一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑中的用途，特異性LAMP引物根據(jù)Msp5基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物：外，內(nèi)，環(huán)引物，正向外引物命名為Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內(nèi)引物命名為Msp5-FIPb，反向內(nèi)引物命名為Msp5-BIPb，為了加速反應(yīng)設(shè)計(jì)環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物Msp5-LBb，三對(duì)的外引物用于PCR檢測(cè)。在63℃條件下進(jìn)行LAMP反應(yīng)20分鐘后，LAMP產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳顯示呈階梯狀圖案。該方法具有高特異性，高靈敏度，時(shí)間短且操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
【專利說明】一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的 試劑中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣 無(wú)漿體病原的試劑中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛邊緣無(wú)漿體病是一種由邊緣無(wú)漿體經(jīng)蜱傳播的專性寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的血液傳 染疾病,主要引起牛、羊等反芻動(dòng)物發(fā)病，。其特征為高熱、貧血、消瘦、黃疸和膽囊腫大并 廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)引起奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失（Katherine et al.，2010)。檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體的常見基因包括16S rRNA，熱休克蛋白（groEL基因） (Lew et al.，2003)，主要表面蛋白-Ia(Mspla) (Lew et al.，2002;Molad et al.，2004), Msp4(Molad et al·，2004)和 Msp5(Molad et al·，2004 ;Corona et al·，2009)。牛邊緣 無(wú)漿體主要表面蛋白Msp5是由633bp單拷貝基因編碼高度保守的19ku的蛋白，在免疫印 跡試驗(yàn)中通過與單克隆抗體表面蛋白結(jié)合，Msp5 ANAF16C1證明在已知的無(wú)楽體屬的幾個(gè) 亞種中是高度保守的（Visser et al. ,1992 ;Ybafiezet al. ,2012)。因此，Msp5可以作 為一種有效的診斷抗原。傳統(tǒng)的檢測(cè)邊緣無(wú)漿體Msp5基因的方法是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸 附法（CELISA) (Strik et al·，2007 ;Echaide et al·，1998)競(jìng)爭(zhēng)抑制性酶聯(lián)免疫吸附法 (CI-ELISA) (NI et al.，2011)，間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT) (0ΙΕ，2009)，套式PCR法（Echaide et al.，1998)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Picoloto et al.，2010)和半套式 PCR 測(cè)定法（Singh et al.，2012)。但是這些方法還有許多缺陷，例如，它們必須在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并且反應(yīng)需要 很長(zhǎng)的時(shí)間。自2000年以來，Notomi開發(fā)出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP)，在恒溫條件 (60°C _65°C )下，不到Ih的時(shí)間里進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、等溫靈敏、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物 易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)動(dòng)物病原（病毒、細(xì)菌、寄生 蟲）（Tomita et al.，2008)。然而，使用LAMP技術(shù)診斷牛邊緣無(wú)漿體病尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在 制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑中的用途，根據(jù)牛邊緣無(wú)漿體保守基因 Msp5設(shè)計(jì)了引 物，評(píng)估LAMP技術(shù)的檢測(cè)方法。
[0004] 其具體技術(shù)方案為：
[0005] -種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑中的用途，
[0006] 特異性LAMP引物根據(jù)Msp5基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物：外，內(nèi)，環(huán)引物，正向外引物命名 為Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內(nèi)引物命名為Msp5-FIPb，反向內(nèi)引物命名 為Msp5-BIPb，為了加速反應(yīng)設(shè)計(jì)環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物 Msp5-LBb，三對(duì)的外引物用于PCR檢測(cè)；
[0007]

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑中的用途，其特征在 于， 特異性LAMP引物根據(jù)Msp5基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物：外，內(nèi)，環(huán)引物，正向外引物命名為 Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內(nèi)引物命名為Msp5-FIPb，反向內(nèi)引物命名 為Msp5-BIPb，為了加速反應(yīng)設(shè)計(jì)環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物 Msp5-LBb，三對(duì)的外引物用于PCR檢測(cè)； Msp5-F3b ACCTTCTGCTGTTCGTTG Msp5-B3b GAGAAGCCATGCCTAACTC Msp5-FIPb GTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGA (Flc+F2) GAGGTTTAC Msp5-BIPb CCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGG (Blc+B2) CTGAGAAGC Msp5-LFb TGCCCTCACTTACAACTTCG Msp5-LBb CGGCAAGCACATGTTGGTA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物在制備檢測(cè)牛邊緣無(wú)漿體病原的試劑 中的用途，其特征在于，采用以下步驟完成： LAMP反應(yīng)體系是25 μ L，包括0. 4 μ Μ外引物，1. 6 μ Μ內(nèi)引物，0. 8 μ Μ環(huán)引物，1 μ LDNA 樣品，硫酸緩11111(11'01:>]\^11111111，11111]1甜菜喊，2.5 4 1^10\11161'1]1(^〇1131^€61'111的138七0嫩聚 合酶，加 ddH20共25 μ L ;混勻后，加入20 μ L油混勻并離心；在PCR管的中下部加入0. 5 μ L SYBR GREEN I染料然后輕輕蓋上，以防止SYBR GREEN I染料降入管底；將混合物在63°C下 恒溫反應(yīng)20分鐘；反應(yīng)后，在光亮視野下觀察到混合物與SYBR GREEN I染料在PCR管中的 顏色變化，并在紫外線照射下365nm處也可觀察到；之后LAMP產(chǎn)物3 μ L用0. 8 %瓊脂糖凝 膠電泳分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293936SQ201410509621
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】倪宏波, 王欣, 王云光, 安先全, 蔣慧婷 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)