雙色fish用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙色FISH用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒，所述試劑盒包括兩組雙色探針，所述的兩組雙色探針是（l)ALK基因雙色分離探針，（2)ALK-EML4雙色融合探針；其中ALK為SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，EML4為SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。本法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性高，可以快速，準(zhǔn)確，直觀檢測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師對(duì)肺癌進(jìn)行精確分子分型的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】雙色FISH用于篩查肺癌融合基因的方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病相關(guān)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的，涉及肺癌相關(guān)融合基因檢測(cè)技 術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法和相關(guān)檢測(cè)探針及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不 完全明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。
[0003] 根據(jù)肺癌的生長(zhǎng)、侵犯及轉(zhuǎn)移速度和范圍以及對(duì)化療藥物和放射治療的敏感性， 臨床將肺癌分為小細(xì)胞肺癌（SCLC)及非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)，后者占肺癌發(fā)病率80%左 右。只有合理應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、靶向治療等方法，才能獲得較好控制率，延長(zhǎng)生存期。
[0004] 在過去的幾十年里，雖然科學(xué)家們不斷地探索非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)化療和放療 的方法，但取得的成果仍不能令人滿意，例如晚期肺癌患者的平均生存時(shí)間仍未超過一年， 療效不確定，部分患者會(huì)出現(xiàn)一些毒副反應(yīng)，如惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，影響了生活質(zhì)量， 甚至中斷治療。傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化學(xué)藥物可比作是"殺敵一千，自損八百"，因而許多患者對(duì) 此是談之色變，而靶向治療正是科學(xué)家們幾十年來致力于分辨癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子 生物學(xué)差異的臨床研究成果。
[0005] 所謂靶向治療，就是通過基因或分子的選擇，有針對(duì)性地殺死惡性腫瘤細(xì)胞，而幾 乎不影響正常細(xì)胞。這一劃時(shí)代的生物腫瘤療法的特點(diǎn)可以總結(jié)為4個(gè)字："高效低毒"。 一方面，祀向治療大大提1? 了腫瘤治療的療效；另一方面，祀向治療減少患者在治療中的副 作用，提高生活質(zhì)量。
[0006] 靶向治療是指在分子生物學(xué)診斷的基礎(chǔ)上，利用肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間存在 的差異，有針對(duì)性地抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，例如，采用拮抗受體、抑制腫瘤生長(zhǎng)所需的 血管和阻斷腫瘤生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路等方法來抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，從而達(dá)到治療目 的。
[0007] ALK-EML4融合基因是肺癌靶向治療新寵。ALK-EML4融合基因可見于多種腫瘤，例 如間變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎性成肌纖維細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)等， 它是由第2號(hào)染色體短臂基因片段顛換（Inversion)引起。ALK-EML4的發(fā)現(xiàn)，代表了一種 NSCLC的分子亞型，該組患者具有獨(dú)特的臨床特征：不能從EGFR-TKI靶向治療中獲益。接 受EGFR-TKI治療的野生型患者和ALK陽性患者相比，后者可能更容易產(chǎn)生耐藥。ALK-EML4 的發(fā)現(xiàn)促使肺癌治療朝向"個(gè)體化"的目標(biāo)邁近了一步。雖然ALK-EML4融合基因僅有 4% -10%的陽性率，在ALK-EML4融合基因陽性的患者中，其抑制劑Crizotinib的療效可達(dá) 60%以上。美國(guó)FDA迅速批準(zhǔn)Crizotinib上市，對(duì)于ALK-EML4融合基因陽性的患者是個(gè) 福音。由于該基因較低的陽性率，所以在使用前應(yīng)進(jìn)行基因檢測(cè)，只有在陽性的患者中才建 議使用。
[0008] ALK基因，間變型淋巴瘤激酶基因，定位于染色體2p23。FISH可檢測(cè)與ALK基因 相關(guān)的染色體易位，包括EML4、TFG和KIF5B及其他基因融合。雅培Vysis ALK雙色分離 探針試劑盒是第一個(gè)針對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者新型亞類的伴隨診斷試劑，適用于福爾馬林固 定、石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌組織切片樣本。選擇XALKORI (crizotinib)藥物治療的必要 條件是FISH檢測(cè)ALK陽性的非小細(xì)胞肺癌。雅培Vysis ALK雙色分離探針試劑盒和輝瑞 的XALKORI (crizotinib)同時(shí)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。另外，此探針也可用于間變型大細(xì)胞淋 巴瘤的輔助診斷。
[0009] 然而，目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的ALK FISH檢測(cè)試劑盒（雅培Vysis ALK雙色分離探針 試劑盒）僅能檢測(cè)ALK基因的斷裂，但不能判斷ALK斷裂后是否和EML4發(fā)生融合，因此提 供給臨床醫(yī)生的信息不夠全面，不利于肺癌的精確分子分型和靶向治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問題與不足，提供一種肺癌相關(guān)融合基因 FISH檢測(cè)的改良方法，探針及試劑盒。該法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性高，可以快 速，準(zhǔn)確，直觀地測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師對(duì) 肺癌進(jìn)行分子分型的參考依據(jù)，適用于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，
[0012] 本發(fā)明一方面提供一種用于檢測(cè)肺癌相關(guān)融合基因的兩組雙色FISH探針，其特 征在于，所述的兩組雙色探針是（I)ALK基因雙色分離探針，（2)ALK-EML4雙色融合探針；其 中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO : 2所示的核苷酸序列。
[0013] 更佳地，（I)ALK基因雙色分離探針采用ALK基因3'端探針紅色熒光素標(biāo)記，ALK 基因5'端探針綠色突光素標(biāo)記，（2) ALK-EML4雙色融合探針采用ALK基因紅色突光素標(biāo)記， EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
[0014] 本發(fā)明另一方面提供一種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括 兩組雙色探針，所述的兩組雙色探針是（I)ALK基因雙色分離探針，（2) ALK-EML4雙色融合 探針；其中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序 列。
[0015] 更佳地，該試劑盒中，（I)ALK基因雙色分離探針采用ALK基因3'端探針紅色熒光 素標(biāo)記，ALK基因5'端探針綠色突光素標(biāo)記。（2) ALK-EML4雙色融合探針采用ALK基因紅 色突光素標(biāo)記，EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供一種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法，包括如下步驟：對(duì) 肺癌組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用上述兩組雙色探針先后進(jìn)行原位雜交，根據(jù) 檢測(cè)到的熒光信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。
[0017] 具體地說，第一步用ALK基因雙色分離探針進(jìn)行雜交，確定ALK基因是否斷裂。第 二步，選擇ALK基因斷裂的樣本，用ALK-EML4雙色融合探針進(jìn)行第二次雜交檢測(cè)。以確定 ALK斷裂后是否和EML4基因形成了融合基因。
[0018] 更佳地，（I)ALK基因雙色分離探針采用ALK基因3'端探針（ALK斷裂熱點(diǎn)3'端） 紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5'端探針（ALK斷裂熱點(diǎn)5'端）綠色熒光素標(biāo)記；（2) ALK-EML4 雙色融合探針采用ALK基因紅色突光素標(biāo)記，EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法通過對(duì)肺癌 組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用兩組雙色探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光 信號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。本法設(shè)計(jì)周全，操作簡(jiǎn)單，特異性和敏感性高， 可以快速，準(zhǔn)確，直觀檢測(cè)出肺癌相關(guān)ALK-EML4融合基因，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為 醫(yī)師對(duì)肺癌進(jìn)行精確分子分型的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。下列具體實(shí)施 例采用的主要試劑，儀器和操作步驟如下：
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 一、探針DNA的獲取
[0023] 1)劃線接種：將攜帶有ALK基因和EML4的BAC菌種劃線接種于含有抗生素（氯 霉素）的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜（約14小時(shí)）。
[0024] 2)初始培養(yǎng)：次日挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單克隆菌種，接種于2ml含有抗生素（氯 霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床，設(shè)置搖床速度約200rpm，培養(yǎng)6-8小時(shí)。
[0025] 3)過夜培養(yǎng)：每Iml菌液轉(zhuǎn)移至200ml培養(yǎng)體系，放置于37°C搖床，轉(zhuǎn)速200rpm， 培養(yǎng)過夜（約14-16小時(shí)）。
[0026] 4)次日按照QIAGEN公司質(zhì)粒大量提取試劑盒操作說明進(jìn)行DNA大量提取和純化。
[0027] 二、探針標(biāo)記
[0028] 1 ?酶切 DNA:
[0029] 1)按照以下反應(yīng)體系對(duì)目的DNA進(jìn)行酶切
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)肺癌相關(guān)融合基因的兩組雙色FISH探針，其特征在于，所述的兩組雙 色探針是（I)ALK基因雙色分離探針，（2) ALK-EML4雙色融合探針；其中ALK為SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩組雙色FISH探針，其特征在于：（I) ALK基因雙色分離探針 采用ALK基因3'端探針紅色突光素標(biāo)記,ALK基因5'端探針綠色突光素標(biāo)記，（2) ALK-EML4 雙色融合探針采用ALK基因紅色突光素標(biāo)記，EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
3. -種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括兩組雙色探針，所述的 兩組雙色探針是（I)ALK基因雙色分離探針，（2) ALK-EML4雙色融合探針；其中ALK為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4為SEQ ID NO : 2所示的核苷酸序列。
4. 一種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于=(I)ALK基因雙色分離探針采 用ALK基因3'端探針紅色突光素標(biāo)記,ALK基因5'端探針綠色突光素標(biāo)記。（2) ALK-EML4 雙色融合探針采用ALK基因紅色突光素標(biāo)記，EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
5. -種肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)肺癌組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī) 預(yù)處理，然后采用權(quán)利要求1所述兩組雙色探針先后進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信 號(hào)判斷是否存在所述肺癌相關(guān)融合基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的肺癌相關(guān)融合基因FISH檢測(cè)方法，其特征在于=(I)ALK基因 雙色分離探針采用ALK基因3'端探針（ALK斷裂熱點(diǎn)3'端）紅色熒光素標(biāo)記，ALK基因5' 端探針（ALK斷裂熱點(diǎn)5'端）綠色熒光素標(biāo)記；（2)ALK-EML4雙色融合探針采用ALK基因 紅色突光素標(biāo)記，EML4基因綠色突光素標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104212903SQ201410470360
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】繆為民 申請(qǐng)人:江蘇蒙特立生物技術(shù)有限公司