鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法，該方法提取總DNA；利用DNA條形碼通用引物擴增雙翅目昆蟲的線粒體COI基因前段序列作為標(biāo)記；并進(jìn)行物種鑒別的序列特征比對，從而進(jìn)行物種鑒定。本發(fā)明方法能對桔小實蠅、果蠅和麗蠅三種害蟲不同生物型以及幼蟲或殘缺個體進(jìn)行鑒定，具有準(zhǔn)確、迅速、便捷和費用低的特點，相比傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定方法，節(jié)省了時間也降低費用；本方法對使用的儀器設(shè)備要求較低，一般的分子生物學(xué)實驗室均可進(jìn)行，比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別更準(zhǔn)確可靠，并從根本上解決了當(dāng)前桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲在檢疫過程中較難進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的難題，填補了行業(yè)空白，具有重要意義。
【專利說明】鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桔小實蠅（Bactrocera dorsalis Hendel)是一種世界危害性檢疫害蟲，該蟲寄主 范圍較廣，能取食香蕉，柑橘，楊桃，番石榴，芒果，茄子，辣椒等46個科250多種水果和蔬 菜。該物種主要以幼蟲為害，成蟲產(chǎn)卵于果皮下，幼蟲孵化后靠取食果肉發(fā)育，被危害的果 實會出現(xiàn)腐爛和未熟先黃脫落的癥狀，嚴(yán)重影響各種水果果實的質(zhì)量和品質(zhì)，甚至失去食 用價值。由于該蟲具有寄主范圍廣，繁殖力高，適應(yīng)能力強，危害性大的特點，給果蔬業(yè)和花 卉業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，許多國家都將其列為重點檢疫對象，在中國桔小實蠅被列為二 類檢疫性害蟲。
[0003] 果蠅英文俗名fruit fly或vinegar fly,廣泛存在于全球溫帶及熱帶氣候區(qū)，由 于其主食為腐爛的水果，因此在人類的棲息地內(nèi)如果園、菜市場等地區(qū)內(nèi)皆可見其蹤跡，與 桔小實蠅一樣，主要以幼蟲為害，成蟲產(chǎn)卵于果皮下，幼蟲孵化后靠取食果肉發(fā)育。除了南 北極外，目前至少有1〇〇〇個以上的果蠅物種被發(fā)現(xiàn)，大部分的物種以各種腐爛的水果或植 物體為食，少部分則只取用真菌，樹液或花粉為其食物。對水果的危害主要見于使得櫻桃等 很多水果種類快速腐爛，從而造成經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 麗蠅是屬于雙翅目麗蠅科。成蟲除在肉、魚、腐肉上產(chǎn)卵外，也可在人、畜的傷口內(nèi) 產(chǎn)卵，引起蠅蛆癥。這種習(xí)性常為偶然現(xiàn)象，但在有些種類中則為固有的特性。一般卵生， 少數(shù)蚴蟲，即產(chǎn)生活的幼蟲，繁殖數(shù)量極大。對人體有危害，除了造成騷擾外，部分種類具醫(yī) 學(xué)上的重要性，例如大頭金蠅可機械性地傳播腸道傳染病，蛆癥金蠅是專性蠅蛆癥的病原 昆蟲，引起人畜的蠅蛆癥，在經(jīng)濟(jì)上有重要意義。麗蠅是芒果重要的授粉昆蟲，農(nóng)民會以無 食用價值的魚頭等，吸引麗蠅前來產(chǎn)卵，并為其授粉，以增加產(chǎn)量。由于引致人類及動物蠅 蛆病的成因主要是來自狂蠅總科、麗蠅及麻蠅科，故此麗蠅很多成為治療此病的研究對象。 單單銅綠蠅在澳大利亞每年就造成超過1. 7億美元的經(jīng)濟(jì)損失。在人類發(fā)生的蠅蛆病主要 分類6種：皮膚及皮下、面部、傷口或創(chuàng)傷、胃腸道、陰道及一般的蠅蛆病。蠅蛆病的幼蟲一 般都是在一齡階段?，F(xiàn)時唯一的治療方法是清除蛆蟲，讓病人自行康復(fù)。
[0005] 由于桔小實蠅、果蠅和麗蠅同屬雙翅目昆蟲，其卵、幼蟲和蛹很難鑒定；傳統(tǒng)的物 種鑒別主要依賴于專業(yè)的昆蟲分類學(xué)家花費大量時間和精力整理積累后所描述的形態(tài)特 征，存在較大的局限性，不僅費時費力，而且常受主觀因素干擾，極易混淆出錯。其次，傳統(tǒng) 的鑒別方法難以展開針對三種幼蟲或殘缺個體的鑒別。
[0006] 快速而準(zhǔn)確的物種鑒定是科學(xué)經(jīng)濟(jì)的防治害蟲的必要前提和基礎(chǔ)。由于我國大部 分地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)均采取間混套作（intercropping/interplanting)模式，且桔小實蠅具有 寄主范圍廣，繁殖力高的特點，使得這三種害蟲常常得以同域混合發(fā)生。因此有必要尋找一 些快捷、準(zhǔn)確鑒別這三種害蟲的分子生物學(xué)方法，從而應(yīng)用于檢疫和及時有效地控制其給 能源作物生產(chǎn)帶來的危害。
[0007] 自2003年DNA條形碼（DNA barcodes)概念出現(xiàn)以來，DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding)受到生物分類學(xué)領(lǐng)域普遍關(guān)注，DNA條形碼，也稱DNA條形編碼，類似于超級 市場商品包裝上用于識別商品的粗細(xì)、間隔不同的黑白條紋圖案，線粒體細(xì)胞色素氧化酶 亞基I(mtDNA C0I)被用作動物類群的主要條形碼序列，基于該基因片段的昆蟲條形碼研 究在國內(nèi)外廣泛開展，是利用線粒體DNA的細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I基因 （Cytochrome C oxidase I，C0I)的前部約650bp長的序列作為標(biāo)記來實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動化地對物種進(jìn) 行鑒定和分類。DNA條形碼快速而精確的特點彌補了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的諸多不足，使其廣泛應(yīng) 用于動物分類鑒定中。但是目前國內(nèi)外尚無利用DNA條形碼作為分子標(biāo)記區(qū)別鑒定桔小實 蠅、果蠅和麗蠅的報道。
[0008] 因此，本發(fā)明首次通過DNA條形碼，即擴增測定這三個物種線粒體DNA的C0I基因 序列，結(jié)合相關(guān)軟件進(jìn)行分析處理，實行快速簡捷，經(jīng)濟(jì)實惠地對三種雙翅目昆蟲進(jìn)行物種 鑒定；最終為及時有效的控制桔小實蠅的危害，從而保護(hù)其危害的水果和蔬菜等植物，提高 作物產(chǎn)量，降低作物產(chǎn)業(yè)成本提供必要的前提和基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲形態(tài)鑒定難，科學(xué)鑒別手段缺乏 的不足，提供一種科學(xué)有效、簡便快捷、準(zhǔn)確的桔小實蠅害蟲的分子生物學(xué)鑒定方法。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué) 方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0011] ⑴提取雙翅目昆蟲總DNA ;
[0012] (2)利用DNA條形碼通用引物擴增線粒體C0I基因前段序列進(jìn)行PCR擴增和測序 作為標(biāo)記；
[0013] (3)依據(jù)雙翅目昆蟲的核苷酸的序列特征變異位點進(jìn)行物種鑒別。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述提取雙翅目昆蟲總DNA的個體為幼蟲。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟（2)中，所述通用引物序列為：
[0016] C0IF :5，-ggaatagtaggaacatcccttagaa-3，
[0017] COIR :5，-acttctgggtgtccaaagaat-3,。
[0018] 進(jìn)一步的，所述PCR反應(yīng)體系為50μ 1，其中模板DNA約25ng，25ul2XTaq PCR MasterMix，正反向引物各2pM，加去離子水（ddH20)調(diào)至終體積50ul ;
[0019] PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性45秒，50°C復(fù)性45秒，72°C延伸 45秒，35個循環(huán)后，72°C延伸10分鐘，4°C保存
[0020] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：
[0021] (1)本發(fā)明方法能對桔小實蠅、果蠅和麗蠅三種害蟲不同生物型以及幼蟲或殘缺 個體進(jìn)行鑒定，具有準(zhǔn)確、迅速、便捷和費用低的特點，相比傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定方法，大大 節(jié)省了時間也減少了費用；
[0022] (2)本發(fā)明方法對使用的儀器設(shè)備要求較低，一般的分子生物學(xué)實驗室均可進(jìn)行， 比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別更準(zhǔn)確可靠；
[0023] (3)本鑒別方法從根本上解決了當(dāng)前桔小實蠅、果蠅和麗蠅幼蟲在檢疫過程中較 難進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的難題，填補了行業(yè)空白，具有重要意義。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 實施例1
[0026] 1、采用DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取雙翅目昆蟲桔小 實蠅、果蠅和麗蠅總DNA。為了鑒定幼蟲，DNA提取全部測定的是幾種雙翅目昆蟲的幼蟲個 體。
[0027] 2、利用DNA條形碼通用引物PCR擴增線粒體C0I基因前段序列和序列測定，具體 包括以下步驟：
[0028] ① PCR擴增和測序所用的引物為：
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取雙翅目昆蟲總DNA ; (2) 利用DNA條形碼通用引物擴增線粒體COI基因前段序列進(jìn)行PCR擴增和測序作為 標(biāo)記； (3) 依據(jù)雙翅目昆蟲的核苷酸的序列特征變異位點進(jìn)行物種鑒別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法，其特征在于，步驟（1)中， 所述提取雙翅目昆蟲總DNA的個體為幼蟲。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法，其特征在于，步驟（2)中， 所述通用引物序列為： COIF ：5, -ggaatagtaggaacatcccttagaa~3, COIR :5J _acttctgggtgtccaaagaat_3,〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述鑒定雙翅目昆蟲的分子生物學(xué)方法，其特征在于，步驟（2) 中，所述PCR反應(yīng)體系為50μ1，其中模板DNA約25ng，25ul2XTaq PCR MasterMix，正反向 引物各2pM，加去離子水（ddH20)調(diào)至終體積50ul ; PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性45秒，50°C復(fù)性45秒，72°C延伸45 秒，35個循環(huán)后，72°C延伸10分鐘，4°C保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120189SQ201410393538
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】李地艷, 楊明耀, 吳楠, 徐懷亮, 胡耀東, 姚永芳 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)