流速、1kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行一級(jí)超濾，取透過(guò)液I再以4.25bar壓力、25 °C、24ml/min進(jìn)料流速、5kDa的Pe11 icon XL超濾膜管匣進(jìn)行二級(jí)超濾分離濃縮，取透過(guò)液2在_55°C、真空度0.1MPa條件下，冷凍干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范圍為3kDa_5kDa分子量段的活性肽占11.12%, 3kDa_lkDa分子量段的活性肽占79.88%,分子量在IkDa以下的活性肽占9.00% ;純度為93.97% ;抗氧化作用包括:體外清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基和 ABTS 自由基的 IC50 值分別為 0.36mg/mL、0.52mg/mL、0.41mg/mL 和 0.19mg/mL。降血糖功能活性包括:體外對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值為52.55mg/L，對(duì)鏈脲佐菌素、鹽酸腎上腺素和四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用，飼喂花生非淀粉多糖治療實(shí)驗(yàn)后的空腹血糖值比實(shí)驗(yàn)前分別降低了 86.87%,88.89%和90.61%。
[0015]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，包括以下步驟: (1)花生柏粉碎過(guò)150目篩，篩下物加入石油醚脫脂，干燥得到脫脂的花生柏粉，加入蒸懼水，微波加熱混合均勻，調(diào)節(jié)pH值,加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L,微波輔助酶解，得到Viscozyme L酶解液； (2)調(diào)節(jié)ViscozymeL酶解液pH值,加入復(fù)合蛋白酶,微波輔助酶解,滅酶,離心； (3)上清液I加入4倍于其體積的無(wú)水乙醇，冰箱中靜置過(guò)夜，離心，上清液2真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，超濾膜分離濃縮，透過(guò)液冷凍干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步驟(I)所述的花生柏粉碎篩下物與石油醚的質(zhì)量與體積比為1:8.3-10.2 (g/ml),石油醚沸程為30-60°C，脫脂的條件為51°C恒溫水浴振蕩器中，以325r/min轉(zhuǎn)速往復(fù)式振蕩脫脂16h，通風(fēng)櫥中揮發(fā)干燥，脫脂的花生柏粉與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為1:9.7-10.7(g/ml)，微波功率800w、加熱溫度47.5°C、加熱時(shí)間3.2min條件下混合均勻，pH值調(diào)節(jié)至.4.8-5.8, Viscozyme L 加入量為每克花生柏粉 17.5-20.5FBG (FBG 為 Viscozyme L 的酶活單位)，微波功率800w、加熱溫度45.5-52.5°C、加熱時(shí)間8.5-10.5min條件下酶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步驟(2)所述的pH值調(diào)節(jié)至7.2-8.2,復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶Neutral Protease、無(wú)花果蛋白酶以2.1: 1.8:2.5:2.6比例混合的復(fù)合蛋白酶，加入量為每克花生柏粉5000-7000U (U為復(fù)合蛋白酶的酶活單位)，酶解的條件為微波功率800w、加熱溫度50-60°C、加熱時(shí)間4.5-12.5min, 100°C滅酶5min，7200r/min離心18min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熱榨花生柏制備葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步驟(3)所述的離心條件為7200r/min離心18min,在水浴加熱溫度73°C、真空度.0.1MPa條件下，以224r/min轉(zhuǎn)速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)中以.3.45bar壓力、25°C、34ml/min進(jìn)料流速、1kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行一級(jí)超濾，再以4.25bar壓力、25°C、24ml/min進(jìn)料流速、5kDa的Pellicon XL超濾膜管匣進(jìn)行二級(jí)超濾分離濃縮，冷凍干燥條件為_(kāi)55°C、真空度0.1MPa，干燥48h。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104342475SQ201410547450
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】齊宏濤 申請(qǐng)人:青島博之源生物技術(shù)有限公司