一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138等35個(gè)遺傳位點(diǎn)的組合。該標(biāo)志物可用于制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志 物及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低 頻高外顯性遺傳標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是目前全球受累人數(shù)最多的惡性腫瘤。據(jù)國(guó)際癌癥研究署（IARC)估計(jì)，2012 年肺癌新發(fā)病例182. 5萬人，死亡159. 0萬人，位居全球范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率的首 位。由于持續(xù)增長(zhǎng)的煙草消費(fèi)、環(huán)境污染以及生活方式的改變，近二十年來，我國(guó)肺癌發(fā)病 和死亡一直呈上升趨勢(shì)，僅2000年至2005年間，中國(guó)肺癌的發(fā)病人數(shù)和因肺癌死亡的人 數(shù)分別增加了 12萬和10萬，據(jù)估計(jì)，2012年我國(guó)男性肺癌發(fā)病率為52. 8/10萬，女性為 20. 4/10萬，超過發(fā)達(dá)的工業(yè)化國(guó)家水平。英國(guó)著名腫瘤學(xué)家R. Peto預(yù)言：如果中國(guó)不及時(shí) 控制吸煙和空氣污染，到2025年我國(guó)每年肺癌將超過100萬，成為世界第一肺癌大國(guó)。由 此可見，肺癌是威脅全球及我國(guó)居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解決的重大公共 衛(wèi)生問題。
[0003] 目前，對(duì)肺癌的一級(jí)預(yù)防（病因預(yù)防）尚無明確、有效的預(yù)防措施，但如果能加強(qiáng) 二級(jí)預(yù)防，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，則可以明顯改善疾病預(yù)后，提高肺癌患者的5年 生存率。因此，爭(zhēng)取早期診斷是肺癌防治的重點(diǎn)。目前肺癌早期診斷的方法主要有影像學(xué) 檢查（胸部X線檢查、胸部CT、核磁共振、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層掃描）、微創(chuàng)介入檢查（支 氣管鏡檢、熒光纖維支氣管鏡檢、超聲纖維支氣管鏡檢等）、痰液脫落細(xì)胞學(xué)檢查、腫瘤生物 標(biāo)記等。但是現(xiàn)在臨床常用的胸部X線、胸部CT和纖維支氣管鏡檢存在一些弊端。胸部X 線檢查難以發(fā)現(xiàn)，或難以鑒定局部粘膜上較小的腫瘤；胸部CT不能確定病變的性質(zhì)，可能 存在假陽性或假陰性。纖維支氣管鏡檢對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)深度、有無轉(zhuǎn)移了解不清。另外目前 臨床所用肺癌標(biāo)志物的特異性不強(qiáng)，血清癌胚抗原（CEA)在肺癌早期多不增高，對(duì)診斷意 義不大。病理活組織檢查作為肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然在臨床肺癌確診中居于重要地位，但 由于需要有創(chuàng)取活檢組織，不適宜作為臨床健康篩查的手段。
[0004] 自20世紀(jì)60年代Dol 1和Hi 11通過病例-對(duì)照研究和隊(duì)列研究首次發(fā)現(xiàn)吸煙與 肺癌的關(guān)系以來，煙草暴露已經(jīng)被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的最主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。研究表明，吸煙 者發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)可比非吸煙者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究顯示，遺傳因素在肺癌 的發(fā)生中同樣扮演重要角色。雙生子研究表明，肺癌是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。流行 病學(xué)研究表明，80%以上的肺癌可以歸咎為煙草暴露，但僅有不到20%的吸煙者發(fā)生肺癌， 說明在同等環(huán)境暴露下，具有不同遺傳背景的個(gè)體對(duì)肺癌的易感性不同。低頻高外顯性遺 傳標(biāo)志物是指較小等位基因頻率（MF)小于0.05的遺傳變異。遺傳變異的存在被認(rèn)為賦 予了個(gè)體不同的表型性狀，以及對(duì)環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)，因此可能是導(dǎo)致 個(gè)體對(duì)常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。
[0005] 通過疾病易感的遺傳標(biāo)志物來診斷疾病的發(fā)生，靈敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng) 用前景。近年來，疾病遺傳標(biāo)志物已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)，在腫瘤和心腦血 管疾病等常見重大疾病的應(yīng)用價(jià)值已初見端倪。
[0006] 然而，目前還沒有將低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌診斷的報(bào)道，若能篩選 出肺癌易感的低頻高外顯性遺傳變異作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我國(guó) 肺癌診斷現(xiàn)狀將會(huì)是個(gè)有力的推動(dòng)，也為其藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療開辟了新的途 徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問題，提出一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻 高外顯性遺傳標(biāo)志物及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述遺傳標(biāo)志物的特異性引物。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述遺傳標(biāo)志物及其特異性引物在制備原發(fā)性肺癌 輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒。
[0011] 發(fā)明人通過分離和研究原發(fā)性肺癌患者及健康對(duì)照外周血DNA中的遺傳多態(tài)性， 尋找一組與原發(fā)性肺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物，并研制 出可便于臨床應(yīng)用的原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，為原發(fā)性肺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支 持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0013] 一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物，該標(biāo)志物 為 rsll31897、 rsll33833、 rsll5019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、 rs200170353、 rs200660845、 rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、 rs6141383、 rs61737776、 rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556 的組合。
[0014] 所述的遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，該引物為：
[0015] rsll31897 的引物序列為 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 ;
[0016] rsll33833 的引物序列為 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5 ;
[0017] rsll5019901 的引物序列為 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 ;
[0018] rsll7855259 的引物序列為 SEQ ID No :10、SEQ ID No :11 ;
[0019] rsll8154190 的引物序列為 SEQ ID No :13、SEQ ID No :14 ;
[0020] rsl41059768 的引物序列為 SEQ ID No :16、SEQ ID No :17 ;
[0021] rsl41350740 的引物序列為 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20 ;
[0022] rsl42881943 的引物序列為 SEQ ID No :22、SEQ ID No :23 ;
[0023] rsl45529151 的引物序列為 SEQ ID No :25、SEQ ID No :26 ;
[0024] rsl45638335 的引物序列為 SEQ ID No :28、SEQ ID No :29 ;
[0025] rsl45940981 的引物序列為 SEQ ID No :31、SEQ ID No :32 ;
[0026] rsl50279473 的引物序列為 SEQ ID No :34、SEQ ID No :35 ;
[0027] rsl50695913 的引物序列為 SEQ ID No :37、SEQ ID No :38 ;
[0028] rsl51223396 的引物序列為 SEQ ID No :40、SEQ ID No :41 ;
[0029] rsl85832840 的引物序列為 SEQ ID No :43、SEQ ID No :44 ;
[0030] rsl88159138 的引物序列為 SEQ ID No :46、SEQ ID No :47 ;
[0031] rs 188908188 的引物序列為 SEQ ID No :49、SEQ ID No :50 ;
[0032] rsl90614894 的引物序列為 SEQ ID No :52、SEQ ID No :53 ;
[0033] rs200170353 的引物序列為 SEQ ID No :55、SEQ ID No :56 ;
[0034] rs200660845 的引物序列為 SEQ ID No :58、SEQ ID No :59 ;
[0035] rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No :61、SEQ ID No :62 ;
[0036] rs201210090 的引物序列為 SEQ ID No :64、SEQ ID No :65 ;
[0037] rs201308754 的引物序列為 SEQ ID No :67、SEQ ID No :68 ;
[0038] rs202173016 的引物序列為 SEQ ID No :70、SEQ ID No :71 ;
[0039] rs34687332 的引物序列為 SEQ ID No :73、SEQ ID No :74 ;
[0040] rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No :76、SEQ ID No :77 ;
[0041] rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No :79、SEQ ID No :80 ;
[0042] rs45442501 的引物序列為 SEQ ID No :82、SEQ ID No :83 ;
[0043] rs6141383 的引物序列為 SEQ ID No :85、SEQ ID No :86 ;
[0044] rs61737776 的引物序列為 SEQ ID No :88、SEQ ID No :89 ;
[0045] rs62176112 的引物序列為 SEQ ID No :91、SEQ ID No :92 ;
[0046] rs6756629 的引物序列為 SEQ ID No :94、SEQ ID No :95 ;
[0047] rs73016227 的引物序列為 SEQ ID No :97、SEQ ID No :98 ;
[0048] rs7703522 的引物序列為 SEQ ID No :100、SEQ ID No :101 ;
[0049] rs79472556 的引物序列為 SEQ ID No :103、SEQ ID No :104。
[0050] 所述的遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物，該引物為：
[0051] rsl 131897 的引物序列為 SEQ ID NO :3 ;rsl 133833 的引物序列為 SEQ ID NO : 6 ;rsl 15019901 的引物序列為 SEQ ID NO :9;rsl 17855259 的引物序列為 SEQ ID NO: 12;rsll8154190 的引物序列為 SEQ ID N0:15;rsl41059768 的引物序列為 SEQ ID NO: 18;rsl41350740 的引物序列為 SEQ ID N0:21;rsl42881943 的引物序列為 SEQ ID NO: 24;rsl45529151 的引物序列為 SEQ ID N0:27;rsl45638335 的引物序列為 SEQ ID NO: 30;rsl45940981 的引物序列為 SEQ ID N0:33;rsl50279473 的引物序列為 SEQ ID NO: 36;rsl50695913 的引物序列為 SEQ ID N0:39;rsl51223396 的引物序列為 SEQ ID NO: 42;rsl85832840 的引物序列為 SEQ ID N0:45;rsl88159138 的引物序列為 SEQ ID NO: 48;rsl88908188 的引物序列為 SEQ ID N0:51;rsl90614894 的引物序列為 SEQ ID NO: 54;rs200170353 的引物序列為 SEQ ID N0:57;rs200660845 的引物序列為 SEQ ID NO: 60;rs200847762 的引物序列為 SEQ ID N0:63;rs201210090 的引物序列為 SEQ ID NO: 66;rs201308754 的引物序列為 SEQ ID N0:69;rs202173016 的引物序列為 SEQ ID NO: 72;rs34687332 的引物序列為 SEQ ID N0:75;rs3733782 的引物序列為 SEQ ID N0:78; rs3827760 的引物序列為 SEQ ID NO :81 ;rs45442501 的引物序列為 SEQ ID NO :84 ; rs6141383 的引物序列為 SEQ ID NO :87 ;rs61737776 的引物序列為 SEQ ID NO :90 ; rs62176112 的引物序列為 SEQ ID NO :93 ;rs6756629 的引物序列為 SEQ ID NO :96 ; rs73016227 的引物序列為 SEQ ID N0:99;rs7703522 的引物序列為 SEQ ID N0:102; rs79472556 的引物序列為 SEQ ID NO :105。
[0052] 所述的遺傳標(biāo)志物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0053] 所述的遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng) 用。
[0054] 所述的遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng) 用。
[0055] -種原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA中rsll31897、 rsll33833、 rsll5019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、rs200170353、 rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、 rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、 rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
[0056] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述的特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引 物。
[0057] 所述診斷試劑盒，該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑。如Taq酶、dNTP混合液、 Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>
[0058] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù) 庫(kù)：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。（2)基因型檢測(cè)：選擇原發(fā)性肺癌病例和健康對(duì)照，利用高密度低頻高外顯性遺傳標(biāo) 志物芯片，在全外顯子組范圍內(nèi)找出與原發(fā)性肺癌相關(guān)的遺傳標(biāo)志物。（3)對(duì)篩選出的陽性 關(guān)聯(lián)標(biāo)志物，進(jìn)一步在另外的樣本中進(jìn)行檢測(cè)，以判斷其關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定性。（4)原發(fā)性肺癌輔 助診斷試劑盒的研制：根據(jù)原發(fā)性肺癌病例和健康對(duì)照中基因型分布頻率有顯著差異的遺 傳標(biāo)志物開發(fā)輔助診斷試劑盒。
[0059] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人 口 學(xué)資料、臨床資料等，并米用了 Illumina ΙηΠη?ιπ--ηξ_ Human Exome BeadChip(Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片進(jìn)行全外顯子組掃描，Sequenom MassARRAY基因分型進(jìn)行單個(gè) 位點(diǎn)的檢測(cè)等。
[0060] 具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：
[0061] 1.研究樣本的選擇
[0062] (1)臨床確診為原發(fā)性肺癌；
[0063] (2)健康對(duì)照；
[0064] 本研究共采用4336例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0065] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/y 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0066] 3. Illumina In I inium κ RHuman Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA) 芯片檢測(cè)
[0067] (1)取受試者全基因組DNA樣本；
[0068] (2)在 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片上進(jìn)行全外顯子組掃描；
[0069] (3)檢測(cè)并比較各基因型在原發(fā)性肺癌病例與健康對(duì)照中的分別差異。
[0070] 4.單個(gè)遺傳標(biāo)志物的Sequenom MassARRAY基因分型
[0071] (1)取受試者DNA樣本；
[0072] (2)設(shè)計(jì)單個(gè)遺傳標(biāo)志物的特異性引物；
[0073] (3)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；
[0074] (4)檢測(cè)并比較原發(fā)性肺癌病例與健康對(duì)照中不同基因型的分布差異。
[0075] 5.診斷試劑盒制備方法
[0076] Illumina Infinium8 Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA)芯 片進(jìn)行全外顯子組掃描和單個(gè)遺傳標(biāo)志物檢測(cè)后確定原發(fā)性肺癌病例與健康對(duì)照中基因 型分布頻率有顯著差異的遺傳標(biāo)志物，作為原發(fā)性肺癌診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與原發(fā) 性肺癌發(fā)病有關(guān)的遺傳標(biāo)志物組成輔助診斷試劑盒（rsll31897、rsll33833、rsl 15019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556)。診斷試劑可以包括這些遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)，以及Taq酶、dNTP等試 劑。
[0077] 6.統(tǒng)計(jì)分析方法
[0078] 運(yùn)用卡方檢驗(yàn)（用于分類變量）或者student t檢驗(yàn)（用于連續(xù)性變量）比較人 口學(xué)特征等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān) 聯(lián)分析。
[0079] 為了進(jìn)一步研究這35個(gè)低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷 的效果，我們構(gòu)建了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個(gè)遺傳標(biāo)志物與原發(fā)性肺癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān) 聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對(duì)每個(gè)遺傳標(biāo)志物的三種基因型進(jìn)行評(píng)分，野生純合型 ="0"，雜合型="1"，變異純合型="2"，以單個(gè)遺傳標(biāo)志物分析時(shí)的additive模型下的 回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)遺傳標(biāo)志物的情況給每個(gè)研究對(duì)象確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危 險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下：危險(xiǎn)分值=(〇. 65Xrsll31897的評(píng)分）+ (1. 97Xrsll33833的評(píng) 分）+ (0· 57Xrsll5019901 的評(píng)分）+ (0· 57Xrsll7855259 的評(píng)分）+ (1. 04Xrsll8154190 的 評(píng)分）+ (〇· 92Xrsl41059768 的評(píng)分）+ (0· 92Xrsl41350740 的評(píng)分）+ (0· 42Xrsl42881943 的評(píng)分）+ (〇.79Xrsl45529151 的評(píng)分）+ (0.96Xrsl45638335 的評(píng) 分）+ (1. 97Xrsl45940981 的評(píng)分）+ (2. 84Xrsl50279473 的評(píng)分）+ (-0· 67Xrsl50695913 的評(píng)分）+ (0.86Xrsl51223396 的評(píng)分）+ (1. 79Xrsl85832840 的評(píng) 分）+ (-0· 62Xrsl88159138 的評(píng)分）+ (L 77Xrsl88908188 的評(píng)分）+ (0· 82Xrsl90614894 的評(píng)分）+ (1. 40Xrs200170353 的評(píng)分）+ (0.73Xrs200660845 的評(píng) 分）+ (-1. 41Xrs200847762 的評(píng)分）+ (1. 31Xrs201210090 的評(píng)分）+ (1. 03Xrs201308754 的評(píng)分）+ (〇· 65Xrs202173016 的評(píng)分）+ (L 86Xrs34687332 的評(píng)分）+ (-0· 81Xrs3733782 的評(píng)分）+ (〇. 35Xrs3827760 的評(píng)分）+ (1. 86Xrs45442501 的評(píng)分）+ (0. 56Xrs6141383 的 評(píng)分）+ (-1. 22Xrs61737776 的評(píng)分）+ (1. 59Xrs62176112 的評(píng)分）+ (0· 73Xrs6756629 的 評(píng)分）+ (2. 15Xrs73016227 的評(píng)分）+ (2. 64Xrs7703522 的評(píng)分）+ (0· 85Xrs79472556 的 評(píng)分），獲得的危險(xiǎn)分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全外顯子組關(guān)聯(lián)研究的4336例樣本 中。（以rsll31897為例：0· 65為rsll31897的回歸系數(shù)（見表I) ;rsll31897的評(píng)分，野 生純合型=" 0 "，雜合型=" 1"，變異純合型=" 2 "，某個(gè)SNV的基因型由儀器檢測(cè)結(jié)果確定； 某個(gè)樣本的總評(píng)分是這些個(gè)SNV分別評(píng)分的總和，單個(gè)SNV的基因型只是計(jì)算評(píng)分的一個(gè) 中間過程，不需要知道具體基因型。）
[0080] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成（PLINK1. 07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為〇. 05,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
[0081] 以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明：
[0082] 上述共有1386例符合條件的原發(fā)性肺癌病例及2950例健康對(duì)照。我們將這兩組 人群經(jīng) Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片 進(jìn)行全外顯子組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。
[0083] 根據(jù) Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA) 芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在"原發(fā)性肺癌病例"組和"健康對(duì)照"組中基因型分布頻率存在 差異的遺傳標(biāo)志物包括：rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、 rsl88908188、 rsl90614894、 rs200170353、 rs200660845、 rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、 rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
[0084] 根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，我們將這35個(gè)與原發(fā)性肺癌發(fā)病相關(guān)的遺傳標(biāo)志物在另外 1500例原發(fā)性肺癌病例和3000例健康對(duì)照中進(jìn)行了單個(gè)遺傳標(biāo)志物的檢測(cè)，結(jié)果與芯片 檢測(cè)一致。
[0085] 單因素和多因素 Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這35個(gè)遺傳標(biāo)志物與原發(fā)性肺 癌的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)。
[0086] 進(jìn)一步分析這35個(gè)遺傳標(biāo)志物的組合用于原發(fā)性肺癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合 能夠很好的區(qū)分病例與對(duì)照。
[0087] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于原發(fā)性肺癌輔助診斷的試劑盒， 包含測(cè)定受試者血標(biāo)本DNA中上述遺傳標(biāo)志物的特異性引物和其他檢測(cè)試劑。
[0088] 具體而言，這35個(gè)遺傳標(biāo)志物的組合，或者這35個(gè)遺傳標(biāo)志物的特異性引物構(gòu)成 的相關(guān)診斷試劑盒有助于原發(fā)性肺癌的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀 態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0089] 本發(fā)明有益效果：
[0090] 本發(fā)明提供的遺傳標(biāo)志物作為原發(fā)性肺癌輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
[0091] (1)低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志 物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功 開發(fā)將為原發(fā)性肺癌的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借 鑒。
[0092] (2)遺傳標(biāo)志物試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于原發(fā)性肺癌的輔助 診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時(shí)采取更具個(gè)性 化的防治方案提供支持。
[0093] (3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用全外顯子組芯片掃描以獲取 疾病相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物，并應(yīng)用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大樣本 中進(jìn)行了驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了低頻高外顯性遺傳生物標(biāo)志物和診斷 試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0094] 本發(fā)明通過病例對(duì)照研究，發(fā)掘低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物在原發(fā)性肺癌輔助診斷 的應(yīng)用前景，闡述遺傳標(biāo)志物對(duì)于原發(fā)性肺癌進(jìn)展的影響，揭示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明 獲得了原發(fā)性肺癌發(fā)病相關(guān)遺傳標(biāo)志物；通過遺傳生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng) 用，可使得原發(fā)性肺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治 療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0095] 圖1 :顯示全外顯子組關(guān)聯(lián)研究病例組和對(duì)照組的ROC曲線。
[0096] 顯示原發(fā)性肺癌病例組對(duì)健康對(duì)照組為參照的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0097] 實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0098] 發(fā)明人于2005月4月開始至2011年12月從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和江 蘇省腫瘤醫(yī)院收集了大量的原發(fā)性肺癌患者血標(biāo)本，通過對(duì)樣品資料的整理，發(fā)明人從 中選擇了 4336例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全外顯子組芯片掃描和單個(gè)遺傳標(biāo)志物Sequenom MassARRAY基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品：
[0099] 1、病理組織學(xué)確診的原發(fā)性肺癌患者；
[0100] 2、健康對(duì)照；
[0101] 并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0102] 實(shí)施例2外周血DNA中遺傳標(biāo)志物的全外顯子組掃描
[0103] 上述共有1386例符合條件的原發(fā)性肺癌患者和2950例健康對(duì)照。將這兩組人群 經(jīng) Illumina InHnium(K;i: Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片檢測(cè) 獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為：
[0104] 1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0105] 2、去除紅細(xì)胞：用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0106] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液（每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化鈉， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二燒基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同）和8μ 1蛋 白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0107] 4、去除蛋白質(zhì)：加 Iml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入 兩個(gè)I. 5ml的離心管）。
[0108] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水 乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0109] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心IOmin,棄上清后真空抽 干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0110] 7、測(cè)量濃度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0111] 8、進(jìn)行全外顯子組掃描：在 Illumina InHniumB Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片上進(jìn)行全外顯子組掃描；
[0112] 9、數(shù)據(jù)分析與處理：在"原發(fā)性肺癌病例"組和"健康對(duì)照"組中發(fā)現(xiàn)的基因型分 布頻率有顯著差異的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。
[0113] 表1病例組與對(duì)照組全外顯子組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
【權(quán)利要求】
1. 一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的低頻高外顯性遺傳標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志 物為 rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、 rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、 rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556 的組合。
2. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物為： rsll31897 的引物序列為 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 ; rsll33833 的引物序列為 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5 ; rsll5019901 的引物序列為 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 ; rsll7855259 的引物序列為 SEQ ID No :10、SEQ ID No :11 ; rsll8154190 的引物序列為 SEQ ID No :13、SEQ ID No :14 ; rsl41059768 的引物序列為 SEQ ID No :16、SEQ ID No :17 ; rsl41350740 的引物序列為 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20 ; rsl42881943 的引物序列為 SEQ ID No :22、SEQ ID No :23 ; rsl45529151 的引物序列為 SEQ ID No :25、SEQ ID No :26 ; rsl45638335 的引物序列為 SEQ ID No :28、SEQ ID No :29 ; rsl45940981 的引物序列為 SEQ ID No :31、SEQ ID No :32 ; rsl50279473 的引物序列為 SEQ ID No :34、SEQ ID No :35 ; rsl50695913 的引物序列為 SEQ ID No :37、SEQ ID No :38 ; rsl51223396 的引物序列為 SEQ ID No :40、SEQ ID No :41 ; rsl85832840 的引物序列為 SEQ ID No :43、SEQ ID No :44 ; rsl88159138 的引物序列為 SEQ ID No :46、SEQ ID No :47 ; rsl88908188 的引物序列為 SEQ ID No :49、SEQ ID No :50 ; rsl90614894 的引物序列為 SEQ ID No :52、SEQ ID No :53 ; rs200170353 的引物序列為 SEQ ID No :55、SEQ ID No :56 ; rs200660845 的引物序列為 SEQ ID No :58、SEQ ID No :59 ; rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No :61、SEQ ID No :62 ; rs201210090 的引物序列為 SEQ ID No :64、SEQ ID No :65 ; rs201308754 的引物序列為 SEQ ID No :67、SEQ ID No :68 ; rs202173016 的引物序列為 SEQ ID No :70、SEQ ID No :71 ; rs34687332 的引物序列為 SEQ ID No :73、SEQ ID No :74 ; rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No :76、SEQ ID No :77 ; rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No :79、SEQ ID No :80 ; rs45442501 的引物序列為 SEQ ID No :82、SEQ ID No :83 ; rs6141383 的引物序列為 SEQ ID No :85、SEQ ID No :86 ; rs61737776 的引物序列為 SEQ ID No :88、SEQ ID No :89 ; rs62176112 的引物序列為 SEQ ID No :91、SEQ ID No :92 ; rs6756629 的引物序列為 SEQ ID No :94、SEQ ID No :95 ; rs73016227 的引物序列為 SEQ ID No :97、SEQ ID No :98 ; rs7703522 的引物序列為 SEQ ID No :100、SEQ ID No :101 ; rs79472556 的引物序列為 SEQ ID No :103、SEQ ID No :104。
3. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為： rsl 131897 的引物序列為 SEQ ID NO :3;rsl 133833 的引物序列為 SEQ ID NO :6; rsll5019901 的引物序列為SEQIDN0:9;rsll7855259 的引物序列為SEQIDN0:12; rsll8154190 的引物序列為SEQIDN0:15;rsl41059768 的引物序列為SEQIDN0:18; rsl41350740 的引物序列為SEQIDN0:21;rsl42881943 的引物序列為SEQIDN0:24; rsl45529151 的引物序列為SEQIDN0:27;rsl45638335 的引物序列為SEQIDN0:30; rsl45940981 的引物序列為 SEQ ID NO :33 ;rsl50279473 的引物序列為 SEQ ID NO :36 ; rsl50695913 的引物序列為SEQIDN0:39;rsl51223396 的引物序列為SEQIDN0:42; rsl85832840 的引物序列為 SEQ ID NO :45 ;rsl88159138 的引物序列為 SEQ ID NO :48 ; rsl88908188 的引物序列為SEQIDN0:51;rsl90614894 的引物序列為SEQIDN0:54; rs200170353 的引物序列為 SEQ ID NO :57 ;rs200660845 的引物序列為 SEQ ID NO :60 ; rs200847762 的引物序列為SEQIDN0:63;rs201210090 的引物序列為SEQIDN0:66; rs201308754 的引物序列為SEQIDN0:69;rs202173016 的引物序列為SEQIDN0:72; rs34687332 的引物序列為 SEQ ID NO :75 ;rs3733782 的引物序列為 SEQ ID NO :78 ; rs3827760 的引物序列為 SEQ ID NO :81 ;rs45442501 的引物序列為 SEQ ID NO :84 ; rs6141383 的引物序列為 SEQ ID NO :87 ;rs61737776 的引物序列為 SEQ ID NO :90 ; rs62176112 的引物序列為 SEQ ID NO :93 ;rs6756629 的引物序列為 SEQ ID NO :96 ; rs73016227 的引物序列為SEQIDN0:99;rs7703522 的引物序列為SEQIDN0:102; rs79472556 的引物序列為 SEQ ID NO :105。
4. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)志物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的遺傳標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑 盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的遺傳標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑 盒中的應(yīng)用。
7. -種原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA 中 rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、 rsl88908188、 rsl90614894、 rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、 rs6141383、 rs61737776、 rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的特 異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述的特異性延伸引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的 試劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104263723SQ201410469284
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 馬紅霞, 戴俊程, 孫潔 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)