一種fish檢測肺癌基因擴增的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種FISH檢測肺癌基因擴增的方法及試劑盒，該方法對肺癌組織石蠟切片進行常規(guī)預處理，然后采用一組雙色探針進行原位雜交，根據檢測到的熒光信號判斷是否存在所述肺癌相關基因的擴增；所述一組雙色探針是(1)標記為紅色的PDGFRB基因探針(2)標記為綠色的5號染色體中心粒探針；其中PDGFRB：Entrez Gene ID:5159。本發(fā)明方法特異性和敏感性強，可以快速，準確，直觀檢測出肺癌細胞中PDGFRB基因擴增狀況，檢測結果準確可靠，適合于大規(guī)模推廣使用。
【專利說明】-種FISH檢測肺癌基因擴增的方法及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病相關基因檢測【技術領域】，具體是指一種肺癌TOGFRB基因擴增的 FISH檢測方法和相關檢測探針及試劑盒。

【背景技術】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不 完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關系。
[0003] 根據肺癌的生長、侵犯及轉移速度和范圍以及對化療藥物和放射治療的敏感性， 臨床將肺癌分為小細胞肺癌（SCLC)及非小細胞肺癌（NSCLC)，后者占肺癌發(fā)病率80%左 右。只有合理應用手術、放療、化療、靶向治療等方法，才能獲得較好控制率，延長生存期。
[0004] 在過去的幾十年里，雖然科學家們不斷地探索非小細胞肺癌（NSCLC)化療和放療 的方法，但取得的成果仍不能令人滿意，例如晚期肺癌患者的平均生存時間仍未超過一年， 療效不確定，部分患者會出現一些毒副反應，如惡心、嘔吐等胃腸道反應，影響了生活質量， 甚至中斷治療。傳統(tǒng)的細胞毒性化學藥物可比作是"殺敵一千，自損八百"，因而許多患者對 此是談之色變，而靶向治療正是科學家們幾十年來致力于分辨癌細胞與正常細胞之間分子 生物學差異的臨床研究成果。
[0005] 所謂靶向治療，就是通過基因或分子的選擇，有針對性地殺死惡性腫瘤細胞，而幾 乎不影響正常細胞。這一劃時代的生物腫瘤療法的特點可以總結為4個字："高效低毒"。 一方面，祀向治療大大提1? 了腫瘤治療的療效；另一方面，祀向治療減少患者在治療中的副 作用，提高生活質量。
[0006] 靶向治療是指在分子生物學診斷的基礎上，利用肺癌細胞和正常細胞之間存在 的差異，有針對性地抑制肺癌細胞生長和增殖，例如，采用拮抗受體、抑制腫瘤生長所需的 血管和阻斷腫瘤生長的信號傳導通路等方法來抑制肺癌細胞生長和增殖，從而達到治療目 的。
[0007] 原癌基因（proto-oncogene)是細胞內與細胞增殖相關的基因，是維持機體正常 生命活動所必須的，在進化上高度保守。當原癌基因的結構或調控區(qū)發(fā)生變異，基因產物增 多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。PDGFRB是一種和肺癌發(fā)病密切相關的位 于人類5號染色體（5q33)的原癌基因。TOGFRB基因的擴增，對于肺癌的靶向治療具有重要 指導意義。
[0008] 目前，市場上檢測TOGFRB基因擴增主要用PCR方法，由于檢測的是腫瘤和正常細 胞的混合物，因此結果不夠準確，而市場上亦迫切需要一種更為準確的檢測方法。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種肺癌TOGFRB基因 擴增的FISH檢測方法，探針及試劑盒。該法設計周全，操作簡單，特異性和敏感性高，可以 快速，準確，直觀地測出肺癌TOGFRB基因的擴增，檢測結果準確可靠，從而可作為醫(yī)師對肺 癌進行分子病理分型的參考依據，適用于大規(guī)模推廣應用。
[0010] 本發(fā)明采用的技術方案為：
[0011] 一種肺癌相關I3DGFRB基因擴增的FISH檢測的一組雙色FISH探針，所述一組雙色 探針是（1)標記為紅色的TOGFRB基因探針（2)標記為綠色的5號染色體中心粒探針。其 中PDGFRB:EntrezGeneID:5159。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種肺癌相關I3DGFRB基因擴增的FISH檢測試劑盒，包括一組雙 色FISH探針，所述一組雙色探針是（1)標記為紅色的TOGFRB基因探針（2)標記為綠色的 5號染色體中心粒探針。其中I3DGFRB:EntrezGeneID:5159。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種肺癌TOGFRB基因擴增的FISH檢測方法，包括如下步驟：對 肺癌組織石蠟切片進行常規(guī)預處理，然后采用一組雙色探針進行原位雜交，根據檢測到的 熒光信號判斷是否存在所述肺癌相關基因的擴增；所述一組雙色探針是（1)標記為紅色 的TOGFRB基因探針（2)標記為綠色的5號染色體中心粒探針；其中roGFRB:EntrezGene ID:5159。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的肺癌H)GFRB基因擴增FISH檢測方法通過對肺 癌組織石蠟切片進行常規(guī)預處理，然后采用一組雙色探針進行原位雜交，根據檢測到的熒 光信號判斷是否存在所述肺癌相關基因的擴增狀態(tài)。本法設計周全，操作簡單，特異性和敏 感性高，可以快速，準確，直觀地檢測出肺癌相關I3DGFRB基因的擴增狀態(tài)，檢測結果準確可 靠，從而可作為醫(yī)師對肺癌進行精確分子病理分型的參考依據，適于大規(guī)模推廣應用。

【具體實施方式】
[0015] 為更好的理解本發(fā)明的內容，下面結合具體實施例作進一步說明。下列具體實施 例采用的主要試劑，儀器和操作步驟如下：
[0016] 實施例1
[0017] 一、探針DNA的獲取
[0018] 1)劃線接種：將攜帶有I3DGFRB基因和5號染色體中心粒的BAC菌種劃線接種于 含有抗生素（氯霉素）的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜（約14小時）。
[0019] 2)初始培養(yǎng)：次日挑取生長狀態(tài)良好的單克隆菌種，接種于2ml含有抗生素（氯 霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床，設置搖床速度約200rpm，培養(yǎng)6-8小時。
[0020] 3)過夜培養(yǎng)：每Iml菌液轉移至200ml培養(yǎng)體系，放置于37°C搖床，轉速200rpm， 培養(yǎng)過夜（約14-16小時）。
[0021] 4)次日按照QIAGEN公司質粒大量提取試劑盒操作說明進行DNA大量提取和純化。
[0022] 二、探針標記
[0023] 1.酶切DNA:
[0024] 1)按照以下反應體系對目的DNA進行酶切
[0025]

【權利要求】
1. 一種肺癌相關roGFRB基因擴增的FISH檢測的一組雙色FISH探針，其特征在于：所 述一組雙色探針是（1)標記為紅色的TOGFRB基因探針（2)標記為綠色的5號染色體中心 粒探針；其中 PDGFRB:Entrez Gene ID:5159。
2. -種肺癌相關TOGFRB基因擴增的FISH檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括一 組雙色FISH探針，所述一組雙色探針是（1)標記為紅色的TOGFRB基因探針（2)標記為綠 色的5號染色體中心粒探針；其中roGFRB:Entrez Gene ID:5159。
3. -種肺癌TOGFRB基因擴增的FISH檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：對肺癌組 織石蠟切片進行常規(guī)預處理，然后采用一組雙色探針進行原位雜交，根據檢測到的熒光信 號判斷是否存在所述肺癌相關基因的擴增；所述一組雙色探針是（1)標記為紅色的TOGFRB 基因探針（2)標記為綠色的5號染色體中心粒探針；其中TOGFRB :Entrez Gene ID:5159。
【文檔編號】C12Q1/68GK104278095SQ201410514904
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】繆為民 申請人:天津蒙特立醫(yī)療科技有限責任公司