多色fish用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多色FISH用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒，包括如下步驟：對(duì)肺癌組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用多色FISH探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。本發(fā)明的肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法通過(guò)對(duì)肺癌組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用高分辯多色FISH進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。本法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性高，可以快速，準(zhǔn)確，直觀檢測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師對(duì)肺癌進(jìn)行精確分子分型的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】多色FISH用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病相關(guān)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的，涉及肺癌相關(guān)融合基因檢測(cè)技 術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)方法和相關(guān)檢測(cè)探針及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來(lái)許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不 完全明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。
[0003] 根據(jù)肺癌的生長(zhǎng)、侵犯及轉(zhuǎn)移速度和范圍以及對(duì)化療藥物和放射治療的敏感性， 臨床將肺癌分為小細(xì)胞肺癌（SCLC)及非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)，后者占肺癌發(fā)病率80%左 右。只有合理應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、靶向治療等方法，才能獲得較好控制率，延長(zhǎng)生存期。
[0004] 在過(guò)去的幾十年里，雖然科學(xué)家們不斷地探索非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)化療和放療 的方法，但取得的成果仍不能令人滿意，例如晚期肺癌患者的平均生存時(shí)間仍未超過(guò)一年， 療效不確定，部分患者會(huì)出現(xiàn)一些毒副反應(yīng)，如惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，影響了生活質(zhì)量， 甚至中斷治療。傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化學(xué)藥物可比作是"殺敵一千，自損八百"，因而許多患者對(duì) 此是談之色變，而靶向治療正是科學(xué)家們幾十年來(lái)致力于分辨癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子 生物學(xué)差異的臨床研究成果。
[0005] 所謂靶向治療，就是通過(guò)基因或分子的選擇，有針對(duì)性地殺死惡性腫瘤細(xì)胞，而幾 乎不影響正常細(xì)胞。這一劃時(shí)代的生物腫瘤療法的特點(diǎn)可以總結(jié)為4個(gè)字："高效低毒"。 一方面，祀向治療大大提1? 了腫瘤治療的療效；另一方面，祀向治療減少患者在治療中的副 作用，提高生活質(zhì)量。
[0006] 靶向治療是指在分子生物學(xué)診斷的基礎(chǔ)上，利用肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間存在 的差異，有針對(duì)性地抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，例如，采用拮抗受體、抑制腫瘤生長(zhǎng)所需的 血管和阻斷腫瘤生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路等方法來(lái)抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，從而達(dá)到治療目 的。
[0007] ALK-EML4融合基因是肺癌靶向治療新寵。ALK-EML4融合基因可見(jiàn)于多種腫瘤， 例如間變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎性成肌纖維細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC) 等，它是由第2號(hào)染色體短臂片段顛換（inversion)引起。ALK-EML4的發(fā)現(xiàn)，代表了一種 NSCLC的分子亞型，該組患者具有獨(dú)特的臨床特征：不能從EGFR-TKI靶向治療中獲益。接 受EGFR-TKI治療的野生型患者和ALK陽(yáng)性患者相比，后者可能更容易產(chǎn)生耐藥。ALK-EML4 的發(fā)現(xiàn)促使肺癌治療朝向"個(gè)體化"的目標(biāo)邁近了一步。雖然ALK-EML4融合基因僅有 4% -10%的陽(yáng)性率，在ALK-EML4融合基因陽(yáng)性的患者中，其抑制劑Crizotinib的療效可達(dá) 60%以上。美國(guó)FDA迅速批準(zhǔn)Crizotinib上市，對(duì)于ALK-EML4融合基因陽(yáng)性的患者是個(gè) 福音。由于該基因較低的陽(yáng)性率，所以在使用前應(yīng)行基因檢測(cè)，只有在陽(yáng)性的患者中才建議 使用。
[0008] ALK基因，間變型淋巴瘤激酶基因，定位于染色體2p23。FISH可檢測(cè)與ALK基因 相關(guān)的染色體易位，包括EML4、TFG和KIF5B及其他基因融合。雅培Vysis ALK雙色分離 探針試劑盒是第一個(gè)針對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者新型亞類的伴隨診斷試劑，適用于福爾馬林固 定、石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌組織切片樣本。選擇XALKORI (crizotinib)藥物治療的必要 條件是FISH檢測(cè)ALK陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌。雅培Vysis ALK雙色分離探針試劑盒和輝瑞 的XALKORI (crizotinib)同時(shí)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。另外，此探針也可用于間變型大細(xì)胞淋 巴瘤的輔助診斷。
[0009] 然而，目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的ALK FISH檢測(cè)試劑盒（雅培Vysis ALK雙色分離探針 試劑盒）僅能檢測(cè)ALK基因的斷裂，但不能判斷ALK斷裂后是否和EMBL4發(fā)生融合，因此提 供給臨床醫(yī)生的信息不夠全面，不利于肺癌的精確分子分型和靶向治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問(wèn)題與不足，提供一種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)的改良方法，探針及試劑盒。該法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性高，可以快 速，準(zhǔn)確，直觀地測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師對(duì) 肺癌進(jìn)行分子分型的參考依據(jù)，適用于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種肺癌相關(guān)融合基因多色 FISH檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是，對(duì)肺癌組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用多色FISH探針 進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。
[0012] 較佳地，所述多色探針包括ALK 3'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針 (位于斷裂熱點(diǎn)5'端），和EML4全長(zhǎng)探針，其中ALK為SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列， EML4為SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0013] 更佳地，ALK基因3'端探針采用紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠色熒 光素標(biāo)記，EML4基因探針采用藍(lán)色突光素標(biāo)記。
[0014] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)的多色FISH 探針，所述多色探針包括ALK 3'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針（位于斷裂 熱點(diǎn)5'端），和EML4全長(zhǎng)探針，其中ALK為SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0015] 較佳的，所述ALK基因3'端探針采用紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠 色突光素標(biāo)記，EML4基因探針采用藍(lán)色突光素標(biāo)記。
[0016] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)試劑盒，包括多色 探針，所述多色探針包括ALK 3'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針（位于斷裂 熱點(diǎn)5'端），和EML4全長(zhǎng)探針，其中ALK為SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0017] 較佳的，所述ALK基因3'端探針采用紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠 色突光素標(biāo)記，EML4基因探針采用藍(lán)色突光素標(biāo)記。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)方法通過(guò)對(duì)肺癌 組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用高分辯多色FISH進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒 光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。本法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性 高，可以快速，準(zhǔn)確，直觀檢測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可 作為醫(yī)師對(duì)肺癌進(jìn)行精確分子分型的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。下列具體實(shí)施 例采用的主要試劑，儀器和操作步驟如下：
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一、探針DNA的獲取
[0022] 1)劃線接種：將攜帶有ALK基因和EML4的BAC菌種劃線接種于含有抗生素（氯 霉素）的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜（約14小時(shí)）。
[0023] 2)初始培養(yǎng)：次日挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單克隆菌種，接種于2ml含有抗生素（氯 霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床，設(shè)置搖床速度約200rpm，培養(yǎng)6-8小時(shí)。
[0024] 3)過(guò)夜培養(yǎng)：每1ml菌液轉(zhuǎn)移至200ml培養(yǎng)體系，放置于37°C搖床，轉(zhuǎn)速200rpm， 培養(yǎng)過(guò)夜（約14-16小時(shí)）。
[0025] 4)次日按照QIAGEN公司質(zhì)粒大量提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA大量提取和純化。
[0026] 二、探針標(biāo)記
[0027] 1.酶切 DNA:
[0028] 1)按照以下反應(yīng)體系對(duì)目的DNA進(jìn)行酶切
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：對(duì)肺癌組織石 蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用多色FISH探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)判 斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)方法，其特征在于，所述多色探 針包括ALK 3'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)5'端），和 EML4全長(zhǎng)探針，其中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO :2所示的 核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)方法，其特征在于ALK基因3' 端探針采用紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠色熒光素標(biāo)記，EML4基因探針采用 藍(lán)色突光素標(biāo)記。
4. 一種用于肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)的多色FISH探針，其特征在于，包括ALK 3' 端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)5'端），和EML4全長(zhǎng)探針。 其中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)的多色FISH探針，其特征 在于：ALK基因3'端探針采用紅色突光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠色突光素標(biāo)記， EML4基因探針采用藍(lán)色突光素標(biāo)記。
6. -種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括多色FISH探針，所述多 色FISH探針包括ALK 3'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)3'端），ALK 5'端探針（位于斷裂熱點(diǎn)5' 端），和EML4全長(zhǎng)探針。其中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO : 2所示的核苷酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于：ALK基因 3'端探針采用紅色突光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針采用綠色突光素標(biāo)記，EML4基因探針采 用藍(lán)色熒光素標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104195258SQ201410470181
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】繆為民 申請(qǐng)人:江蘇蒙特立生物技術(shù)有限公司