專利名稱：用于增強(qiáng)昆蟲防治的基因修飾的昆蟲病毒和化學(xué)、生物學(xué)殺蟲劑的混合物的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗昆蟲的殺蟲劑組合物，其包含用于增強(qiáng)昆蟲防治的基因修飾的病毒和化學(xué)、生物學(xué)殺蟲劑的混合物。
發(fā)明的背景防治侵害市售谷物的害蟲已是各種處理的主題?；瘜W(xué)殺蟲劑已被廣泛使用，但是它們的使用上引起了各種關(guān)注。除了無益的靶昆蟲類外，化學(xué)殺蟲劑還可影響有益的昆蟲類。昆蟲有獲得對(duì)這些化合物的抗性的傾向，因此需要發(fā)展新的化合物。化合物在使用后可在環(huán)境中持續(xù)一段時(shí)間。
在減少化學(xué)殺蟲劑使用的一項(xiàng)努力中，利用昆蟲特異性病毒攻擊幼蟲階段的昆蟲，昆蟲特異性病毒包括DNA和RNA病毒。DNA病毒包括昆蟲痘病毒(“EPV”)和桿狀病毒科的諸如核型多角體病毒(“NPV”)、顆粒體病毒(“GV”)和桿狀病毒亞科(Baculovirinae)的無包含體桿狀病毒(“NOB”)等。
RNA病毒包括披膜病毒、黃病毒、微小核糖核酸病毒、胞漿多角體病毒(“CPV”)等。雙鏈DNA病毒的亞科真桿狀病毒亞科(Eubaculovirinae)，包括兩屬，NPV和GV，它們對(duì)于生物學(xué)控制特別有用，因?yàn)樗鼈冊谄渖钪芷谥挟a(chǎn)生包含體(“OB”)。
NPV的例子包括舞毒蛾NPV(吉普賽蛾NPV)、苜蓿銀紋夜蛾MNPV、Syngrapha falcifera NPV(芹菜尺蠖NPV)、海灰翅夜蛾(Spodoptera litturalis)NPV、草地夜蛾NPV、甜菜夜蛾NPV、棉鈴蟲NPV、甘藍(lán)夜蛾NPV、樅色卷葉蛾NPV、粉紋夜蛾NPV、Helicoverpa zea NPV，等等。GV的例子包括蘋果小卷蛾GV(蘋果蛾GV)、大菜粉蝶GV、粉紋夜蛾GV，等等。NOB的例子為Orcytes rhinoceros NOB和玉米夜蛾NOB。昆蟲痘病毒的例子包括西方五月鰓角金黽子EPV、桑紅緣燈蛾EPV、飛蝗EPV、遷徒蚱蜢EPV、沙漠蝗EPV、埃及伊蚊EPV、淡色搖蚊EPV，等等。
已有400余株桿狀病毒分離株被描述存在于無脊椎動(dòng)物。苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(“AcMNPV”)是桿狀病毒科的原型病毒，有廣泛的宿主范圍。AcMNPV病毒最初分離于苜蓿銀紋夜蛾(A.cal.)，一種鱗翅目的夜蛾(其成年階段是夜蛾)，通常稱作苜蓿尺蠖。這種病毒感染鱗翅目昆蟲中的12個(gè)科、30余個(gè)種。但不知是否大量感染該目之外的任何種。
桿狀病毒(例如AcMNPV)的生活周期包括兩個(gè)階段。生活周期的每一階段以病毒的一種具體形態(tài)為代表無包含體的胞外病毒顆粒(“ECV”)和包含體病毒顆粒(“OV”)。胞外和包含體病毒形式有相同的基因組，但顯示不同的生物學(xué)性質(zhì)。病毒的每種形態(tài)的成熟均由各自的病毒基因指導(dǎo)，有些基因?qū)γ恳恍螒B(tài)是獨(dú)特的。
人們發(fā)現(xiàn)，多病毒顆粒以其天然存在的昆蟲感染形態(tài)包埋在稱作包含體(“OB”)、也稱作多角體包含體(“PIB”)的次晶蛋白質(zhì)基質(zhì)中。由蛋白質(zhì)組成的病毒包含體稱作多角體。多角體蛋白，其分子量為29KD，是主要的病毒編碼的病毒包含體的結(jié)構(gòu)蛋白(相類似地，GV產(chǎn)生OB，后者主要由顆粒體蛋白而非多角體蛋白組成)。
病毒包含體是天然桿狀病毒生活周期的重要部分，它在易感性昆蟲種間提供水平傳遞(昆蟲至昆蟲)方式。在環(huán)境中，易感性昆蟲(通常為幼蟲期)從污染的食物源(如植物)攝食病毒包含體。結(jié)晶包含體在易感性昆蟲的腸中解離，釋放出感染性病毒顆粒。這些多角體衍生的病毒(“PDV”)侵襲中腸組織細(xì)胞，并在其中復(fù)制。
據(jù)信，病毒顆粒通過胞吞或融合作用進(jìn)入細(xì)胞，病毒DNA在核孔或核內(nèi)脫殼。在6小時(shí)內(nèi)檢出病毒DNA復(fù)制。感染后約(“p.i.”)約10-12小時(shí)，通過胞外病毒(“ECV”)從細(xì)胞表面出芽而使繼發(fā)感染曼延到其它昆蟲組織。病毒的ECV形式與病毒在感染昆蟲個(gè)體內(nèi)細(xì)胞向細(xì)胞的擴(kuò)散有關(guān)，也與細(xì)胞培養(yǎng)物中的傳遞感染有關(guān)。
在感染周期后期(感染后12小時(shí))，在感染細(xì)胞中可檢出多角體蛋白。直至感染后18-24小時(shí)，多角體蛋白才在感染細(xì)胞的核中裝配，病毒顆粒則包埋在蛋白質(zhì)組成的包含體中。當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，病毒包含體在4-5天中大量積聚。這些多角體在幼蟲感染的擴(kuò)散方面無活性作用。ECV散布在受感染的幼蟲體內(nèi)，導(dǎo)致幼蟲死亡。
受感染的幼蟲死亡時(shí)，無數(shù)多角體保留在分解的組織中，而ECV被降解。當(dāng)其它幼蟲暴露于多角體(如通過攝食污染的植物或其它食料)時(shí)，該周期則重復(fù)。
總之，病毒的包含體形態(tài)與昆蟲通過腸的初期感染及病毒的環(huán)境穩(wěn)定性有關(guān)。當(dāng)PDV注射給予時(shí)基本上無傳染性，而口服時(shí)則有高度傳染性。病毒的非包含體形態(tài)(即ECV)與病毒的病毒血癥和組織培養(yǎng)中細(xì)胞至細(xì)胞傳染有關(guān)。ECV對(duì)于組織培養(yǎng)中的細(xì)胞或通過注射對(duì)昆蟲體內(nèi)組織有高度傳染性，但口服給予時(shí)基本上無傳染性。
這些昆蟲病毒對(duì)脊椎動(dòng)物或植物無致病性。而且，桿狀病毒一般宿主譜窄，很多株限于一種或幾種昆蟲種。
桿狀病毒用作生物殺蟲劑是大有前途的。它們在農(nóng)業(yè)上廣泛使用的主要障礙之一是昆蟲的初期感染與其死亡之間的時(shí)間滯后。這種滯后可從幾天至幾周。在此滯后期間，昆蟲幼蟲繼續(xù)進(jìn)食，引起對(duì)植物的進(jìn)一步損害。很多研究者通過將異源基因插入病毒基因組以表達(dá)昆蟲防治或修飾物質(zhì)，如毒素、神經(jīng)肽和激素或酶，來努力克服這一弊端。
然而，迄今尚未將作為害蟲控制總計(jì)劃一部分的這種基因修飾的昆蟲病毒與化學(xué)殺蟲劑合并使用。野生型昆蟲病毒與化學(xué)殺蟲劑的合用雖有報(bào)道，但由于野生型病毒(文獻(xiàn)目錄第1-5條目)的限制，其結(jié)果不是最合適的。研究者們還致力于用其它生物防治劑，如細(xì)菌(如蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis))、真菌、原生動(dòng)物和線蟲，單獨(dú)使用或與昆蟲病毒或化學(xué)殺蟲劑合用，但它們也未提供最適結(jié)果(2、3、5、6)。因此，有必要發(fā)展化學(xué)殺蟲劑和基因修飾的昆蟲病毒的聯(lián)合應(yīng)用，這將提供兩種成分的優(yōu)點(diǎn)，而通過基因修飾的昆蟲病毒的使用來減少所用化學(xué)品的量，并減少用野生型病毒所得到的殺蟲時(shí)間。
發(fā)明的概述本發(fā)明的目的是提供用于抗鱗翅目昆蟲的殺蟲劑組合物，其包含用于增強(qiáng)昆蟲防治的基因修飾的病毒和化學(xué)、生物學(xué)殺蟲劑的混合物。病毒的基因修飾包括插入表達(dá)昆蟲防治或修飾物質(zhì)如毒素、神經(jīng)肽或激素、或酶的基因。病毒的基因修飾還包括基因缺失。
本發(fā)明提供殺蟲劑組合物，包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由擬除蟲菊酯、芳基吡咯、二酰肼和甲脒組成的化學(xué)品；(b)有效量的基因修飾的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(“AcMNPV”)，包括(i)表達(dá)Androctonus australis昆蟲毒素(“AaIT”)的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的脫皮甾類(ecdysteroid)UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(“EGT”)的基因的缺失，其中，所述組合物用于抗鱗翅目昆蟲，其條件為當(dāng)昆蟲為美洲棉鈴蟲、化學(xué)殺蟲劑為甲脒時(shí)，基因修飾的AcMNPV包含表達(dá)AaIT的插入基因。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗煙芽夜蛾(Heliothis virescens)昆蟲的組合物，包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由擬除蟲菊酯和芳基吡咯組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包括(i)表達(dá)AaIT的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的EGT的基因的缺失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗玉米夜蛾昆蟲的殺蟲劑組合物，包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由芳基吡咯和二酰肼組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包括(i)表達(dá)AaIT的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的EGT的基因的缺失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗玉米夜蛾昆蟲的殺蟲劑組合物，包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由甲脒組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包含表達(dá)AaIT的插入基因。
本發(fā)明還提供用于防治包括鱗翅目昆蟲的方法，包括對(duì)所述昆蟲或作物投藥，其中所述昆蟲喂飼上述殺蟲劑組合物。
附圖的簡要說明


圖1是下面的表13所示數(shù)據(jù)的圖解說明，即除了表13中“未處理校正”數(shù)據(jù)在
圖1中未繪出之外，繪出了表13所述前三種處理的一天、4天和10天的死亡百分率。
圖2是下面的表14所示數(shù)據(jù)的圖解說明，即除了表14中“未處理校正”數(shù)據(jù)在圖2中未繪出之外，繪出了表14所述前三種處理的一天、4天和10天的死亡百分率。表14中的＂AcMNPV AaIT-ins＂與
圖1中的＂rNPV＂相同。
發(fā)明的詳述諸如鱗翅目昆蟲在其從卵到成蟲的發(fā)育過程中經(jīng)歷特征性很強(qiáng)的活動(dòng)順序。在卵孵化后，昆蟲幼蟲進(jìn)入大量進(jìn)食階段。在此時(shí)期，它蛻皮數(shù)次以便繼續(xù)生長。相繼的蛻皮之間的蟲期稱作齡期。幼蟲生長期末，幼蟲化蛹和羽化成為成蟲。本發(fā)明的目的是加強(qiáng)對(duì)幼蟲期傳播疾病的昆蟲的防治。已知是重要的作物害蟲的鱗翅目一些科包括夜蛾科、天社蛾科、燈蛾科、螟蛾科、菜蛾科、粉蝶科和尺蛾科。
兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)被用來測定殺蟲劑組合物是否提供對(duì)昆蟲害蟲的有效防治。一個(gè)是在一段時(shí)間內(nèi)殺滅的幼蟲數(shù)，指“死亡百分率”。另一個(gè)是殺滅速度。即使最后時(shí)期死亡百分率不改善，如果早期階段有更多幼蟲被殺滅，在更少進(jìn)食時(shí)間因而對(duì)作物較少損害上也是有利的。因此，如果死亡百分率或殺滅速度改善，受試組合物可說是比現(xiàn)有組合物有改進(jìn)。
基因修飾的昆蟲病毒與化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑合用，如果合用的死亡率大于單個(gè)成分分別用的總和，則稱作“協(xié)同”，如果合用的死亡率等于單個(gè)成分分別用的總和，則稱作“相加”，如果合用的死亡率大于單個(gè)成分分別使用，則稱作“亞相加”，如果合用的死亡率小于單個(gè)成分分別使用，則稱作“拮抗”。
當(dāng)合用產(chǎn)生協(xié)同或相加時(shí)則獲利。甚至當(dāng)合用產(chǎn)生相加時(shí)，與分別使用的劑量相比，通過減少一種或兩種成分的劑量，成本有所節(jié)約，對(duì)環(huán)境也有利，如減少化學(xué)殺蟲劑的量，這減少存留和耐藥性的發(fā)生。
殺蟲劑組合物如果對(duì)敏感和/或半敏感昆蟲增強(qiáng)防治作用，則是有益的。敏感昆蟲比半敏感昆蟲對(duì)昆蟲或化學(xué)殺蟲劑一般易感100-1,000倍。例如，煙芽夜蛾對(duì)AcMNPV敏感，而玉米夜蛾對(duì)AcMNPV半敏感。
本發(fā)明的附屬優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)殺蟲劑和昆蟲病毒的合用比起各個(gè)成分單用可有更多類型昆蟲被擊中?；瘜W(xué)殺蟲劑和昆蟲病毒均有特殊的宿主譜。合用因有兩種成分的存在而可擴(kuò)大宿主譜。然而，這種作用不是由于殺蟲劑成分之間的任何相互作用。
很多種類的殺蟲劑化合物被用來防治昆蟲害蟲。下面將列出很多這些種類的概括及其作用方式的描述。
擬除蟲菊酯是與鈉離子通道蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物，它繼而引起跨軸突膜動(dòng)作電位的變化，這又破壞了昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。擬除蟲菊酯的例子包括氯氰菊酯(α-氰基-3-苯氧基芐基-順/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯；FMC Corp.)、PERMETHRINTM(3-苯氧基芐基-順/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯；Coulston International Corp.)、氰戊菊酯(α-氰基-3-苯氧基芐基-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酯)和cyhalothrin(α-氰基-3-苯氧基芐基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-丙-1-烯基)-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯)。
甲脒化合物有幾種推定的作用方式，包括與章魚胺(一種神經(jīng)激素/神經(jīng)遞質(zhì))受體結(jié)合，起激動(dòng)劑的作用，促進(jìn)cAMP的產(chǎn)生，引起行為改變，或抑制單胺氧化酶的混合功能。甲脒的例子包括雙蟲脒(N’-(2，4-二甲基苯基)-N-[[2，4-二甲基苯基)亞氨基]甲基]-N-甲基甲烷酰亞胺酰胺；NOR-AM，Schering AG)和殺蟲劑(N’-(4-氯-O-甲苯基)-N，N-二甲基甲脒)。
芳基吡咯是線粒體毒素，通過使氧化磷酸化作用解偶聯(lián)而顯示其致死效應(yīng)。芳基吡咯的例子包括4-溴-2-對(duì)氯苯基-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基-吡咯-3-腈(美國專利No.5,310,938)和美國專利No.5,010,098中描述的化合物。
二酰肼是非甾類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，其主要作用方式是作為蛻皮素激動(dòng)劑。二酰肼的例子包括二芐基-叔丁肼(其制備在美國專利No.5,300,688中有描述)和MIMICTM(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2-(4-乙基苯甲酰基)酰肼；Rohm & Haas Co.)。
環(huán)二烯與GABA復(fù)合物的受體亞單位結(jié)合。環(huán)二烯的例子是硫丹(6，7，8，9，10，10-六氯-1，5，5，6，9，9-六氫-6，9-亞甲基-2，4，3-苯并二噁thiepin 3-氧化物；Hoechst)。
氨基甲酸酯起膽堿酯酶抑制劑的作用。氨基甲酸酯的例子包括thiodicarb(二甲基-N，N-(硫代雙(甲基亞氨基)羰基氧)雙(乙烷亞氨硫代酯)；Rhone-Poulenc)和滅多蟲(N-[(甲基氨基甲?；?氧]硫代乙酰亞氨酸S-甲酯)。
有機(jī)磷起膽堿酯酶抑制劑的作用。有機(jī)磷的例子包括丙溴磷(硫代磷酸O-4-溴-2-氯苯酯O-乙酯S-丙酯；Ciba-Geigy)、馬拉松(巰基琥珀酸乙酯的二硫代磷酸O，O-二甲酯)、甲丙硫磷(二硫代磷酸O-乙酯O-[4-(甲基硫代)苯酯]S-丙酯)和樂果(S-甲基氨基甲?；谆?-二硫代磷酸(O，O-二甲酯)。
吡唑類化合物是線粒體呼吸抑制劑，特異性地作用于電子傳遞系統(tǒng)的復(fù)合物I。吡唑類化合物的例子包括tebufenpyrad(N-(4-叔丁基芐基)-4-氯-3-乙基-1-甲基吡唑-5-甲酰胺；Mitsubishi Kasei，美國氰胺公司)和公開的歐洲專利申請(qǐng)No.289,879中描述的化合物。
硝基胍通過其與乙酰膽堿受體結(jié)合而阻止乙酰膽堿與突觸后膜某些乙酰膽堿受體結(jié)合。這些化合物阻斷神經(jīng)傳遞。硝基胍的例子包括吡蟲啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亞胺；Bayer)及其衍生物。
Milbemycin先與GABA受體/氯離子通道復(fù)合物的一個(gè)部位結(jié)合，然后通過抑制神經(jīng)肌接頭的信號(hào)傳遞而引起昆蟲麻痹和死亡。Milbemycin的一個(gè)例子是齊墩螨素(含＞80％除蟲菌素Bla和＜20％除蟲菌素Blb的除蟲菌素混合物；Merck，Sharp & Dohme)。
苯甲?；交迨抢ハx生長調(diào)節(jié)劑，它干擾殼多糖合成，從而破壞昆蟲蛻皮過程中角質(zhì)層形成的過程。苯甲?；交宓囊粋€(gè)例子是除蟲脲(1-(4-氯苯基)-3-(2，6-二氟苯甲酰基)脲；Uniroyal Chemical Co.，Inc.)。
脒基腙是抑制復(fù)合物II線粒體電子傳遞的線粒體呼吸抑制劑。脒基腙的一個(gè)例子是伏蟻腙(四氫-5，5-二甲基-2(1H)-嘧啶酮[3，-[4-(三氟甲基)苯基]-1-[2-[4-三氟甲基)苯基]乙烯基]-2-亞丙烯基]；美國氰胺公司)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，上述類型的化學(xué)品的另外的例子是已知的，可購自供應(yīng)商，或在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中被描述。
按照本發(fā)明，殺蟲劑組合物包括殺蟲化學(xué)品(或如下所述的生物學(xué)殺蟲劑)和基因修飾的昆蟲病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，昆蟲病毒的基因修飾包括在病毒基因組內(nèi)任何適當(dāng)?shù)牟课徊迦氡磉_(dá)昆蟲防治或修飾物質(zhì)的基因。例如，該物質(zhì)是毒素、神經(jīng)肽或激素或酶。被這樣表達(dá)的物質(zhì)增強(qiáng)病毒的生物殺蟲效應(yīng)。
這樣的毒素包括從蝎子Androctonus australis得到的昆蟲特異性毒素AaIT(7)、從谷癢病螨虱狀蒲螨(Pvemotes tritici)得到的一種毒素(8)、蘇云金桿菌毒素(9、10)和從蜘蛛毒液中分離到的一種毒素(11)。這樣的神經(jīng)肽或激素的例子包括羽化激素(12)、促前胸腺激素(PTTH)、脂動(dòng)激素、利尿激素和原肛肽(13)。這樣的酶的例子是保幼激素酯化酶(JHE)(14)。
本發(fā)明以包含表達(dá)AaIT的插入基因的基因修飾的AcMNPV為例加以說明。基因修飾的起始點(diǎn)是稱作E2的AcMNPV的野生型株(ATCC VR-1344)。插入這一病毒株的毒素是AaIT，它由南非蝎子Androctonus australis Hector的毒液制成。該毒素長度為70個(gè)氨基酸，結(jié)合于昆蟲的鈉通道，以ng至mg級(jí)的量引起昆蟲幼蟲收縮麻痹。因?yàn)锳aIT不結(jié)合于哺乳動(dòng)物鈉通道，所以是用作生物殺蟲劑來保護(hù)作物的候選者，因?yàn)樗馨踩乇蝗藬z入。
AaIT基因編碼區(qū)域的上游區(qū)域包括指導(dǎo)細(xì)胞分泌AaIT的信號(hào)序列。具體地說，該信號(hào)序列將毒素通過分泌途徑導(dǎo)向細(xì)胞表面，在該處分泌到細(xì)胞外。在運(yùn)送過程中，酶切割信號(hào)序列，留下成熟AaIT。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在昆蟲毒素如AaIT(15)的表達(dá)和分泌方面異源信號(hào)序列是有用的。較佳的異源信號(hào)序列是果蠅(Drosophila melanogaster)的表皮信號(hào)序列(對(duì)于骨胳外蛋白質(zhì))，它分泌大量相關(guān)的成熟蛋白質(zhì)。
也使用編碼表皮信號(hào)序列和AaIT的密碼子最優(yōu)化DNA序列。基因密碼的簡并使核苷酸序列變異，而仍產(chǎn)生和天然DNA序列編碼的多肽具有同樣氨基酸序列的多肽。稱作密碼子最優(yōu)化的這種過程給人們提供了設(shè)計(jì)這種改變的DNA序列以反映被宿主昆蟲利用的密碼子頻率的手段。在這一實(shí)施方案中，利用果蠅密碼子表產(chǎn)生編碼表皮信號(hào)序列和AaIT的密碼子最優(yōu)化的DNA序列。
改進(jìn)AaIT表達(dá)的另外一個(gè)手段是利用AcMNPV DA26“早期”啟動(dòng)子。此啟動(dòng)子被插入編碼表皮信號(hào)序列和AaIT的密碼子最優(yōu)化DNA序列的上游。按照共同轉(zhuǎn)讓的待批美國專利申請(qǐng)No.08/070,164(在此引作參考)所述的方法，構(gòu)建含有DA26啟動(dòng)子和編碼表皮信號(hào)序列和AaIT的密碼子最優(yōu)化DNA的基因修飾的Ac MNPV E2株的樣本。所得的病毒構(gòu)建物的樣本稱作AC1001，保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，被指定為ATCC No.VR-2404。本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)技術(shù)可產(chǎn)生其它使用野生型AaIT DNA序列的構(gòu)建物、其它異源信號(hào)序列和其它啟動(dòng)子。
用昆蟲病毒的基因修飾改進(jìn)昆蟲病毒防治昆蟲的性能也采取基因缺失的形式。一個(gè)例子是編碼蛻皮甾類UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(“EGT”)的基因缺失。Miller等報(bào)告了昆蟲病毒這種EGT-株(16)的構(gòu)建。Miller特別描述了AcMNPV EGT-株的構(gòu)建。
egt基因的表達(dá)引起EGT的產(chǎn)生。EGT使昆蟲羽化激素(蛻皮素)失活，阻止昆蟲幼蟲羽化或化蛹。當(dāng)egt基因失活時(shí)，例如通過產(chǎn)生EGT-株而失活，受昆蟲病毒感染的幼蟲可進(jìn)行羽化或化蛹。這種繼續(xù)發(fā)育的昆蟲繼而導(dǎo)致諸如減少進(jìn)食、減緩生長和快速死亡之類的有益的作物保護(hù)的結(jié)果。這是由于EGT-昆蟲病毒不能阻斷昆蟲羽化和化蛹，以及準(zhǔn)備羽化時(shí)的停止進(jìn)食。結(jié)果，EGT-感染的昆蟲在其感染狀態(tài)試圖羽化時(shí)，比野生型(EGT+)感染的昆蟲更趨于早死亡。以LT50值(感染病毒后一組昆蟲的一半死亡所需的時(shí)間)表示，用EGT-株感染的昆蟲比用野生型病毒感染的昆蟲更有效。
通過替代或在egt基因中插入另一基因如對(duì)β-半乳糖苷酶的非病毒標(biāo)記基因，可使egt基因失活。任何DNA序列可用來破壞egt基因，只要它破壞egt編碼序列的表達(dá)?；蛘?，通過一個(gè)合適的編碼片段的缺失或突變，可從基因組除去egt基因的全部或部分。此外，控制egt基因表達(dá)的基因組的調(diào)節(jié)部分可以改變或除去。這些修飾的結(jié)果使egt基因表達(dá)不足。通過病毒連續(xù)通過昆蟲或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，也可產(chǎn)生失活egt基因的缺失。所有這些插入、缺失或突變用常規(guī)手段達(dá)到。所得到的缺失的昆蟲病毒其優(yōu)點(diǎn)是不含有外來DNA，與野生型病毒的區(qū)別也僅在于缺少功能性egt基因。
Miller用稱為vEGTDEL的重組體得到的AcMNPV EGT-病毒為例，其中部分egt基因缺失。Miller通過將質(zhì)粒pEGTDEL(用EcoRI和XbaI切割含egt基因的質(zhì)粒以切除部分基因的產(chǎn)物)和來自病毒vEGTZ的DNA(含有插入在帶有上述egt編碼序列的骨架中的lac Z基因)共轉(zhuǎn)染到SF細(xì)胞中，得到了vEGTDEL。同源重組導(dǎo)致以來自pEGTDEL的缺失egt基因替代vEGTZ中的egt-lac Z融合基因，得到重組體病毒vEGTDEL，即EGT-。
Miller使用了一株稱作L1的AcMNPV，這是最初分離的野生型株(ATCCVR-1345)的克隆分離株。后來，一株稱作為V8的AcMNPV被分離和鑒定。該V8株樣本保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，U.S.A.)，編號(hào)為TACC[VR 2465]。Miller文中描述的構(gòu)建L1EGT-株的技術(shù)很易用來構(gòu)建V8EGT-株。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)制劑技術(shù)來制備本發(fā)明的組合物。組合物的形式為可濕式粉劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、氣溶膠溶液、毒餌和其它常規(guī)的殺蟲制劑。
組合物常包括惰性載體，可以是液體如水、醇、烴類或其它有機(jī)溶劑、或礦物、動(dòng)物或植物油，或粉末如滑石、粘土、硅酸鹽或硅藻土。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)對(duì)本發(fā)明的殺蟲劑組合物加以施用。這些技術(shù)包括用吸入(通過對(duì)所述昆蟲食用的谷物進(jìn)行噴霧或撒粉)、攝入或直接接觸使害蟲暴露于組合物。
殺蟲劑組合物以幾種方式施用。將病毒和化學(xué)品以一種劑量形式或同時(shí)以兩種劑量形式同時(shí)施用。如果使用兩種劑量形式，它們單獨(dú)包裝，然后混合(如有必要，在稀釋劑存在下)，形成最終組合物?；蛘?，病毒或化學(xué)品之一可先施用，以使昆蟲受應(yīng)激，然后用另一成分。
本發(fā)明的殺蟲劑組合物的施用劑量范圍為2.4×108-2.4×1012PIBs/公頃基因修飾的病毒和0.001-1.0kg/公頃化學(xué)殺蟲劑。這些劑量表示本領(lǐng)域?qū)γ恳怀煞址謩e確定的劑量范圍，以及通過本發(fā)明合用殺蟲劑組合物而可能降低的劑量。
產(chǎn)生植物保護(hù)的最優(yōu)化殺蟲有效組合物所需的組合物每一活性成分的濃度取決于有機(jī)體、化學(xué)品和所用的昆蟲病毒修飾以及組合物的制劑。這些濃度很易被本領(lǐng)域技術(shù)人員測定。
作為化學(xué)殺蟲劑的替代物，將生物防治劑與昆蟲病毒合用。生物防治劑包括例如可購自Abbott實(shí)驗(yàn)室、商品名為XENTARITM和DIPELTM2X的蘇云金桿菌之類的細(xì)菌。其它生物防治劑包括Nosema polyvora，M.grandis和Braconmellitor之類原生動(dòng)物(5)。其它生物防治劑還包括昆蟲病原性真菌(5)和線蟲。線蟲以液體制劑或分散在凝膠中加以施用，在該制劑中它們處于休眠階段，直接準(zhǔn)備使用。
為了使本發(fā)明可被更好地理解，闡述如下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是為了闡述的目的，而不能看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 生物測定技術(shù)這些實(shí)施例中使用的生物測定技術(shù)是食物鋪層法，該生物測定按如下方法進(jìn)行。使用的昆蟲是煙芽夜蛾和玉米夜蛾。將幼蟲在黃豆/麥芽瓊脂基食物(Stoneville食物)上培養(yǎng)，該食物得自USDA昆蟲實(shí)驗(yàn)室，Stonevile，MS。將每個(gè)集落保持在28℃持續(xù)熒光下。所有生物測定均在Stoneville食物上用第二齡幼蟲(煙芽夜蛾4日齡，玉米夜蛾3日齡)進(jìn)行。
生物測定盤(C-D International，Inc.，Pitman，NJ)每個(gè)含有32個(gè)分開的場所。每個(gè)4×4cm的場所含有5ml Stoneville食物。在處理和傳染后，將場所內(nèi)的昆蟲用清潔的帶孔粘合蓬蓋上。清潔的蓬可容易地評(píng)分。
對(duì)于log/PROBITTM(HRO Group，Inc.)分析，每一實(shí)驗(yàn)前從病毒的貯備液用丙酮2倍蒸餾水進(jìn)行連續(xù)稀釋。根據(jù)受試病毒種，從1×108至1×101PIB/ml進(jìn)行對(duì)數(shù)稀釋。需要時(shí)，通過離心來濃縮病毒貯備液。技術(shù)級(jí)殺蟲劑制備成各種濃度，以殺蟲劑的重量對(duì)稀釋劑體積計(jì)，為份/百萬(“ppm”)。
向人工飼料(已硬化)的表面滴加以下溶液的丙酮∶水(60∶40)溶液0.4ml病毒溶液；化學(xué)品溶液；病毒+化學(xué)品溶液；病毒+化學(xué)品溶液或未處理的溶液。對(duì)于病毒溶液，根據(jù)受試?yán)ハx種以10倍稀釋，稀釋范圍為1×108至1×101PIB/ml。根據(jù)所研究的化學(xué)品和受試?yán)ハx種，化學(xué)品的施用范圍從1000ppm至0.1ppm。每種稀釋液用32條幼蟲作試驗(yàn)，重復(fù)3-4次。通過旋轉(zhuǎn)測定盤使施用平均分布，將溶液在煙罩中干燥。一旦干燥，即將一條幼蟲加到每一試驗(yàn)區(qū)，喂養(yǎng)其8-10天。煙芽夜蛾喂養(yǎng)8天；玉米夜蛾喂養(yǎng)12天。整個(gè)研究期間，生物測定盤在持續(xù)熒光下保持于28℃。一天讀數(shù)一次以觀察感染的早期發(fā)生時(shí)間。每次讀數(shù)時(shí)，如果幼蟲即使在振搖食物盤時(shí)仍不顯示運(yùn)動(dòng)或如果它變得液化了，就認(rèn)為是死的。基于3-4次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算化學(xué)品和病毒的LC20和LC50值(觀察到20％或50％死亡率的濃度)。用SAS log/PROBITTM程序統(tǒng)計(jì)計(jì)算處理后8天或10天時(shí)的死亡率/劑量。這些PROBITM值一經(jīng)計(jì)算出，即用同樣的食物鋪層法，以預(yù)定的LC20和LC50劑量的化學(xué)品單獨(dú)LC20和LC50劑量的病毒單獨(dú)和化學(xué)品/病毒的各種可能的變換進(jìn)行試驗(yàn)?！癓C20”是預(yù)期通過施用該產(chǎn)品引起幼蟲20％死亡率的劑量，而“LC50”則是預(yù)期通過施用該產(chǎn)品引起幼蟲50％死亡率的劑量。
結(jié)果表中指明PIB/ml的濃度，例如，“5E4”，即5×104，其中“E”表示指數(shù)。表中的術(shù)語“DAT”表示處理后天數(shù)。在這些表中，“插入AaIT的”AcMNPV是基因修飾的E2株，該E2株含有DA26啟動(dòng)子和編碼表皮信號(hào)序列的密碼子最優(yōu)化DNA及AaIT。
含基因修飾的昆蟲病毒和化學(xué)殺蟲劑合用的組合物，當(dāng)其中一個(gè)(或兩者)增加死亡率或改善殺蟲效果的速度時(shí)，昆蟲的防治得到加強(qiáng)。
實(shí)施例2-5給出了用Helicoverpa zea所作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)施例6-8給出了用煙芽夜蛾所作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例2甲脒、阿米曲士和基因修飾的昆蟲病毒合用在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將甲脒，阿米曲士和昆蟲病毒AcMNPV合用進(jìn)行試驗(yàn)，該昆蟲病毒經(jīng)基因修飾成含AaIT或成為EGT-。結(jié)果在表1和表2中給出。
表1甲脒、阿米曲士對(duì)“插入AaIT”的AcMNPV-E2對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％5天8天阿米曲士100ppm 1 2“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml25 44阿米曲士100ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml5427021.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)4次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
表2甲脒、阿米曲士對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV-V8對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％5天8天阿米曲士100ppm 1 2“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 29 56阿米曲士100ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2224821.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)4次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
結(jié)論如下阿米曲士100ppm與“插入AaIT的”AcMNPV對(duì)H.zea幼蟲的生物活性有協(xié)同作用。上述病毒的協(xié)同作用有些劑量依賴性，因?yàn)樵撝亟M病毒合用1000ppm阿米曲士對(duì)H.zea產(chǎn)生相加而非協(xié)同效應(yīng)。
相反，阿米曲士對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV對(duì)H.zea幼蟲的生物活性無明顯效應(yīng)。有一數(shù)值傾向揭示H.zea對(duì)甲脒/“缺失EGT的”重組體的反應(yīng)略小于相加作用。
實(shí)施例3芳基吡咯與基因修飾的昆蟲病毒的合用在下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈與經(jīng)基因修飾成含AaIT和為EGT-的昆蟲病毒AcMNPV合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表3和表4中給出。
表3芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈對(duì)“插入AaIT的”AcMNPV-E2對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天 5天8天芳基吡咯1.7ppm 29 41 43“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2 9 34芳基吡咯1.7ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml4825236331.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＜0.05)。
3.表示反應(yīng)并非顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn))。
表4芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)吡咯-3-腈對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV-E2對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天 5天 8天芳基吡咯1.7ppm 29 4143“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2 1942芳基吡咯1.7ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 4025036131.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
結(jié)論如下芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈顯著加速“插入AaIT的”AcMNPV對(duì)H.zea的殺蟲速度[即基于處理后3天所得數(shù)據(jù)]。然而，在處理后5天和8天，H.zea對(duì)比芳基吡咯/重組病毒聯(lián)合應(yīng)用的反應(yīng)是相加的(或略小于相加)。
該芳基吡咯對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV-V8產(chǎn)生的第2齡H.zea的平均死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的效應(yīng)。然而，有一數(shù)值傾向(處理后3天時(shí))提示該芳基吡咯略加速“缺失EGT的”AcMNPV對(duì)H.zea幼蟲的殺滅速度。
實(shí)施例4二酰肼與基因修飾的昆蟲病毒合用在下一個(gè)試驗(yàn)中，二酰肼二苯甲?；?叔丁基肼與基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的昆蟲病毒AcMNPV合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表5和6中給出。
表5二酰肼二苯甲酰基-叔丁基肼對(duì)“插入AaIT的”AcMNPV-E2對(duì)第2齡和第3齡Helicoverpa zea混合幼蟲的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天 5天8天二酰肼200ppm 11 45 82“插入AaIT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml9 19 27二酰肼200ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml4526338431.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
3.表示反應(yīng)并非顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
表6二酰肼二苯甲?；?叔丁基肼對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV-V8對(duì)第2齡和第3齡Helicoverpa zea混合幼蟲的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天 5天 8天二酰肼200ppm 11 45 82“缺失EGT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml6 20 39二酰肼200ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml2925438931.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
3.表示反應(yīng)并非顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
結(jié)論如下二酰肼顯著加速“插入AaIT的”AcMNPV對(duì)H.zea幼蟲的殺滅速度〔即基于處理后3天收集到的數(shù)據(jù)〕。
二酰肼還顯著加速“缺失EGT的”AcMNPV對(duì)H.zea幼蟲的殺滅速度〔即基于處理后3天收集到的數(shù)據(jù)〕。
實(shí)施例5苯甲酰基苯基脲與基因修飾的昆蟲病毒合用在下一個(gè)試驗(yàn)中，苯甲酰基苯基脲diflubenzuron與基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的昆蟲病毒AcMNPV合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表7和8中給出。
表7苯甲?；交錮iflubenzuron對(duì)“插入AaIT的”AcMNPV-E2對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天5天8天Diflubenzuron 25ppm9 12 16“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml7 23 36Diflubenzuron 25ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml632233721.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
3.表示反應(yīng)并非顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
表8苯甲?；交錮iflubenzuron對(duì)“缺失EGT的”AcMNPV-V8對(duì)第2齡Helicoverpa zea的致病力的沖擊處理1幼蟲平均死亡％3天 5天 8天Diflubenzuron 25ppm 9 12 16“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 5 13 36Diflubenzuron 25ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 1022333031.在食物鋪層試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次；每次重復(fù)由32條幼蟲組成。
2.表示反應(yīng)顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
3.表示反應(yīng)并非顯著區(qū)別于相加作用(配對(duì)t-檢驗(yàn)，p＝0.05)。
結(jié)論如下苯甲酰基苯基脲diflubenzuron不改善“插入AaIT的”AcMNPV-E2對(duì)H.zea幼蟲的活性；而且，H.zea幼蟲對(duì)這種聯(lián)合應(yīng)用的反應(yīng)小于相加作用。
該苯甲?；交逡膊桓纳啤叭笔GT的”AcMNPV-E2對(duì)H.zea幼蟲的活性；而且，H.zea幼蟲對(duì)這種聯(lián)合應(yīng)用的反應(yīng)小于相加作用。
實(shí)施例6擬除蟲菊酯與野生型或基因修飾的昆蟲病毒合用在下一個(gè)試驗(yàn)中(在第2齡煙芽夜蛾上)，擬除蟲菊酯與野生型或基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的昆蟲病毒AcMNPV合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表9-14中給出。
表9描述Cypermethrin與AcMNPV的野生型E2株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC20的劑量。
表9平均死亡百分率％1天 4天10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 19 19野生型AcMNPV(400PIB/ml) 013 27Cypermethrin(0.5ppm)+ 531 41野生型AcMNPV(400PIB/ml)未處理的對(duì)照 00 0
與各個(gè)成分相比，聯(lián)合應(yīng)用并未觀察到如Aspirot(1)報(bào)告的協(xié)同作用。
表10描述Cypermethrin與AcMNPV的V8 EGT-株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC20的劑量。
表10平均死亡百分率％1天 4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 1919缺失EGT的”AcMNPV(775PIB/ml) 0 2 3Cypermethrin(0.5ppm)+23 2734“缺失EGT的”AcMNPV(775PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0與各個(gè)成分相比，聯(lián)合應(yīng)用觀察到協(xié)同作用。此協(xié)同作用與cypermethrin和野生型病毒合用缺乏協(xié)同作用正相反。
表11描述Cypermethrin與AcMNPV的“插入AaIT”E2株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC20的劑量。
表11平均死亡百分率％1天 4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 1919“插入AaIT的”AcMNPV(1000PIB/ml) 0 6 22Cypermethrin(0.5ppm)+ 22 3844“插入AaIT的”AcMNPV(1000PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0與各個(gè)成分相比，聯(lián)合應(yīng)用在1和4天觀察到協(xié)同作用。此早期的殺滅速度優(yōu)于擬除蟲菊酯和野生型病毒合用所觀察到的結(jié)果。
表12描述Cypermethrin與AcMNPV的E2野生型株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC50的劑量。
表12平均 死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(1ppm) 39 58 58野生型AcMNPV(1200PIB/ml) 0 25 53Cypermethrin(1ppm)+48 77 91野生型AcMNPV(1200PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0除了1天外，聯(lián)合應(yīng)用與各個(gè)成分相比未觀察到協(xié)同作用。
表13描述Cypermethrin與AcMNPV的V8 EGT-株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于預(yù)期的擬除蟲菊酯LC20和AcMNPV V8 EGT-株LC50的劑量。
表13平均死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 19 19“缺失EGT的”AcMNPV(1100PIB/ml) 0 0 8Cypermethrin(0.5ppm)+34 47 50“缺失EGT的”AcMNPV(1100PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0表13的結(jié)果也在
圖1中繪出。與各個(gè)成分相比，聯(lián)合應(yīng)用觀察到協(xié)同作用。此協(xié)同作用與cypermethrin和野生型病毒合用缺乏協(xié)同作用正相反，即使將小劑量cypermethrin與基因修飾的病毒合用也是如此。
表14描述cypermethrin與AcMNPV的“插入AaIT”E2株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC50的劑量。
表14平均死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(1ppm) 31 31 31“插入AaIT的”AcMNPV(5000PIB/ml)0 6 16Cypermethrin(1ppm)+25 63 72“插入AaIT的”AcMNPV(5000PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0
表14的結(jié)果也在圖2中繪出。在4天和10天，聯(lián)合應(yīng)用與各個(gè)成分相比，觀察到協(xié)同作用。此協(xié)同作用與cypermethrin和野生型病毒合用缺乏協(xié)同作用正相反。
因此，cypermethrin與基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的病毒合用優(yōu)于cypermethrin與野生型病毒合用。鑒于只使用野生型病毒和擬除蟲菊酯聯(lián)合應(yīng)用的現(xiàn)有資料(1)，這些結(jié)果是不可預(yù)料的。
實(shí)施例7二酰肼與野生型或基因修飾的昆蟲病毒合用在下一個(gè)試驗(yàn)中(在第3齡煙芽夜蛾上)，二酰肼二苯甲?；?叔丁基肼與野生型或基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的昆蟲病毒AcMNPV(L1株)合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表15-16中給出。聯(lián)合應(yīng)用使用低于實(shí)施例6中使用的劑量。
表15描述該二酰肼與AcMNPV的野生型L1株的聯(lián)合應(yīng)用。
表15死亡百分率處理/劑量 1天4天 10天野生型AcMNPV(1E2 PIB/ml) 0 025二酰肼(100ppm)0 031野生型AcMNPV(1E2 PIB/ml)+ 0 19 69二酰肼(100ppm)丙酮水對(duì)照 0 00在聯(lián)合應(yīng)用后4天和10天觀察到協(xié)同作用。
表16描述該二酰肼和基因修飾的AcMNPV的EGT-(L1株)的聯(lián)合應(yīng)用。
表16死亡百分率處理/劑量 1天4天 10天重組體(1E3 PIB/ml)0 688二酰肼(100ppm)0 031重組體(1E3 PIB/ml)+ 0 13 100二酰肼(100ppm)丙酮水對(duì)照 0 00觀察表明此反應(yīng)略不同于合用4天時(shí)的相加作用。
實(shí)施例8芳基吡咯與野生型或基因修飾的昆蟲病毒合用在下一個(gè)試驗(yàn)中(在第2齡煙芽夜蛾上)，芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈與野生型或基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的昆蟲病毒AcMNPV(L1株)合用，進(jìn)行測試。結(jié)果在表17-19中給出。
表17描述該芳基吡咯與AcMNPV的野生型E2株的聯(lián)合應(yīng)用。該聯(lián)合應(yīng)用使用相當(dāng)于每一成分單獨(dú)使用預(yù)期的LC20的劑量。
表17平均死亡百分率1天 4天 10天芳基吡咯(1ppm) 3 8 13野生型AcMNPV(400 PIB/ml) 0 0 6芳基吡咯(1ppm)+2 1941野生型AcMNPV(400 PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0在聯(lián)合應(yīng)用后4天和10天觀察到協(xié)同作用。
表18描述該芳基吡咯和基因修飾的AcMNPV的EGT-(V8株)的聯(lián)合應(yīng)用。
表18平均死亡百分率％1天 4天 10天芳基吡咯(2ppm) 205284“缺失EGT的”AcMNPV(1100 PIB/ml)0 0 3芳基吡咯(2ppm)+335072“缺失EGT的”AcMNPV(1100 PIB/ml)未處理的對(duì)照 0 0 0結(jié)果表明，合用1天時(shí)觀察到比芳基吡咯和野生型病毒合用早期殺滅速度改善。
表19描述該芳基吡咯和基因修飾的AcMNPV的插入AaIT的E2株聯(lián)合應(yīng)用。
表19平均死亡百分率％1天4天10天芳基吡咯(2ppm) 20 52 84“插入AaIT的”AcMNPV(1000 PIBs/ml) 0 3 22芳基吡咯(2ppm) + 39 69 78“插入AaIT的”AcMNPV(1000 PIBs/ml)未處理的對(duì)照0 0 0合用1天和4天觀察到協(xié)同作用，表明比芳基吡咯和野生型病毒合用早期殺滅速度改善。
因此，在總體基礎(chǔ)上，芳基吡咯4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈與基因修飾成含AaIT或?yàn)镋GT-的病毒合用優(yōu)于芳基吡咯與野生型病毒合用。
書目1.Aspirot，J.，et al.，美國專利No.4,668,511.
2.Mohamed，A.I.，et al.，Environ.Entomology，12，478-481(1983).
3.Mohamed，A.I.，et al.，Environ.Entomology，12，1403-1405(1983).
4.Velichkova-Kozhukharova，M.，et al.，Rasteniev”dni Nauki，25，80-86(1988).
5.Jaques，R.P.，et al.，“Compatability of Pathogens with Other Methods of PestControl and with Different Crops”，第38章，第695-715頁.
6.Geervliet，J.B.F.，et al.，Eed.Fac.Landbouww.Rijksuniv.Gent，56，305-311(1991).
7.Zlotkin，E.，et al.，Toxicon，9，1-8(1971).
8.Tomalski，M.D.，et al.，美國專利No.5,266,317.
9.Martens，J.W.M.，et al.，App.&Envir.Microbiology，56，2764-2770(1990).
10.Federici，B.A.，In Vitro，28，50A(1992).
11.Jackson，J.R.H.，et al.，美國專利No.4,925,664.
12.Eldridge，R.，et al.，Insect Biochem.，21，341-351(1992).
13.Menn，J.J.，et al.，J.Aqric.Food Chem.，37，271-278(1989).
14.Hammock，B.D.，et al.，Nature，344，458-461(1990).
15.1993年1月25日提出的美國專利申請(qǐng)No.08/009,265.
16.Miller，L.K.，et al.，國際專利申請(qǐng)No.WO91/00014.
權(quán)利要求
1.殺蟲劑組合物，包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由擬除蟲菊酯、芳基吡咯、二酰肼和甲脒類組成的化學(xué)品；(b)有效量的基因修飾的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒“AcMNPV”，包括(i)表達(dá)Androctonus australis昆蟲毒素(“AaIT”)的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的脫皮甾類UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶“EGT”的基因的缺失，其中，所述組合物用于抗鱗翅目昆蟲，其條件為當(dāng)昆蟲為玉米夜蛾、化學(xué)殺蟲劑為甲脒時(shí)，基因修飾的AcMNPV包含表達(dá)AaIT的插入基因。
2.按權(quán)利要求1所述的殺蟲劑組合物，其中組合物包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由擬除蟲菊酯和芳基吡咯組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包括(i)表達(dá)AaIT的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的EGT的基因的缺失，其中所述組合物用于抗煙芽夜蛾昆蟲。
3.按權(quán)利要求1所述的殺蟲劑組合物，其中組合物包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由芳基吡咯和二酰肼組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包括(i)表達(dá)AaIT的插入基因，或(ii)編碼AcMNPV的EGT的基因的缺失，其中所述組合物用于抗玉米夜蛾昆蟲。
4.按權(quán)利要求1所述的殺蟲劑組合物，其中組合物包括(a)有效量的化學(xué)殺蟲劑，選自由甲脒類組成的化學(xué)品；和(b)有效量的基因修飾的AcMNPV，包含表達(dá)AaIT的插入基因，其中所述組合物用于抗玉米夜蛾昆蟲。
5.按權(quán)利要求2所述的殺蟲劑組合物，其中化學(xué)殺蟲劑選自由擬除蟲菊酯組成的化學(xué)品。
6.按權(quán)利要求5所述的殺蟲劑組合物，其中擬除蟲菊酯為α-氰基-3-苯氧基芐基-順/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸。
7.按權(quán)利要求2或3所述的殺蟲劑組合物，其中化學(xué)殺蟲劑選自由芳基吡咯組成的化學(xué)品。
8.按權(quán)利要求7所述的殺蟲劑組合物，其中芳基吡咯為4-溴-2-(對(duì)氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈。
9.按權(quán)利要求3所述的殺蟲劑組合物，其中化學(xué)殺蟲劑選自由二酰肼組成的化學(xué)品。
10.按權(quán)利要求9所述的殺蟲劑組合物，其中二酰肼為二苯甲氧基-叔丁基腈。
11.按權(quán)利要求4所述的殺蟲劑組合物，其中甲脒為N’-(2，4-二甲基苯基)-N-〔〔(2，4-二甲基苯基)亞氨基〕甲基〕-N-甲基甲烷酰亞胺酰胺。
12.按權(quán)利要求2、3或4中任何一項(xiàng)所述的殺蟲劑組合物，其中化學(xué)殺蟲劑的有效量為0.001-1.0kg/公頃。
13.按權(quán)利要求2、3或4中任何一項(xiàng)所述的殺蟲劑組合物，其中基因修飾的AcMNPV包含表達(dá)AaIT的插入基因。
14.按權(quán)利要求2、3或4中任何一項(xiàng)所述的殺蟲劑組合物，其中基因修飾的AcMNPV包含編碼AcMNPV的EGT的基因的缺失。
15.按權(quán)利要求2、3或4中任何一項(xiàng)所述的殺蟲劑組合物，其中基因修飾的AcMNPV的有效量為2.4×108-2.4×1012多角體包涵體“PIB”/公頃。
16.用于防治鱗翅目昆蟲的方法，其特征在于對(duì)所述昆蟲或作物投藥，其中所述昆蟲喂飼權(quán)利要求1所述殺蟲劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明描述用于抗昆蟲的殺蟲劑組合物，其包含用于增強(qiáng)昆蟲防治的基因修飾的昆蟲病毒和化學(xué)及生物學(xué)殺蟲劑的混合物。病毒的基因修飾包括插入基因，該基因表達(dá)昆蟲防治或修飾物質(zhì)，如毒素、神經(jīng)肽或激素，或酶。病毒的基因修飾還包括基因的缺失。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1162906SQ95194976
公開日1997年10月22日 申請(qǐng)日期1995年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月27日
發(fā)明者B·C·布萊克, C·F·庫克爾, M·F·特里西 申請(qǐng)人:美國氰胺公司