用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊，所述襯墊將所述盒體分隔為上下兩部分，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有32條逆轉(zhuǎn)錄特異性引物的試劑管、裝有dNTP的試劑管、裝有逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑管、裝有RNA酶抑制劑的試劑管和裝有逆轉(zhuǎn)錄緩沖液的試劑管、裝有PCR?MIX試劑的試劑管被設(shè)置在所述小孔內(nèi)；分別裝有110條PCR擴(kuò)增引物的試劑管被放置在所述襯墊下方的盒體內(nèi)。該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計合理，在使用該試劑盒篩查31種血液病融合基因時，可以快速、簡便地得到檢測結(jié)果，便于在臨床檢測中推廣應(yīng)用。
【專利說明】用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)工作者們發(fā)現(xiàn)越來越多的血液病的發(fā)生、發(fā)展與基因異常有關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)與白血病有關(guān)的基因多達(dá)數(shù)百種之多，通過檢測這些基因可以幫助血液病的的類型、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療、檢測微小殘留白血病(MRD)。
[0003]目前常檢測的與血液病有關(guān)的基因如下:
[0004](DCBFB/MYHll:Inv(16) (pl3q22)是急性髓系白血病(AML)特征性染色體異常，通常見于AML-M4EO亞型，占總AML患者的10%，其中50%發(fā)生在AML-M4EO中。帶有Inv(16)(pl3q22)的病人通常有較好的預(yù)后。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0005](2)AML1/ET0:t(8, 21) (q22;q22)在 1973 年首次報道。AMLI/ETO 融合基因出現(xiàn)在所有的t (8，21)陽性的AML中，同時也出現(xiàn)在具有復(fù)雜移位的t (8，21)陰性的AML病例中。t(8, 21)出現(xiàn)在大約7%的AML病例中，在年輕的患者中更為常見。其主要出現(xiàn)在AML-M2這一亞型中，大約有20-40%病例具有t (8，21)。在非常少見的AML-Ml，AML-M4和t_AML中也有報道。t(8，21)異位是一個較好的標(biāo)志，它的存在使這類病例對一些藥物有較好的反應(yīng)。因此基于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的檢測結(jié)果，可以為病人選擇風(fēng)險低的較好的治療方案。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0006](3)PML/RARa:t(15, 17)易位是APL的一個典型標(biāo)志，其易位造成了 15號染色體上的PML基因和17號染色體上的RARa基因的融合，產(chǎn)生了一個融合基因PML/RARa。由于PML基因上融合位點的不同，PML/RARa有三種融合型，即:bcrl (55%), bcr2 (5%), bcr3 (40%)。檢測PML/RARa融合基因的存在與否，對APL的診斷，判斷ATRA的療效和預(yù)后復(fù)發(fā)都非常重要。PML/RARa陽性強烈預(yù)示著復(fù)發(fā)的可能，而其持續(xù)性陰性則預(yù)示病人有更長的生存期。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0007](4)E2A/PBX1:t (1:19)導(dǎo)致了 19號染色體上的E2A基因和I號染色體上的PBXl基因的融合，產(chǎn)生了融合基因E2A/RBX1，在5-6%的兒童ALL和3%的成人ALL檢測到，幾乎全部出現(xiàn)在前B細(xì)胞ALL病例中。攜帶有該易位的病人，其臨床癥狀都比較兇險。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0008](5)MLL/AF4:在50-70%的嬰幼兒ALL和將近5%的小兒和成人ALL病例中有MLL/AF4 融合基因。t(4, 11) (q21;q23)與前 B-ALL(CD79A+，CD19+，CD10-, CD24-)相關(guān)，同時與粒系分化抗原⑶16和⑶65以及NG2抗原共表達(dá)。MLL/AF4融合基因在所有t (4; 11)移位的病例中存在，也存在于相當(dāng)一部分細(xì)胞遺傳學(xué)沒有檢測到t (4; 11)移位的病例中。在嬰幼兒ALL中MLL/AF4融合基因被認(rèn)為是預(yù)后不良的標(biāo)志。在成人ALL中也是一個不良的標(biāo)志，但對于成人ALL，該融合基因的存在似乎能增強高劑量的Ara-C的療效。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0009](6) BCR/ABL:在超過95%的CML病人的白血病細(xì)胞中，30% (20-50%)的成人ALL和2-10%的兒童ALL中，以及小于2%的AML (淋巴瘤和骨髓瘤)的病例中有BCR/ABL融合基因。在CML中BCR/ABL融合基因都是p210型的，在CML病例中有55%的b3_a2型，40%的b2_a2型。在5%的病例中b3_a2和b2_a2型由于剪接的不同同時存在。另外，在非常少的ph+的CML病人中存在一種大的BCR/ABL融合基因el9_a2，即u_bcr，p230型BCR/ABL融合基因。在30-50%的成人ph+的ALL，20-30%兒童ph+的ALL病例中BCR/ABL融合基因是P210型的。還有60%的ph+的ALL患者的BCR/ABL融合基因是pl90型的。在ALL中，Ph陽性和隨之出現(xiàn)的BCR/ABL融合基因是一個非常不好的標(biāo)志，它影響著病人血相的完全緩解率和可能的生成率。該基因陽性的病人，可用格列衛(wèi)進(jìn)行治療，并可進(jìn)行療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0010](7)TEL/AML1:t(12;21) (pl3;q22)易位最早在1995年被報道。隨后的報道發(fā)現(xiàn)這種普通遺傳學(xué)無法檢測的易位，是兒童ALL中最為常見的易位。幾乎25%的小兒ALL有該易位。其主要的陽性病人出現(xiàn)在1-12歲之間，其中最多的在2-5歲的這個年齡段。所有的病例其免疫分型都是前B細(xì)胞ALL。另外，這類病人的另一個特征是其白細(xì)胞比較低。t(12;21)陽性的病人都有較好的預(yù)后，其復(fù)發(fā)的時間也會較晚。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0011](8)SIL/TAL1:位于染色體1ρ32上的TALl基因可以通過多種遺傳變異導(dǎo)致在T細(xì)胞中異常表達(dá)。其中最常見的重組方式是TALl基因上游約90kb的DNA缺失，導(dǎo)致SIL與TALl融合，這種染色體內(nèi)微缺失全部出現(xiàn)在T-ALL病例中。SIL/TAL1融合基因與T-ALL的免疫表型密切相關(guān)。SIL/TAL1融合基因可以在26%的兒童T-ALL病例和16%的成人(主要是年輕成人)T-ALL病例檢測到。SIL/TAL1融合基因與T-ALL預(yù)后的關(guān)系還不是很清楚。該融合基因可以用于T-ALL的輔助診斷，該融合基因還可以用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。
[0012](9)EVI1:定位于染色體3q26。在小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)的急性髓系白血病模型中，EVIl是病毒常見的插入位點。EVIl編碼一個能結(jié)合DNA的鋅指蛋白，其過度表達(dá)在髓系惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。與其表達(dá)相關(guān)的還有MDS和CML?，F(xiàn)階段的研究表明EVIl高表達(dá)的患者的預(yù)后不良，但其機(jī)制尚未清晰。
[0013](IO)HOXll:據(jù)細(xì)胞基因?qū)W研究，4-7%的T-ALL中涉及染色體10q24的易位。HOXll正是定位在10q24上，并被t(10;14) (q24;qll)易位以及t(7;10) (q35;q24)易位激活。B-ALL中無HOXll的發(fā)現(xiàn)。在現(xiàn)階段的文獻(xiàn)報道中，HOXlI高表達(dá)的兒童T-ALL的預(yù)后較陰性者有優(yōu)勢。成人中也有相似的論斷。低表達(dá)的HOXll與陰性者無統(tǒng)計學(xué)差異。
[0014](11)MLL/AF10:MLL/AF10 與 AML 相關(guān)，染色體上表現(xiàn)為 t(10;ll) (pl2;q23)的易位,主要見于AML-M5型患者,兒童多見,80%的患者小于3歲。MLL/AF10陽性的患者的預(yù)后差。
[0015](12)MLL-AF9:t(9;ll) (p22;q23)易位主要發(fā)生在 AML 中，是 AML 中 t(llq23)最常見的易位形式。MLL-AF9的病人的預(yù)后較差。
[0016](13)MLL/ENL:t(ll; 19) (q23;pl3.3)易位可見于 ALL, AML-M4, M5, Ml, M2。以小于I歲的嬰兒多見，中位生存期為17.6月。易位導(dǎo)致MLL-ENL融合基因形成。預(yù)后尚無確切說明，與年齡，免疫表型相關(guān)。
[0017](14)MLL/ELL:t(ll;19) (q23;pl3.1)占 llq23 異常的 3.8%，為 AML 特征性異常，年齡以成人為主。白細(xì)胞20X 109/L，F(xiàn)AB分型M4或M5，免疫表型為⑶13⑶33，⑶14⑶15，⑶11，HLA-DR表達(dá)陽性。易位導(dǎo)致MLL-ELL融合基因形成。預(yù)后不良，2年無病生存率50%。
[0018](15) MLL/AFX: t (X; 11) (ql3; q23)易位僅有體外分子的一些研究研究表明MLL-AFX可以增強造血干細(xì)胞的自我更新并阻止它們成熟。無預(yù)后相關(guān)資料。
[0019](16)MLL/AFlq:t(l;ll) (q21;q23)易位，多發(fā)于 AML。關(guān)于 MLL/AFlq 的預(yù)后說法存在爭論:在一項研究中，高表達(dá)的AFlq是一個獨立的不良預(yù)后因子；另一項研究表明MLL-AFlq陽性的患者預(yù)后良好，是否因為MLL-AFlq的形成改變了 AFlq的表達(dá)還不得而知。
[0020](17)MLL/AFlp:t(l;ll) (p32;q23)易位，ALL, AML, MDS 中均有發(fā)現(xiàn)。中位生存期為15個月。預(yù)后與性別及分型相關(guān)，女性的中位生存期可達(dá)28個月，而男性為11個月。缺乏關(guān)于預(yù)后的相關(guān)文獻(xiàn)。
[0021](18)PLZF/RARa:t(ll;17) (q23;q21)易位，特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴細(xì)胞白血病M3型中發(fā)現(xiàn)。功能尚不明確。預(yù)后明顯差與有t(15;17)易位的ANLL M3型，其對ATRA的化療無反應(yīng)。
[0022](19)MLL/AF6:t(6;ll) (q27;q23)是 llq23 中常見的易位，長發(fā)與 AML，特別是 M4，M5中，在T-ALL中也有發(fā)現(xiàn)。預(yù)后非常差，幾乎無緩解，生存期短。
[0023](20)MLL/MLL:llq23的部分串聯(lián)重復(fù)(MLL-PTD)，已經(jīng)在10%的正常核型的AML中檢測出MLL-PTD，可以作為穩(wěn)定的MRD的監(jiān)測標(biāo)記。預(yù)后差，臨床緩解率低。
[0024](21)TLS/ERG:t(16;21) (pll;q22)易位多見于年輕患者，F(xiàn)AB各亞型均見。預(yù)后不良，可能不能達(dá)到完全緩解，一年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高，中位生存期為22個月。
[0025](22)TEL/PDGFR:t(5;12) (q33;pl3)易位形成的融合基因，與 Ras/ERK 和 STAT5 信號傳導(dǎo)通路相關(guān)，誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。預(yù)后尚不明確，中位生存期〈20個月(n=ll)。
[0026](23)TEL/ABL:t(9;12) (q34;pl3)易位罕見，至 2010 年只有 19 例被報道于CML, AML, ALL中。數(shù)量少，從報道的病例上看，預(yù)后不良。
[0027](24)SET/CAN:t(9;9) (q34;q34)易位，罕見，作用不明。有文獻(xiàn)報道稱SET-CAN可以抑制增生，促分化。
[0028](25)DEK/CAN:t(6;9) (p23;q34)易位，由位于 9q34 的 CAN 基因與 6q23 的 DEK 基因融合，CAN基因是產(chǎn)物核孔復(fù)合物的一部分，能夠運送RNA及蛋白質(zhì)穿過核膜。在AML中占2%，主要為M2型，其次為M4。最初描述是以骨髓中正常嗜堿粒細(xì)胞增多為特征20%患者有既往MDS病史。年輕患者(20?30歲)。預(yù)后差。
[0029](26) MLL/AF17: t (11; 17) (q23; ql2-21)易位，發(fā)現(xiàn)于 AML 中。無預(yù)后相關(guān)文獻(xiàn)。
[0030](27)E2A/HLF:t(17;19) (q22;pl3)易位產(chǎn)生E2A/HLF融合基因，發(fā)生在其少數(shù)的
ALL病例中。預(yù)后差，對密集化療無反應(yīng)，生存期短。
[0031](28)NPM/MLF1:t(3;5) (q25.1; q34)易位，在 MPS, MDS, ANLL (M2，M4，M6)中有發(fā)
現(xiàn)。預(yù)后非常差，中位生存期少于I年。
[0032](29)NPM/RARa:t(5;17) (q35;q22)易位發(fā)生于急性非淋巴細(xì)胞白血病，見于M3，即急性早幼粒細(xì)胞白血病。病例少，有記載的只有2例兒童病例，2例的復(fù)發(fā)時間都短，預(yù)后可能不樂觀。[0033](30)NPM1/ALK:t(2;5) (p23;q35)易位，2p23的易位發(fā)生在超過一半的間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)中，一種高級的非霍奇森淋巴瘤。雖然發(fā)生于高等級的侵襲性腫瘤中，但80%患者的生存期長于5年。
[0034](3DAML1/MDS1:t(3;21) (q26;q22)易位發(fā)生于 CML(約占 1%)，ANLL 和 MDS 中，通常與治療相關(guān)。預(yù)后不良，生存率低。
[0035]目前臨床常采用細(xì)胞遺傳學(xué)檢測分析染色體核型來識別、篩查染色體結(jié)構(gòu)畸變形成的融合基因，但該方法檢測周期長，很難識別微小的染色體異位，常不能滿足臨床需要。
實用新型內(nèi)容
[0036]為了解決上述技術(shù)問題，本實用新型的目的在于提供一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，可應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時在一個檢測體系中對不同的融合基因進(jìn)行檢測，可以快速、簡便地得到檢測結(jié)果。
[0037]為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)將所述盒體(I)分隔為上下兩部分，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有32條逆轉(zhuǎn)錄特異性引物的試劑管(4 )、裝有dNTP的試劑管(5 )、裝有逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑管(6 )、裝有RNA酶抑制劑的試劑管
(7)和裝有逆轉(zhuǎn)錄緩沖液的試劑管(8)、裝有PCR MIX試劑的試劑管(9)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)；分別裝有110條PCR擴(kuò)增引物的試劑管被放置在所述襯墊(3)下方的盒體內(nèi)。
[0038]其中，所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(10)。
[0039]其中，所述襯墊(3)上設(shè)有7個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
[0040]其中，所述32條逆轉(zhuǎn)錄特異性引物序列如下:
[0041]FG15’ -GCTGACATTGAT-3’
[0042]FG25’ -ACTCAAGCTGTG-3’
[0043]FG35’ -CCACGTGTGCCTCTC-3’
[0044]FG45’ -GTATTGACAGTAT-3 ’
[0045]FG55’ -GACACCTTGAAG-3 ’
[0046]FG65，-ATGGCTGGCTCAG-3 ’
[0047]FG75’ -AGGTCATTTTGAG-3 ’
[0048]FG85， -TTCCTCCTCTGAG-3’
[0049]FG95’ -CCGATCAATCTTT-3’
[0050]FG105，-CTGCCACACTT-3，
[0051]FGl 15，-GCATAACAGTTGT-3’
[0052]FG125’ -AAGTCTCCAACAG-3 ’
[0053]FG135’ -TTTGCACTCTGAT-3 ’
[0054]FG145’ -CGGTAATCGATTTC-3 ’
[0055]FG155，-CCCGTAACATAAC-3，
[0056]FG165，-TAAGGCTGCTCT-3，
[0057]FG175，-TTGCCTGGTACT-3 ’[0058]FG185’ -GCCCATGCTCAG-3 ’
[0059]FG195’ -CCAGCCTTGATG-3 ’
[0060]FG205，-TCTCCACGAAGT-3，
[0061]FG215’ -TGTCCAGCGTAGC-3 ’
[0062]FG225， -GTGTTAACTCTT-3，
[0063]FG235’ -GGCTATCCATACTT-3 ’
[0064]FG245’ -TGGGTACCTCTC-3’
[0065]FG255，-TGGCAATGGAAAG-3 ’
[0066]FG265’ -CTGCTGGGTGAG-3 ’
[0067]FG275’ -AGCTGCTTGATG-3 ’
[0068]FG285’ -CAGCGAACAATG-3 ’
[0069]FG295， -CCCTCCAGAAG-3’
[0070]FG305’ -CTGCAGGAAGGT-3 ’
[0071]FG315，-CGGTAAGCTCTC—3，
[0072]FG325’ -CCGATTACCTA-3’
[0073]其中，所述dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液和PCR MIX試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑。
[0074]其中，所述110條PCR擴(kuò)增引物的序列如下表:
[0075]第一輪引物序列:
[0076]FG335’ -TTTGACTCCCATGATTCTG-3 ’
[0077]FG345’ -AGGCCTTAGGCCAGCTTCTTCT-3 ’
[0078]FG355，-GAGCTGTCCGAGAGAGTGGAGAT-3，
[0079]FG365’ -CCGCCTCTGTTAGCCTACTAC-3 ’
[0080]FG375，-AGCACTCCAATGGCAATAGT-3，
[0081]FG385，-GGGTTCTCTGGCAGCACAGAT-3，
[0082]FG395，-CCGCTGCGACACTTCATAG-3 ’
[0083]FG405’ -ACACCCCAGTGTGTCCTGTATG-3 ’
[0084]FG415，-CCGCAATCTGCCACCTACTAC-3，
[0085]FG425’ -AGCACCTCCCAATGGCAATAGT-3 ’
[0086]FG435’ -GGATACCTTCTCTTCATCTGTGTC-3 ’
[0087]FG445’ -CCTCCAGTGGCTGCTCTGTGT-3 ’
[0088]FG455’ -CTGTTCTGTCATGGCTGCTACTG-3 ’
[0089]FG465’ -TTGCCCTCTGTGCACCTAGTCT-3 ’
[0090]FG475’ -5-TGGACTTTATCGGCACCATTAC-3 ’
[0091]FG485’ -TTTAGAGCACGAACACAGATGG-3 ’
[0092]FG495，-GCCACGCGAATTCCGCTAAC-3，
[0093]FG505，-CGACCCGCCAACCAGAG-3 ’
[0094]FG515’ -CGGTCCTGGTCCGGGCATATTT-3 ’
[0095]FG525，-GCCCACATGCTCCCTCAAGT-3，
【權(quán)利要求】
1.一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，其特征在于:包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)將所述盒體(I)分隔為上下兩部分，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有32條逆轉(zhuǎn)錄特異性引物的試劑管(4)、裝有dNTP的試劑管(5)、裝有逆轉(zhuǎn)錄酶的試劑管(6 )、裝有RNA酶抑制劑的試劑管(7 )和裝有逆轉(zhuǎn)錄緩沖液的試劑管(8 )、裝有PCR MIX試劑的試劑管(9)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)；分別裝有110條PCR擴(kuò)增引物的試劑管被放置在所述襯墊(3)下方的盒體內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(10)。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種用于篩查31種血液病融合基因的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設(shè)有7個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
【文檔編號】C12M1/34GK203530309SQ201320688645
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】朱立文, 米國穩(wěn), 趙程, 侯然, 梁超, 王緒華, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請人:北京海思特臨床檢驗所有限公司